TEMA 1. INTRODUCCIN AL LABORATORIO 1.

FUNCIN La funcin del laboratorio de anlisis clnicos es efectuar determinaciones analticas cualitativas y cuantitativas de lquidos orgnicos como sangre, orina, lquido cefalorraqudeo, etc, as como heces y otras sustancias. 2. PELIGROS Y ACCIDENTES EN EL LABORATORIO a. Incendio o explosin Ocurre cuando se utilizan solventes inflamables o sus vapores. Ej. Alcohol, ter, tolueno, etc. Se deben manipular todos los solventes inflamables o vapores alejados de llama directa o chispa. b. cidos y Bases fuertes Destruyen rpidamente tejidos produciendo cicatrices. Nunca pipetear con la boca. Siempre se aadir el cido o la base sobre el agua, lentamente y agitando con frecuencia utilizando vidrios resistentes. Si se realiza el agua sobre el cido o la base, se produce una reaccin exotrmica que puede llegar incluso a explotar. Los vapores de amoniaco son irritantes y pueden daar ojos y pulmones. c. Oxidantes fuertes Como por ejemplo H2O2, ac. perclrico, ac. crmico, dicromato potsico, etc. d. Compuestos venenosos Como ac. perclrico, ac.crmico, dicromato potsico, metanol, cianuro, arsnico, Hg, Pb, I, Ba, Zn, hidrocarburos, derivados del petrleo, aminas aromticas,etc. El I y Hg son compuestos venenosos que en bajas concentraciones no son perjudiciales para el organismo y pueden ser utilizados como antisptico. Todos los reactivos hay que manejarlos con mucha precaucin para evitar daos en piel y ojos. e. Quemaduras y Escaldaduras. Choque elctrico Quemadura: dao en los tejidos producido por un slido. Escaldadura: dao en los tejidos producido por lquidos o vapores. Medidas de Seguridad Atencin (descuido, rapidez) Extintor manual Contaminacin Vacunar al personal del laboratorio con gammaglobulinas 1

 No pipetear con la boca. En caso de pipeteados accidentales enjuagarse con agua y/o profilcticos. Botiqun de urgencias 3. CAUSAS DE ERROR EN EL LABORATORIO DE ANLISIS CLNICOS ( ojo cae en examen) A. Debido al paciente Error en la identificacin Error en la peticin Preparacin del paciente Variaciones individuales Toma de alimentos Hora del da al realizar las analticas Posicin del cuerpo al realizar las analticas, ya que puede haber variaciones de parmetros, como por ejemplo las protenas debido a la variacin existente entre el lquido intra y extracelular en distintas proporciones. Medicamentos que tomen los pacientes Recomendaciones: estar sentado en ayunas maanas de 79 horas B. Debido a la muestra Extraccin de la muestra. No deben utilizarse recipientes contaminados El paciente debe estar en reposo Cuando se vaya a realizar una extraccin de sangre el stasis no sea muy prolongado No hemlisis en la muestra Transporte de la muestra. Hay que tener en cuenta: Temperatura de la muestra Proteccin frente a la luz Tiempo (lo ms rpido posible y no pasar ms de 2 horas desde la toma de la muestra hasta que llega al laboratorio) Separacin de la muestra 2

 Conservacin de la muestra Evitar la contaminacin Luz Evitar posible evaporacin de la muestra Evitar prdida de su estabilidad C. Determinacin Mtodo analtico. Los ms adecuados son los que sean ms especficos a la hora de determinar una sustancia, generalmente son los enzimticos. Errores tcnicos Medio ambiente Error instrumental Mal funcionamiento del aparato Mal uso del instrumental Reactivos Pipetas Espectrofotmetros Tiempo y temperatura D. Procesos de Datos Tener en cuenta las prediluciones Trabajar con unidades concretas E. Resultados Tener en cuenta las prediluciones (multiplicar por inverso de dilucin) Trabajar con unidades concretas Errores en la coma TEMA 2. INTRODUCCIN A LA BACTERIOLOGA La microbiologa es una disciplina que estudia la biologa de los microorganismos. Los microorganismos son seres vivos cuya caracterstica comn es que para su visualizacin es necesario utilizar el microscopio. Los microorganismos se agrupan en el reino de los protistas, las creacin de este nuevo reino se debe a Haeckel (1866), discpulo de Darwin que ante la polmica de la poca que inclua a unos microorganismos en el reino animal y otros en el reino vegetal , sugiri que haba microorganismos que distan mucho de parecerse a los animales o a los vegetales y eran considerados una cosa u otra segn la corriente del momento, por eso Haeckel sugiri el nuevo reino para agrupar a los protozoos, bacterias, algas, etc. 3

El reino de los protistas es muy heterogneo, son unicelulares y lo ms caracterstico que lo diferencia esencialmente de los animales y vegetales es que no presenta diferenciacin interna, es decir, no hay diferenciacin celular ni mucho menos especializacin celular en tejidos. Mientras las clulas microbianas son capaces de crecer y reproducirse como seres aislados, los animales y vegetales no son capaces de vivir solos sino en grupo. En el reino de los protistas se aprecian claramente dos grados de evolucin, cuya diferencia fundamental radica en la estructura nuclear: Procariotas: no tienen estructura nuclear definida. Ej: bacterias. Eucariotas: si tienen estructura nuclear definida. Ej: hongos, protozoos. Otros autores hablan de un tercer grupo que se denomina Acariota, en este grupo incluyen los virus. 1. IMPORTANCIA Y APLICACIONES DE LA MICROBIOLOGA La microbiologa la podemos clasificar desde distintos puntos de vista: Taxonmico bacteriologa viriologa microbiologa fitologa (algas) Ecolgico del suelo de las aguas de la leche etc. Aplicado Agrcola Industrial Clnico 2. BACTERIOLOGA CLNICA Estudia las bacterias que pueden causar infecciones en el hombre. Las bacterias son microorganismos unicelulares que presentan una estructura relativamente sencilla y que se incluyen en el reino de los protistas subgrupo procariota. CARACTERSTICAS DE LAS BACTERIAS. 1. Tamao y forma Tamao:

Las bacterias miden 0,5 1m de dimetro y de 2 5 m de longitud. De las ms pequeas esta el micoplasma con 0,125 0,250m de dimetro ( no visible al microscopio ptico). De las ms grandes es la Espiroqueta que puede llegar a 500m de longitud, pero con un dimetro de 0,1 0,2m ( no visible al microscopio ptico por ser demasiado fina). Formas: Las bacterias pueden ser: Cocos: son esfricos y exponen menos superficie al exterior distorsionndose menos. Suelen ser ms resistentes a la desecacin. La relacin superficie/volumen es pequea. Bacilos: tienen forma cilndrica rectangular, aparece mayor superficie al exterior. La relacin superficie/volumen es mayor que la anterior. Tienen un metabolismo muy rpido. Espirales: son adaptaciones al movimiento, avanzando con mayor facilidad. Tenemos: Vibrios: tienen media vuelta de hlice. Espirilos: tienen ms de una vuelta de hlice y son rgidos. Espiroquetas: que se pueden confundir con los espirilos ya que tienen ms de una vuelta de hlice, pero son ms flexibles. Otras formas: bacterias estrelladas. Bacterias penduladas. Bacterias con forma filamentosa. Bacterias con forma ramificada. Cuando se dividen las bacterias pueden quedarse unidas, esto da lugar a una serie de agrupaciones. Estas dependen de: que la bacteria tenga cpsula, ya que va a impedir que se separe. que la bacteria sea mvil o inmvil. Las bacterias mviles tienden a separarse y las inmviles a juntarse. los planos de divisin. Las agrupaciones ms frecuentes en cocos son: Diplococos, un nico plano de divisin. Las bacterias aparecen unidas de dos en dos y su morfologa puede variar. Estreptococos, se dividen en un nico plano formando cadenas. Estafilococos, se dividen segn dos planos de divisin. Algunas quedan unidas y otras sueltas, dan lugar a agrupaciones irregulares (racimo de uvas). Lampropedia, se dividen segn dos planos y permanecen unidas siempre, formndose una especie de tableta. Sarcina, se dividen segn tres planos de divisin, formando una agrupacin en forma de cubo. Las agrupaciones de bacilos ms frecuentes son: 5

 Estreptobacilos, son bacilos en cadena. Otros casos: *pendulares *empalizadas 2. Estructura Se comparan clulas procariotas y eucariotas. Las clulas eucariotas tienen ncleos definidos mientras que la procariotas no tienen ncleo definido. PROCARIOTA No No Una molcula no asociada a protenas No mitosis No meiosis No esteroles Son invaginaciones de la membrana plasmtica Son 70 S EUCARIOTA Si Si Varios cromosomas constituidas por ADN y protenas Si mitosis Si meiosis Si esteroles Tienen retculo endoplsmico, Ap.Golgi Son 80 S Estn presentes vacuolas, Estn ausentes lisosomas Lo poseen en parte de la membrana Son rganos especficos para la plasmtica respiracin como las mitocondrias Aparecen vesculas en continuidad Tienen rganos especializados: de la membrana plasmtica cloroplastos Complejos formando subunidades Simples de 9+2 Movimiento no deslizante y Movimiento deslizante ameboide Probablemente estn ausentes Movimientos extendidos

M. Nuclear Nuclolo ADN Divisin Reproduccin Sexual Composicin Formaciones Membranosas Ribosomas rganos de Membrana Simple Respiracin Aparato Fotosinttico Flagelos Movimiento no flagelados Microtbulos

ESTRUCTURA BASICA DE FUERA A DENTRO 1. CAPSULA: puede existir o no. 2. PARED 3. MEMBRANA: por debajo de la cual puede existir o no flagelos. 4. CITOPLASMA: se encuentra hacia el exterior, contiene gran cantidad de ribosomas. El material nuclear es un filamento formado por una maneja sin principio ni fin. No hay cromosomas. 5. ESTRUCTURAS MEMBRANOSAS NO FOTOSINTETICAS: cuerpos laminares, lisosomas y vacuolas.

6. ESTRUCTURAS MEMBRANOSAS FOTOSINTETICAS: son equivalentes a los cloroplastos y se denominan tilacoides, pueden ser laminales, vesicales y tubulares. 7. INCLUSIONES CON DISTINTAS SUSTANCIAS: a) polihidroxibutilico que son sustancias de reserva carbonada. b) glucgeno: reserva de hidratos de carbono. c) bolutina: reserva de fsforo y cobre. 1. CPSULA Algunas bacterias poseen hacia el exterior una envoltura constituida por sustancias mucosas ricas en agua denominada cpsula. La cpsula es cuando esta sustancia tiene un espesor de 0.2 micrmetros y si est en menor cantidad se habla de capa mucosa. Este material lo sintetiza la propia bacteria y se pone de manifiesto mediante tincin negativa con Ac especficos ya que la cpsula tiene poder antignico. Si observamos al microscopio ptico (m.o.) las cpsula es mucho ms refringente, lo que se denomina hinchazn de la cpsula o Reaccin de Quellus. La formacin de la cpsula no e caracterstica de especie (sp) pudiendo existir en cepas. La cpsula no es una estructura bsica, es facultativa, puede o no estar presente, y se puede eliminar por medios enzimticos. Composicin qumica En general, la cpsula esta compuesta por polisacridos, aunque puede haber polipptidos y complejos polisacridoprotena. Ejemplo: Estreptococo neumoniae, tiene una naturaleza polisacrida a base de glucosa y cido glucurnico formando cido celobiurnico. Estreptococo pygenes, tiene en su capsula ac. glucurnico y Nacetilglucosamina que dan lugar al ac. hialobiurnico. Funciones Bacterias patgenas proteccin frente a fagocitosis contribuye a aumentar su virulencia si el animal est inmunizado frente a la cpsula, posee Ac. anticapsulares y la bacteria puede ser fagocitada Bacterias no patgenas proteccin de la ingesta de protozoos proteccin frente a la infestacin de bacteriofgos 7

Otras funciones proteccin frente a la desecacin captacin de cationes mediante restos carboxlicos libres (COO) adherencia al medio formando rosetas La cpsula est unida a la pared, y esta unin puede ser por medio de enlaces inicos, enlaces covalentes, puentes de H y fuerzas de VanderWalls. 2. PARED Est fuera de la membrana plasmtica y aparece n todas las bacterias a excepcin del micoplasma. Su composicin qumica es original y las bacterias con pared se dividen en dos grupos: gram + y gram , denominacin que procede de la respuesta frente a la Tincin de Gram. Desde el punto de vista de la composicin qumica, las bacterias gram + retienen el colorante cristal violeta mientras que en las gram el colorante es eliminado. Desde el punto de vista de la estructura fsica si damos un corte y observamos al microscopio electrnico: las bacterias gram + por fuera de la membrana plasmtica aparece una capa gruesa y compacta de 150 a 800 amstrongs. las bacterias gram fuera de la membrana plasmtica aparece una capa estratificada de 100 amstrongs. Composicin qumica Est formada por murena, glicopptidos y peptidoglucanos. Es importante tener en cuenta que la murena slo aparece en la pared bacteriana ( podemos utilizar antibiticos inocuos para el hombre ( las clulas humanas no tienen pared y por tanto el antibitico no las daa)). Ejemplo: en E.Coli existe en la murena una serie de cadenas polisacridas derivadas de Nacetilglucosamina y Nacetilmurnico. En la pared tambin pueden aparecer ac. teicoicos, estos se encuentran en la pared de las bacterias gram + y no existen en las gram . Estos cidos son polmeros de polialcoholes fosfatos, los ms importantes son: glicerol teicoico ribitol teicoico Los OH libres de los ac. teicoicos se sustituyen por distintos radicales como Nacetilglucosamina, alanina, etc. Para la sntesis de los ac. teicoicos es necesario fsforo en el medio, si no lo hay estos cidos son sustituidos por los cidos teutnicos formados por: ac. teurnico y Nacetilgalactosamina. Son compuestos cargados negativamente con carcter cido que sirven para captar cationes y proporcionando un ambiente de carga necesaria para la actividad enzimtica. Tienen funcin en el crecimiento de la pared, tienen carcter antignico y son receptores para fagos (virus) En la pared tambin se encuentran lipopolisacridos que se encuentran en las bacterias gram . Son molculas complicadas desde el punto de vista qumico y presentan una parte lpidica y una sacrida. Se 8

denominan Ag 0 (somticos) Otro componente de la pared son las lipoprotenas apareciendo solo en las bacterias gram . Las protenas se encuentran en gram + y gram y tienen una funcin degradativa, como ribonucleasas o desoxiribonucleasas, aunque algunas no son degradativas como las isomerasas. Las protenas degradan los compuestos grandes que no pueden atravesar la membrana. Las bacterias producen las protenas que degradan los polmetros en monmeros. No todos los monmeros pueden ser transportados, actuando las isomerasas las cuales transforman los monmeros en ismeros. 3. MEMBRANA Es un elemento obligado. Est situada debajo de la pared, se cree que ntimamente adherida a la pared debido a la existencia de una elevada P osmtica que la empuja hacia la pared. Presenta lo que se conoce como unidad de membrana, que es la presencia de dos capas densas envolviendo a una capa clara con un espesor de 75 amstrongs. Composicin qumica Su composicin qumica global es igual a la de la membrana de las clulas eucariotas, 40% lpidos y 60% protenas, aunque existen diferencias en el detalle del anlisis qumico, por ejemplo: en la membrana de las bacterias hay ac. grasos ramificados, existe ciclopropano y es raro encontrar lecitina. La funcin de los lpidos de membrana son: estructural intervenir en procesos de biosntesis La funcin de las protenas de membrana son: estructural tienen enzimas con accin dirigida al citoplasma enzimas que participan en la sntesis de la pared permeasas actividad ATPasa Funciones de la membrana Mantenimiento osmtico de la clula que regula el paso de sustancias de un lado a otro. Este paso de sustancias puede ser a favor de gradiente o en contra de gradiente requiriendo un gasto de E. Interviene en el metabolismo oxidativo y en la produccin de E. Participa en la divisin celular, en la duplicacin del material gentico y sntesis de la nueva pared. 4. ESTRUCTURAS MEMBRANOSAS Se les denomina tilacoides porque son similares a los tilacoides de las plantas, y pueden ser tubulares, vesicales y laminares. Son invaginaciones de la membrana plasmtica igual que le mesosoma.

Pueden crecer en condiciones de anaerobiosis si las ponemos en condiciones anaerobias y si se aplica cierta cantidad de luz aparecen vesculas en la periferia siendo muy numerosas. 5. CITOPLASMA No presenta grnulos membranosos independizados. La mayor parte de sus componentes estn en estado soluble. El citoplasma est lleno de ribosomas (sntesis de proteinas) estando libres y no unidos a la membrana como en las cels. eucariotas. Se puede encontrar distintos pigmentos como piocianina (azul), pioverdina (verde), prodigiosina (rojo) y violacina (violeta). 6. RIBOSOMAS No se obtienen ribosomas aislados sino polirribosomas. Para obtener ribosomas aislados tratamos el polirribosoma con ribonucleasa y tambin con actinomicinaD. Si se hace en presencia de Mg se obtienen las dos subunidades del ribosoma, la 30s y la 50s. Su composicin qumica es ARN y protenas. 7. INCLUSIONES CITOPLASMTICAS Las bacterias pueden presentar en su citoplasma distintas inclusiones que son generalmente sustancias de reserva y se suelen formar cuando hay un desequilibrio nutricional en el medio. Las inclusiones son: a. Glucgeno: en el medio hay muchos carbonos en forma de azcares capaces de dar glucosa, que por medio de la glucognesis da glucgeno. Estas inclusiones no tienen morfologa diferenciada al observarlas al microscopio electrnico como ocurre con los animales. Al microscopio tico el glucgeno no se ve pero puede ponerse de manifiesto cuando la bacteria tiene una alta concentracin de glucgeno mediante tincin con lugol ya que se tie de color pardorojizo. b. Bolutina: su principal constituyente es el fsforo. Desde el punto de vista qumico son fosfatos polimerizados, tambin pueden encontrarse otros constituyentes en menores proporciones. Pueden llegar a constituir el 50% de los fosfatos de reserva en la clula. c. Polibetahidroxilbutlico: es una reserva de carbono que se sintetiza cuando la fuente de carbono es acetato o compuestos que se degradan en acetato. d. Azufre: la acumulan dos tipos de bacterias: sulfooxidantes: capaces de oxidar compuestos de azufre para obtener E. fototrofas: emplean compuestos de azufre como dadores y aceptores de electrones en la fotosntesis. e. Cristales paraesporales: se forman en bacterias esporuladas. Desde el punto de vista qumico son protenas de estructura cristalina muy compacta y brillante al microscopio ptico. Su significado funcional no se conoce y tiene relacin con la esporulacin. 8. MATERIAL NUCLEAR Se habla de material nuclear y no de ncleo ya que no tiene envoltura nuclear, por lo que no hay separacin entre ncleo y citoplasma. No se puede ver al microscopio ptico( M/O), para ver el material nuclear se recurre a tcnicas especiales, como la tcnica de Feulgen que consiste en hacer una hidrlisis cida sobre los 10

cidos nucleicos. La duplicacin del cromosoma bacteriano se caracteriza por: ser semiconservativa, el material nuclear esta constituido por dos cadenas de ADN a partir de la doble hlice. Cuando se produce la duplicacin cada cadena sirve de molde para la sntesis de su complementaria. slo tiene un origen de duplicacin. Es discontinua, la cadena no se sintetiza continuamente sino en pequeos fragmentos denominados de Okazoki que posteriormente son soldados. Es bidireccional, ya que crece en dos direcciones. En la duplicacin cromosmica es necesario la participacin de enzimas, como: enzimas desenrollantes, cumplen la funcin de desenrollar la doble hlice para que cada cadena sintetice su complementaria. ARN polimerasa, ya que el ADN no se puede biosintetizar sin obtener un pequeo fragmento de cido nucleico al que se aade. ADN polimerasa, que se va aadiendo al ARN cebador. 9. ADN EXTRACROMOSMICO Pequeos fragmentos de ADN pueden estar libres y duplicarse de forma autnoma , se les denomina plsmidos o bien estos pequeos fragmentos de ADN que estn libres pueden integrarse en el cromosoma bacteriano y duplicarse al mismo tiempo que el cromosoma y se les denomina episoma. Dentro de los plsmidos tenemos distintos ejemplos: 1 Factor R o RTF (Factores de Transferencia a la Resistencia): son factores que transfieren resistencia antimicrobiana, son frecuentes. Ej: bacterias que tengan plasmido penicilasa. 2 Factor F o factor sexual: codifican para la sntesis de una estructura de la superficie de la bacteria denominada Pili sexuales, permite que en unas bacterias se de la conjugacin. A las cepas que presentan el factor F se las denomina F+ o machos, ya que cede su material gentico. Las cepas que carecen del factor F se las denomina F o hembras. 10. ESPORAS Se tratan de estructuras presentes en algunas bacterias bacilares que pueden estar en el interior de la bacteria (endoespora) o permanecer libre. Son formas de resistencia y son capaces de soportar durante tiempos elevados temperaturas de 60 80 C, esta temperatura no la soporta una bacteria normal. Las ms resistentes pueden resistir 120C durante 10 minutos. Son visibles al M/O, la forma y posicin de la espora en el interior de la bacteria es caracterstica taxonmica a la hora de clasificar las bacterias esporuladas. El tamao es importante y se pueden clasificar en : esporas no deformantes, son aquellas que su dimetro es inferior a la clula vegetativa. En funcin de la posicin en que se encuentra la espora tenemos: 11

 Espora en posicin central. Espora en posicin subterminal. Espora en posicin terminal. esporas deformantes, son aquellas en las que su dimetro es mayor que la clula vegetativa. Las bacterias esporuladas son un pequeo grupo de gneros, los ms importantes son : Bacillus, son aerobios. Clostridium, son anaerobios. Estructura de las esporas De dentro hacia fuera encontramos: 1. Citoplasma con material nuclear. 2. Membrana plasmtica. 3. Pared. 4. Por fuera aparece una capa gruesa propia de la espora llamada Cortex (corteza) que da resistencia. 5. Aparecen dos tnicas ( intima y exina) o ms que son ms resistentes a los agentes fsicos y qumicos. 6. Puede haber una ltima capa de contorno irregular llamada exosporio (slo en algunas especies). A la bacteria que produce la espora se la denomina clula vegetativa o esporangio. Se denomina esporulacin al fenmeno por el cual una bacteria vegetativa produce una espora al ser las condiciones del medio adversas. Se denomina gemacin al proceso por el cual de una espora surge una bacteria al volver a ser favorables las condiciones para el germen. 11. FLAGELOS La mayora de las bacterias mviles deben sta a apndices filamentosos denominados flagelos, cuya longitud es igual a 10 20m y su dimetro a 10 20nm. No son visibles al M/O por su pequeo dimetro . Segn el nmero y posicin de los flagelos en la bacteria se clasifican en : Monotriticas, un flagelo en el polo. Politriticas o L ofotriticas, varios flagelos en el polo. Anfitrcas, varios flagelos en ambos polos. Peritricas, varios flagelos alrededor de la bacteria. Los flagelos tienen naturaleza proteica. Al observarlos al M/E se distinguen tres partes: Filamentos, constituidos por una cadena proteica denominada flagelina (diferente en cada especie). Tiene 12

carcter antignico y se denomina Ag h o Ag flagelar. Gancho, es un engrosamiento constituido por protenas globulares. Cuello o cuerpo basal, con dos parejas de cilindros y protenas diferentes. 12. FIMBRIAS, PILIS O PELOS Son apndices filamentosos similares a flagelos, aparecen en la superficie de algunas bacterias , son mviles e inmviles y no tienen nada que ver con el movimiento y son ms finos que los flagelos, longitud 0,5 2m y dimetro 7 8nm. No son visibles al M/O. Puede haber distintos tipos de pilis segn el grosor: pili I, pili II, pili III, pili IV, pili V. Una bacteria puede tener varios tipos dentro de una misma especie. Los pelos mejor conocidos son los de E. Coli, tipo I, en los que se ha aislado una protena denominada pilina que son protenas globulares con ordenacin helicoidal o lineal. A las especies cuyas cepas no tienen pelos se las denomina calvas. Funcin de los pelos 1. Adherirse al medio donde vive, en superficies inertes o clulas de animales. 2. Las cepas con pelos poseen una actividad respiratoria mayor que las cepas sin pelos. Existen unos pelos especiales (pilis sexuales) que determinan presencia de material gentico extracromosmico (Factor F) su funcin es actuar como conducto de material gentico de una bacteria F+ a una F . La protena es distinta de los pelos normales y se denomina pilina F. 13. GLICOCLIX Es una masa de fibras constituida por polisacridos que rodean a una o varias bacterias (posicin extracelular). Gracias a l las bacterias pueden unirse a distintas superficies, como piezas dentarias, etc. Sus funciones son : De adherencia. Concentra enzimas lticos. Almacena y canaliza alimentos. Protege a la bacteria de los fagocitos. Interfiere en la respuesta inmune. 3. Tipo de reproduccin bacteriana La principal forma de reproduccin bacteriana es binaria o asexual, esta divisin requiere la duplicacin de todos los constituyentes necesarios y el reparto de todos en las clulas hijas. La 1 etapa es la separacin de las cadenas de ADN y replicacin de cada una para dar dos cromosomas ms que se repartirn entre las dos clulas hijas, luego se forma un tabique transversal asociado al mesosoma que separa las dos clulas que se origina. Los dos cromosomas hijos emigran a uno de los polos as como los orgnulos ms importantes. Tambin puede haber una reproduccin bacteriana pero menos importante a partir de la gemacin (ms tpica en hongos) % Mecanismo de intercambio gentico: 13

Tiene lugar principalmente por divisin binaria. Tiene como principal inconveniente la falta de material gentico, por ello la nica posibilidad de que la bacteria evolucione: Variacin en el fenotipo: relacionado con las condiciones del medio ambiente. El genotipo no se altera, es reversible y no hereditario. Mutacin: se altera el genotipo, son irreversibles y hereditarias. Transferencia: se produce cuando un fragmento de ADN (plsmido) procedente de una bacteria pasa a otra. Existen tres tipos de trasferencias: transformacin: la bacteria receptora capta ADN que se encuentra presente en el ADN despus de haber sido liberado por la bacteria donante. congujacion: se transfiere el plasmido por medio de un contacto fsico entre dos bacterias a travs de pilis sexuales. Traduccin: transferencia de ADN por medio de bacterifagos (virus). % Crecimiento bacteriano: La principal funcin de cualquier bacteria es el crecimiento considerando este un aumento de nmero o masa de todos los componentes celulares. La medicin del crecimiento se realiza inoculando un medio lquido con la bacteria y estudiando la concentracin celular en cada momento. De esta forma comparando el nmero de clulas vivas/ml a lo largo del tiempo se obtiene la curva de crecimiento, en la que se distinguen las siguientes fases: 1) fase de latencia: las bacterias inoculadas se adaptan al nuevo medio, no se observa crecimiento. 2) fase exponencial: la masa bacteriana aumenta como consecuencia de la multiplicacin bacteriana. 3) fase estacionaria: a medida que se agotan los nutrientes y aparecen productos txicos de materia celular, el crecimiento se endentece pero existe un equilibrio que mantiene constante el nmero de clulas. 4) fase de declive: la tasa de mortalidad aumenta y el crecimiento se endentece por disminuir nutrientes el nmero de bacterias viables disminuye hasta casi cero. El tiempo que un cultivo bacteriano necesita para completar este ciclo depende del tiempo de generacin de cada especie (tiempo para que cada clula de lugar a dos clulas hijas). Este tiempo de generacin es de 2030 minutos encontradas con frecuencia en patologa humana por lo que la curva se completara en 1824h. El crecimiento bacteriano tambin se puede simular en aparatos del laboratorio denominados quimiostatos y trbidostatos, ambos aparatos se basan en aadir medio fresco en un cultivo a medida que eliminamos igual volumen que el cultivo viejo. 4. Nutricin Bacteriana Para que una bacteria se desarrolle adecuadamente es necesario que el medio disponga de: % De una fuente carbonada a partir de glcidos, lpidos y cetoacidos. % Una fuente de nitrgeno que se consigue a partir de protenas, pptido y aminocidos.

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% Fuente de fsforo a partir de fosfatos inorgnicos. % Metabolitos esenciales obtenidos de la degracion de alimentos y formados en el interior de las bacterias gracias a reacciones metablicas que dan lugar a g6p. % Factores de crecimiento que las bacterias no pueden producir F.V y F.X. % Factores estimulantes que no son imprescindibles pero aligeran el procedimiento. Las bacterias pueden obtener la energa de dos formas: Energa radiaciones solares (fototrofas) Reacciones qumicas (quimiotrofas). En cuanto al poder sintetizante de cada bacteria, tiene una distinta capacidad para sintetizar glucidos, lpidos y protenas a partir de elementos sencillos como agua, CO2 dependiendo de esta capacidad podemos distinguir: Bacterias auttrofas: gran poder de sntesis (glucidos, lpidos y protenas) obtienen energa a partir de materia inorgnica. Dentro de estas las podemos clasificar en: % Estrictas: no pueden utilizar la materia orgnica. % Facultativas: si pueden utilizar la materia orgnica. Bacterias hetertrofas: poder de sntesis menor. Necesita obtener sus propios nutrientes (glucidos, lpidos, protenas) a partir de materia orgnica. 5. Metabolismo bacteriano Cuando los nutrientes has entrado en la bacteria sufren transformaciones qumicas que dan lugar a la sntesis de materia bacteriana. A estas reacciones se les denomina metabolismo, el cual se divide en tres etapas: Catabolismo: conjunto de transformaciones que sufre la materia asimilada por las bacterias hasta llegar a degradarse en componentes ms sencillos y producir energa necesaria para que la bacteria pueda sintetizar sus propios nutrientes. La energa se almacena en forma de ATP. Anfibolismo: los metabolitos intermedios se transforman enzimaticamente en componentes bsico como aminocidos, bases nitrogenadas. Tambin se puede obtener energa y almacenar en forma de ATP. Anabolismo: sntesis de macromolculas de las bacterias. Aprovechando la energa obtenida en las fases anteriores. Las bacterias tienen un anabolismo sintetizado, hidratos, lpidos, protenas, ADN, ARN, y 20 aminocidos necesarios. (las clulas eucariotas no sintetizan los 20 aminocidos). Principales vas catablicas: se pueden clasificar en funcin de las oxidaciones biolgicas teniendo en cuenta la naturaleza del aceptor final del hidrogeno: 1) Respiracin aerobia: el aceptor final es el oxigeno. 2) Respiracin anaerobia: el aceptor final es un componente inorgnico distinto del oxigeno, Ej.: sulfato y nitrato 3) Fermentacin: el aceptor final es un componente orgnico.Existen distintos tipos de fermentacin: Alcohlica: producto final es el CH3CH2OH y CO2. 15

 Lctica: producto final es el acido lctico y el CO2 por contaminacin de bacterias acticas que pueden dar lugar a acido actico. Propionica: CH3CH2COOH, CO2 y acido actico. La fuente de obtencin y utilizacin del oxigeno en los distintos microorganismo permite clasificarlos en los siguientes grupos: Aerobios estrictos u obligados: deben utilizar el oxigeno como ultimo aceptor de electrn. Utiliza la respiracin aerobia en su metabolismo. Anaerobios estrictos u obligados: mueren o se inhiben ante la presencia utilizando la fermentacin en su matebolismo. Facultativas: pueden utilizar el oxigeno como aceptor final de electrones o alternativamente sales como son, NO3, carbonatos. Utiliza la respiracin anaerobia. Microaeroficos: son inhibidos por una partcula de oxigeno que es igual que atmosfrica, crecen o lo hacen mejor con una concentracin baja de oxigeno. Anaerobios aerotolerantes: no requieren oxigeno ni son inhibidos o destruidos por el, utilizan matebolismo fermentativo. TEMA 3. CLASIFICACIN, TAXONOMA Y NOMENCLATURA BACTERIANA. BACTERIAS MS COMUNES, BACTERIAS DE LENTO CRECIMIENTO Y BACTERIAS ESPECIALES 1. CLASIFICACIN, TAXONOMA Y NOMENCLATURA Para clasificar las bacterias se hace colocndolas en distintos segn sus caractersticas. Una bacteria pertenece a: a. Cepa. En ellas se encuentran organismos dentro de la misma especie con una cualidad determinada. Son organismos con la mayora de sus caractersticas iguales. b. Serotipo o Serogrupo: Son organismos que difieren por la posesin de los mismos Ag siendo todos de la misma especie. c. Especie: Son organismos que tienen caractersticas biolgicas iguales para todos. d. Gnero: Son un grupo de especies estrechamente relacionadas. e. Familia: Grupos de gneros estrechamente relacionados. En la clasificacin podemos distinguir: Reino Filo Orden Clase Familia Tribu Gnero Especie Cepa Serotipo Ejemplo: Neisseria gonorreae IV 16

 Reino: Procariotas Filo: Bacteria Orden: Eubacteria Clase: Escotobacteria Familia: Neisseriaceae Gnero: Neisseria Especie: Gonorreae Cepa: IV 2. BACTERIAS MS COMUNES Cuadro de las fotocopias 3. BACTERIAS DE LENTO CRECIMIENTO Como vimos en la curva de crecimiento bacteriano, la mayora de las bacterias crecen entre 1824 horas, aunque hay algunas bacterias que su periodo de crecimiento es superior. (> 7 das). Ejemplo: Brucella y Micoplasma. 4. BACTERIAS ESPECIALES a. Rickettsias Son parsitos. Son cocobacilos pleomrficos, gram + que se presentan en cadenas o parejas y poseen pared celular rgidas. Son parsitos intracelulares. La infeccin es transmitida por vectores. Generalmente el parsito vive en las clulas intestinales y la saliva de donde se trasmiten al hombre por picadura o agresiones en la piel. b. Clamidias Son cocobacilos gram con pared celular que se caracterizan por ser parsitos intracelulares. Es uno de los microorganismos patgenos de mayor difusin dentro del reino animal, ya que utiliza como husped desde el hombre hasta artrpodos pasando por todos los animales peridomsticos. En el gnero Clamidia hay muchas especies entre las que se destacan: Clamidia trachomatis (ETS) Clamidia neumoniae ( relacionado con enfermedades respiratorias) Clamidia psittachi (relacionada con enfermedades respiratorias) c. Micoplasma Organismos procariotas gram que carecen de pared celular, por lo que son muy pleimficos y varan desde coco a filamentoso. Su hbitat es muy amplio y puede multiplicarse en plantas, insectos o mamferos. Entre los aislados en el hombre y productores de patologa: Micoplasma neumoniae (infecciones respiratorias) Micoplasma hominis (ETS) Ureaplasma (ETS) 17

TEMA 4. RELACIN HUSPEDPARSITO Parsito: Organismo que vive en otro organismo llamado husped y le causa un dao Infeccin: La infeccin es la situacin en la cual un microorganismo se introduce en el husped y se desarrolla perjudicndolo o no. No es sinnimo de enfermedad puesto que una infeccin no siempre se traduce en dao para el husped, incluso si el patgeno es potencialmente virulento. Enfermedad: Resultado de la interaccin entre agente patgeno y husped causando como consecuencia un dao en el husped (modificacin en el metabolismo celular, malestar, lesiones, etc. Las enfermedades infecciosas se clasifican segn la facilidad de transmisin de un individuo a otro en: a. Enfermedades infecciosas contagiosas o transmisibles: se transmiten fcilmente por contacto directo o indirecto (besos, tos, toallas, cepillos de dientes). Ej. SIDA, gonorrea, sarampin, lepra, etc. b. Enfermedades infecciosas no contagiosas: No se transmiten fcilmente por contacto sino por inoculacin directa. Ej. Ttanos. Virulencia: Capacidad de una cepa para producir enfermedad. Patogenicidad: Capacidad de un grupo de organismos para producir enfermedades; pueden existir especies patgenas que tengan cepas virulentas. La Epidemiologa se encarga de estudiar las enfermedades infecciosas y los factores que determinan su frecuencia y distribucin en una poblacin dada. Desde el punto de vista etimolgico: epi significa por encima o sobre demos significa pueblo loga significa tratado o ciencia. En la Epidemiologa es importante: 1. Identificar el agente causal. 2. Descubrir la fuente de infeccin. 3. Buscar el mecanismo de infeccin. 4. Buscar las caractersticas del husped. 5. Investigar la influencia del medio ambiente. Para que se produzca las enfermedad infecciosa es indispensable que se cierre la cadena epidemiolgica, la cual est constituida por tres eslabones: Fuente de Infeccin: Pueden ser: Personas: pueden ser: Persona enferma, es aquella que elimina los grmenes durante un periodo caracterstico de la enfermedad. Persona portadora, es aquella que transmite la enfermedad pero no la padece. La persona est infectada pero 18

no presenta manifestaciones clnicas. Hay dos tipos de portadores: temporales (12 meses) y crnicos (toda la vida). A veces lo grmenes no se eliminan se quedan en sangre o tejidos del enfermo portador, sern, por tanto, reservorios siempre que haya un vector que transmita el microorganismo (artrpodos picadores como plasmodium, tripanosoma, leismonia,etc). Cuando la fuente de infeccin es el hombre hablamos de infeccin homloga, si es un animal infeccin heterloga. Animal: Tiene un doble papel ya que el animal puede actuar como fuente de infeccin y como vector. Mecanismo de Transmisin Son los procedimientos que los agentes patgenos utilizan para su transmisin desde la fuente de infeccin hasta la persona susceptible. Pueden ser: Directos: Por contacto fsico o estrecha relacin entre la persona sana y la fuente. Ej. contacto sexual, piel. Por gotitas salivares: gotculas de Wells y de Pfluge. La diferencia entre unas y otras es el tamao. Ambas estn en la boca u se transmiten por besos, estornudos, tos, el habla, etc. Manos sucias. Objetos recientemente contaminados, principalmente por contaminacin salivar u orofarngea. (fomites)* Inoculacin directa por transfusiones sanguneas u jeringuillas (SIDA, hepatitis). Indirectos: Aire Agua contaminada Artrpodos (vectores) Fomites (objeto contaminado capaz de transmitir enfermedad como toallas, ropa, bolgrafos, etc.) Persona sana o susceptible de padecer enfermedad La principal a destacar son las vas de entrad y de salida de los microorganismos como son: Aerea Digestiva Parenteral Cutnea Ocular tica Urogenital Anal Placentaria 2. CLASIFICACIN DE LAS ENFERMAEDADES TRANSMISIBLES DIGESTIVAS: El contagio se denomina DAME (dedos, alimentos, moscas y excretas) 19

RESPIRATORIAS: Su via de transmisin ms frecuente son las gotculas de Wells y las de Pluge (ej. Paperas, sarampin, gripe) ETS (sfilis) ANIMALES (zoonosis) ej. Brucelosis, triquinosis. 3. MEDICINA PREVENTIVA La prevencin se realiza a tres niveles: Fuente de infeccin. En el hombre, realizar un diagnostico precoz, tratamiento y aislamiento. En el portador, realizar control y aislamiento. En animales, realizar un diagnstico, tratamiento y sacrificio. Mecanismo de Transmisin. Saneamiento ambiental. Desinfeccin. Lucha contra el vector. Persona sana. Vacunacin. Prevencin con quimoprofilaxis. 4. EPIDEMIOGNESIS Es el estudio de las epidemias y su desarrollo. Hay que saber: Endemia: Presencia habitual de una enfermedad en un rea geogrfica. El reservorio es generalmente humano y el nmero de casos que casos que aparecen es aproximado al nmero terico. Epidemia: Se produce cuando en un pas o comunidad el nmero de casos de una enfermedad es el esperado. Pandemia: Se produce cuando la epidemia afecta a varios pases o continentes. Comienzo y Desarrollo de la Epidemiologa La epidemiologa se inicia al romperse el equilibrio entre el husped y el germen debido a: Falta o disminucin de inmunidad o resistencia de un grupo de poblacin con respecto al germen. La llegada de un nuevo germen. (ej. Grmenes que llevaron los conquistadores a Amrica) Mutacin del agente infeccioso; ocurre con frecuencia en virus de la gripe. El desarrollo depende de: Nmero de poblacin susceptible Conservacin y virulencia del germen Factores sociales, ambientales y econmicos Factores de agregacin (colegios, internados) 20

 Factores de dispersin (turismo, inmigracin) Factores de saneamiento ambiental y hbitos higinicos. Clima y meteorologa que influyen en la supervivencia del germen. Hay distintos tipos de epidemia: Brote Holomintico: Se produce a travs de una fuente comn transmitiendo la infeccin a un nmero de personas en poco tiempo. Suele transmitirse por va digestiva a travs de agua y/o alimentos contaminados. Se caracteriza por una fuerte subida y un descenso brusco afectando a mucha poblacin. La epidemia se extingue al suprimir la fuente de infeccin. Ej. Salmonelosis. Brote Prosodmico: La propagacipn es de persona a persona establecindose una cadena de casos que aumenta gradualmente hasta alcanzar un mximo que perdura en el tiempo y luego empieza a declinar. Ej. Gripe. Brote Mixto: Se caracteriza porque presenta un comienzo holomintico y continuacin prosodmica o viceversa. 5. PODER PATGENO DE LOS MICROORGANISMOS En la relacin husped microorganismo existen diversos grados: 1) Colonizacin: llegada, establecimiento y multiplicacin del microorganismo sin que haya respuesta inmune por parte del husped. 2) Infeccin inaparente: los microorganismos que han colonizado origina una respuesta en el organismo inmunitario. 3) Enfermedades infecciosas: cuando el microorganismo provoca daos en el husped, la enfermedad depende del n de microorganismo, virulencia y resistencia que oponga el husped. E= N x V / R Para saber la virulencia de un germen se recurre a: 1) dosis mnima letal (DmL) que es la menor cantidad de microorganismo capaz de producir la muerte en la dosis mnima letal, debemos sealar: % El animal de experimentacin. % Va entrada. % proporcin respecto al animal. Ej.: conejo, por va parenteral con 50 mg/Kg. de conejo. 2) dosis letal 50 ( Dl 50): dosis mnima letal que mata el 50% de los animales de experimentacin. 3) dosis infectiva 50 (Di50) provoca la infeccin del 50% de los animales. 6. FACTORES QUE DETERMINAN LA VIRULENCIA

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1) Colonizacin 2) Penetracin 3) Multiplicacin 4) Invasin por continuidad a travs de va linftica, nerviosa o sangunea. Cuando el germen invade la va sangunea hay que definir: bacteremia: paso ocasional de bacterias o virus de la sangre. septicemia: paso constante y masivo de la bacteria a la sangre. viremia: paso ocasional de virus a sangre. 5) Toxinas: sustancia que proceden de las bacterias y causan lesin en el husped. Se denomina toxigenicidad: a la capacidad de producir enfermedad por la liberacin de toxinas. Las toxinas se clasifican: Exotoxinas: toxinas liberadas extracelularmente por las bacterias a medida que van creciendo. Las toxinas se trasladan por el cuerpo y causan daos en regiones retiradas del lugar donde estn creciendo las bacterias que las produce. Cada toxina tiene un tejido u rgano especfico donde acta o causa dao denominado tejido u rgano diana. Se dir que la toxina tiene tropismo (tendencia) Ej.: toxina del botulismo es neurotropa. Son de naturaleza proteica, la producen las bacterias gram positivas y negativas. Son sensibles al calor y a los rayos UV. Se deterioran a T ambiente y pierden su capacidad toxica a mas de 60. Tiene un gran poder toxico (el veneno biolgico mas potente es la toxina de botulismo). Ej.: 1mg de la toxina mata 100 toneladas de materia viva. Las exotoxinas tienen un gran poder antigenico por lo que estimulan la formacin de Ac. Si se le aplica formol se convierten en Anatosoides: pierden su capacidad toxica pero no la antignica, esto es a base de las vacunas hechas a partir de exotosinas. Son altamente especficas frente a su actuacin de su rgano diana. Endotoxinas: de naturaleza liposacrida y provienen de la pared bacteriana gram negativa. Se liberan con la lisis de la bacteria. la bacteria tiene poder toxico bajo, no forman anatoxoides por lo que no sirven para vacunas. Provocan leucopenia, hipertermia, hipotensin, plaquetopenia, etc. EXOTOXINAS Bacterias positivas y algunas negativas. Se recogen del sobrenadante del cultivo. Proteica Elevada Especifica sobre tejidos diana Termolbil es Son muy antignicos estimulando formacin de Ac ENDOTOXINAS Bacterias negativas. Salen de la bacteria cuando se destruye Liposacridos Baja Inespecfica Termoestables Pocos antignicos no inducen la formacin de Ac 22

Origen Composicin Toxicidad Accin Labilidad Poder antignico

Se transforman en toxoides por lo que sirven como vacunas Accin de los sueros Son efectivos Estudio de las exotoxinas ms importantes Accin del formol

No se transforman en toxoides No son efectivos

Toxina Diftrica: producida por Corinebacterium difteriae. Es pantotropa (tendencia por todo el organismo). Se unen a las clulas del husped y a las pocas horas pierde su capacidad de sntesis proteica y mueren. Toxina tetnica: producida por Clostridium tetanus. Es cardiotoxica y hemoltica. Lo ms importante es su accin espasmolizante al ser neurotropa y fijarse de forma irreversible a la sinapsis (conexiones entre neuronas) neuronal. Toxina botulnica: producida por Clostridium botulium. Es neurotropa y provoca una parlisis dando lugar a la muerte por asfixia debida a parada cardio respiratoria. Toxina de Clostridium perfinges: provoca gangrena gaseosa. Toxina del Estreptococos pyogenes: lo ms importante es la estreptolisina que provoca hemlisis y la toxina eritrognica que es la responsable del eritema de la escarlatina. Toxina del Estafilococos aureus: acta como enterotoxina. Toxina del Vibrio cholerae: produce el clera. Toxinas enterotxicas: toxinas de E.coli y Salmonella, producen deshidratacin que puede llegar a la muerte. 7. TIPOS DE MICROORGANISMOS 1. Patgenos: son exgenos al husped colonizan, infectan y producen enfermedad. Su accin patognica es debida al nmero y virulencia. 2. Oportunistas: suelen ser endgenos al husped formando parte de la flora microbiana normal, colonizando y en determinadas circunstancias provocando enfermedad, la cual es provocada por la disminucin de las defensas del husped. 3. Flora habitual (saprofita): Son microorganismos que colonizan al husped y le producen incluso beneficio comportndose como simbitico y preservando la salud del husped al : facilitar la absorcin de vitaminas. Degradacin de cidos biliares. Realizar la interferencia microbiana que consiste en evitar la infeccin de verdaderos patgenos por medio de bactericidas, alterar el pH o competir por el espacio con los verdaderos patgenos. Por tanto ante un tratamiento antibitico se debe elegir el que menos daa la flora habitual. Flora normal, oportunista y patgena en el hombre Las reas del cuerpo se subdividen en dos categoras generales: Las que poseen normalmente microorganismos.

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 Las que normalmente son estriles o que ocasionalmente albergan algunos microorganismos pero que pueden ser altamente colonizados en caso de enfermedad. La flora segn aparatos es: 1 Aparato Respiratorio reas que normalmente albergan microorganismos: boca nariz garganta regin nasofarngea amgdalas senos paranasales La localizacin del organismo es muy importante para saber si es patgeno o no. Pueden aparecer en algunas personas sin ser patgenos. reas normalmente estriles: bronquios bronquolos alvolos laringe traquea Es posible su contaminacin por distintos microorganismos ocasionales. Los distintos mecanismos de defensa tendern a eliminarlos rpidamente. Tanto el exputo como algunos aspirados pueden estar contaminados por la flora de garganta, nariz y boca. 2 Tracto gastrointestinal reas que normalmente albergan microorganismos: intestino grueso ileon inferior reas normalmente estriles aunque ocasionalmente pueden presentar microorganismos: esfago estmago Aunque hay que tener en cuenta que debida al paso de alimentos pueden estar contaminados por bacterias pero no sobreviven por los jugos del estmago. El hgado y la vescula biliar estn normalmente exentas de contaminacin microbiana. En estas zonas los microorganismos son sntomas de enfermedades. 3 Tracto genitourinario

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 reas que normalmente albergan microorganismos: genitales externos uretra vagina La microflora normal de la vagina dura hasta la menopausia siendo frecuente la presencia de bacilos de Doderlein o ms correctamente Lactobacilus acidofilus. En ocasiones las complicaciones de los abortos prolongados pueden ser ocasionados por la microflora vaginal, de modo similar los recin nacidos pueden tener enfermedades por la flora vaginal. reas normalmente estriles: el rin 4 Tracto de la piel, odo y ojo L a superficie externa del cuerpo esta poblada constantemente por microorganismos que reflejan las costumbres del individuo, su dieta, clima, trabajo, etc. 5 Sangre y LCR (lquido cefalorraqudeo) Son generalmente estriles pero en muchas enfermedades infecciosas y durante las complicaciones infecciosa de las enfermedades es frecuente encontrar microorganismos en sangre. 8. CLASIFICACIN DE LOS AGENTES PRODUCTORES DE INFECCIN De acuerdo con la clasificacin etiolgica se dividen en agentes productores de infeccin en: 1. enfermedades por hongos. 2. enfermedades por bacterias. 3. enfermedades por virus. 4. enfermedades por protozoos. 5. enfermedades por helmintos. 6. enfermedades por artrpodos. 7. enfermedades por algas. 8. enfermedades por priones. Priones: son partculas infecciosas de pequeo tamao y naturaleza no bien conocida. Se presentan como partculas de naturaleza proteica en las que no se ha determinado ni ADN ni ARN aunque no se excluye que tenga alguno. Se les considera los agentes productores de la enfermedad de Crentzfeld Jacobs (CJ). TEMA 5. OBSERVACIN DE LOS GRMENES VIVOS: MOVILIDAD DE LOS ORGANISMOS. TINCIONES

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1. OBSERVACIN DE LOS GERMENES VIVOS Para la investigacin de algunas caractersticas biolgicas de los microorganismos como son su morfologa y movilidad es necesario observar los grmenes in vivo. Para ello se debe partir de cultivos jvenes ya que los microorganismos de los cultivos viejos pierden su movilidad y gran parte de ellos estn en regresin. Estas tcnicas son las siguientes: a. EXAMEN EN FRESCO Fundamento: Suspendiendo el microorganismo en un medio lquido transparente es posible observar al M/O sus caractersticas morfolgicas y su movilidad. Se utiliza para clasificar a los organismos en los procesos de identificacin en : mviles o inmviles observacin de estructuras espiriladas fase de reproduccin Material: m.o., cubreobjetos, portaobjetos excavado, mechero, asa de siembra. Reactivos: vaselina slida y microorganismos (Proteus vulgaris). Tcnica: Para el examen en fresco existen dos mtodos, son los siguientes: 1 Mtodo de la gota pendiente Tcnica: 1 En el centro de un cubre limpio y desengrasado se coloca una gota de la suspensin de microorganismos con un asa esterilizada. 2 Invertir sobre el cubre el porta excavado untando con vaselina alrededor del pocillo, colocndolo de forma que la gota quede centrada en la depresin, la vaselina adhiere el cubre al porta de modo que se forma una cmara que evita la evaporacin de la gota. 3 Despus dar rpidamente la vuelta a la preparacin. 4 Observar al M/O con el objetivo de 40x. 2 Mtodo de la cmara hmeda Tcnica: 1 Depositar en el centro de un porta limpio y desengrasado una gota de agua estril. 2 Tomar con el asa una muestra del microorganismo y realizar una suspensin con la gota de agua. 3 Colocar sobre la suspensin un cubre evitando que queden burbujas de aire. 4 Observar al M/O con el objetivo de 40x.

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 Resultados e interpretacin: La movilidad se manifiesta en un desplazamiento del microorganismo en todas las direcciones del campo del M/O a diferencia del movimiento browniano de los grmenes presentes en la suspensin que no presentan movilidad, los cuales se desplazan en la misma direccin. Este extremo se puede comprobar aadiendo un antisptico a la preparacin en caso de tratarse de organismos mviles desaparecer el movimiento observado. Observaciones al mtodo: Es importante que el tamao de la gota sea adecuado. Si es muy grande provocara en ambas tcnicas el desplazamiento del cubre impidiendo la visin correcta de la preparacin, si es muy pequea puede evaporarse en el interior de la cmara. En el mtodo de la gota pendiente si no se dispone de vaselina se puede humedecer los bordes de la excavacin con solucin salina estril o agua destilada. b. COLORACIN VITAL Fundamento: Es un proceso intermedio entre el examen en fresco y las tcnicas de coloracin despus de fijacin. Tiene por objeto poner de relieve detalles estructurales de los microorganismos que no es posible observar en fresco sin causar modificaciones fsicas o qumicas incompatibles con el elemento examinado. En general no se tien sino que se acumulan en ciertas partes del microorganismo. Se deben emplear colorantes atxicos a diluciones muy altas. Material: Portaobjetos, cubreobjetos, asa de siembra, mechero, papel de filtro y aceite de inmersin. Reactivos: Se emplean colorantes en disoluciones: 1/1000, 1/5000, 1/10000. Son: nigrosina, azul de metileno, verde janus, verde malaquita. Tcnica: 1 Colocar en el centro del porta una gota de la suspensin del microorganismo y otra del colorante. 2 Mezclar con el asa de siembra y colocar el cubreobjetos sobre la gota resultante (sin burbujas). 3 Observar al M/O con el objetivo de inmersin (100x). 2. TIPOS DE COLORANTES Los colorantes son sustancias capaces de dar color a otros cuerpos, pero para que sean efectivos deben tener predileccin por determinados organismos, es decir, deben ser selectivos. Los colorantes se pueden dividir en: a. En funcin de su naturaleza estructural, pueden ser: Naturales (carmn y hematoxilina). Artificiales (anilinas), que proceden de la destilacin de la hulla. b. Desde el punto de vista qumico, pueden ser: cidos (citoplasma) Bsicos (ncleo) 27

 Neutros (cuando se asocian el colorante cido y el bsico. Los ms conocidos son los eosicionatos de tiacina que suelen designarse con el nombre del autor que inventa la mezcla) Indiferentes (son insolubles en agua y solubles en alcohol. Ej. Sudn III) En bacteriologa, se usan principalmente los colorantes artificiales bsicos. Algunos colorantes se depositan sobre determinadas estructuras cuando han sido sometidas a la accin de un mordiente (fijador) que puede actuar en solitario o junto con el colorante formando lo que se denomina como laca (LACA=FIJADOR+COLORANTE). 3. TCNICAS DE TINCIN En la mayora de las ocasiones para la observacin de los microorganismos, stos son teidos ya que de esta forma son ms fciles de visualizar y se pueden poner de manifiesto caractersticas diferenciales. Las tinciones se pueden clasificar es funcin de 2 caractersticas: a. Procedimiento de coloracin: Se pueden dar: Tcnicas de Inmersin: Permite teir varias preparaciones a la vez. Se realizan introduciendo la extensin en el/los recipientes que contienen colorante. Tcnicas de Vertido: Son las ms usadas. Se efectan por decantacin libre de colorantes y reactivos distinguindose 2 tipos: Tcnica en condiciones normales. Tcnica en condiciones drsticas. Llamada Tincin de Emisin de Vapores. Se suele emplear para los BAAR (Bacilos cido alcohol resistentes). Materiales: El mismo utilizado en condiciones normales. Tcnica: La extensin debe quedar cubierta por un trozo de papel de filtro del mismo tamao que el porta que se ir impregnando de forma intermitente con el colorante usado en la tincin. La emisin de vapores se consigue calentando la parte inferior del porta con algodn impregnado en alcohol etlico sostenido del extremo de una varilla de vidrio. No se debe mantener la llama fija, pues se puede romper el porta. La extensin se somete a calentamiento hasta que se emitan vapores. En ese momento se retira la llama hasta que deje de emitirlos y se repite nuevamente el ciclo, as sucesivamente durante todo el tiempo que dure al titulacin (prctica). Observaciones: No se debe dejar secar el papel de filtro ya que si no se deteriorara la extensin. Hay que ir aadiendo peridicamente el colorante. Algunos autores no usan papel de filtro realizando la tcnica por contacto directo del colorante sobre la extensin y posterior calentamiento hasta la emisin de vapores. Se debe tener la precaucin de aadir el colorante repetidamente. Estas tinciones requieren calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana como en las micobacterias. b. Segn su aplicacin Tcnica General de Tincin 1. Extensin. Para obtener una pelcula lo ms homognea posible de muestra. Si la muestra el lquida, depositar una pequea cantidad en el extremo del porta, extenderlo con el asa de siembra hasta conseguir una capa fina y homognea.

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Si la muestra es slida, depositar una gota de suero fisiolgico o agua destilada y suspender en ella una pequea cantidad de cultivo, hasta obtener una capa fina y homognea. 2. Desecacin. Tiene como objeto eliminar el agua de la extensin para fijarla. Se deja secar a T ambiente o calentando ligeramente alrededor de la llama, jams directamente sobre ella. 3. Fijacin. Se consigue la muerte de los microorganismos por coagulacin de las protenas quedando la extensin adherida al porta, para que resista las operaciones siguientes. Tiene por objeto mantener la composicin fcoqca. del microorganismos de forma que conserve definitivamente una estructura lo ms parecida posible a la inicial. La fijacin puede realizarse por: Solucin fijadora (etanol, metanol), que se deja actuar durante varios minutos; se escurre y se deja secar. Calor, poniendo la parte inferior del porta contra la llama del mechero repitiendo la operacin. 4. Tincin. Mediante la cual el microorganismo capta el colorante. 5. Lavado. Mediante el cual eliminamos el exceso de colorante. 6. Secado. Se mejora la visualizacin del microorganismo. Hay distintos tipos: Tincin Simple Son aquellas que solo utilizan un colorante y tienen como objetivo permitir la observacin de la morfologa bacteriana. La tincin resultante puede ser uniforme o presentar algunos grnulos en su interior, lo que significa una mayor afinidad de determinados componentes de la clula por el colorante. Los mas usados son: verde malaquita, violeta de genciana Tincin diferencial o compuesta Requieren ms de un colorante y sirven para poner de manifiesto algn carcter propio de microorganismos. Las principales tinciones son: tincin de Gram y tincin ZiehlNielsen. TINCION DE GRAM Fundamento: divide a los microorganismos en gram positivas y gram negativas. Las gram positivas son aquellas que resisten la accin de colorante del disolvente alcoholacetona, tras el tratamiento con un colorante bsico y lugol, mientras que las gram negativas son decoloradas siendo posteriormente 29

teidas con un colorante de contraste como puede ser la fusina diluida o safranina, este hecho se debe a la diferente composicin de la pared celular. Es conveniente realizar la tincin de gram sobre clulas de cultivos jvenes ya que algunos microorganismos son gram positivos solo en la fase de crecimiento. Material: portaobjetos, mechero, asa de platino, pipeta, pinzas de madera, M.O. y equipos de tincin (cristalizador, barras paralelas y frascos lavaderos). Reactivos: lugol, violeta de genciana, fusina diluida o safranina, alcoholacetona, aceite de inmersin. Tcnica (ver fotocopia) RESULTADOS PASOS Colorante bsico Mordiente Decolorante Colorante contraste METODOS Violeta genciana Lugol Alcohol / acetona Suframina o fusina Positivos Negativos Violeta Violeta Violeta Violeta Violeta Se decolora Violeta Rosa

Resultados e Interpretacin: Las bacterias gram positivas son de color violeta y las gram negativas de coloracin rosa. TINCION DE ZIEHLNIELSEN Fundamento: se utiliza para diferenciar BAAR es decir, aquellos microorganismos que resisten la decoloracin con una mezcla de cido y alcohol. Algunas bacterias poseen en su pared celular ciertos lpidos que le confieren la propiedad de resistir la decoloracin con cido alcohol. Esta tincin requiere un calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana. Los microorganismos que resisten la coloracin son: micobacterias, actinomicetos y nocardia. Material: portaobjetos, asa de siembra, pipetas, pinzas de madera, mechero, M.O. y equipo de tincin. Reactivos: fusina, alcohol clorhdrico (97:3), azul de metileno, microorganismo uno BAAR y uno no BAAR y aceite de inmersin. Tcnica: (ver fotocopia). Resultados e interpretacin: Los microorganismos BAAR adquieren color rojo y los no BAAR azul. Tincin AuraminaRodamina Fundamento: Tanto la Auramina como la Rodamina son dos fluorocromos que tien microorganismos. En las micobacterias se fijan sobre los cidos micolicos de la pared diferencindolas, por lo que en la investigacin de estas bacterias es una tcnica principal. Adems se aplica un colorante de contraste no fluorescente con el fin de ejercer un papel de campo oscuro. Materiales: portaobjetos, mechero, equipo de tincin, m/f. Reactivos: Auraminarodamina. Tcnica: 1 Extender, secar y fijar. 30

2 Teir con AuraminaRodamina a temperatura ambiente (37C) durante 15 minutos. 3 Lavar con agua destilada. 4 Decolorar con alcohol clorhdrico durante 23 minutos y despus lavar con agua destilada. 5 Contrastar durante 24 minutos con colorante de contraste, ya que tiempos mayores originan perdidas de brillo. El contraste reduce la posibilidad de artefactos. 6 Lavar, secar y observar al m/f con objetivo de 40x. Resultado e interpretacin: En los microorganismos se vern puntos amarillosverdosos brillantes. Observaciones al mtodo: Es una tincin equivalente a la de los B.A.A.R. No obstante debe utilizarse una tincin B.A.A.R de ZiehlNielsen para confirmar su prueba. Este mtodo tiene la ventaja sobre el anterior de que no es necesario el calentamiento de la preparacin. Tincin cido resistente de Kinyoun Fundamento: la observacin de presencia o ausencia de B.A.A.R. Tcnica: 1 Extensin. 2 Fijacin en llama(preferiblemente). 3 Cubrir la muestra con solucin de Kinyoun durante 3 minutos. 4 Lavar con aguas corriente durante 30 segundos. 5 Cubrir con solucin de Gabett durante 1 minuto. 6 Lavar con agua corriente y secar. 7 Observar al m/o con objetivo de inmersin. Tinciones estructurales Nos permiten ver distintas estructuras: flagelos, esporas, cpsula, corpsculos metacromticos, etc. Flagelos: Mtodo de Rodees. Mtodo de Triboadeau. Mtodo de Leifson. Esporas: Mtodo de Moeller. 31

 Mtodo de WirlzConklin. Cpsula: Mtodo de Hiss. Mtodo de la tinta china. Corpsculos metacromticos: Mtodo de Albert. Mtodo de Loeffer. Tincin de WirlzConklin Tcnica: 1 Extensin. 2 Desecacin. 3 Fijacin. 4 Teir con verde malaquita a emisin de vapores durante 10 minutos. 5 Lavar con agua destilada arrastrando el papel de filtro (opcional). 6 Teir con fusina diluida durante 3 minutos. 7 Lavar, secar y observar al m/o con el objetivo de inmersin. Resultados e interpretacin: las esporas se observan de color verde, mientras que la forma vegetativa se observa de color rojo. TEMA 6. MEDIOS DE CULTIVO I 1. INTRODUCCIN Para estudiar las reacciones metablicas y fisiolgicas de las bacterias es necesario cultivarlas en un medio de cultivo que es una mezcla de sustancias que proporcionan en forma asimilable todos los elementos necesarios para su crecimiento y multiplicacin. El desarrollo de las bacterias en un medio de cultivo depende de una serie de factores: 1. Composicin: los medios de cultivo deben incluir los elementos imprescindibles para la vida bacteriana: Fuente de N y C. Elementos minerales como: S, P, Mg, Ca, Fe, etc. Factores de crecimiento que por si solas no son capaces de sintetizar(aa, vitaminas, etc.). Factores estimulantes o de arranque. Ej: sangre. 2. pH: suele estar alrededor de la neutralidad, aunque hay algunos microorganismos que tienen un pH especfico diferente. Ej: bacterias acidofilas. 32

3. Presin osmtica: los medios se preparan en condiciones de isotonia. 4. Potencial Redox: esta en relacin con el tipo respiratorio de cada bacteria, que puede ser: aerobios estrictos u obligados. anaerobios estrictos u obligados. facultativos. microaerfilos. anaerobios aerotolerantes. 5. Hidratacin: el agua es imprescindible para el crecimiento bacteriano por lo que estar en cantidad suficiente en los medios de cultivo. 6. Temperatura: se incuba a la temperatura de inters mdico (3537C). 7. Atmsfera: algunas bacterias, especialmente algunas aerobias y facultativas necesitan la presencia de ciertos ambientes gaseosos. El ms usado es el CO2 en proporciones entre 310%. 2. CLASIFICACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Los medios de cultivo se pueden clasificar: 1. Segn el fin al que estn destinados: Medios generales: en los cuales se desarrollan una amplia variedad de microorganismos sin condiciones nutritivas especiales. Ej: agar nutritivo o caldo nutritivo. Medios selectivos o inhibidores: inhiben por completo el crecimiento de bacterias distintas de las que se quieren aislar y que existen en la muestra. La selectividad del medio se consigue con la adiccin de sustancias como sales biliares( inhiben las formas cocaceas gram +) o la zida sdica( slo permite el crecimiento de las gram+). Los antibiticos son otras sustancias que transforman los medios de cultivo en selectivos. Medios de enriquecimiento: favorecen el crecimiento de algn tipo de bacteria que se encuentra minoritariamente en una mezcla de varias bacterias. Ej: caldo de selenito y tetrationato que se usan para en aumento de Salmonellas que existen en el contenido intestinal. Medios de diferenciacin: se usan para poner de manifiesto a las bacterias que dan positiva alguna prueba bioqumica y que estn presentes en la mezcla. Ej: bacterias glucosa + o glucosa Medios de identificacin: son aquellos que se utilizan para estudiar la accin de un solo tipo de bacterias frente a un determinado sustrato. Se diferencian del anterior en que se siembran con bacterias pertenecientes a un slo clon. Se utiliza para la identificacin de bacterias. Medios de multiplicacin: son aquellos que poseen una composicin determinada y ptima que permiten el mximo aumento celular bacteriano en el mnimo tiempo. Son muy usados en la preparacin de vacunas y Acs. Medios de conservacin: son aquellos cuya composicin favorece el mantenimiento de los microorganismos que en l se siembran y que posteriormente se incuban entre 24 C. Algunos medios de conservacin incluyen glicerol y se guardan en el congelador(20C), estos medios han sido desplazados por la liofilizacin. 33

Existe una variacin de los medios de conservacin que son los medios de transporte cuya finalidad es mantener el estado viable aunque sin reproduccin(mnimamente) de los microorganismos presentes en la muestra, permitiendo con posterioridad recuperar incluso a los que estn minoritariamente presentes. Los ms utilizados son: de Stuart, Amies, CaryBlair. 2. Segn su consistencia. Medios Lquidos: Tambin llamados caldos. No llevan ninguna sustancia gelificante, se usa principalmente para enriquecimiento o identificacin. Su recipiente puede ser un frasco, una botella o un tubo. Medios semislidos: Contienen una proporcin menor del 5% de agente gelificante. Medios slidos: Se denominan agares. Contienen agentes gelificantes en proporciones considerables. Los medios slidos se pueden dividir en: Inicialmente lquidos: segn su reversibilidad de estado hay 2 tipos: Reversibles: despus de solidificar pueden volver a licuar. Tienen fcil conservacin. Los agentes gelificantes incorporados son agar, suero, etc. Irreversibles: no se pueden volver a licuar. Como sustancias solidificantes contienen huevo, suero, etc. Inicialmente slidos: en funcin de la naturaleza qumica del agente solidificante se distinguen 2 tipos: Orgnicos: como tubrculos. Inorgnicos: como silicatos. Los medios slidos pueden estar contenidos en frascos, botellas o tubos, pudiendo aparecer stos: en horizontal: usado en siembra de picadura inclinado: se emplean en identificacin, obtencin de masa de microorganismos y almacenamiento (colonias). Una variante es el pico de flauta. Tambin los medios slidos suelen estar contenidos en placas, siendo las ms utilizadas las placas de Petri. 3. Segn su consistencia. Medios naturales o empricos: Estn constituidos por componentes de origen animal o vegetal como huevos, leche, patatas, etc. Actualmente est en desuso. Medios sintticos: Son una solucin de medios puros qumicamente disueltos en agua destilada. Poseen composicin constante. Se utilizan para el crecimiento y metabolismo bacteriano. Medios semisintticos: Contienen sustancias qumicas de naturaleza y proporciones conocidas junto a productos de origen natural. Son los medios ms utilizados actualmente. 3. PREPARACIN DEL MEDIO DE CULTIVO FUNDAMENTO: La manipulacin adecuada de determinados agentes nutritivos permite obtener una fuente de alimentacin y ambiente adecuado para que puedan crecer y desarrollarse los 34

microorganismos en las condiciones idneas. REACTIVOS: Ingredientes del medio de cultivo, NaOH (1%) y HCl (1%). MATERIALES: Vaso de precipitados de 250/500 cc., erlenmeyer de 250/500 cc., placa petri, pipetas de 10 y 25 ml, papel indicador de pH, tubos de cultivo, autoclave, algodn graso, papel de aluminio y balanza. TCNICA: Eleccin de los ingredientes: Slo cuando se elabora un medio de cultivo a partir de los elementos que los componen. Este paso es poco frecuente debido a la comercializacin de los medios. Pesada de cada uno de los ingredientes. Hidratacin: El agua usada en la reconstitucin debe ser destilada o desionizada y calentada a 5060C. Se coloca en un vaso de precipitado la mitad del agua a la que se le aaden los ingredientes o el medio de cultivo homogenizando con una varilla agitadora y manteniendo la exposicin al calor. Los medios lquidos no necesitan llevar a ebullicin en su preparacin, mientras que los medios slidos deben llevarse a ebullicin pues necesitan una T de 98100C para disolverse. En la preparacin del medio slido se recomienda que antes de iniciar el calentamiento se deje reposar el agua precalentada durante 510 minutos para provocar un esponjamiento del agente gelificante que facilitar la disolucin. Ajuste de pH: Se hace imprescindible cuando se parte de ingredientes por separado. Se mide el pH y si este no es el adecuado se ajusta con las disoluciones de NaOH y HCl. Distribucin: Para la esterilizacin se distribuir el medio de cultivo en recipientes que permitan un buen proceso de esterilizacin y procurar que los recipientes sean los definitivos para llevar a cabo el cultivo. Se plantean dos posibilidades: Medios en tubo: con una pipeta de boca ancha o un dosificador se depositan en cada tubo la cantidad de medio de cultivo correspondiente a 1020 cc., segn la capacidad del tubo. Se tapa con una torunda de algodn graso que se cubre a su vez con papel de aluminio y se lleva a esterilizar. Tambin se puede utilizar tubos con tapn de rosca. Con ello se consigue esterilizar recipiente y medio de cultivo por lo que ste estar dispuesto para ser sembrado y almacenado hasta su uso, ya que los tubos constituyen el recipiente definitivo. Medios en placa: Se vierte el medio en un erlenmeyer no debe ocupar ms de 2/3 de la capacidad total pues la ebullicin en el autoclave hara que el medio rebasase. Antes de esterilizar se tapa con algodn graso y aluminio. Esterilizacin: Se realiza a 121C durante 15 minutos. Para volmenes mayores de 250cc. se aumenta el tiempo. Vertido en placa: Tras la esterilizacin se homogeniza moviendo en sentido rotatorio. El vertido en placa se debe realizar cuando la T sea prxima a la gelificacin 4555C (puede mantener la mano sobre el recipiente).Con ello se evita la excesiva formacin de agua de condensacin en la tapa de las placas. Para el llenado se usan pipetas estriles de boca ancha o un dosificador estril, siendo este ms adecuado para evitar la obstruccin del agar. Las placas estriles por lo que la tcnica de vertido debe realizarse en condiciones de esterilidad. El volumen de muestra que debe depositarse en la placa ser segn el espesor de la capa deseada y las dimensiones de la misma ( de 2.53 mm, un poco ms de la mitad de la placa). Enfriamiento: Medios lquidos: Tal como se extraen del autoclave se dejan enfriar. Medios slidos: Depender de donde se encuentre el medio, as Tubos: enfriar a T ambiente en posicin vertical (para conseguir agar horizontal) u oblicuo (para conseguir agar inclinado). Placas: tras el vertido debe asegurarse que no existen burbujas ejerciendo movimientos rotatorios 35

(las burbujas se quitan con el asa esterilizada). OBSERVACIONES AL MTODO: Si no se dispone de autoclave se pueden esterilizar los medios en bao mara hirviente o en olla a presin durante 30 min. repitiendo la operacin durante 3 das consecutivos. Los ingredientes o medios deshidratados se protegern de la humedad, la luz y el calor. Los recipientes deben ser de plstico o vidrio opaco y cierre hermtico. No deben abrirse en ambientes hmedos y deben desecharse cuando se apelmacen. Se controlar peridicamente su fecha de caducidad. Los medios hidratados y esterilizados tienen un tiempo limitado de conservacin, en general pueden conservarse 46 semanas en condiciones adecuadas. El problema ms frecuente es la deshidratacin, se tendr en cuenta las siguientes recomendaciones: almacenar en nevera a 4C, tambin a Tamb. aunque su duracin es ms limitada. no deben guardarse a T menor de 0C (T de congelacin) pues altera la estructura del gel. protegerlos de la luz, para ello envolver el recipiente en papel de aluminio los tubos con cierre hermtico son ms recomendables que las torundas de algodn los medios para verter en placa se conservan mejor en el frasco original aunque pueden quedarse en ellos teniendo en cuenta: se deben refrigerar inmediatamente despus de su solidificacin se protegern frente a desecacin precintando con cinta adhesiva su borde lateral o envolviendo varias en bolsa de plstico se recomienda mantener en posicin invertida para evitar que se caiga sobre el medio el agua de condensacin Los medios conservados en refrigerador deben ser atemperados antes de su empleo con estufas de cultivo o a T ambiente. No utilizar nunca medios con excesiva deshidratacin, la cual se manifiesta: en medios lquidos, por aumento de concentracin o disminucin de volumen en medios slidos, por disminucin de espesor, agrietamiento, retraccin, cambio de color, etc. Algunos medios son conservados en estado slido en el recipiente original y luego son refundidos para su distribucin. Las precauciones a tener en cuenta son: no deben realizarse con medios cidos, ya que se alteran sus caractersticas (el agar se hidroliza al calentarse en medios cidos) si se mantienen fundidos periodos de tiempo mayores de 60 minutos, la calidad del medio disminuye considerablemente es aconsejable refundir al bao mara o autoclave durante 30 minutos, nunca aplicar calor directamente 4. ELIMINACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Cualquier medio de cultivo sobre todo si ha sido sembrado, es un posible foco de contaminacin debiendo eliminarlo tras su utilizacin. Los medios de cultivo se pueden descontaminar: 1. Inundacin en solucin desinfectante: Se cubre la superficie con esta solucin y se deja unas 12 horas. Se utiliza cuando no hay autoclave. 36

2. Esterilizacin en autoclave 3. Incineracin: se utiliza para microorganismos muy patgenos. Solo despus de la descontaminacin del medio de cultivo se proceder a la limpieza de sus recipientes (cuando stos son recuperables). 5. CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO El 4% de los medios de cultivo de los lotes se controlan en estufas durante 57 das a una temperatura de 37C, durante este tiempo debe verificarse el color del medio preparado as como la gelificacin, los precipitados atpicos, etc. en el caso de advertir variaciones atpicas se desechan los lotes. Con los medios de cultivo se deben establecer tres tipos de controles antes de considerarlos aptos: 1. Control de esterilidad (explicado anteriormente). 2. Control de calidad, se realiza para comprobar que el medio contiene aquellos componentes que le caracterizan. Para su comprobacin se utilizan por lo menos dos grmenes distintos: uno que crece en ese medio o da + una determinada prueba. Otro que no crece en ese medio o da la prueba. 3. Control de caducidad, para ponerlo en prctica es necesario que en el momento de emplaque se rotule en un lugar de la placa adems del medio, la fecha de preparacin. TEMA 7. CULTIVO DE BACTERIAS II (SIEMBRA) 1. Introduccin Dado que la manipulacin de muestras en microbiologa entraa riesgos, recordamos las siguientes instrucciones: Todo material debe ser estril. La manipulacin en radio de 1015 cm. (zona asptica) alrededor de campana o zona de flujo. Se procurar disponer de todo el material al alcance de la mano para evitar desplazamientos. Es necesario adquirir rapidez y automatismo indispensable para una buena ejecucin de las tcnicas. 2. Manipulacin del material Asa de hilo, platino o micro: 1 Esterilizar antes y despus de su uso, para lo cual se coloca perpendicular a la llama hasta que alcance el rojo vivo en toda su longitud. Para evitar salpicaduras el instrumento se introduce gradualmente en la llama. 2 Cuando se quiere meter en recipiente de boca estrecha se debe flamear la parte del mango que quede dentro del recipiente durante su manipulacin. 3 Tras la esterilizacin se enfriar unos segundos en la fuente asptica, pues si contacta con la zona del microorganismo (colonia, medio lquido, etc.)esterilizaremos la muestra recogida. Pipetas: Con pipetas de seguridad (tienen filtro de algodn en su boquilla) o con prepipetas se 37

flamear previamente la punta y en toda su longitud que contacte con el recipiente de la muestra. La pipeta se manejara con la punta dirigida hacia abajo, mantenindola vertical u oblicua pero nunca horizontal. Recipientes de vidrio: Siempre que contenga algn producto en su interior (m.c.) deben estar tapados con torundas de algodn as: No se abrirn en posicin vertical. Su apertura se realizara oblicuamente dirigiendo su apertura sobre la llama. El algodn se coge con el dedo meique de la mano opuesta, evitando el contacto mientras se manipula el contenido del medio. La boca se flameara al abrir y al cerrar, la cual se expone en la llama unos segundos con movimientos rotativos. Placas de Petri: Se manipularan semiabiertas con la abertura orientada a la llama del mechero. 3. MANUPILACION DE MUESTRAS 1) Medio lquido: Con asa de platino o Nicron: destapar el tubo flamear la boca del tubo introducir el asa estril y sumerguirlo extraer el asa La muestra queda formando una pelcula circular en la luz del asa, solo se puede conocer el volumen de la muestra utilizando asas calibradas. Con pipeta estril: se debe tener la precaucin de mantener limpia la parte exterior de la pipeta por lo que se dejara gotear l liquido adherido a las paredes sobre el recipiente antes de taparlo. 2) Medios slidos: destapar el tubo o flamear el tubo contactar suavemente el asa o el hilo estril con alguna colonia visible flamear la boca del tubo o cerrar la placa 4. PREPARACION DEL INOCULO ESTANDARIZADO (prctica) Cuando las muestras son muy viscosas o concentradas y para tcnicas en las que se pretende el aislamiento del germen o la realizacin de un anlisis cuantitativo, es necesario preparar l inoculo de siembra para obtener resultados fiables. Tcnica general de preparacin de inoculos: Se obtiene a partir de un cultivo joven (fase exponencial de crecimiento) y puro o de un producto patolgico. Se toma con un asa estril colonias de un cultivo o una porcin de una muestra biolgica y se diluye en 5 cm cbicos de una solucin diluyente, la cual se homogeneiza. Como diluyente podemos utilizar caldo nutritivo, solucin salina o agua destilada estril. Tcnica de KYRBY BAUER: Utiliza escalas con gradiente de turbidez, cada tubo de la escala va numerada y sirve de referencia segn el n de microorganismos que se quieran. l inoculo se puede ajustar al patrn de referencia 38

mediante: comparacin visual aproximada (turbidez) espectrofotometra Una escala universalmente aceptada es la escala de Mc FARLAN, constituida por una serie de tubos en los que se origina un precipitado blanco de BaSO4 por accin de H2SO4 con BaCl2. Cada tubo se lee en el espectrofotmetro y se obtiene una absorbancia de cada uno. Se representa Absorbancia frente a concentracin y se obtiene una recta en la que se interpolan las absorbancias de las muestras problema pudiendo conocer la concentracin de stas, as se estandariza la muestra problema. 5. SIEMBRAS Existen diferentes tcnicas y stas se clasifican segn el modo de efectuarse: 1. Por inoculacin. Se puede llevar a cabo en medio liquido o medio slido. Medio liquido: Con asa: sumergir el asa cargada y agitar. Con pipeta: verter el contenido de la pipeta sobre el m.c. y se homogeneiza. Con escobillon: se realiza de igual modo que con el asa de siembra. Medio slido: En placa : Hay dos tcnicas: tcnica de Barry y la tcnica de Kirby Bauer. Tcnica de Barry: Es una inoculacin previa al vertido en placa, se siguen los siguientes pasos: 1) se toma 0,1 cm cubico de inoculo y se aaden a 25 cm cbicos de m.c. fundido (4050). 2) homogeneizar. 3) verter en la placa de petri. Una modificacin de esta tcnica consiste en verter l inoculo directamente en la placa y seguidamente se agrega en m.c. y dando movimientos de rotacin para as mezclar. Esta tcnica se utiliza para el recuento de viables y antibiogramas. Tcnica de Kyrby Bauer: Es la inoculacin sobre la superficie del medio solidificado, se siguen los siguientes pasos: 1) preparado l inoculo en tubo estril se introduce un escobillon tambin estril hasta quedar impregnado. 2) se elimina el exceso de inoculo presionando el escobillon con movimientos de rotacin contra las paredes del tubo. 3) se siembra la placa empleando la tcnica de los tres giros, pasando el escobillon por toda la placa 2 o 3 veces antes de efectuar cada giro, para distribuir uniformemente l inoculo. 4) se deja secar la placa 34 min. En posicin semi abierta e invertida quedando lista para utilizar.

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Esta tcnica se emplea para el estudio de sensibilidad o inoculacin directa de productos patolgicos. En tubo: Existen dos tcnicas: siembra en estras y siembra en picadura. Siembra en estras: En superficie inclinada, se siguen los siguientes pasos: 1) se toma la muestra con el asa. 2) se introduce en el tubo que contiene el medio. 3) desde el fondo de la superficie y en progresin ascendente, deslizar el asa con movimientos de zigzag. Esta tcnica se utiliza para obtener colonias, renovar cepas (resembrar) y pruebas biolgicas. Siembra en picadura: Se siguen los siguientes pasos: 1) se toma la muestra con la punta del hilo. 2) se punciona en el centro del m.c. introduciendo la punta del hilo hasta 23 mm del fondo del tubo. 3) se extrae el hilo por la misma lnea que se introdujo. 4) si se trata del medio inclinado (pico de flauta) se puede realizar una siembra en estras con el mismo hilo por la superficie del medio. Esta tcnica se emplea para pruebas de identificacin, movilidad, pruebas bioqumicas, hidrlisis de principios inmediatos etc. 2. Por aislamiento Se realizan en placa y hay dos tipos: Por dilucin: 1 Disponer de tres tubos fundidos a 3050 C previamente marcados con los nmeros 1, 2 y 3. 2 Tomar con el asa estril la muestra y sembrar en el tubo 1. 3 Homogeneizar el tubo 1 por dilacin (entre las palmas de las manos) y tomar un asa del mismo tubo, resembrando al tubo 2 dejando el tubo 1 al bao mara a 45C. 4 Homogeneizar el tubo 2, tomar una muestra y pasarla el nmero 3 dejando el tubo 2 en el bao mara a 45C. 5 verter el contenido de cada uno de los tubos homogeneizados de nuevo en tres placas marcadas con los nmeros 1, 2 y 3, esperar que solidifique el medio. 6 En la placa nmero 3 se obtendrn colonias aisladas. Por agotamiento: Hay cuatro modos: Siembra en estras o zigzag 1 Se deposita el inoculo en el extremo superior de la polaca.

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2 Se siembra con el asa a partir del inoculo con un movimiento de zigzag cada vez ms amplio (en la lnea media de la placa alcanza su mxima amplitud), para ello el asa debe contactar suavemente con la superficie del medio (no se debe presionar demasiado pues se agrietara). 3 La siembra se efectuar hasta la zona distal del comienzo, donde se obtendrn colonias aisladas. Siembra en estras mltiples 1 Se deposita el inoculo en el extremo de la placa. 2 Con el asa se reparten en varios tramos siguiendo el borde de la placa. Entre cada tramo se debe flamear el asa. 3 Los segmentos seguidos definen un poliedro regular. El ltimo tramo se efectuar hacia el interior, donde se obtendrn las colonias aisladas. Siembra en los cuatro cuadrantes 1 Se divide la placa en cuatro cuadrantes (se puede rotular con rotulador de vidrio en la parte superior). 2 Se deposita el inoculo en la parte superior de uno de los cuadrantes y se siembra por estras. 3 Sin flamear el asa se repite la operacin en los tres cuadrantes, en cada uno de ellos se siembra el inoculo adherido al cuadrante anterior. Tenemos colonias aisladas en el cuarto cuadrante. Siembra en tres giros 1 Se siembra en estra la mitad de la placa. 2 Flamear el asa. 3 Se gira la placa 90, sembrando en estra la mitad superior de la misma. 4 Se repiten los pasos 2 y 3. 5 Las colonias aisladas aparecen en la zona sembrada en ltimo lugar. 6. ESTUDIO MORFOLGICO DE LAS COLONIAS El estudio morfolgico se hace tanto macro como microscpicamente. 1. Estudio macroscpico Cuando una bacteria se cultiva en medio slido se desarrolla una colonia. La morfologa de dicha colonia y su entorno en relacin con el medio donde se desarrolla es un dato orientativo y puede servir para identificar al microorganismo. El aspecto de la colonia puede recordar algn objeto denominndose de la misma forma. Hay que tener en cuenta que una bacteria puede dar colonias distintas en funcin del medio (ejemplo: salmonella en agar makonki da colonias distintas que en agar SS). El estudio de la morfologa de colonias es solo orientativo, puesto que en determinados medios especies distintas pueden dar colonias similares.

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Las colonias aisladas en placa se pueden clasificar atendiendo a: Forma: puntiforme, circular, filamentosa, ameboide, rizoide y fusiforme. Elevacin: plana, convexa y umbonada. Borde: entero, ondulado, lobulado, crenado, filamentoso y enrollado. Superficie: lisa, rugosa, brillante y mete. Color: relacionado con el medio de cultivo y el metabolismo del microorganismo. Consistencia: para determinarla es necesario tocar la colonia con el asa (mantecosa, grumosa) Las colonias aisladas en agar inclinado pueden ser: filiformes, equinuladas, perladas, difusas, arborescentes y rizoides. Entorno colonial: Las modificaciones del entorno colonial ms significativas son las hemlisis producidas en agar sangre (presencia de una zona de eritrocitos lisados alrededor de una colonia). Es un dato que resulta til en la identificacin inicial de ciertas bacterias, sobre todo Estreptococos. Pueden existir tres tipos de hemlisis: Hemlisis : La colonia est rodeada de una zona de eritrocitos parcialmente lisados frecuentemente acompaada de color marrnverdoso o pardusco. Hemlisis : Las colonias estn rodeadas de una zona clara del color del medio base lo que indica lisis completa de eritrocitos. Hemlisis : no se observa hemlisis aparente. Olor: Es otra caracterstica que facilita la identificacin del entorno colonial (aunque son muy subjetivos) BACTERIAS MEDIOS DE CULTIVO OLOR Pseudomonas MK Jabn E.Coli MK Levadura de cerveza o pan Proteus MK Ftido Salmonella Agar SS Semen 2. Estudio Microscpico Est relacionado con el tamao, forma y agrupacin de las bacterias (visto en tema 2) TEMA 8. RECUENTO DE MICROORGANISMOS 1. Introduccin El recuento de microorganismos es la determinacin del nmero de microorganismos presentes en una muestra. Frecuentemente es conveniente su determinacin pero adems de la dificultad que presentan los resultados no permiten excesiva fiabilidad. 2. Clasificacin de las tcnicas 1. METODOS INDIRECTOS: Son aquellos en los que no se encuentran el nmero de microorganismo sino que se calcula a partir de otros parmetros. Los dividiremos en 3 grupos: a. Determinacin analtica de molculas: pertenecientes al microorganismo. Por ejemplo: protenas, ADN b. Mtodos Gravimtricos: basados en la determinacin del peso seco. c. Mtodos Turbidimtricos: son los ms utilizados.

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2. METODOS DIRECTOS: En ellos a cada uno se considera una unidad. Hay 3 tipos: a. Mtodos directos totales: determinacin del nmero de microorganismos vivos y muertos. Son mtodos microscpicos y entre ellos destacamos: mtodo de Breed o recuento de extensiones teidas, mtodo de Wright mtodo de recuento en cmara. b. Directos culturales: contabilizan nicamente los microorganismos vivos, el mas utilizado: recuento de viables en placa. c. Semidirectos totales: por medio de contadores electrnicos de partculas. Los ms rpidos son los turbidimtricos y semidirectos. Su inconveniente es que requiere un aparataje sofisticado y no distingue entre microorganismos vivos y muertos. 3. RECUENTO EN CAMARA (apuntes Isabel Lpez, 1 lab.) 4. MTODO DE EXTENSIONES TEIDAS Fundamento: Se basa en contar los microorganismos de un volumen determinado de suspensin de los mismos tras la extensin y tincin de sta. El mtodo a desarrollar es el de Breed. Material: Portas, mechero, pipeta de 10 l, equipo de tincin, estufa y microscopio. Reactivos: Azul de metileno y suspensin de microorganismos. Tcnica: Marcar un porta un cuadrado de 1cm de lado con ayuda de papel milimetrado. Invertir el porta y depositar en el cuadrado 10 l de la suspensin. Dejar secar al aire o en estufa. Fijar a la llama. Teir con azul de metileno 3 minutos. Lavar, secar y observar con objetivo de inmersin. Contar los microorganismos existentes en 25 campos distintos situados en la diagonal. Resultados e Interpretacin: Para el clculo del microorganismo se tiene en cuenta: A= rea del cuadrado marcado (100mm2) C= Volumen de suspensin utilizada (10 l) R= Radio del campo del microscopio (mm) S= Superficie del campo del microscopio (r2) V= Volumen de suspensin del microorganismo contada en 25 campos (l) N= Nmero total de microorganismos contados en 25 campos A __________ C S.25 ________ V ! V = CS25/A = 10 r2 25 / 100 = 2.5 r2 43

V ___________ N S.25 ________ X ! X= N / V = n microorganismos / l Observaciones al mtodo: La suspensin de microorganismos debe ser homognea por todo el cuadrado, si no se desecha la preparacin. En lugar de azul de metileno se puede utilizar cualquier colorante de la tincin simple (nigrosina, sudan IV, etc.) 5. Recuento de viables en placa Fundamento: basado en que un microorganismo da lugar en un medio de cultivo a una colonia visible, por tanto el nmero de colonias contadas ser igual al nmero de microorganismos existentes inicialmente. Material: pipeta de 1 ml, tubo de ensayo y placa de petri. Reactivos: solucin salina estril, medio de cultivo para el microorganismo y suspensin del microorganismo. Tcnica: 1. Tomar 1ml de la solucin problema, homogeneizarla y aadirlo a 9 ml de solucin salina estril (suspensin 1/10). 2. Homogeneizar. 3.Tomar 1ml y pasarlo a otro tubo con 9ml de solucin salina estril (suspensin 1/100). 4. Repetir la operacin. 5. De cada dilucin se siembran un mnimo de tres placas estriles. Depositar en cada una 1ml del inculo correspondiente y agregar 10ml de medio de cultivo, imprimiendo un movimiento de rotacin con el fin de homogeneizar la muestra. 6. Dejar solidificar e incubar a una temperatura adecuada segn el tipo de microorganismo. 7. Contar las placas cuyo nmero de colonias este entre 30300. Resultado e interpretacin: En primer lugar se calcula la media aritmtica de las colonias contadas en las placas seleccionadas, esta se multiplica por la inversa de la dilucin a la que se ha efectuado el recuento, con lo que se obtendr el nmero de microorganismos viables por ml de muestra. Observaciones al mtodo: El error ms habitual radica en que una colonia se forma a partir de ms de un microorganismo. No obstante tiene ventajas frente a los anteriores, no cuentan los microorganismos muertos o partculas contaminantes indistinguibles de los microorganismos en los recuentos microscpicos. Si se dispone de material suficiente se preparan 10 placas, de este modo los resultados estadsticos son ms representativos. Hay que homogeneizar la muestra perfectamente. El medio y las condiciones de cultivo deben ser las idneas para el microorganismo estudiado. Una alternativa empleada para el recuento de viables consiste en utilizar un asa calibrada con la que se siembra en placa.

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TEMA 9. DESINFECCIN Y ESTERILIZACIN 1. Conceptos bsicos Asepsia: ausencia de microorganismos conseguida por mtodos fsicos. Antisepsia: ausencia de microorganismos conseguida por mtodos qumicos. Desinfeccin: tcnica de saneamiento encaminada a eliminar elementos patgenos. Esterilizacin: tcnica de saneamiento encaminada a eliminar cualquier forma de vida patgena, no patgena o formas de resistencia como esporas. Desinfectante: sustancia antimicrobiana que no puede aplicarse sobre superficies vivas. Bactericida: sustancia que destruye a las bacterias. Bacteriosttico: sustancia que impide el crecimiento y multiplicacin de las bacterias. Desinfectante Se utiliza para destruir las formas de vida patgenas, el ideal es el que ms se aproxime al concepto de esterilizacin, pero estn muy lejos de conseguirlo. Segn el microorganismo sobre el que acte se denomina: Bactericida, si destruye bacterias. Viricida, si destruye virus. Funguicida, si destruye hongos. Normalmente los desinfectantes son bactericidas y los antispticos son bacteriostticos. Hay que tener en cuenta que muchos desinfectantes cuando se utilizan de forma errnea pueden estimular el desarrollo de los organismos al seleccionarse las cepas ms resistentes que son las ms virulentas. Esterilizacin Un objeto puede estar desinfectado pero no esterilizado, mientras que el objeto esterilizado esta desinfectado tambin. Experimentalmente se comprueba que la esterilizacin no destruye el 100% de los microorganismos. Slo se conseguir la asepsia con temperaturas y tiempos muy elevados (que son inoperantes). Para que el mtodo de esterilizacin sea til debe destruir el 99,99% de los microorganismos. Antes de desinfectar o esterilizar hay que limpiar bien el material de restos de materia orgnica ya que estos dificultan dicho proceso. Vamos a aclarar dos conceptos: Material estril: Es aquel objeto que tras ser esterilizado sigue manteniendo esta propiedad en el tiempo a la hora de ser utilizado, pues se le han aplicado medidas para ser estril. Material esterilizado: Ha sido esterilizado y en el momento de usarlo ya no se conserva la esterilidad, ya que no se le han aplicado las medidas para conservarlo. 2. MTODOS DE DESINFECCIN Y ESTERILIZACIN

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1. MTODOS FSICOS a. Mtodos Trmicos Factores que influyen en la muerte de microorganismos por calor 1. Nmero de microorganismos: Al aumentar en nmero de microorganismos aumentar la intensidad del tratamiento aumentando la temperatura o el tiempo. 2. Naturaleza del microorganismo: Las formas vegetativas son ms sensibles que las esporas. 3. Temperatura: Al aumentar la temperatura hasta cierto lmite aumenta la efectividad y rapidez. 4. Tiempo de actuacin: Generalmente el tiempo de actuacin se relaciona con la temperatura, jugando con ambos. Si se aumenta la temperatura disminuye el tiempo y si disminuye el tiempo se aumenta la temperatura, es decir, con frecuencia estas dos variables se comportan de forma inversa. 5. Tiempo de duracin: Hay que tener en cuenta la suma de: Tiempo de penetracin: Tiempo necesario para que el material adquiera la temperatura de esterilizacin. Tiempo de calefaccin: Tiempo requerido para que dicha temperatura destruya la poblacin microbiana. Tiempo de seguridad: Se asigna de forma arbritaria. Los sistemas enzimticos de las bacterias tienen una temperatura ptima para actuar, pero por encima y por debajo de dicha temperatura tambin siguen viviendo, son las temperaturas mximas y mnimas. Por ejemplo en E.Coli el intervalo de temperatura oscila entre 847C y en N.Gonorreae 3040C. Segn esto, los intervalos de temperatura pueden ser grandes o pequeos en funcin de los microorganismos. Se pueden distinguir: Bacterias psicrfilas: Intervalo de temperatura oscila entre 030C. Ejemplo: Pseudomonas. Bacterias mesfilas: Intervalo de temperatura oscila entre 2045C. Son las ms numerosas y patgenas. Incluyen: 2024C: grmenes saprofitos y parsitos de plantas superiores. 3545C: grmenes saprofitos y parsitos del hombre y animales superiores. Bacterias termfilas: Temperatura ptima est por encima de los 45C. Habitan en suelo y aguas termales. El fro no mata a los microorganismos sino q impide su reproduccin. Se dan 2 tipos de mtodos trmicos: CALOR HUMEDO: Puede ser a travs de H20 o vapor. H2O Ebullicin: en el lab. Se utiliza poco no es muy fiable en el sentido estricto, no es un 46

mtodo de esterilidad ya que no destruye a las esporas. Consiste en introducir el material en H2O hmeda durante unos 10 minutos. Pasteurizacin: no mata las formas de resistencia, es muy til en tecnologa de alimentos. Ej: leche. Podemos distinguir 2 tipos de pasteurizacin: pasteurizacin alta: se consigue con T de 7275 durante 15 minutos. Pasteurizacin baja: se consigue con T de 63 durante 30 minutos. Tindalizacion: es un mtodo de esterilizaciones sucesivas, se utiliza en microbiologa cuando existen problemas de contaminacin en el autoclave. Consiste en esterilizaciones repetidas a lo largo de 3 o 4 das. Tericamente no se deben alcanzar T superiores a 100 y durante este intervalo no se debe abrir el aparato que se somete a la tindalizacion. El objetivo es destruir esporas cuando germinan, as como evitar contaminacin con microorganismos resistentes. La tindalizacion se lleva a cabo a 65 durante 30 minutos cada da, durante 4 das. El resto del tiempo se mantiene a 3035. Uperizacion: es muy til en industrias alimentarias, se realiza a una T aproximada de 150 durante 15 segundos. No se alteran las propiedades organolecticas (son atributos, aquellas que podemos apreciar a travs de los sentidos, ej: color, olor, sabor) y se produce esterilizacin. VAPOR A chorro: se alcanzan T de hasta 100, es un mtodo poco utilizado en microbiologia. Autoclave: es un recipiente cilndrico que se cierra hermticamente. Externamente lleva un manmetro, un reloj de T y otro para el tiempo. En el interior tiene un cestillo donde se introduce el material a esterilizar. La esterilizacin se puede conseguir a 1 atm. 20 minutos a 120 . No abrir hasta que la presin no este en cero. CALOR SECO: Flameado: poner algo a la llama. Incinerado: se lleva a cabo en crematorios. Horno pasteur o poupinel: la esterilizacin se consigue a 180 2 h. o 160 en 3h y media. La esterilizacin se lleva a cabo: se preparan los instrumentos a esterilizar que debern estar debidamente protegido. Se introduce en la estufa, se conecta y se selecciona la T en el termostato y el tiempo en el reloj (si lo hubiera). Comenzara a contabilizar cuando alcance la T deseada, transcurrido el tiempo se desconecta el interruptor y dejamos que baje la T, los materiales que se pueden esterilizar por este mtodo son: porcelana, vidrios y no para m.c. , plstico. b. Radiaciones Ionizantes: son fundamentalmente R. alfa y R. gamma. Destruyen las bacterias al actuar los ac. Nucleicos y enzimas. Presentan un poder de penetracin alto. No ionizantes: son R. UV no son muy tiles porque son poco penetrantes, solo aseptizan la superficie. 2. METODOS MECANICOS Filtros: con poro de menor tamao que las bacterias por lo que las retienen, se hacen con barro y otras sustancias, generalmente los virus pueden atravesarlos. Ultrasonido: consiste en introducir en tanques de distintos tamaos que contienen lquido desinfectante. Una vez puesto en marcha el dispositivo comienza a vibrar a gran velocidad ocasionando pequeas burbujas que entran en todos los recodos 47

consiguiendo eliminar todos los microorganismos. Es un mtodo poco utilizado ya que es aro y poco practico. Agitacin: se lleva a cabo por perlas de vidrios. 3. SALES MINERALES Medios hipotnicos: colocar una bacteria en este medio tiende a coger H2O hasta estallar. Esto es solo teora ya que en la prctica la pared bacteriana la protege. Medios hipertnicos: colocar una bacteria en este medio pierde H2O hasta deshidratarse, con lo que se frena la multiplicaron pero no se destruye. 4. COMPUESTOS QUIMICOS: van a producir la destruccin de todos los microorganismos patgenos. Todo buen material de desinfeccin debe cumplir: 1) matar al mayor n de grmenes o al menos a todos los patgenos. 2) ser econmico y de fcil adquisicin. 3) no ser corrosivo (material), toxico (para personas, animales o plantas) ni irritantes para los tejidos. 4) que posea un alto poder de penetracin. 5) olor agradable. 6) estabilidad y homogeneidad de composicin y difusin. Las tcnicas mas empleadas para su uso son: inmersin locin nebulizacion pulverizacin Los desinfectantes y antispticos ms utilizados son: Compuestos inorgnicos Detergentes catinicos: se utilizan derivados del RNH4 , los ms empleados son: Cloruro de Benzalconio Cetrimida Se suelen emplear para la limpieza y desinfeccin de paredes, ropa, etc. Detergentes aninicos: como por ejemplo el uridilsulfato sdico. Metales pesados: son derivados del mercurio, la ms conocida es la mercromina que generalmente se emplea como antisptico. Halgenos: existen dos tipos: Derivados del cloro: se utilizan en forma de gases o hipoclorito (leja). Se utilizan principalmente para el saneamiento de aguas. Derivados del yodo: se utilizan en solucin alcohlica como la tintura de yodo (Betadine). Agentes oxidantes: como el agua oxigenada. Compuestos orgnicos Alcoholes: se utilizan como antisptico y desinfectante sobre el filo de algunas 48

superficies. Se emplea el etanol o alcohol etlico para tejidos y metanol para superficies que no vayan a estar en contacto con la piel. Fenoles: se utilizan para la desnaturalizacin de protenas. Los ms utilizados son el resorfinol, hexaclorofeno, zotal, etc. muy utilizada es la clorohexidina que se puede considerar lo ms parecido a un antisptico ideal, junto con el Betadine, ya que acta sobre gram + y , hongos, virus, etc. Aldehdos: se utilizan principalmente vapores de formol y glutaraldehdo. Oxido de etileno: es un gas txico que con el aire forma una molcula explosiva, por lo que se utiliza en cmaras de oxido de etileno a 46 atm. y mezclado con un gas inerte como dixido de carbono queda adsorbido en el material por lo que una vez estabilizado hay que airear dicho material. Presenta un gran poder de penetracin y se aplica a cualquier material resistente al calor y que no puede desinfectarse por otros mtodos. Ej: instrumentos para endoscopia, plsticos termolbiles, cauchos, etc. El material esta disponible para ser utilizado a las 48 horas despus de su esterilizacin y deber conservarse estril en bolsas cerradas por procedimientos termoelctricos. La duracin de la esterilizacin es de aproximadamente 6 semanas. propiolactona: es un lquido muy txico que se utiliza para esterilizar material sensible al calor. Podemos generalizar y decir: que para esterilizar se utiliza: Calor. Radiaciones. Formol Glutaraldehdo. Oxido de etileno. .propiolactona. que para desinfectar se utilizan: cidos y lcalis. Algunos halgenos. Glutaraldehdo. que como antispticos se utilizan: Detergentes. Metales pesados. Derivados halogenados. Agentes oxidantes. Alcoholes. Fenoles. Actualmente son ampliamente empleadas mezclas de desinfectantes para aumentar la potencia o espectro de accin. Las asociaciones ms utilizadas son: Clorhexidina con cetrimida Mercuriales orgnicos con detergentes aninicos y fenoles. 3. CONTROLES DE ESTERILIDAD Sirven para comprobar la eficacia del proceso de esterilizacin. Podemos distinguir: a. De tipo Fsico: Son sistemas de control incluidos en sistemas de esterilizacin. Ejemplo: manmetros, termmetros, vacumetros (miden el vaco) y registros grficos de distintos 49

parmetros. b. De tipo Qumico: Son cintas adhesivas en las que se produce un cambio de color si se ha estilizado bien. c. De tipo Biolgico: Sistemas comerciales en forma de cpsula cerrada en cuyo interior hay esporas. Dichas cpsulas tras haber sido sometidas a esterilizacin se incuban a 4045C durante 4864 horas y se procede a la lectura donde la germinacin y cambio de color indicar en cada caso que no se ha producido condiciones de esterilizacin. 4. EVALUACIN DE ACTIVIDAD DE UN DESINFECTANTE. DETERMINACIN DEL COEFICIENTE FENOL (prctica) Fundamento: Se puede determinar la potencia de un desinfectante problema utilizando como patrn el fenol. Para ello se compara el poder germicida a distintas concentraciones. Material: Tubos de ensayo, pipetas de 2 y 5 ml, gradilla, asa de siembra, estufa de cultivo, cronmetros o relojes. Reactivos: Fenol, desinfectante problema, caldo nutritivo y microorganismo problema. Tcnica: Se preparan 4 tubos con 5 ml de cada una de las diluciones crecientes del desinfectante a titular. Las diluciones son: 1/100, 1/200, 1/400 y 1/800. De la misma forma se preparan 4 tubos con 5ml de cada una de las diluciones crecientes de fenol (patrn) cuya concentracin es el doble del antisptico problema. Las diluciones son: 1/50, 1/100, 1/200 y 1/400. Se llevan los todos los tubos al bao mara a 37C durante 5 minutos. Se aade a cada tubo 1.5ml de la suspensin de microorganismos problema. Pasados 5 minutos se toman de cada tubo un asa y se siembra en caldo nutritivo. Se efecta la misma operacin a los 10 y 15 minutos. Se incuba durante 48 horas a 37C en estufa. El crecimiento puede verse por turbidez, cambio de color, precipitado blanco lechoso, etc. Resultados e Interpretacin: El coeficiente final es la relacin existente entre el inverso de la mayor dilucin del desinfectante problema que no inhibe los microorganismos en 5 minutos de contacto pero s en 10 minutos y la mayor dilucin del fenol que se comporta igualmente. TEMA 10. TIPACIN BIOQUMICA 1. Introduccin. 2. Clasificacin. 3. Requerimientos nutritivos. Factores V y X. 4. Pruebas del metabolismo hidrocarbonado (oxidativo y fermentativo). OF de Hung y Lesin. Produccin de cido gas. DGalactosidasa. 1. INTRODUCCIN

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Los microorganismos como seres vivo tienen su propio metabolismo: Anabolismo: relacionado con sntesis para lo que se requiere energa. Catabolismo: relacionado con degradacin con ganancia de energa. Estas reacciones vienen regidas por unos biocatalizadores de naturaleza proteica denominados enzimas, los cuales son caractersticos para cada germen, por lo que la deteccin in vitro del conjunto de estos enzimas es de gran utilidad en el proceso de identificacin microbiolgica. La presencia de enzimas se investiga de dos formas: Sembrando el microorganismo en un medio que contenga el sustrato a investigar con posterior incubacin en condiciones adecuadas. Ej: prueba de Hung y Leifson o la reduccin de nitratos. Cultivando previamente en un medio que o contenga el sustrato y posteriormente se pone en contacto con l. Ej: prueba de la oxidasa, de la catalasa. La tipacin bioqumica puede realizarse sobre un cultivo puro. El nmero y tipo de pruebas bioqumicas a realizar sobre el germen depende de los primeros datos del examen microbiolgico: morfologa del germen y sus colonias. caractersticas tintoriales. medios donde crecen, etc. 2. CLASIFICACIN (fotocopias) 3. REQUERIMIENTOS NUTRITIVOS. FACTORES V y X. Algunos microorganismos son muy exigentes nutricionalmente y requieren para su desarrollo la presencia de sustancias especficas llamadas factores de crecimiento, vitaminas, aminocidos, factores de la coagulacin, etc. El ejemplo ms conocido en bacteriologa es el de Haemophylus que precisa del factor X, V o ambos para desarrollarse de forma ptima. Las bacterias Haemophylas crecen bien en sangre entera, la cual aporta ambos principios: Factor X o hemina: es una sustancia termoestable derivada de la Hb. Factor V o coenzima I (NAD): es una sustancia termolbil. Fundamento: FV y FX por ser hidrosolubles difunden rpidamente en medio slidos como el agar, si se depositan tiras de papel de filtro impregnadas en estos factores en un medio dificultorio de los mismos se puede conocer la necesidad de F V y X del microorganismo estudiado, observando el desarrollo de las colonias alrededor de las tiras. Material: placa de petri, asa, pipeta Pastear, pipeta calibrada y tubos estriles. Reactivos: medio deficiente de F V y X, como agar MuellerHilton, caldo infusin de cerebro corazn, tiras de papel de filtro impregnadas en F V y X respectivamente y microorganismos. Tcnica: 51

1. A partir de un cultivo puro del microorganismo problema preparar una suspensin de 23 ml de caldo infusin cerebro corazn (BHI). 2. Realizar con esta suspensin una siembra de inoculacin en una placa con agar MuellerHilton, preferiblemente por la tcnica de Kirby Bauer. 3. Colocar una tira con el FV y otra con el FX en la superficie del agar presionando suavemente, deben estar separadas por 1 cm. 4. Incubar a 37C 1824 horas. Resultados e interpretacin Se observa si existe crecimiento alrededor de las tiras: 1 Caso: microorganismo requiere FX. 2 Caso: microorganismo requiere FX. 3 Caso: microorganismo requiere ambos factores. Si el microorganismo estudiado es Haemophylus se cultivar en una atmsfera del 510% de CO2. 4. PRUEBAS DEL METABOLISMO HIDROCARBONADO La utilizacin por un microorganismo de los hidratos de carbono tiene lugar por alguno de estos procesos: metabolismo oxidativo metabolismo fermentativo La oxidacin de hidratos de carbono es un proceso aerbico y lo realizan los microorganismos aerobios obligados o estrictos. La fermentacin es un proceso anaerbico efectuado por microorganismos aerbicos y anaerbicos facultativos. Las diferencias entre el metabolismo oxidativo y fermentativo estn presentes en el esquema siguiente: Metabolismo fermentativo Aerbica y anaerbicamente Pueden producirlo Alto S Sustrato orgnico Metabolismo oxidativo Aerbicamente No Bajo No Oxgeno

Produccin de cido Produccin de gas Grado de acidez Fosforilacin de glucosa ltimo aceptor de e en la cadena respiratoria

Las pruebas del metabolismo hidrocarbonato son: 1. PRUEBA O.F. DE HUNG Y LEYSON

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 Fundamento: Se basa en que el metabolismo oxidativo slo produce cido en la superficie del medio mientras que en el fermentativo el cido es producido en todo el medio, incluso en las zonas de anaerobiosis; adems en caso de aparicin de gas ste slo se forma en el metabolismo fermentativo. La formacin de cido se detecta por el viraje de un indicador de pH mientras que la de gas por la aparicin de burbujas dispersas, grietas o porque el medio se despega del fondo. La prueba se puede realizar sobre distintos HC, los ms utilizados son glucosa, lactosa, sacarosa y maltosa. Entre las principales aplicaciones de esta prueba estn: Diferenciar gneros intestinales: Enterobacterias: fermentan la glucosa Pseudomonas: oxidan la glucosa Moxarella, Alcalgenas, Acinetobacter: ni fermentan ni oxidan la glucosa Diferenciar gneros de la familia Micrococaceae: Staphylococo: fermentan la glucosa Micrococus y Planococus: oxidan la glucosa Material: Tubos de cultivo, hilo de siembra, pipeta de 10 ml, algodn, mechero y estufa de cultivo. Reactivos: Medio bsico de Hung y Leyson, parafina o vaselina estril, solucin de HC al 10% y microorganismo. Tcnica: 1. Agregar al medio bsico de Hung y Leyson un 10% de la solucin de HC con lo que se obtiene una dilucin final del 1%. 2. A partir de un cultivo puro y joven de microorganismo problema se toma una muestra con el hilo. Se siembra en picadura 2 tubos con el medio HL. Un tercer tubo no inoculado actuar como control negativo. 3. Calentar uno de los dos tubos cultivados para que el CO2 del medio se desprenda y se sella con 12 ml de vaselina o parafina fundida para mantener la anaerobiosis. 4. Se incuba a 37C durante 4872 horas y en algunas ocasiones se requieren hasta 14 das de incubacin. Resultados e Interpretacin: Si se forma cido el medio virar de verde a amarillo. La produccin de gas se ver en burbujas, grietas, elevacin del medio, etc. La interpretacin de resultados posibles se detalla en el siguiente esquema: Tubo abieto Fermentacin anaerognica Oxidacin No oxidacin ni fermentacin Oxidacin y Amarillo Amarillo Verde Amarillo Tubo cerrado Amarillo Verde Verde Amarillo 53

fermentacin El tubo de control siempre ser de color verde quede cerrado o abierto. Observaciones al mtodo: Para microorganismos con requerimientos nutritivos se agrega al medio bsico de HL un 2% de suero o 0.1% de extracto de levadura. En esta prueba se puede observar la movilidad del microorganismo ya que har un zigzag en el medio. 2. PRODUCCIN CIDOGAS Fundamento: Se basa en el viraje del indicador de pH al producirse cido. La produccin de gas se detecta por la retencin de ste en una campana de Durham. Al igual que en la prueba O.F. se puede realizar sobre distintos HC. Su aplicacin fundamental es la investigacin de la capacidad degradativa de un HC por el microorganismo. Material: Tubo de cultivo, asa de siembra, campana de Durham, pipeta de 10 ml, algodn, mechero y estufa de cultivo. Reactivo: Agua de peptona, solucin al 10% de HC, solucin al 1% de rojo fenol y microorganismo. Tcnica: 1. Mezclar 900 ml de agua de petona, 100 ml de solucin de HC al 10% y 1ml de la solucin de rojo de fenol al 1%. 2. Llenar 2 tubos de ensayo con la campana de Durham con 5ml del medio preparado. 3. Esterilizar en autoclave. 4. A partir de un cultivo joven y puro de un microorganismo tomar una muestra con el asa. Se inocula en uno de los tubo mientras que el otro acta de control negativo. 5. Incubar a 37C durante 2448 horas. Resultados e Interpretacin: Si se produce cido el medio virar de color rojo a color amarillo. La produccin de gas se detecta en la acumulacin de ste en la campana de Durham. Observaciones al mtodo: La campana de Durham de estar llena de caldo nutritivo en el momento de incubar ya que la sola presencia de un burbuja de gas indica la formacin del mismo si queremos ver la presencia de cido y gas a partir de lactosa por medio de Enterobacterias. El medio descrito se sustituye por el caldo McKonkey que lleva lactosa. En la preparacin del medio de cultivo se puede sustituir el rojo de fenol por otros indicadores a la misma concentracin, como: azul de bromotimol o prpura de bromocresol. 3. PRUEBA DE LA DGALACTOSIDASA Determina la capacidad de fermentar la lactosa. Los microorganismos que fermentan la lactosa de forma activa poseen dos enzimas: Lactosa permeasa: localizada en la membrana celular y relacionada con el transporte de la lactosa. 54

 Dgalactosidasa: enzima intracelular capaz de desdoblar la lactosa en glucosa y galactosa. Segn acten sobre la lactosa los microorganismos se clasifican en: Fermentadores activos de lactosa: poseen ambos enzimas y la catabolizan rpidamente (antes de 24 horas) No fermentadores de lactosa: carecen de ambos enzimas y no penetran en la clula ni es degradada la lactosa. Fermentadores tardos de lactosa: carecen de lactosa permeasa pero pueden fermentar la lactosa porque tienen Dgalactosidasa. Estos microorganismos en presencia de altas concentraciones de lactosa son capaces de permeabilizarse ligeramente a la lactosa y fermentarla entre 215 das. La principal aplicacin de esta prueba es la diferenciacin de Enterobacterias: da positiva esta prueba E.coli, Yersinia, Klebsiella y Shigella y la da negativa Salmonella y Proteus. Funadamento: Se puede detectar el enzima Dgalactosidasa empleando ortonitrofenilDgalactopiransido (ONPG), compuesto de estructra similar a la lactosa en el que la glucosa ha sido sustituida por el ortonitrofenol, el cual liberado en medio alcalino, por accin de la Dgalactosidasa, produce un color amarillo. Esta reaccin se produce en un intervalo mximo de 24 horas. ( La lactosa se pone en contacto con el microorganismo; si el microorganismo posee la Dgalactosidasa desdoblar la lactosa, si no la posee no la desdoblar). Material: Tubo de ensayo, asa de siembra y bao o estufa a 37C. Reactivos: Solucin tamponada a pH 7 de ONPG y microorganismo. Tcnica: 1. A partir de un cultivo puro preparar una suspensin densa de microorganismo en 0,5ml de suero fisiolgico estril. 2. Aadir una gota de tolueno a la suspensin y mezclar. (As se consigue la liberacin de la Dgalactosidasa de la bacteria). 3. Agregar 0,5ml de solucin tamponada de ONPG. 4. Incubar a 37C y leer antes de 24 horas. Resultados e Interpretacin: ONPG positivo: color amarillo. Algunos microorganismos lo producen en 510 minutos, la mayora antes de 1 hora. ONPG negativo: incoloro. No se debe interpretar como negativo antes de 24 horas de incubacin. Observaciones al mtodo: La solucin de ONPG se puede sustituir por tabletas o discos comerciales. Los microorganismos ensayados en esta prueba deben provenir de un medio con lactosa (ej: kliger).

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La solucin de ONPG recin preparada debe ser incolora y se puede emplear un control positivo (E.coli) y otro negativo (Proteus). La solucin debe conservarse en frascos de olor topacio a 4C y antes de emplearse se debe atemperar a 37C para redisolver el fosfato que cristaliza durante la conservacin. Es importante utilizar un inculo concentrado para obtener una elevada concentracin de enzima y as acelerar la velocidad de reaccin. TEMA 11. TIPACIN BIOQUMICA II 1. Metabolismo proteico Hidrlisis de la gelatina. Produccin de sulfhdrico. Prueba de las descarboxilasas. 2. Pruebas enzimticas. Prueba de la oxidasa. Prueba de la catalasa. Prueba de la coagulasa. Pruebas de la ureasa. Prueba de reduccin de nitratos. 1. METABOLISMO PROTEICO 1. Hidrlisis de la gelatina Las protenas exgenas son muy grandes para entrar en la clula bacteriana por tanto para poder ser utilizadas deben hidrolizarse con enzimas extracelulares de tipo proteoltico. Estas enzimas son secretadas por ciertas bacterias y esta capacidad es utilizada para su tipacin. El catabolismo de las protenas por enzimas proteolticas es un proceso en dos etapas: 1 protenas + H2O proteinasa polipptidos. 2 polipptidos H2O + proteinasa aminocidos. Con esta tcnica se permite diferenciar distintas especies, como por ejemplo Psudemonas aurogenosa(da +), Serratia (da +) y Listeria monocitogenes (da ). Debemos tener en cuenta que la gelatina entre 2025C es slida y a temperaturas superiores a 28C se licua. Fundamento: Se siembra en picadura un tubo con gelatina nutritiva, observndose la licuefaccin por la accin de las gelatinas. Material: Hilo, tubos, algodn, mechero, pipeta 10ml, estufa de 56

cultivo. Reactivos: Medio gelatina nutritivo y microorganismo. Tcnica: 1. Se preparan dos tubos con gelatina nutritiva estril. Para su llenado se licua el medio tras lo cual se solidifica con inmersin en hielo. 2. A partir de un cultivo joven y puro de microorganismo problema se toma una muestra con el hilo. 3. Se siembra en picadura 1 tubo, el otro se punciona con el hilo estril (actuar como control ). 4. Incubar a 2225C de 114 das. Resultados e interpretacin: Hidrlisis de gelatina +: se produce una zona de licuefaccin con ensanchamiento en la lnea de puncin. Hidrlisis de gelatina : no se produce ensanchamiento en la lnea de puncin. 2. produccin de sulfhdrico (H2S) Fundamento: Algunos microorganismos son capaces de liberar azufre en forma de H2S (gas) como producto final de la accin metablica sobre protenas con aminocidos azufrados. Dan reaccin + : Proteus vulgaris y Proteus mirabilis. Dan reaccin : Proteus morganii y Proteus rettegeri (permite distinguir distintos especies de Proteus) Tambin permite distinguir distintas Pseudomonas. Tcnica: 1. A partir de un cultivo joven y puro del microorganismo problema se toma una muestra con el hilo. 2. Se siembra en el medio AHP (Agar con Hierro y Peptona). 3. Incubar a 37C durante 1824 horas. Resultados e interpretacin: Sulfhdrico + : ennegrecimiento del medio. Sulfhdrico : no ennegrecimiento del medio. 3.PRUEBAS DE LAS DESCARBOXIDASAS Son un grupo de enzimas capaces de atacar el grupo carboxilo de los aminocidos para formar aminas con desprendimiento de CO2. Este proceso se realiza en anaerobiosis. Cada descarboxilacion es especfica de un aminocido: lisina, arginina y ornitina son los 3 aminocidos ms utilizados en la tipacion bioqumica:

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LISINA CADAVERINA + CO2 (LDC= Lisina descarboxidasa) ORNITINA PUTRESCINA + CO2 (ODC= Ornitina descarboxidasa) ARGININA CITRULINA + NH3 PUTRESCINA + CO2 (ADC= Arginina descarboxidasa) Son pruebas importantes para el estudio de las Enterobacterias. En los 3 procesos se produce una alcalinizacin del medio con desprendimiento de CO2. Fundamento: Si a un medio base (medio general) con un indicador de pH se le aade los aminocidos correspondientes al enzima estudiado y posteriormente se le aade el microorganismo, el viraje del indicador del pH indicar la alcalinizacin del medio y por tanto la presencia del enzima estudiado DC R CH COOH !!!!! R CH2 NH2 % CO2 bsico (ANAEROBIOSIS) NH2 Amarillo Rojo prpura Material: Tubo de ensayo y asa. Reactivos: Caldo de Moeller para descarboxilasa, aminocidos ensayados, parafina o vaselina estril y microorganismo. Tcnica: 1. Se preparan 4 tubos: T1 (C) 5 ml Caldo Moeller ! Control T2 (L) 5 ml Caldo Moeller + L. Lisina (1% con respecto al caldo) T3 (O) 5 ml Caldo Moeller + L. Ornitina (1% con respecto al caldo) T4 (A) 5 ml Caldo Moeller + L. Arginina (1% con respecto al caldo) 2. A partir de 1 cultivo joven y puro del microorganismo problema se inoculan los 4 tubos. 3. Sellarlos con 23 ml de parafina estril (aprox. 1 cm de altura). 4. Incubar 35 C 1824 horas.

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 Resultados e interpretacin: Si el aminocido es descarboxilado se forman aminas que alcalinizan el medio dando un color rojo prpura (la prueba es +). Si la prueba es el primer tubo es de color amarillo. NOTA: el pH del caldo de Moeller es igual a 6. 2 . PRUEBAS ENZIMATICAS 1. PRUEBA DE LA OXIDASA La oxidasa es el enzima que cataliza la transferencia de electrones del sustrato al oxigeno, en general se detecta en los microorganismo aerobios o anaerobios facultativos. Los anaerobios estrictos carecen de ella. Se denomina tambin citocromo oxidasa y sirve para diferenciar Pseudomonaceae de los miembros oxidasa negativa de Enterobacteriaceae. Ayuda a diferenciar entre los gneros Moraxella + y Neiseria + de Acinetobacter . Fundamento: consiste en la utilizacin de indicadores susceptibles de ser oxidados en presencia de oxidasa. Estos tienen la propiedad de ser incoloros en estado reducido y colorearse al ser oxidados (cesin de electrones a la oxidasa). Entre los indicadores ms utilizados se encuentran los derivados de la parafenilendiamina que por accin de la oxidasa dan indofenol. Material: Placa de petri, mechero, estufa de cultivo, papel, placa de cultivo, asa, pipeta de 10 ml y pipeta Pasteur. Reactivos: Agar sangre, microorganismo y reactivo oxidasa de Kovacs. Tcnica: 1. Cultivar el microorganismo problema en una placa de petri con agar sangre. 2. Colocar un papel de filtro de 6 cm2 en la placa de petri vaca y estril. 3. Depositar 23 gotas del reactivo oxidasa de Kovacs en el centro del papel. 4. Recoger con el asa una colonia de la placa con agar sangre y extenderla en el papel. 5. Leer el resultado a los 510 sg. Resultados e interpretacin: Oxidasa + : aparicin de color negro prpura (violeta). Oxidasa : no se produce color. 2. PRUEBA DE LA CATALASA

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La catalasa es una enzima que acta sobre el peroxido de hidrogeno (H2O2) segn la reaccin: catalasa 2 H2O2 2H2O2 + O2 (gas) BURBUJAS El H2O2 se forma como producto terminal oxidativo de la degradacin aerbica de los hidratos de carbono. Si se acumula es toxica para los microorganismos y produce la muerte por lo que la catalasa es imprescindible para su desarrollo. Entre sus aplicaciones se encuentra la diferenciacin de: Staphylococo, Bacillus, Listeria monocitogenes ! positivo Estreptococo, Micrococo, Clostridium ! negativo Fundamento: Se basa en poner en contacto el microorganismo posible productor de catalasa con un sustrato natural (H2O2) y observar la presencia del enzima por la aparicin de gas. Material: Porta, pipeta pasteur, asa y mechero. Reactivos: Agua oxigenada al 30% y microorganismo. Tcnica: 1. Recoger con un asa una colonia de 1824 horas. 2. Colocar en un porta. 3. Agregar sobre el microorganismo una gota de agua oxigenada al 30%. Resultados e interpretacin: Catalasa + ! formacin inmediata de burbujas de O2. Catalasa ! no aparecen burbujas. Observaciones al mtodo: No utilizar m.c. que tengan hemates. Ej.: agar sangre, agar chocolate, puesto que estos contienen catalasa por lo que podran producir falsos negativos. El agua oxigenada es inestable y se descompone con la luz, por ello hay que mantenerlo en refrigerador y en frascos opacos. 3. PRUEBA DE LA COAGULASA Enzima producida por ciertos microorganismos que es capaz de coagular en plasma. Se utilizan para diferenciar Staphyloocos Aereus de otras especies. Fundamento: Consiste en poner en contacto el microorganismo problema con el plasma para observar la coagulacin de este por la accin de la coagulasa. Material: Tubo de hemlisis, pipeta de 0,5 ml., asa, mechero, bao, estufa de cultivo. Reactivos: Plasma humano o plasma de conejo y microorganismo. Tcnica: 1. Colocar en un tubo de hemlisis estril 0,5 ml. de plasma 60

2. Agregar 0,5 ml de un cultivo de 1824 h en medio liquido del microorganismo problema. En caso de partir de un medio slido, tomar con el asa 2 o 3 colonias y emulsionarlas en el plasma. 3.Homogeneizar con rotacin suave en los tubos. 4. Incubar al bao M a 37. Observar cada 30 min. si hay coagulacin, durante 4 h. Si a las 4 h no hay coagulo visible se deja en estufa de cultivo a 37 durante 24 h. Resultados e interpretacin: Coagulasa + ! formacin de coagulo. Coagulasa ! no formacin de coagulo. Observacin al mtodo: la prueba se puede realizar mezclando una gota de plasma ms una gota de microorganismo en un porta. Si la reaccin es + se detecta un precipitado en forma de aglutinado blanco. 4. PRUEBA DE LA UREASA La hidrlisis de la urea es catalizada por una enzima especfica denominada ureasa dando carbonato amonico como producto final con la consiguiente alcalinizacin del medio: ureasa NH2CONH2 + H2O CO2 +2NH3 ! CO3 (NH4)2 ROJO Fundamento: Se basa en el viraje del indicador de ph debido a la alcalinizacin del medio por el carbonato amonico producido por la accin de la ureasa sobre la urea del cultivo. Material: Tubos de cultivo, asa, pipeta de 10 ml, estufa de cultivo, mechero, algodn. Reactivos: Microorganismo agar uera de Christensen. Tcnica: 1. A partir de un cultivo puro y joven se toma una muestra con el asa. 2. Inocular en la superficie del tubo con agar urea de Christensen. 3. Incubar a 37 hasta detectarse el viraje del indicador. Si no se produce el viraje en 6 das la prueba ser negativa. Resultados e interpretacin: Urea + ! color rojo rosado. Urea ! no se produce viraje del indicador. 5. PRUEBA DE REDUCCIN DE NITRATOS Algunos microorganismos anaerobios o anaerobios facultativos utilizan nitrato como ltimo aceptor de electrones en su metabolismo. Este proceso de reduccin de nitratos es producido por una enzima, nitratasa o nitrato 61

reductasa, pudiendo originar diversos productos finales: nitritos, nitrogeno molecular, oxido ntrico, oxido nitroso, amoniaco,etc. La formacin de uno u otro depende de la especie bacteriana, lo ms comn son nitritos y nitrogeno molecular. La reduccin de nitratos consiste en la deteccin de los productos de reduccin al ser excretados al medio por el microorganismo. Se utilizan para la identificacin de especies de Haemophylus y Neisserias. Fundamento: Puesto que los productos finales de la reduccin ms comn son los nitratos y nitrgeno molecular, la prueba constar de dos fases: Deteccin de nitritos por una reactivo colorimtrico. La no aparicin de color en la primera fase puede significar: No se ha reducido el nitrato, se comprueba aadiendo un agente reductor, con lo que se desarrolla la reaccin colormetrica de la primera fase. El nitrito se ha reducido a nitrgeno molecular, el cual se detecta por la campana de Durham (si el medio es lquido) o por la formacin de grietas (si el medio es slido). El nitrito se ha reducido a otros productos nitrogenados. Ej: oxido nitrico. Materiales: Tubo, asa, pipeta 10ml., campana de Durham, algodn, mechero, estufa de cultivo. Reactivos: Caldo con nitrato, reactivo A (alfanaftilamina al 0.5%), reactivo B (cido sulfanilico al 0.8%), Zn en polvo y microorganismo. Tcnica: 1. A partir de un cultivo joven y puro se toma un amuestra con el asa. 2. Inocular un tubo con caldo con nitrato, otro sin sembrar actuar como control , en ambos se pone campana de Durham. 3. Incubar a 37C durante 1224 horas. 4. Agregar 1ml. de reactivo A y 1 ml. De reactivo B. Si se desarrollar color antes de 30 segundos se da por finalizada la prueba, en caso contrario aadir al tubo un pellizco de polvo de Zn. Resultados e interpretacin: Si la prueba es positiva: Reduccin a nitritos, aparicin de color rojo o rosado al aadir el reactivo A y B. Reduccin a nitrgeno molecular, acumulacin de gas en la campana de Durham. Reduccin a otros productos nitrogenados, si al aadir el polvo de Zn no se desarrolla color. TEMA 12. TIPACIN BIOQUMICA III

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El IMVIC son 4 pruebas de identificacin bioqumica que hacen referencia a: I ! Indol: Se utiliza en el metabolismo proteico. M ! Rojo de Metilo: Se utiliza en el metabolismo hidrocarbonado. V ! VogesProskauer: Se utiliza en el metabolismo hidrocarbonado. C ! Citrato: Se utiliza en el metabolismo hidrocarbonado. Estas pruebas son muy tiles en el estudio de Enterobacterias ( E.Coli, Salmonella, Shigella, Proteus, Yersinia). 1. PRUEBA DEL INDOL Fundamento: Estudia la utilizacin de prtidos por parte de un microorganismo, en concreto determina la capacidad de desdoblar indol de la molcula de triptfano. El triptfano es un aminocido que puede ser degradado por ciertas bacterias para originar distintos metabolitos indlicos . El triptfano por accin de una enzima, la triptofanasa, da lugar a determinados metabolitos indlicos como: indol, escatol o indol actico). El indol es detectado por un reactivo que produce coloracin al reaccionar con l. Las diversas enzimas intracelulares que intervienen en el proceso reciben el nombre de triptofanasa. Material: Tubo de cultivo, asa de siembra, pipeta de 10ml, algodn, mechero y estufa de cultivo. Reactivos: Agua de peptona, ractivo indol de Kovacs o reactivo indol de Ehrlich, ter etlico (dietilter) y microorganismo. Tcnica: a. Mtodo de Kovacs 1. Sembrar el microorganismo en un tubo con agua de peptona. 2. Incubar a 37C 2448 horas. 3. Agregar 5 gotas del reactivo indol de Kovacs. 4. Agitar muy suavemente y dejar reposar unos minutos. b. Mtodo de Ehrlich 1. Sembrar el microorganismo en un tubo con agua de peptona. 2. Incubar a 37C 2448 horas. 3. Aadir 1ml del ter etlico y esperar a que ste suba a la superficie. 4. Aadir 5 gotas del reactivo de Ehrlich resbalando por la pared del tubo. Resultados e Interpretacin: Indol +: Anillo rojo en superficie. Indol : Color amarillento. 63

 Observaciones al mtodo: El reactivo indol de Kovacs debe ser fresco (refrigerar a 4C varios das), si se deja a T ambiente variar el color de amarillo a castao siendo menos sensible. 2. PRUEBA DEL ROJO DE METILO Fundamento: Investiga la capacidad de un microorganismo de producir cidos como metabolitos finales del proceso de fermentacin de azcares. Emplea como indicador el rojo de metilo. Los microorganismo rojo de metilo positivo producen cidos estables con elevada concentracin de H+ cesando toda la actividad metablica. Los microorganismos rojo de metilo negativo tambin producen cidos pero en menor concentracin porque existe una recesin hacia la neutralidad debido a la degradacin de cidos orgnicos y posible formacin de compuestos de NH4. Material: Tubo de cultivo, asa de siembra, pipeta de 10ml, algodn, mechero y estufa de cultivo. Reactivos: Medio de Clark y Lubs, solucin de rojo de metilo y microorganismo. Tcnica: 1. Sembrar el microorganismo problema en un tubo con medio de Clark y Lubs. 2. Incubar a 37C 4872 horas. 3. Aadir 5 gotas de rojo de metilo. 4. La lectura se efecta inmediatamente despus de aadir el indicador. Resultados e Interpretacin: Rojo de metilo +: Color rojo intenso en superficie. Rojo de metilo : Color amarillo en superficie. Observaciones al mtodo: No interpretar nunca una prueba si el medio no se ha incubado como mnimo 48 horas. Si la lectura se efecta antes los resultados sern falsos positivos, dado que los rojo de metilo no habrn tenido tiempo suficiente para metabolizar los productos cidos iniciales acumulados por la fermentacin de la glucosa. El viraje de rojo de metilo a pH 4.5 da color rojo y a pH 6.3 da color amarillo. Si no hay rojo de metilo empleamos: Rojo Fenol, a pH 6.8 da color amarillo y a pH 8.4 da color rojo. Azul de Bromotimol, a pH 6 da color amarillo y a pH 7.6 da color azul. Prpura de Bromocresol, a pH 5.2 da color amarillo y a pH 6.8 da color prpura. 3. PRUEBA DE VOGES PROSKAUER

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 Fundamento: Consiste en determinar la capacidad de un microorganismo de producir un metabolito neutro llamado acetil metil carbinol o acetona como producto intermediario derivado del metabolismo de la glucosa. En presencia de oxgeno atmosfrico y lcalis, la acetona es oxidada a diacetilo que es un sustrato que genera un compuesto coloreado al aadirle los reactivos adecuados. Material: Tubo de cultivo, asa de siembra, pipeta de 10ml, algodn, mechero y estufa de cultivo. Reactivos: Medio de Clark y Lubs, solucin naftol, solucin KOH al 40% y microorganismo. Tcnica: 1. Sembrar el microorganismo problema en un tubo con medio de Clark y Lubs. 2. Incubar a 37C 4872 horas. 3. Agregar al cultivo en orden: 0.5 ml de naftol y 0.5 ml de KOH. 4. Agitar el tubo suavemente y mantenerlo inclinado casi horizontal con el fin de favorecer la oxidacin de la acetona por el oxgeno atmosfrico. 5. Dejar reposar el tubo 1015 minutos antes de interpretar la prueba. Resultados e Interpretacin: Voges Proskauer +: color rojorosado en la superficie antes de 1hora. Voges Proskauer : color amarillo, a veces aparece color cobrizo al mezclar los reactivos. 4. PRUEBA DEL CITRATO Fundamento: Determina si un microorganismo es capaz de utilizar citrato como nica fuente de carbono. El medio contiene citrato (como fuente de carbono) y sales de amonio inorgnico (como fuente de nitrgeno). Los microorganismos citrato + crecen en este medio alcalinizndolo debido a: formacin de amoniaco por desdoblamiento de las sales de amonio produccin de carbonatos y bicarbonatos por degradacin de citrato Material: Tubo de cultivo, asa de siembra, pipeta de 10ml, algodn, mechero y estufa de cultivo. Reactivos: Medio de Kosser (medio lquido en tubo), medio citrato de Simons (agar inclinado), medio citrato de Christensen (agar inclinado) y microorganismo. Tcnica: 1. Se preparan 2 tubos con el medio elegido. Se inocula uno de ellos, mientras que el otro servir de control . 2. Incubar 4872 horas a 37C. Los tubos estarn destapados para que el CO2 se evapore libremente. Leer despus de 48 horas de incubacin. 65

 Resultados e Interpretacin: Medio Kosser: Positivo: turbidez en el tubo Negativo: no turbidez en el tubo Medio Citrato de Simons Positivo: color azul intenso en superficie Negativo: no hay cambio de color Medio Citrato Christensen Positivo: color rojo o rosa con crecimiento de microorg en superficie Negativo: no cambio de color ni crecimiento de microorganismo. TEMA 13. COCOS POSITIVOS. ESTAFILOCOCOS Y ESTREPTOCOCOS. STAPHYLOCOCO 1. Introduccin (Morfologa y caractersticas). 2. Aislamiento 3. Pruebas de Identificacin Esquema. Prueba de la catalasa. Prueba de la coagulasa. Prueba de hemlisis. Prueba de sensibilidad a la Novobiocina. OF de Hung y Lesin. Prueba de la ureasa. Actividad de la fosfatasa. Prueba de la desoxirribonucleasa. Prueba de la pirrolidonilamidasa. Sistemas comerciales (API). 4. Estructura antignica Pptidoglucanos. cidos teicoicos. Protena A. Factor de aglutinacin. Polisacridos. 5. Enzimas y Toxinas: Toxinas Hemolisinas. Leucocinas o leucotoxinas. Enterotoxinas. Toxina exfoliativa. Toxina responsable del shock toxico. Enzimas: 66

 Coagulasa. Fibrinolisina. Hialurodinasa. lactamasa o penincilasa. Lipasas, esterasas, proteinazas, catalasas y nucleasas. 6. PATOLOGA: Infecciones superficiales. Infecciones intestinales (enterotoxina). Infecciones hematolgicas. Infecciones respiratorias. Localizaciones varias. 7. Infecciones Hospitalarias (Nosocomiales). 8. Diagnstico Directo. Indirecto. 9. Sensibilidad antibitica 1. INTRODUCCIN Son cocos gram + que se pueden encontrar aislados, en parejas, tetradas, cadenas cortas y racimos de uva. La mayor parte de las especies son aerobias o anaerobias facultativas. Son inmviles, no esporuladas y no capsulados. Desde el punto de vista bioqumico son catalasa + , oxidasa y fermentadores de azucares. Crecen bien en los medios habituales, Ej: agar sangre o chocolate (para ver hemlisis) o en caldo de trioglicolato o infusin cerebro corazn. Son bastante resistentes a la accin del calor (50C 30 min.) y a la accin de las sales biliares y NaCl, sin embargo se lisan por la accin de ciertos antibiticos y se inhiben con productos qumicos como hexaclorofeno. Se engloban junto con los gneros no patgenos: Micrococus, Planococus, Estomacocus dentro de la familia Micrococaceae. El gnero Estafilococo se compone actualmente de 27 especies. El hbitat normal de stas es variado, principalmente a nivel de piel y mucosas, Ej: Estafilococos capitis, E. Hominis, E. Haemoliticus (se encuentra en axilas y pubis) E. Auricularis. Las especies que se asocian a infecciones humanas o animales son Estafilococos aureus, epidermis y saprofiticus. 2. AISLAMIENTO. Los medios utilizados son: 67

 Champman. Agar ChamManitol. Baidparker. stos son muy selectivos por tener altas concentraciones de NaCl. Tambin se puede realizar su aislamiento en medios con sangre para el estudio de su hemlisis. En el agar sangre aparecen colonias lisas de color amarillento o blanco. El material de estudio puede ser pus, sangre, esputo y LCR. 3. PRUEBAS DE IDENTIFICACION 1. Esquema ( fotocopias ) 2. PRUEBA DE LA Catalasa (ya explicada) Nos permite diferenciar: Streptocoo () Staphylococo (+). 3. prueba de la Coagulasa (ya explicada) Permite diferenciar: Staphylococo Aureus (+) Staphylococo Saprofitico y Staphylococo Epidermis (). 4. Prueba de hemlisis (ya explicada) Distingue: Staphylococo Aureus (+) Staphylococo Saprofitico y Staphylococo Epidermis, no producen hemlisis. 5. Sensibilidad a la Novobiocina Sirve para diferenciar Staphylococo Epidermis (sensibilidad +, resistencia = si muere) Staphylococo Saprofitico (sensibilidad , resistencia +, = no muere). Medio de cultivo utilizado es Mueller Hinton. Reactivos: discos de Novobiocina. Mtodo: 1. Inocular superficialmente un microorganismo en una placa de cultivo 2. Dejar reposar 15 min. A T ambiente 3. Depositar en el centro de la placa un disco de Novobiocina. 4. Incubar 24 h 35. Lectura: aquellos Staphylococos que son inhibidos por discos de 68

Novobiocina son de la especie de Staphylococo Epidermis, los no inhibidos son Staphylococos Saprofitico. 6. Prueba O F (ya explicada) Staphylococo Aureus son fermentadores de azucares. 7. prueba Ureasa ( fotocopias ) Staphylococo aureus ! Variable: en funcin de la cepa puede dar (+) o () a la ureasa. Staphylococo epidermis ! (+) Staphylococo saprofitico ! (+) 8. prueba Desoxirribonucleasa. staphylococo aureus ! (+) Staphylococo epidermis y Staphylococo saprofitico ! () 9. prueba de la Actividad fosfatasa. 10. prueba de la Pirrolidonilamidasa. 11. Sistemas comerciales (API) Son sistemas mltiples de pruebas de identificacin basadas en pruebas bioqumicas, enzimticos y de sensibilidad (pruebas de antibiogramas). Consisten en tiras con microcpulas que contienen los sustratos deshidratados. Se inocula la suspensin del microorganismo en cada una de ellas y tras la incubacin se leen los resultados directamente o por revelado con reactivos. Las reacciones + se traducen en un perfil numrico con el que se acude a un manual que identifica la especie. 4. ESTRUCTURA ANTIGENICA Los Staphylococos presentan en su estructura un importante contenido antignico que est implicado en el mecanismo de patogeneicidad de estos microorganismos. Las principales estructuras antignicas estn en la pared y las ms importantes son: Peptidoglucanos: Es un polmero polisacrido formado por un compuesto N acetilmuranico y Nacetilglucosamida que desempea un papel importante en la patologa de la infeccin ya que: Induce la produccin de IL (interleucinas). Induce la produccin de Ac opsonizantes por los monolitos humanos. Atrae leucocitos. Activa el C'. Posee actividad endotoxica. Ac. Teicoicos: (visto en pared bacteriana). 69

 Protena A: Es una protena de 42.000 Dalton que aparece en muchos Staphylococos aureus. Se encuentra unida de forma covalente al peptidoglucano. Estas protenas son capaces de anclarse en la regin FC de las Ig G humanas y de activar el C'. Factor de aglutinacin: Tambin conocido como coagulasa. Se encuentra pegado a la superficie externa de Staphylococo aureus y fija fibringeno mediante una reaccin no enzimtica. Polisacridos: Algunos Staphylococos aureus poseen una cpsula polisacrido situada en la parte externa de la pared celular capaz de inhibir la fagocitosis por los leucocitos polimorfonucleares. 5. ENZIMAS Y TOXINAS El efecto ms o menos patognico e Staphylococo aureus para hombre depender de: Ag presentes principalmente en la pared. Toxinas. Enzimas. A. TOXINAS Hemolisina: de composicin proteica y en general lisa con facilidad los eritrocitos, adems de tener efectos txicos sobre clulas como macrfagos y GB. Debido a esta propiedad estas exotoxinas son conocidas como citotxicas. Son en general muy sensibles al calor y se conocen un total de cuatro que son: Alfa hemolisina o alfatoxina: ataca los hemates produciendo una hemlisis total alrededor de las colonias en medio agar sangre o agar chocolate. Por va subcutnea es dermonecrtica, con ella se pueden hacer vacunas. toxina o hemolisina: responsable de la hemlisis parcial de hemates. Gamma hemolisina: interviene en lesiones y heridas pero tienen poca importancia patgena, no producen hemlisis. Delta toxina: tiene una accin detergente sobre membranas biolgicas y se le ha asociado un papel en la diarrea aguda en algunas infecciones staphyloccicas. Leucotoxinas o Leucocidinas: son responsables de matar leucocitos polimorfo nucleares y macrfagos proporcionando una gran resistencia a las bacterias. Enterotoxina: son responsables de intoxicaciones alimentaras de las que se conocen 6 serotipos distintos (A ! F). Se trata de toxinas termoestables y resistentes a la accin de jugo gstrico, unindose posteriormente a los receptores nerviosos del tubo digestivo y actuando sobre el centro del vomito, lo que origina numerosos vmitos, nauseas y diarreas. La intoxicacin alimentara no cursa con fiebre. Exfoliativa: engloba 2 toxinas responsables de los daos dermatolgicos que tienen lugar en el sndrome de la piel escaldada provocando una lesin caracterizada por una aparicin de ampollas. Toxina responsable del Shock Txico: se ha observado que es ms comn en mujeres que utilizan tampones. B. ENZIMAS 70

 Coagulasa: coagula en el plasma sanguneo al activar el fibringeno, as pues la coagulasa interviene en la formacin del coagulo. Fibrinolisinas o Staphyloquinasas: destruyen los cogulos sanguneos formando micrombolos que facilita la diseminacin del trombo, es decir, ejercen un efecto opuesto a la coagulasa. Hialurodinasa: disocia la sustancia fundamental del tejido conjuntivo facilitando la penetracin del Staphylococo. Lactomasa o penicilasa: rompe el anillo lactamico de las penicilinas apareciendo resistencia a las penicilinas. Lipasas, esterasas y proteinasas: que hidrolizan lpidos, esteres y protenas. Catalasa y Nucleasa: la nucleasa produce la ruptura de cidos nucleicos. Catalasa (ya explicada). 6. PATOLOGIA Estudio de las enfermedades producidas por Staphylococos. a. Infecciones superficiales: Principalmente producen: fornculos ntrax. problemas en la piel que producen muerte del tejido. heridas quemaduras. infeccin en el acn. b. Infecciones intestinales: relacionadas con: vmitos nauseas diarrea mal esta a veces fiebre La producen las enterotoxinas. c. Infecciones hematolgicas: dando lugar a: bacteriemia se le ha atribuido a Staphylococo aureus el Sndrome de Shock Txico caracterizado por fiebre, erupcin descamativa, hipotensin y afectacin multisistmica (daos en distintos rganos). d. Infecciones respiratorias: sinusitis laryngitis faringitis bronquitis neumona. e. Localizaciones varias: Puede dar: artritis endocarditis pericarditis 71

 meningitis neumona osteomielitis 7. INFECCIONES HOSPITALARIAS O NOSOCOMIALES Staphylococo aureus constituye el principal patgeno dentro de Staphylococos. Se le denomina el microorganismo dorado ya que produce un pigmento de color amarillo. Aproximadamente entre un 2 40 % de adultos son portadores nasales y un 10 % de las mujeres lo llevan en la vagina. Hay un grupo de poblacin que son ms propensos a ser colonizados por Staphylococo aureus: personal sanitario, adictos por intravenosa, diabticos y pacientes tratados por hemodilisis. Es importante sealar el Staphylococo epidermis que es causante de bacteriemia y endocarditis infecciosa, peritonitis, osteomielitis, infeccin del tracto urinario. El Staphylococo saprofitico es un agente ideolgico de infecciones importantes del tracto urinario en mujeres jvenes sexualmente activas. 8. DIAGNOSTICO Directo: vamos a hacer dos subgrupos: Infecciones no intestinales: se recoge la muestra en condiciones de asepsia de pus, exudados superficiales, LCR, sangre. Se realiza un Gram, se cultiva en agar sangre y se realizan pruebas bioqumicas como catalasa y coagulasa. Infecciones intestinales: la toma de muestra se hace de los alimentos sospechosos y no de heces (ya que en condiciones normales puede aparecer Staphylococo aureus en heces (flora habitual)). Se busca la enterotoxina y no se cultivan grmenes ya que no es el productor de la enfermedad. Tambin se investigan los portadores. Indirectos: no se suele hacer, si se quisiera buscar Ac frente a antihemolisinas, antileucocinas o anticoagulantes (lo que se busca son Ac frente Ag especficos) 9. SENSIBILIDAD ANTIBIOTICA La sensibilidad de Staphylococo aureus a los antibiticos ha disminuido de forma importante en los ltimos aos. Poco despus de la introduccin de la penicilina G apareciendo cepas de Staphylococos que destruyeron el antibitico por las penicilasas. En pacientes con cepas de Staphylococo productoras de penicilasa la penicilina no es eficaz. La introduccin de las tetraciclinas y eritomicinas que se mostraron efectivas en el tratamiento poco despus de ser comercializadas se aislaron numerosas 72

cepas hospitalarias, resistentes a estos antibiticos. La introduccin de las penicilinas semisinteticas no ha resuelto el problema. As la resistencia a ampicilina es del orden del 85% igual que la amoxicilina. El desarrollo de las penicilinas semisintticas resistentes a la penicilasa como la meticilina, oxacilina, doxacilina han resuelto en parte el problema. Hoy en da los antibiticos mas utilizados son Vancomicina, Rifampicina y Ciprofloxacina siendo muy til las Cefalosporinas y Aminoglucsidos. STREPTOCOCO 1. Introduccin (Morfologa y Caractersticas) 2. Aislamiento 3. Pruebas de Identificacin Prueba S.F. o glucosa azida Prueba de la Bacitracina Prueba de sensibilidad a Optoquicina Solubilidad en bilis Prueba Voges Proskauer APIs Otras pruebas: Catalasa Oxidasa Fermentacin de HC, etc. 4. Estructura Antignica Ag de pared especfico de grupo (LANCEFIED) Protena M Otros Ag 5. Clasificacin hemolticos Grupo D: Enterococos No Enterococos hemolticos: Streptococo viridans Streptococo pneumoniae 6. Enzimas y Toxinas

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 Enzimas: Fibrinolisina o streptoquinasa Hialuridinasa Desoxirribonucleasa Proteinazas Toxinas: Toxina eritrgenica Hemolisina : O y F 7. Patologa Streptococo pyogenes: Tejidos (eripsipela) Infecciones locales Enfermedades poststreptoccicas no supurativas Streptococo agalactiae Streptococo grupo C Streptococo viridans Streptococo pneumoniae Streptococo grupo D 8. Diagnstico 9. Sensibilidad a los antibiticos 1. INTRODUCCIN Son cocos gram + agrupados en cadenas o parejas, inmviles, no pigmentados, no esporulados, con o sin cpsula. Pueden ser saprofitos o patgenos en funcin de su ubicacin. En los cultivos viejos la bacteria puede perder su carcter gram + y aparecer como gram . Bioqumicamente son : catalasa , oxidadsa , fermentan lo HC, no producen gas, indol ni SH2. 2. AISLAMIENTO Son aerobios y anaerobios facultativos pero crecen mejor en medios que presenten un 10% de CO2. Su temperatura es de 1545C siendo la ptima 37C. Los medios de cultivo son: M. Generales: agar sangre y agar chocolate. M. Enriquecimiento: caldo tripticasa de soja e infusin cerebro corazn. 74

 M. Selectivos: contienen antibiticos (Ab) que inhiben el desarrollo de la flora acompaante. Ej: agar columbiacolistinanalidixlico. M. Selectivos de enriquecimiento: favorecen el desarrollo de Streptococos inhibiendo el desarrollo del resto de microorganismos. Ej: glucosa azida (inhibe bacilos gram ) y violeta de cristal (inhibe Staphylococos). En agar sangre se comprueba la hemlisis (ver hemlisis). 3. PRUEBAS DE IDENTIFICACIN 1. Prueba de S.F. o de la glucosa azida Fundamento: Consiste en comprobar el crecimiento de microorganismo en presencia de azida sdica y en su caso la capacidad de fermentar la glucosa. Reactivos: El medio de cultivo (m.c.) es el caldo S.F. el cual es selectivo para Streptococo fecalis y Enterococo. Tcnica: 1. Se inocula el microorganismo cogiendo con un asa una colonia de 24horas y se pone en el caldo S.F. 2. Se incuba a 38C y se realiza la lectura a las 24 horas. Resultados: Si hay turbidez en el medio la prueba el positiva con crecimiento bacteriano. La modificacin del color indica fermentacin de la glucosa. 2. PRUEBA DE LA BACITRACINA Fundamento: Los Streptococos hemolticos del grupo A se distinguen de los dems porque son sensibles a la bacitracina. Reactivos: Se utiliza como m.c. agar sangra al 5% y como reactivos discos de bacitracina. Tcnica: 1. Inocular por diseminacin de superficie un placa de agar sangre con la suspensin de microorganismo problema. 2. Dejar reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos. 3. Colocar con unas pinzas estriles un disco de bacitracina. Incubar a 37C 24 horas. Resultados: Los Streptococos hemolticos del grupo A inhiben el crecimiento alrededor del disco con un dimetro de 1018 mm. Los dems Streptococos no inhiben si crecimiento. 3. PRUEBA DE LA SENSIBILIDAD A LA OPTOQUINA Fundamento: El crecimiento de Streptococos pneumoniae se inhibe por la optoquina, mientras que no afecta a otros Streptococos. Reactivos: El m.c. utilizado es agar sangre de cordero o humano y discos de optoquina. Tcnica: 1. Empapar un hisopo con una suspensin de Streptococo, inocular la palca 75

y dejar reposar a temperatura ambiente. 2. Depositar presionando un disco de optoquina para favorecer el contacto con el medio (algunos autores consideran importante aadir al disco una gota de agua destilada para favorecer el crecimiento del halo de inhibicin). 3. Incubar a 35C durante 1824 horas. Resultados: El crecimiento de Streptococo pneumoniae queda inhibido con ms de 15 mm de halo de inhibicin alrededor del disco. NOTA: Si la zona de inhicin es menor de 15mm es indispensable confirmar que es un neumococo con una prueba de solubilidad en bilis. 4. PRUEBA DE SOLUBILIDAD EN BILIS Fundamento: Se basa en la capacidad de determinadas especies (spp) bacterianas de lisarse en medios con sales biliares. Los ms utilizados son desoxicolato sdico y taurocolato sdico al 2%. Ambos provocan un descenso en la tensin superficial que unido a la accin de enzimas autolticas destruyen las clulas. El efecto de esta enzima autoltica se pone de manifiesto sobre colonias viejas de Streptococo pneumoniae crecidas en medio slido. Tcnica: 1. A 5ml de un cultivo de 24 horas se aade 0.5ml de solucin de sales biliares al 10%. 2. Agitar la mezcla con cuidado e incubar a 35C. Resultados: Si antes de 3 horas de incubacin se produce aclaramiento del contenido del tubo se interpreta como soluble en bilis, tendremos Streptococo pneumoniae. Si permanece turbia se interpreta como insoluble en bilis por lo que tendremos otros Streptococos. NOTA: Es esencial el control del pH, ya que si las condiciones son cidas se puede producir un precipitado del desoxicolato. 5. PRUEBA DEL VOGES PROSKAUER 6. OTRAS PRUEBAS 7. APIs 4. ESTRUCTURA ANTIGNICA 1. ANTGENO DE PARED ESPECFICA DE GRUPO Se trata de un carbohidrato localizado en la pared de muchos Streptococos que ha permitido una clasificacin serolgica en los llamados grupos de LANCEFIED. Esta especificidad serolgica de HC especfico de grupo viene determinada por un aminoazcar, as los Streptococos del:

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 Grupo A: tienen como aminoazcar la ramosa Nacetilglucosamina Grupo B: tienen como aminoazcar la ramosa glucosamina Grupo C: tienen como aminoazcar la ramosa Nacetilgalactosamina Grupo D: tienen como aminoazcar la ramosa cido glicerolteicoico Grupo F: tienen como aminoazcar el glucopiranosilNacetilgalactosamina 2. PROTENA M Se trata de un antgeno proteico que pertenece a la pared celular y constituye el principal factor de virulencia de Streptococo pyogenes. Aparece como proyecciones similares a pelos que emergen de la pared y su presencia io ausencia condiciona la virulencia de las cepas. En el caso de que no exista en el husped Ac contra esta protena, las cepas de Streptococo pyogenes con proetena M son capaces de resistir la accin de los fagocitos polimorfonucleares. Esta protena tambin est implicada en la adherencia a clulas epiteliales. Existen ms de 80 tipos distintos de estos Ag, por lo que una persona se puede infectar repetidamente con cepas de Streptococo pyogenes con distintas protena M en su pared. 3. OTROS ANTGENOS Son las sustancias T y R localizadas en la pared celular y nucleoprotenas. En el Streptococo pneumoniae su presencia en la cpsula polisacrida impide que sean ingeridos por fagocitos. Adems es antignica de modo que los Ac frente a la cpsula del pneumococo confieren inmunidad. Existen ms de 80 tipos distintos de Ag capsulares. 5. CLASIFICACIN DE LOS STREPTOCOCOS (Ver fotocopias tabla 6.3) En general, los Streptococos se pueden clasificar en funcin de: Comportamiento antignico frente a distintas pruebas biolgicas Por el tipo de hemlisis Por pruebas bioqumicas. El resultado es la clasificacin en tres grupos importantes: hemolticos: corresponden a distintos grupos denominados con letras del alfabeto griego Grupo D: pueden ser Enterococos y no Enterococos Hemolticos: Se encuentran el Streptococo viridans y Streptococo pneumoniae. 6. ENZIMAS Y TOXINAS

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A. Toxinas: tienen capacidad antignica: T. Eritrognica: provoca el exantema de la escarlatina y erisipela. Es antignica y da lugar a la formacin de una antitoxina especfica. Hemolisinas o estreptolisina: destruyen los hamates y podemos distinguir dos tipos: Estreptolisina O: protena que se inactiva en presencia de oxigeno. Los anticuerpos dirigidos contra ella se denominan ASO, ASLO o AEO (serian antiestreptolisina o ). Cuando un individuo tiene un titulo superior a 250u, sugiere una infeccin reciente por Estreptococos. Estreptolisina S: resistente a la accin del oxigeno. No tiene accin antignica. B. Enzimas: Fibrinolisina o estreptoquinasa: transforma el plasmingeno en plasmina (sustancia responsable de la lisis de lisina) ha sido utilizada por va intravenosa para el tratamiento de embolias y trombosis. Hialudinasa: desdobla el cido hialurnico del tejido conjuntivo, favoreciendo la diseminacin del coco. Tambin induce anticuerpos especficos. Se ha facilitado para la absorcin de medicamentos. 7. PATOLOGA 1. streptococos pyogenes : del grupo A, produce enfermedad por: Invasin de tejidos: es el agente etiolgico de la erisipela (inflamacin aguda de la piel con afectacin de vasos linfticos cutneos, cursa con fiebre elevada y escalofros), el rea afectada suele ser la cara y en ocasiones tronco y extremidades. Tambin puede producir sepsis; la infeccin puede afectar al recin nacido. Tambin puede ocasionar celulitis, linfagitis y miositis (miomsculo). Infecciones locales: la fundamental es faringitis, es ms benigna en nios que en adultos. La toxina puede provocar inflamacin de tejidos que bloquean el paso de aire y producir asfixia. Tambin puede dar lugar a pioderma y procesos de endocarditis, otitis, meningitis y neumona. Enfermedades postestreptococicas no supurativas: fiebres reumticas y glomerulonefritis. Se trata de procesos autoinmunes por reacciones cruzadas por Acs. dirigidos contra Streptococos que se unen a las clulas del rin y en ocasiones a las del miocardio formando inmunocomplejos en estos rganos. Estos complejos atraen las clulas defensivas del husped que son las que originan dao. Se conocen como no supurativas porque en los rganos afectados no se encuentran presentes los microorganismos ni existen reacciones inflamatorias. 2. streptococos agalactiae: Pertenecen al grupo B de Lancefied. Produce hemlisis y forma parte de la flora normal del tracto genitourinario, encontrndose en la vagina de las mujeres sanas, desde donde pasa al recin nacido en el momento del parto. Es el agente etiolgico ms frecuente de sepsis y meningitis neonatal. 78

Tambin se ha visto implicado en osteomielitis, infeccin del tracto urinario, heridas, endocarditis y neumonas. Se asocia a infecciones oportunistas. 3. streptococos del grupo C: Aparecen como saprofitos en la rinofaringe, tracto gastrointestinal y vagina. En raras ocasiones puede actuar como patgeno dando lugar a faringitis, endocarditis, glomerulonefritis, bacteriemia, etc. Pueden provocar sepsis en el parto. 4. streptococos viridans Son saprofitos del tracto respiratorio y gastrointestinal (placa dental, orofaringe, etc.), sin embargo se les ha considerado como patgenos oportunistas, siendo la principal causa de endocarditis bacteriana aguda. Las especies implicadas con mayor frecuencia son: S.mutans (principal agente etiolgico de la caries dental) S.sanguis I, II. Las especies del grupo viridans tambin pueden producir abscesos, neumona y otras infecciones supurativas. 5. streptococos neumoniae Se agrupan en parejas (diplococos) rodeadas de una cpsula, siendo por tanto inmviles, capsulada y no esporuladas. Para evidenciar la virulencia del neumococo se buscan las cpsulas con tinta china o con Acsanticapsulares especficos, provocando un precipitado de la cpsula que se denomina hinchazn de la cpsula o reaccin de Quelluns. Es el agente productor de neumona neumococica, proceso en el que hay una reaccin de tipo inflamatorio en las reas pulmonares donde se desarrolla el germen lo que conlleva una vasodilatacin de los capilares de la zona con salida del plasma, hemates y leucocitos, lo que supone una solidificacin por coagulacin. Clnicamente se presenta con disea, fiebre, dolor pleural, tos productiva, edemas y mal estar general. Su poder patognico se debe a la capacidad que tiene para multiplicarse en los tejidos e inducir la reaccin produciendo fibrosis, siendo sta una reaccin de tipo cocatricial producida por el tejido conjuntivo en la zona afectada en respuesta a un agresin. Tambin produce sinusitis, otitis, meningitis, etc. La principal fuente de infeccin son las gotculas. 6. streptococos del grupo D Pueden ser , o hemolticos, resisten bien los agentes externos, incluso los antibiticos. Se dividen en :

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 Enterococos, corresponden a S.fecalis y S.faecium entre otros. Son saprofitos del intestino del hombre (apareen normalmente en heces, vagina y cavidad oral). Son agentes etiolgicos de endocarditis, bacteriemia, infeccin del tracto urinario, SNC, heridas, abscesos intrabdominales. En ocasiones el origen de infecciones nosocomiales. No enterococos, corresponden a S.bovilis, S.equinus que afectan a vacas y caballos. 7. DIAGNSTICO Directo: se emplea agar sangre para ver las hemlisis y posteriormente se hacen las pruebas bioqumicas. Indirecto: a travs de estudios serolgicos buscando el ASLO (antiestreptolisina O). 8. SENSIBILIDAD ANTIBITICA Streptococo pyogenes: sensible a penicilina y eritromicina. Streptococo agalactiae : sensible a penicilina, ampicilina, cefalosporina y vancomicina. Los aminoglucoxidos se usan combinados con la penicilina para el tratamiento de la endocarditis ya que actan de forma sinrgica. Enterococos: son los Estreptococos ms resistentes, presentan resistencia a cefalosporinas y penicilina, la mayor parte son tambin resistentes a las tetraciclinas, aminoglucoxidos, clidamicina, cloranfenicol y sulfamidas. Son sensibles a : imipenem, ciprofloxacina y vancomicina. Neumococos: el frmaco de eleccin es la penicilina, aunque existen cepas resistentes a este antibitico. La mayor parte de Streptococos son sensibles a la cefotaxima. 9. OTROS COCOS GRAM + Pediococos y leuconstoc, son catalasa . Su principal caracterstica es la resistencia a la vancomicina. Lactococus, se usa en la industria lactea y es una especie no patgena. Gemella, produce procesos de endocarditis. TEMA 14. COCOS GRAM NEGATIVOS. NEISSERIA Y BRAHNAMELLA (MORAXELLA). NEISSERIA 1. INTRODUCCIN. 2. CULTIVOS. 3. CLASIFICACIN DE LAS NEISSERIAS Neisseria meningitidis. Neisseria gonorreae. Otras 80

4. NEISSERIA MENINGITIDIS Poder antignico. Patologa. Epidemiologa. Toma de muestras. Pruebas qumicas y serolgicas. Vacunas y tratamiento. 5. NEISSERIA GONORREAE: Poder antignico. Patologa. Epidemiologa. Toma de muestras. Pruebas qumicas y serolgicas. Vacunas y tratamiento. 6. MORAXELLA CATARRHALIS 1. INTRODUCCIN. Son anaerobios estrictos, se presentan en parejas (diplococos), dentro de los leucocitos polimorfonucleares con aspecto de rin o grano de caf. Son inmviles y pueden presentar cpsula (+ virulentos). Algunos pueden producir pigmentos de naturaleza carotenoide y color amarillo. Bioqumicamente son catalas (+), oxidasa (+) y fermentadores de hidratos de carbono con produccin de cido sin gas. Muy importante a tener en cuenta son los mtodos serolgicos (inmunofluorescencia, aglutinacin, fijacin del complemento, precipitacin, ELISA, etc.). 2. CULTIVOS. Son aerobios y crecen a temperaturas aproximadas de 37C, cesando el crecimiento por debajo de 30C. La adiccin al medio de un 510% de CO2 favorece el crecimiento. Es importante tener en cuenta que se inhibe con la presencia de cidos grasos y sales presentes en el agar. Son microorganismos sensibles que no resisten a la desecacin ni a la exposicin prolongada a la luz, en estas condiciones elaboran enzimas autolticos que conducen a su destruccin. Existen distintos medios: Medios normales de aislamiento: agar sangre y chocolate. Medios selectivos: ThayerMartin, que llevan antibiticos (para 81

destruir otras bacterias gram + y ) y antifngicos (para destruir hongos). Tambin es selectivo el medio New York City (NYC). Los antibiticos que pueden llevar son: colistina (inhibe bacilos gram ), vancomicina (inhibe los bacilos gram +), etc. Hay una modificacin de ThayerMartin que lleva trimetroprim que inhibe Proteus. Estas bacterias se localizan en las mucosas de los tractos respiratorio, digestivo y genitourinario del hombre y los animales. nicamente las especies de Neisseria meningitidis y Neisseria gonorreae se consideran patgenos para el hombre. 3. CLASIFICACIN DE NEISSERIAS Se pueden distinguir tres grupos: Neisseria meningitidis: Producen meningitis y son muy difciles de cultivar siendo necesario un medio especfico y una temperatura de 3537C. Se denomina meningococo. Neisseria gonorreae: Se le denomina gonococo. Son muy exigentes, requieren cultivos muy especficos y una temperatura de 3537C. En muchos casos su crecimiento se ve favorecido por un aporte de CO2 del 510%. Neisserias saprofitas: Se encuentran en el aparato genital y en la rinofaringe. Son microorganismos poco exigentes. Crecen a temperatura de 2235C. Resisten bien a los agentes externos. Crecen en medios generales. (Ej: N. subflava, N. lacatamica y N.sicca). 4. NEISSERIA MENINGITIDIS A. PODER ANTIGNICO. El polisacrido capsular producido por N.meningitidis ha conducido a la clasificacin de este microorganismo en 13 serogrupos. El diagnstico de N.meningitidis puede realizarse por la deteccin de los Ag capsulares en muestras orgnicas (LCR, suero, etc)mediante tcnicas de aglutinacin e inmunofluorescencia que transmiten un diagnostico precoz. El meningococo posee adems otros determinantes antignicos como las protenas de membrana, los pilis y liposacridos (responsables de la mayor parte del proceso de infeccin meningoccica). B. Patologa El hombre es el nico husped natural para el meningococo.Se encuentra frecuentemente en la nasofaringe de individuos sanos portadores, los microorganismos se adhieren a las clulas faringeas con los pilis. 82

El cuadro clnico comienza con rinofaringitis leve que afecta sobre todo a los nios, ya que en adultos aparece Ac protectores frente al meningococo. De esta faringitis leve se evoluciona a una forma ms severa pudiendo complicarse a bronquitis. Si el meningococo pasa a sangre puede dar lugar a una sepsis meningococica que va acompaada de petequias, cefaleas, fiebres altas y fracaso suprarrenal dando lugar a un sndrome denominado WaterhoseFriederichen. Puede pasar a LCR alcanzando las meninges y provocando meningitis con un cuadro caracterizado por la rigidez de nuca, cefaleas y vmitos en escopetazo, fiebre, etc. El microorganismo meningococo puede producir artritis y con menor frecuencia neumona, faringitis y uretritis. C. Epidemiologa La meningitis por Neisseria meningitidis suele ocurrir en brotes epidmicos. Los nios entre 6 12 meses y adolescentes son los que se afectan con mayor frecuencia. Un individuo puede tener colonizada su nasofaringe por el meningococo y no desarrollar sntomas ni infecciones (portador). En periodos interepidemicos de 5 a 30 % de la poblacin puede ser portadora. En pocas de epidemia los portadores aumentan hasta un 70 80 %. El contagio ser por va area, siendo muy importante los factores de agregacin. D. Toma de muestra Podemos hacer: Hemocultivo se existe sepsis. Frotis faringeo para buscar portadores. LCR mediante puncin lumbar: Se toman 2 tubos y se transportan inmediatamente al laboratorio. Se centrifugan los tubos: Con el sedimento se realiza un gram o azul de metileno, puede haber cocos que si son gram () ser meningitis meningococica y si son gram (+) habr que cultivar y hacer la prueba de la catalasa que si es (+) ser Staphylococo y si es () meningitis pneumococica (producida por Estreptococo pneumoniae). Si aparecen bacilos en el gram, si son BAAR indica meningitis tuberculosis (producida por Micobacterium tuberculosis). Con el sobrenadante se estudiara albminas, Ig as como polisacridos capsulares o reacciones inmunolgicas. Tambin se pueden observar polimorfonucleares, glucosa disminuida y cloruros normales o disminuidos. En personas afectadas por Neisserias meningitis el LCR es turbio, purulento 83

y con abundantes meningococos. E. Pruebas bioqumicas y serolgicas Bioqumicas ! catalasa (+), oxidasa (+) y fermentacin de hidratos de carbono. Serologicas ! inmunofluorescenia directa y ELISA. F. Vacunas y tratamientos Existen vacunas en caso de epidemias produciendo una inmunidad de grupo. Las hay frente a los serogrupos A y C pero no contra B que es la que con ms frecuencia origina epidemias. El antibitico de eleccin es la penicilina, en individuos alrgicos a estos se administra cefalosporina. El estado de portador no se puede erradicar con penicilina porque ha creado resistencia, es necesario administrar rifanticina. Un nuevo antibitico lactamico distinto de la penicilina y cefalosporina es el moxalactan, ha dado buenos resultados y se difunde rpidamente por el LCR. 5. NEISERIA GONORREAE A. Poder antignico Es una bacteria con una composicin antignica compleja y capaz de modificar para eludir la R.I. del husped. Entre los componentes antignicos se encuentran los pilis que permiten adherirse a las clulas epiteliales del husped y evitar la fagocitosis. Posee tambin varias protenas con carcter antigenico: Protena I o POR: forman parte de la superficie dando lugar a la formacin de poros a travs de los cuales entra en la clula ciertos nutrientes. Protena II u OPA: mantiene la adherencia y la ayuda a anclarse en las clulas del husped. Protena III o PMR: se asocian a las protenas POR para formar los poros de la superficie celular. Posee liposacridos con carcter antignico y endotxico. B. Patologa Neisseria gonorreae tiene apetencia por las mucosas principalmente por las urogenitales. Los cuadros clnicos son: Gonorrea o Blenorragia Tpica: es una E.T.S. que afecta a la mucosa urogenital produciendo sudoracin purulenta, disuria (dolor en la miccin), puede conllevar a esterilizacin o estrechecimiento en vas 84

urinarias. Es un microorganismo muy infectivo (con un solo contacto es posible padecer la enfermedad). En el varn es mas frecuente la uretritis gonoccica con la denominada dota matinal o militar. El periodo de incubacin es de 2 15 das, la infeccin puede ascender y dar cistitis, prostatitis y orquitis, en la mujer puede cursar sintomticamente, puede producir uretritis, cistitis, cervititis, endometritis u osferitis, peritonitis, salpintigitis. Puede llegar a producir esterilidad. Enfermedad Gonoccica Atpica: localizada en faringe y regin anorectal. Septicemias: mas frecuentes en mujeres sintomticas caracterizada por lesin en la piel, Ej.: papulas, pstulas y en extremidades (artritis, principalmente en tobillos y muecas). Oftalmia neonatal: Puede aparecer en raras. Es una conjuntivitis purulenta del recin nacido que al pasar por el conducto del parto se infecta, puede producir ceguera. La prevencin hasta hace unos aos era con nitrato de plata, hoy se utilizan colirios de penicilina. C. Epidemiologa Es una enfermedad de distribucin mundial transmitida casi exclusivamente por transmisin sexual y principalmente por mujeres portadoras crnicas asintomticas. D. Toma de muestra En el hombre la muestra ser tomada del pus de la gota matinal. En la mujer de la mucosa vaginal y del crvix y en los homosexuales en el recto y uretra. En septicemias la toma de muestra puede ser sangre y muestra farngea. E. Pruebas bioqumicas y serolgicas Se realizan las mismas pruebas que Neisseria meningitidis. Bioqumicas ! catalasa (+), oxidasa (+) y fermentacin de hidratos de carbono. Serologicas ! inmunofluorescenia directa y ELISA. F. Vacunas y tratamientos Con penicilina o ampilicilina se crea resistencia, se suele sustituir por cefalosporinas. Es conveniente administrar simultneamente cefalosporinas con tetraciclina o eritomicina, debido a la concomitancia de infecciones (varias infecciones a la vez por parte de ms de un microorganismo) por Clamidias. En el neonato la gonococia ocular se trata con nitrato de plata con instilacin en el saco conjuntival. Tambin se puede tratar con antibiticos. 6. MORAXELLA CATARRHALIS.

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Se habla de Moraxella o Brahnamella. Es catalasa y oxidasa (+), no fermentan ningn azcar, dan positiva la DNAasa, reduce nitratos, lo que la diferencia de las Neisserias. Produce la enzima butiratoesterasa y lactamasa. Crecen bien en medios habituales como agar sangre y chocolate. Su temperatura ptima es de 35C y la incubacin puede hacerse en una atmsfera con CO2. Las colonias son blanco grisceas en agar sangre o chocolate. Estas bacterias pueden formar parte de la flora normal del tracto respiratorio superior de individuos sanos. No obstante se ha aislado como patgeno en ciertas infecciones, como: septicemia, meningitis, endocarditis,y en infecciones otorrinolaringologicas. Brahnamella catharralis es responsable del 1015% de los casos de otitis media y es un agente etiolgico importante de sinusitis. Los individuos ms susceptibles a padecer esta infeccin son los ancianos y los nios. Las cepas productoras de lactamasa se consideran resistentes clnicamente a la penicilina, ampicilina y amoxicilina (los antibiticos que tienen un anillo lactamico esta enzima lo rompe y se hacen resistentes). Son sensibles a amoxicilinaclavulanico y ampicilinasulfbactem. TEMA 15. COCOBACILOS GRAM NEGATIVO. Haemophylus 1. INTRODUCCIN. 2. CLASIFICACIN E IDENTIFICACIN. Dependencia del factor X y V. Pruebas bioqumicas. Pruebas serolgicas. 3. HAEMOPHYLUS INFLUENZAE. Patologa Tratamiento. 4. HAEMOPHYLUS DUCREY. Patologa Tratamiento. 5. AISLAMIENTO Y DIAGNSTICO BACTERIOLGICO. Toma de muestras. Tinciones. Medios de cultivo. 86

 Pruebas bioqumicas y serolgicas. 1. INTRODUCCIN. El gnero Haemophylus est formado por bacterias gram (), aerobios y anaerobios facultativos, inmviles y no esporulados. Algunas especies poseen cpsula. Son parsitos obligados del tracto respiratorio superior del hombre y animales, llegando a constituir hasta un 10% de la flora acompaante de la orofaringe en los individuos sanos. Las especies del gnero Haemophylus fermentan los hidratos de carbono con produccin de cido, producen nitratos y la mayor parte son catalasa y oxidasa (+) . El crecimiento viene condicionado por la presencia en el medio de factor V y X. El factor V a diferencia del X no se encuentra libre en sangre, para liberarlo deben romperse las clulas sanguneas por calentamiento. Los medios de cultivo son agar sangre y chocolate que deben incubarse a 3537C y en atmsfera de un 510% de CO2. Tambin se puede emplear como medio especfico Levinthlal. 2. CLASIFICACIN E IDENTIFICACIN. Existen distintas especies del gnero Haemophylus, las principales desde el punto de vista patgeno para el hombre son H. influenzae y H. ducrey. Para la identificacin de las especies nos basamos en: Dependencia del factor V y/o X. Pruebas bioqumicas. (ver cuadro). Pruebas serologicas, aglutinacin el ltex y prueba de hinchamiento capsular. 3. HAEMOPHYLUS INFLUENZAE a. Patologa Es una bacteria que parasita exclusivamente al hombre localizndose en el tracto respiratorio superior. Accede a dicho tracto por inhalacin colonizando las mucosas. Hasta un 80% de personas pueden ser portadoras sin que desarrollen sntomas clnicos. Es capsulado (virulento) y se ha observado que la cpsula est formada por polisacridos distintos que segn sus caractersticas se diferencian en 6 serogrupos (a!f). En Espaa es ms frecuente la de tipo b. Este microorganismo es junto al neumococo (Streptococo neumoniae) uno de los agentes etiolgicos ms frecuentes de otitis media bacteriana y sinusitis aguda. Puede invadir el torrente circulatorio y alcanzar las meninges (produciendo meningitis) o localizarse en articulaciones (produciendo artritis). Es la causa 87

ms frecuente de meningitis en nios menores de 5 aos. En recin nacidos es muy rara la infeccin ya que poseen Ac maternos frente a este microorganismo. Tambin afecta a ancianos y adultos debilitados por procesos gripales. Ocasionalmente puede producir epiglotitis con obstruccin respiratoria aguda y un desenlace fatal si no se recurre a traqueotoma. Este microorganismo est implicado como agente etiolgico de neumona principalmente en nios y adultos con infeccin pulmonar o historia de alcoholismo. b. Tratamiento En ausencia de tratamiento puede ser mortal en el caso de meningitis y epiglotitis. El tratamiento de eleccin son ampicilina y cloranfenicol, aunque ltimamente existen cepas resistentes y se recomiendan las cefalosporinas. A partir de los 18 meses de vida los nios se pueden vacunar frente a Haemophylus b. 4. HAEMOPHYLUS DUCREY a. Patologa Es el agente etiolgico del chancro blando o chancroide (ETS), caracterizado por la presencia de lceras en los genitales y zona perianal. El periodo de incubacin es de 7 das, siendo una enfermedad muy similar a la sfilis. b. Tratamiento A base de eritromicina. 5. AISLAMIENTO Y DIGNOSTICO BACTERIANO a. Toma de muestras Se realiza en condiciones totalmente aspticas a travs de exudados farngeos esputo o lquido purulento en caso de infeccin de las vas respiratorias. En caso de meningitis se saca LCR por puncin lumbar. b. Tinciones Generalmente tincin de gram o tincin negativa para el estudio de la cpsula. c. Medios de Cultivo 88

Principalmente agar sangre o agar chocolate a los que aadimos discos con FV y FX y algn Ab para hacer ms selectivo el medio. d. Pruebas bioqumicas y serolgicas Pruebas bioqumicas: (ver cuadro) Pruebas serolgicas: principalmente pruebas de precipitacin y aglutinacin. Brucella 1. INTRODUCCIN. 2. AISLAMIENTO Y DIAGNSTICO BACTERIOLGICO. Estudio microbiolgico: Toma de muestras. Pruebas bioqumicas. Estudio serolgico: Test de seroaglutinacin o de Wright. Test de Coombs antibrucella. Test de rosa de bengala. Prueba de la introdermorreaccin con la melitina. Otras. Medios de cultivo. Tcnicas de cultivo: Tcnica de castaeda. Tcnica de isolator. 3. EPIDEMIOLOGA. 4. PATOLOGA. 5. TRATAMIENTO. 1. Introduccin y Clasificacin Son cocobacilos gram negativos, inmviles, no esporulados y aerobios estrictos. Algunos pueden presentar cpsula. Se observan agrupados en parejas o en cadenas cortas. Su temeperatura ptima de crecimiento es 37C y algunas especies necesitan presencia de CO2. Son catalasa +, la mayora dan la prueba de la oxidasa +, reducen NO3 y fermentan escasos HC. Las especies del gnero Brucella son parsitos obligados de animales y algunos producen infeccin en el hombre. Son bacterias de largo crecimiento y se destruyen con facilidad son temperaturas de pasteurizacin (aprox. 70C).

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2. AISLAMIENTO Y DIAGNSTICO BACTERIOLGICO No es fcil evidenciar la clnica de la brucelosis, debido a que en muchas ocasiones y sobre todo al principio de la enfermedad, sta es difusa (no hay sntomas claros de brucelosis) siendo necesario los estudios microbiolgicos y serolgicos. a. Estudio microbiolgico Toma de muestra: La recogida de muestra de los productos en los que se sospecha presencia de Brucella son principalmente sangre y en ocasiones lquidos orgnicos como pus y LCR. De la muestra de sangre se realiza hemocultivo, de vital importancia ya que la brucelemia (paso de Brucella a sangre) est presente en las primeras fases de la brucelosis, sobre todo en manifestaciones febriles, teniendo en cuenta que un resultado negativo de hemocultivo no excluye en principio la enfermedad. Pruebas bioqumicas: Se realizar al menos la prueba de la catalasa y oxidasa (+), as como la prueba del indol, gelatina, voges proskauer y rojo de metilo (). Tambin se realizan otras pruebas ( ver cuadro 12.3) b. Estudio serolgico Las pruebas ms importantes son: Test de seroaglutinacin o test de Wright: Consiste en diluciones sucesivas del suero problema en el medio que contiene antgeno purificado especfico (el Ag de la Brucella), por lo que los ttulos positivos (aglutinacin) indicarn un contacto previo con la Brucella si este es superior a 1/80. Los ttulos de brucelosis en fase aguda estn alrededor de 1/320. En casos de cronicidad los ttulos suelen ser muy bajos e incluso negativos, ya que en este tipo de pacientes aparecen muchos anticuerpos no aglutinantes (incompletos) que debern ser detectados por otras pruebas (test de Coombs). Test de Coombs antibrucella: Sirve para detectar anticuerpos incompletos. Es una tcnica muy especfica y til en Brucellas crnicas. Su negatividad no excluye brucelosis. Test de rosa de Bengala: Es una prueba muy rpida de aglutinacin y su negatividad no excluye brucelosis. Prueba de la introdermorreaccin con la metilina: Consiste en una inyeccin intradrmica en el brazo o antebrazo de un filtrado autolisado con bacterias muertas, pero con efecto antignico y otra inyeccin de carcter intradrmico (testigo calentado a 100C) en el otro brazo, que acta de control (). Transcurridas 8 horas se efectuar la lectura, si la reaccin es (+) aparecer una zona roja y edematosa de 3 o ms cm. de dimetro en el lugar donde se aplic el autolisado. Otras: fijacin del complemento, radioinmunoanlisis, etc. c. Medios de cultivo

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La Brucella es un microorganismo intracelular, por lo que necesitan compuestos nutricionales. Existen muchos medios para el aislamiento de Brucella: Medios lquidos: como el caldo tripticasa, el caldo de hgado, caldo de brucella, etc. Medios slidos: como el agar tripticasa, agar de brucella, etc. Medios selectivos: que contienen antibiticos, como el medio de Kurdas y Mose, Forwel o JonesMorgan. Las colonias de Brucella son pequeas y transparentes y son de dos tipos morfolgicos: Colonias lisas o S: son transparentes y corresponden a cepas virulentas cuya virulencia corresponde a dos factores virulentos: factor A y M, que son de naturaleza polisacrida. Colonias rugosas o R: no son patgenas. En la tincin de gram para Brucella se recomienda prolongar el tiempo de contacto con la safranina y resuspender las colonias sospechosas con una gota de solucin salina fenicada al 1%, depositndolo en el portaobjetos con el fin de evitar el peligro de contaminacin para el personal del laboratorio. d. Tcnicas de cultivo Las muestras de sangre se cultivan siguiendo dos tcnicas: Tcnica de Castaeda: Utiliza un medio bifsico (medios que tienen una fase lquida y otra slida en un mismo frasco). El medio lquido permite el enriquecimiento previo de la Brucella y el medio slido sirve para la siembra. Esta tcnica tiene las siguientes ventajas: manipilacin sencilla. frascos de cierre hermtico que dificultan la contaminacin. los frascos pueden llevar CO2. conservacin indefinida y transporte cmodo. El volumen de sangre que se siembra no debe superar el 20% del volumen del medio. El frasco se incuba a 3537C en posicin vertical y a las 48 horas se inclina para que la fase lquida impregne la fase slida y se incuba nuevamente en posicin vertical. El hemocultivo se observa cada 23 das hasta un total de 30 das. Tcnica de Isolator: En un sistema de lisiscentrifugacin realizado en el mismo tubo. La sangre inoculada se lisa por la accin de detergentes y se somete a concentracin por centrifugacin. El sedimento se siembra en medio slido. Esta tcnica tiene como ventajas: lisa las clulas sanguneas, por lo que permite una mayor recuperacin de patgenos intracelulares. se acorta el tiempo de aislamiento. mayor nmero de resultados positivos. 91

Inconvenientes: la tasa de contaminacin es mayor al no tratarse de incubacin en recipientes cerrados, sino en placas de agar. 3. EPIDEMIOLOGA. La brucelosis es una tpica zoonosis en la que el hombre es un husped accidental. Las posibles fuentes de contaminacin son: Contagio directo por: contacto con animales infectados inhalacin de aerosoles inoculacin contacto con mucosas principalmente en personas que trabajen con animales Contagio indirecto por ingestin de leche y derivados no pasteurizados. Es importante destacar el peligro que corre el personal del laboratorio que se puede infectar por: contacto con piel y mucosas. inhalacin de aerosoles. inoculacin accidental con agujas contaminadas. Por ello siempre que se sospeche Brucella hay que extremar las condiciones de trabajo. Recomendaciones: Trabajar en campana de seguridad. Usar ropa protectora. No oler ninguna placa de cultivo. Tirar directamente las jeringas del hemocultivo al contenedor. 4. PATOLOGA El periodo de incubacin de la Brucella es de 16 semanas; en este tiempo la Brucella se multiplica en el interior de las clulas en el retculo endoplsmico y de aqu pasa a sangre y tejidos donde se producen granulomas y abcesos. Es caracterstico el polimorfismo de la enfermedad y la recada en los primeros meses. Es frecuente que la infeccin se localice en distintos rganos ( hgado, msculo, huesos, etc). La Brucella melitensis causa un acusado neurotropismo (tendencia por SNC). En humanos las complicaciones ms frecuentes es la osteomielitis. La Brucella es el agente productor de brucelosis, fiebre de malta o fiebres ondulantes. Comienza con fiebre, debilidad, dolores seos y sudoracin. La fiebre aumenta por la tarde y disminuye por la noche apareciendo una 92

sudoracin con olor a paja mojada.. La enfermedad se disemina por va linftica alcanzando los ganglios linfticos, bazo, hgado y vrtebras donde se forman ndulos granulomatosos. 5. TRATAMIENTO Dado que se trata de un microorganismo intracelular y las reacidas son frecuentes, los tratamientos han de ser prolongados principalmente por tetraciclinasestreptomicinas. Tambin es til la rifancitina y la doxiciclina. En ninos menores de 14 aos se usa trimetroprimsulfametoxazol. Bordetella. 1. INTRODUCCIN. 2. CLASIFICACIN Y ESPECIES MS IMPORTANTES. 3. AISLAMIENTO Y DIAGNSTICO BACTERIOLGICO. Toma de muestras. Medios de cultivo. Tinciones. Pruebas bioqumicas y serolgicas. 4. EPIDEMIOLOGA. 5. PATOLOGA. 6. TRATAMIENTO Y PROFILAXIS. 1. INTRODUCCIN Es un bacilo gram , capsulado, mvil o inmvil, no formador de esporas y se considera parsito estricto. Crece en clulas epiteliales ciliadas del tracto respiratorio. Son muy sensibles al calor y desecacin y sobrevive muy poco fuera del hombre. 2. CLASIFICACIN Y ESPECIES MS IMPORTANTES La especie ms importante es Bordetella pertusis. (ver cuadro 12.4) 3. AISLAMIENTO Y DIAGNSTICO BACTERIOLGICO a. Toma de muestras Se toma en condiciones aspticas con una torunda impregnada en alginato clcico a travs de esputos o incluso con un escobilln de la zona nasofarngea. Tambin se puede tomar la muestra por expectoracin en placa en un medio especfico para Bordetella pertusis denominado Bordetgengou. 93

Las placas se incuban a 35C en atmsfera hmeda y CO2 opcional. Las colonias a los 57 das de incubacin son pequeas y de color blanco perlado (similar a gotas de Hg) b. Tinciones Se realiza tincin de gram, de esporas y de cpsula. c. Pruebas bioqumicas y serolgicas Pruebas bioqumicas: (ver cuadro 12.4) Pruebas serolgicas: Consiste en la bsqueda de Ac de Bordetella aglutinante mediante reacciones de precipitado del suero del paciente con suero especfico. Suelen emplear tcnicas de ELISA, fijacin de C e inmunofluorescencia. Son muy tiles en la fase terminal de la fase catarla y paroxstica cuando el microorganismo disminuye su nmero (en fase precoz es ms til el cultivo). 4. EPIDEMIOLOGA La enfermedad que produce se denomina tos ferina. El periodo de incubacin es de 710 das. La fuente de infeccin es el enfermo, generalmente nios menores de 5 aos. Se transmite por va respiratoria al toser, estornudar, hablar, etc. 5. PATOLOGA Bordetella pertusi posee una enterotoxina dermonecrtica y estimulante de la tos. Produce la tos ferina y la enfermedad comienza con un periodo catarral que dura 12 semanas. Es un catarro dbil con fiebre y tos muy contagiosa. Se contina con periodo paroxstico o espasmdico en el cual tras una inspiracin profunda se producen de 1012 golpes de tos breves pero peridicos. Bruscamente se produce una inspiracin profunda de carcter sibilante (silbido) que se asemeja al canto de un gallo (se denomina tos coqueluchoide). El trax queda fijo en inspiracin y el nio aparece ciantico volviendo a producir otra serie de golpes de tos. El mecanismo de la tos es mixto: Central: por accin de la enterotoxina en el centro de la tos Perifrico: por el esputo viscoso y filante y la compresin de los bronquios. Se observa un aumento de linfocitos y tambin puede estar acompaada de vmitos. Puede haber fiebre por asfixia. En lactantes es frecuetne la apnea (ausencia de respiracin), cianosis y 94

estertor (inspiracin forzada). Los nios mayores o adultos inmunizados presentan solamente sntomas catarrales o ligera bronquitis. 6. TRATAMIENTO Y PROFILAXIS Tratamiento: a base de eritromicina. La administracin de antibitico en la fase previa catarral erradica los microorganismos. Cuando la enfermedad ha entrado en su fase paroxstica la administracin de antibitico no bloquea el progreso de la misma. Se recomienda entonces la oxigenoterapia para evitar lesiones cerebrales. Profilaxis: durante el primer ao de vida se debe vacunar a los nios frente a Bordetella Pertussi, se administra la vacuna DTT (Difteria, Ttanos y Tos ferina). Francisella tularensis. 1. INTRODUCCIN. 2. AISLAMIENTO Y CARACTERSTICAS BIOQUMICAS. Toma de muestras. Estudios microbiolgicos y serolgicos. 3. PATOLOGA. 4. TRATAMIENTO. 1. Introduccin Es un cocobacilo gram aerobio y anaerobio facultativo y no esporulado, responsable de una enfermedad zoontica llamada Tularemia. Forma parte de la flora orofaringea normal de un gran nmero de animales salvajes, desde donde pasa al hombre por varias vas: Contacto con cadveres de animales infectados. Inhalacin de aerosoles. Ingestin de carne contaminada. Picaduras de moscas, mosquitos y garrapatas que actan de vectores de las bacterias. 2. Aislamiento y caractersticas bioqumicas Toma de muestras ! la toma de sangre se realiza de las heridas, esputo y sangre. Estudios serologicos y microbiolgicos ! en cuanto a los estudios microbiolgicos: tincin de gram y tincin de fluorescencia. Medio de cultivo ! Thaller Martin y agar sangre enriquecidos con glucosa y cistena a 37. Pruebas bioqumicas: catalasa y produccin de sulfhdrico. Pruebas serologicas: pruebas de aglutinacin y test de introdermoreaccin en la piel. 3. Patologa 95

Tiene un periodo de incubacin de 34 das. El paciente tiene fiebre, escalofros, dolor de cabeza y linfoadenopatias. La forma mas comn de la enfermedad es la Tularemia ulceroglandular, en la que se observa una lesin localizada en la puerta de entrada de las bacterias menos habituales, son las Tularemias OculoGlandular y Orofarngea asociado a infecciones en ojos y faringe. Si la infeccin se produce por inhalacin de aerosoles se vern afectados los pulmones dando lugar a Tularemia Pulmonar. La ingestin de carne contaminada dar lugar a Tularemia Tifoidal (infeccin sistmica con alta tasa de mortalidad). 4. Tratamiento Principalmente estreptomicina. Pasteurella. 1. INTRODUCCIN. 2. ESPECIES MS IMPORTANTES. 3. PATOLOGA. 4. AISLAMIENTO Y CARACTERSTICAS BIOQUMICAS. 1. Introduccin Son cocobacilos gram no esporulados, anaerobios facultativos capsulados y patgenos para algunos hombres y algunos animales. 2. Especies mas importantes Existen seis especies siendo la ms importante Pasteurella Multocida. 3. Patologa Tiene una estructura capsular de accin enterotoxica dando un efecto virulento principalmente en infecciones locales afectando a la piel. El foco de infeccin es a travs de las heridas, de aqu pasa s sangre ocasionando bacteriemia, a veces en enfermedades crnicas de origen pulmonar se han observado sobre infecciones originando cuadros de neumona. Tambin se ha visto implicada en Meningitis. 4. Aislamiento y caractersticas bioqumicas Toma de muestra: de heridas Tinciones: gram principalmente 96

 Medio de cultivo: agar sangre dando colonias pequeas y traslucidos que desprenden olor a champin. Pruebas bioqumicas: oxidasa, catalasa, Indol, nitratos +. Las colonias pueden ser rugosas, lisas o mucosas. Pruebas serologicas: aglutinacin. Tratamiento: penicilina. KINGELLA Cocobacilo gram forma parte de la flora normal de la orofaringe del hombre y rara vez produce dao en este. Se ha aislado en bacteriemia y en lesiones de piel y huesos. El tratamiento: penicilina, gentamicina y cloranfenicol. ACTINOBACILLUS Son cocobacilos gram inmviles y oxidasa +, forman parte de la flora oral habitual de un gran numero de animales domsticos. El hombre se infecta por inoculacin de esta bacteria generalmente por mordeduras. Una de las especies ms importantes es Actinobacillus Actinomycetemcomitans, se le ha asociado a peridontitis destructiva de los adolescentes. Se considera patgeno oportunista y es sensible a la penicilina. TEMA 16. BACILOS Y COCOBACILOS GRAM POSITIVOS 1. BACILLUS Introduccin Especies ms importantes Bacillus anthracis Epidemiologa Patologa Carbunco cutneo Carbunco pulmonar Carbunco intestinal Aislamiento y caractersticas bioqumicas Toma de muestra Tincin Medios de Cultivo Pruebas biqumicas Pruebas serolgicas Tratamiento Bacillus cereus (intoxicacin alimentaria) 2. LISTERIA Listeria monocitogenes Introduccin Patologa 97

 Aislamiento y caractersticas bioqumicas Toma de muestra Tinciones Medios de cultivo Pruebas bioqumicas Pruebas serolgicas Tratamiento 3. Corynebacterium Introduccin Especies ms importantes ! Corynebacterium difteriae Patologa y profilaxis Aislamiento y caractersticas bioqumicas Tratamiento 4. OTROS Erysipelothrix rhusiopathiae Kurthia Lactobacillus 1. BACILLUS A. INTRODUCCIN La familia Bacillaceae comprende los gneros Bacillus y Clostridium que son bacilos gram (+) formadores de esporas (Clostridium lo estudiaremos en un captulo aparte de anaerobios). El gnero Bacillus comprende numerosas especies ampliamente distribuidas en la naturaleza pero slo unas pocas tienen importancia patolgica, entre ellas destaca B.cereus y B. Anthracis. Se caracteriza por crecer la mayor parte a 37C en medios generales. Son aerobios y facultativos (pueden crecer en condiciones anaerobias) y esporulados. B. ESPECIES MS IMPORTANTES Bacillus anthracis Epidemiologa: Es una zoonosis principalmente siendo una enfermedad profesional de pastores, veterinarios, mataderos, etc. El germen entra a travs de rasguos, heridas, inhalaciones, etc. Patologa: Es el microorganismo causante del Carbunco o ntrax; hoy en da no se suele dar en pases industrializados pero s 98

en subdesarrollados. En un bacilo gram (+) que se agrupa en parejas o cadenas, con bordes cortantes, con aspecto de tiza o caa de bamb, capsulado, esporulado e inmvil. Se puede transmitir por inhalacin por lo que se deber realizar un aislamiento. Forma una exotoxina de carcter proteico con una accin muy txica y junto a presencia de cpsula proporciona a estas bacterias propiedades antifagocitarias. El carbunco humano tiene lugar tras el primer contacto con animales infectados que tras un periodo de incubacin de 23 das da lugar a: Carbunco cutneo o Pstula maligna: El poder patgeno se debe a la exotoxina que da lugar a una ppula que se transforma en vescula luego en pstula y posteriormente en lcera necrtica cubierta por una costra negra; a partir de sta se propaga por va linftica provocando linfagitis y septicemia. Los ms habitual son formas benignas que se curan con facilidad tras un tratamiento adecuado. Carbunco pulmonar: Cursa con edema pulmonar u pulmona debido a la inhalacin de polvo contaminado con esporas. Tambin se le denomina como la enfermedad de los cardadores de lana. Carbunco intestinal: Conlleva dolor abdominal, vmitos, diarreas, etc debido a la ingestin de alimentos contaminados. Es la ms rara y grave. Aislamiento y caractersticas bioqumicas: Toma de muestra: se coge a partir de la pstula o tambin del esputo. Se realizara un hemocultivo (septicemia). Tinciones: gram, esporas y cpsula. Medio de cultivo: medios generales como sangre, dando lugar a colonias grandes en forma de melenas de len o cabezas de medusas. Pruebas bioqumicas: (esquema, fotocopias: tabla 10.1 y 10.2) Pruebas serologicas: inmunofluorescencia Prueba de la Antracina: Es una prueba de introdermoreaacion, la cual ser positiva si da una reaccin 99

eritomatosa de al menos 8 ml de dimetro a las 24 h. Tratamiento: Penicilina y alternativamente tetraciclina, cefalosporina, cloranfenicol y aminoglucosidos. BACILLUS CEREUS Agente capaz de producir toxiinfecciones mediante el aislamiento en alimentos y heces del paciente. Es resistente a los betalactamicos, y sensibles a los aminoglucosidos, vancomicina y clindamicina. 2. LISTERIA Existen 8 especies siendo la ms importante Listeria monocitogenes. A. PATOLOGA Se han descrito una gran variedad de manifestaciones clnicas, entre ellas, las importantes son: sepsis o meningitis neonatal, sepsis o meningitis en pacientes inmunodeprimidos (particularmente en transplantados de rin) y sepsis puerperal (despus del parto) o enfermedad gripal en la gestacin. Se ha observado que se desarrolla en personas que tienen bajas las defensas pudiendo producir la muerte. Listeria monocitogenes es capaz de crecer en el interior de las clulas del sistema retculo endotelial lo que le permite vivir en macrfagos confirindole una extraordinaria resistencia frente a agentes antibacterianos(Ab). Adems este mecanismo le va a facilitar su diseminacin. Posee una estructura antignica especfica correspondiente a Ag flagelares (Ag H) y Ag somticos (Ag O). B. AISLAMIENTO Y CARACTERSTICAS BIOQUMICAS Toma de muestra: Sangre, LCR, esputo, etc. Tincin: Gram Medios de Cultivo: Medios enriquecidos con ambiente microaerfilo (10% de CO2) a 3742C. Se puede sembrar en agar sangre para conocer su grado de hemlisis. Listeria nopresenta ni cpsula ni esporas, pero s 100

flagelos en disposicin peritrtica. Su distribucin es ubicua (en todas las partes, agua, tierra, ser humano, aire, etc) y se ha aislado asociado a numerosas enfermedades de peces, mamferos, plantas, etc. Pruebas bioqumicas: Catalasa, ONPG, esculina (+); oxidasa, coagulasa, decarboxilasa, ureasa (); movilidad (+) a 22C. (ver cuadro 10.2) Pruebas serolgicas: Principalmente pruebas de aglutinacin en el que se evaluar el ttulo de las aglutininas H de las muestras del suero del paciente. Tambin se realizan tcnicas de fijacin de C' cuyo ttulo se da como positivo a partir de 1/10. Tambin tcnicas de inmunoprecipitacin, inmunofluorescencia, test de alergia por introdermoreaccin, etc. C. TRATAMIENTO Principalmente ampicilina y eritromicina. 3. CORYNEBACTERIUM A. INTRODUCCIN Y ESPECIES MS IMPORTANTES Comprende un grupo de cocobacilos gram positivos, no esporulados, generalmente inmviles y pueden contener grnulos metacromticos que se tien irregularmente. Son pleomrficos y lo ms caracterstico es que adoptan una posicin en empalizada o letras chinas. Estn muy distribuidos en la naturaleza y forman parte de la flora normal del hombre; algunos autores los denominan difteromorfos. Son erobios facultativos o microarfilos. La especie ms represantiva es Corynebacterium difteriae que junto con Corynebacterium ulcerans y Corynebacterium pseudotuberculosis son los nicos que pueden producir toxinas o ser patgenos. Las dems especies son patgenos oportunistas. B. PATOLOGA Y PROFILAXIS El Corynebacterium difteriae produce la difteria que es una enfermedad infecciosa aguda causada por cepas que producen toxinas. La va de entrada es la mucosa respiratoria donde se 101

multiplica y produce la exotoxina que causa necrosis en los tejidos vecinos provocando una respuesta inflamatoria con formacin de la pseudomembrana diftrica. La toxina puede afectar al corazn y nervios perifricos. El periodo de incubacin es de 35 das y teniendo en cuenta el punto de entrada se produce faringitis o amigdalitis con fiebre y/o disea (dificultad respiratoria). Esto se debe a la pseudomembrana que provoca una obstruccin de las vas areas producindose un edema (hinchazn por retencin de lquidos) localizado en el cuello, denominado cuello de toro, provocando un taponamiento de las vas respiratorias que puede llevar a la asfixia lo que se denomina crup difttico. Si hay una difusin de la toxina se pueden producir alteraciones hepticas, renales,etc. Su efecto patgeno se encuentra directamente relacionado con dos tipos de Ag: Ag O: es un polisacrido termoresistente y responsable de reacciones cruzadas con micobacterias. Ag K: es un Ag proteico sensible a la T y responsable de da la reaccin de hipersensibilidad. Otros factores de patogenocidad: Hialurodinasa: causa la infeccin sobre las clulas. Exotoxina Glicoliticos: muy toxico y causa muerte celular. En cuanto a la profilaxis: la vacuna DTT. C. Aislamiento y caractersticas bioqumicas Toma de muestra: vas respiratorias. Tincones: gram, corpsculos metacromicos. Medio de cultivo: Loeffler que da colonias grisceas pequeas con bordes irregulares. Pruebas bioqumicas: (ver tabla 10.3) Prueba de la Toxigenicidad: Puede realizarse in vivo o in vitro. In vivo ! se inyecta introperitonalmente una suspensin con el corinebacterium difteriae a un animal de experimentacin (cobaya) y a un control al que se le inyecta 102

adems antitoxina difterica, al cabo de 2 das si la cepa de la suspensin fuese toxgena se producir una infeccin. In vitro ! se lleva a abo por medio de un test de inmunodifusion radial en placa, la prueba ser positiva si aparece el precipitado en el pocillo. D. Tratamiento Penicilina y eritromicina. 4. OTROS Erysipelothrix Rhusiopathiae Solo tiene una especie, es muy frecuente como patgeno en los cerdos y otros animales. Produce la Erisipela Porcina. En el hombre puede producir una lesin inflamatoria en la piel que generalmente afecta a manos y a dedos que se denomina Erysipeloide. Las lesiones presentan un borde eritomatoso elevado y puede complicarse con septicemia y endocarditis. La adquisicin en el hombre esta vinculado con contactos de tejidos animales: matarife, carniceros, pescadores, pescaderos, etc. aunque tambin puede estar presente en suelos contaminados. Diagnostico: muestra de biopsias de las lesiones de la piel y hemocultivos. Crece bien en los medios habituales (agar sangre, chocolate). La caracterstica mas llamativa es la produccin de sulfhdrico en el medio TSI (triple sugar iron) hay que relacionarlo con el Kligler. Caractersticas bioqumicas: catalasa negativa, oxidasa negativa, movilidad negativa, sulfhdrico positiva, nitratos negativa, glucosa positiva, lactosa positiva, xilosa negativa, manitol negativa, sacarosa negativa. Kurthia Lactobacillus Son bacilos gram positivos, pleomrficos, normalmente inmviles, microaerfilos y catalasa negativos. Reciben este nombre porque el producto principal de su metabolismo es el cido lctico. Destacan algunas especies como el bacilo de 103

Doderleim presente en la flora vaginal. Otras especies forman parte de la flora intestinal como el Lactobacillus acidofilus. Especialmente se ha aislado en casos de neumona, sepsis o infeccin del tracto urinario. Son sensibles a muchos betalactmicos. TEMA. 17 MICOBACTERIUM Y ACTINOMICETOS 1. Introduccin. 2. Micobacterium Introduccin. Procesamiento de las muestras para el estudio de micobacterias. Aislamiento y caractersticas bioqumicas. Realizacin de baciloscopias. Patogenicidad. Especies ms importantes: M.tuberculosis y M. Leprae. 3. Micobacterim tuberculosis 3.1 Patologa. 3.2 Epidemiologa. 3.3 Prueba de la tuberculina. 3.4 Tratamiento. 4. Micobacterium leprae 4.1 Patologa: lepra tuberculoide y lepra lepromatosa. 4.2 Epidemiologia. 4.3 Prueba de la lepromina o mitsuda. 4.4 Toma de muestras. 4.5 Tratamiento. 5. Actinomicetos 5.1 Introduccin. 5.2 Especies ms importantes. 104

5.3 Aislamiento y caractersticas bioqumicas. 5.4 Patologa. 5.5 Tratamiento. 1. Introduccin De acuerdo con la ltima edicin del manual de Bergey`s Micobacterium se encuentra en la seccin 17 dentro de los Actinomicetes, el orden actinomiceto presenta ocho familias de las que dos resultan importantes para el ser humano por su inters clnico: Micobacteriaceae. Nocardiaceae. 2. Micobacterium 2.1. Introduccin Los Micobacterium son bacilos rectos o ligeramente curvados de 0.2 0.6 m, son aerobios, inmviles y no esporulados. Siendo tpico de estos microorganismos la pared, ya que se encuentra altamente enriquecida por cidos miclicos y en general componentes creos, de tal forma que para su coloracin se necesitan colorantes de alta capacidad tintorial as como calor para facilitar su penetracin ya que este tipo de microorganismos se tien muy difcilmente. Una vez teidos son altamente resistentes a la decoloracin cida, por todo ello son llamados BAAR, que es la principal diferencia con los dems microorganismos. La presencia de estos componentes en la pared ofrecen a las micobacterias resistencia a la desecacin y accin de decolorante, desinfectante y de agentes antibacterianos. As el colorante verde malaquita y el antibitico penicilina se emplean en medios habituales de aislamiento de Micobacterium. Son grmenes muy distribuidos en la naturaleza, pueden ser saprfitos del agua, suelo, etc. , incluso afectar al hombre causando infecciones graves y en ocasiones crnicas como la lepra. De las 57 especies que se conocen al menos 25 se han aislado en infecciones del hombre.

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Se tien difcilmente con gram pero cuando lo hacen responden a gram + , aunque su principal caracterstica es su capacidad BAAR. Las micobacterias se pueden clasificar : Atendiendo a su velocidad de crecimiento. Morfologa colonial. Y a la propiedad de desarrollar pigmentos de naturaleza carotenoide en determinadas condiciones. Segn estos puntos Runyon dio los siguientes grupos: Micobacterium fotocromgenos: desarrollan color cuando se exponen a la luz (pigmento amarilloanaranjado) Micobacterium escotocromgenos: desarrollan color en la oscuridad. Micobacterium no cromgenos: de crecimiento lento ( ms de 1 semana). Micobacterium crecedores rpidos: (menos de 7 das) Posteriormente se vio que esta clasificacin no era perfecta puesto que existen micobacterias que pueden clasificarse en ms de un grupo. Otros autores realizan otra clasificacin dividiendo a las micobacterias en dos grupos importantes: Bacilos de Micobacterium cultivables en medios artificiales, con crecimiento ms bien lento y que en funcin de su cuadro clnico que producen en el hombre se dividen en: Especies que producen tuberculosis en el hombre y animales (Micobacterium tubercolisis y Micobacterium bovis) Especies de micobacterias atpicas de crecimiento muy lento y que pueden presentar un poder patgeno en el hombre distinto de tuberculosis y lepra. Bacilos de Micobacterium no cultivables en medios artificiales y patgenos para el hombre (Micobacterium leprae) 2.2. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS PARA EL ESTUDIO DE MICOBACTERIAS La mayor parte de las muestras que se procesan para micobacterias proceden del tracto respiratorio (esputos, lquido pleural, broncoaspirado), orina, 106

LCR, biopsias, etc. El procesamiento de muestras requiere un paso inicial que es una concentracin por medio de centrifugacin (muestras ms peligrosas). La mayor parte de las muestras contaminadas por flora acompaante que crece ms rpido que las micobacterias puede inhibir el desarrollo de stas, por ello las muestras deben ser sometidas a un proceso de homogenizacindescontaminacin previo a las siembra. La homogenizacin de esputo es necesario para fluidificar la muestra, normalmente muy mucosa, para ello se utilizan mucolticos como Nacetilcistena o el detergente laurilsulfatosdico. La descontaminacin se lleva a cabo con cido o lcalis, a pesar de que las micobacterias son muy resistentes a estos agentes nicamente sobreviven de un 1020% de la poblacin inicial. El tiempo de contacto de NaOH no debe ser mayor a 15 minutos. Los lquidos estriles cono el LCR no necesitan del proceso de homogenizacin ni descontaminacin y pueden sembrarse directamente. El proceso de descontaminacin se lleva a cabo en cabinas de seguridad. 2.3. AISLAMIENTO Y CARACTERSTICAS BIOQUMICAS Toma de Muestras: esputo, LCR, broncoaspirado, etc. Tinciones: principalmente ZiehlNielsen y AuraminaRodamina. Medios de Cultivo: LowensteinJensen que contiene huevo y verde malaquita y antibiticos, como penicilina, para inhibir el crecimiento de otros microorganismos. Miedlebrook Hoy se utilizan medios de cultivo radiomtricos siendo el ms utilizado BactecTB. Este sistema contiene un medio liquido de soporte de crecimiento de micobacterias suplementado con Ab y que contiene un sustrato marcado con C14. Las micobacterias al crecer metabolizan el sustrato y liberan CO2 marcado radiactivamente que puede ser detectado. La principal ventaja de este mtodo es el acortamiento del tiempo de crecimiento de 107

micobacterias. Cuando se emplean medios de cultivo convencionales deben cultivarse a 35C en oscuridad y en atmsfera hmeda con 510% de CO2 durante 1 semana, y despus se pone a atmsfera normal. Pruebas bioqumicas: Test de la niacina, reduccin de nitratos, catalasa, hidrlisis de Tween 80, test de la arilsulfatasa, reduccin de telurito e inhibicin del crecimiento por la hidracida del cido tiofeno2carboxlico. Hoy en da se han desarrollado nuevas tcnicas que permiten la determinacin de especies en pocas horas. Las ms empleadas son: tcnicas de sondas genticas de ADN y anlisis cromatogrfico de lpidos de la pared celular. Pruebas serolgicas: principalmente precipitacin, aglutinacin, fijacin de complemento. 2.4. REALIZACIN DE BACILOSCOPIAS Una vez recogida la muestra debe hacerse un proceso de concentracindescontaminacin y una tincin BAAR. El hallazgo de BAAR en un frotis no es diagnstico definitivo de infeccin bacteriana pero permite: Un diagnstico de presuncin de tuberculosis. Seguimiento del paciente que est siendo tratado con antituberculosos, pudindose saber cuando la baciloscopia de vuelve negativa. Para la realizacin de la extensin se recoge una mnima parte de esputo y cubrir las 2/3 partes de la superficie, no deben ser gruesas pues dificultaran la visin. Cuando se observa una tincin de ZiehlNielsen se recomienda hacer una valoracin cuantitativa de los bacilos presentes en la muestra. El objetivo se debe colocar en un extremo de la preparacin y se recorre toda una lnea. Si se observan aproximadamente 100 campos se cuentan los BAAR encontrados. Si se han visto 50 BAAR no es necesario continuar y se informa como 50/1L (50 bacilos en una lnea del porta). Si el nmero est entre 10 y 50 se informa con X/1L, siendo X el nmero de bacilos contados. Si el nmero de bacilos es menor de 10, habr que observar 2 lneas ms, un total de 300 campos, 108

expresndose el nmero de BAAR como X/3L. Otra de comunicar la informacin es por semicuantificacin (sistema de cruces). El examen microscpico es subjetivo y el microscopista que carece de experiencia puede cometer errores, por lo que es necesario conocer las causas ms frecuentes de los falsos positivos y negativos: Falsos positivos: Restos de comida en esputo Fibras de algodn Ralladura del porta Precipitados de colorante Falsos negativos: Mala realizacin del frotis ( grueso, no haber cogido la zona ms purulenta, mala fijacin, mala decoloracin) Fallo del microscopista 2.5. PATOGENICIDAD Los bacilos tuberculosos virulentos contienen una serie de componentes celulares que daan los tejidos del husped. Son ceras, fosfolpidos, protenas, polisacridos y cidos gluclicos. Tambin producen factores txicos como ceraD y factor cord (denominado factor cuerda o cuerda serpentina, ya que al microscopio tiene disposicin de largas cuerdas) cuya presencia est relacionado con la virulencia. 3. MICOBACTERIUM TUBERCULOSIS 3.1. PATOLOGA Es un bacilo denominado Bacilo de Koch. Es capaz de crecer en el interior de las clulas retculoendoteliales sin ser destruidas. Llega al organismo por inhalacin aunque excepcionalmente por ingestin de alimentos contaminados o heridas en la piel. Tras una nica exposicin es menor el riesgo de desarrollar la infeccin (35%), siendo necesarias exposiciones repetidas para que aumente esta probabilidad junto con una inmunidad deteriorada por parte del husped. Cuando el M.tuberculosis llega al husped por 109

inhalacin produce una infeccin primaria o primoinfeccin tuberculosa que acta sobre el pulmn y ms concretamente a nivel de los alvolos provocando una intensa reaccin inflamatoria que produce exudacin. Estos bacilos pueden llegar a los vasos linfticos, ganglios y retornar a la circulacin venosa originando focos metatsicos en distintos rganos. Si no hay tratamiento a tiempo el tubrculo que se origina en el pulmn se va desarrollando evolucionando a necrosis caseosa (masa amorfa y homognea generalmente debida a protenas coaguladas formada por estructura de tejidos en descomposicin; es similar a un queso en su aspecto). El tubrculo que se forma est constituido en su parte central por clulas gigantes en cuyo interior se encuentran los bacilos, una parte intermedia de carcter epitelial y con apenas bacilos y una parte perifrica que contiene abundantes linfocitos, monocitos y bacilos tuberculosos. Esto va acompaado de fiebre, sudoracin nocturna, adelgazamiento, tos con esputos purulentos y en fases avanzadas hemoptisis (expulsin de sangre por la boca procedente de las vas respiratorias bajas). Adems de la lesin primaria tambin podemos hablar de tuberculosis postprimaria o reaccin secundaria que ocurre tras una reactivacin de la lesin primaria. Histolgicamente hablamos de que micobacterium puede producir dos tipos de lesiones: Exudativas: son propias de la etapa inicial apareciendo lesin inflamatoria aguda con edema y acumulacin de polimorfonucleares alrededor del bacilo tuberculoso. El cuadro se asemeja a la neumona. Puede curar espontneamente, producir necrosis tisular p evolucionar hacia una lesin productiva. Lesin productiva granulomatosa: consiste en un granuloma crnico formado en la zona central por clulas gigantes y bacilos, una zona intermedia de carcter epitelial y zona perifrica con linfocitos y macrfagos. 3.2. EPIDEMIOLOGA Se difunde por las gotculas y esputos de individuos y animales, tambin por contaminacin de alimentos (tuberculosis intestinal) y por heridas.

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Los bacilos pueden sobrevivir hasta 6 semanas en esputos y se destruyen a la luz solar en poco tiempo. Su mayor incidencia est en grupos sociales de bajo nivel, malnutridos y sin condiciones higinicas. La tuberculosis es una enfermedad importante a nivel en pases subdesarrollados y en grupos marginados de pases industrializados. El M.tuberculosis produce cada ao de 58 millones de nuevos casos, siendo el responsable de 23 millones de muertes en el mundo. En el M.tuberculosis la fuente de infeccin es el hombre a nivel del tracto respiratorio; en el caso de M. Bovis la va de entrada es respiratoria por la tos de la vaca o por ingestin de la leche no pasteurizada o de la carne procedente de una vaca tuberculosa. La tuberculosis afecta principalmente a las personas inmunideprimidas: alcoholicos, ancianos, drogadictos, pacientes con SIDA. 3.3. PRUEBA DE LA TUBERCULINA Permite diferenciar entre individuos infectados y no infectados. Prueba positiva: indica que el individuo ha estado en contacto con M.tuberculosis y es portador de micobacterium en los tejidos. No implica que exista infeccin activa en ese momento pero existe el riesgo de adquirir la enfermedad por reactivacin de dicho foco primario. Prueba negativa: no se corre el riesgo de reactividad. A la prueba de la tuberculina tambin se le llama prueba de Mantoux, que consiste en una inyeccin intradrmica de DPP (derivado proteico purificado); a las 4872 horas se mide el grado de induracin de la zona. Tradicionalmente se consideraba positivo cuando el dimetro es mayor o igual a 10 mm. Actualmente se siguen las siguientes pautas para considerara positivo el test: Dimetro " 10 mm en pacientes menores de 35 aos. Dimetro " 15 mm en pacientes de 35 aos o ms. Dimetro " 5 mm en individuos en contacto con pacientes tuberculosos e infectados con 111

VIH. 3.4. TRATAMIENTO Los frmacos antituberculosos que se usan normalmente son isoniazida, etanbutol, rifampicina y estreptomicina. Para evitar la aparicin de resistencia se lleva a cabo la politerapia. Los tratamientos son largos, de 612 meses, ya que las bacterias son muy resistentes a agentes teraputicos; no se debe olvidar que son microorganismos intracelulares y que el acceso del antibitico se dificulta la propia composicin caseosa de las lesiones tuberculosas. Las micobacterias que producen lesiones cutneas se tratan con ciruga. Las infecciones por otras micobacterias distintas de tuberculosis se denominan micobacteriosis. 4. MICOBACTERIUM LEPRAE 4.1. PATOLOGA Agente etiolgico de la lepra. Se trata de una especie que no se puede cultivar en el laboratorio por lo que se conoce muy poco sus caractersticas microbiolgicas. Se ha observado que el nico reservorio es el hombre con autntica predileccin por las terminaciones nerviosas. Son BAR aislados en parejas o masas, se pueden inocular en animales siendo el armadillo la especie ms receptora. S existen pruebas serolgicas para la lepra. Es un bacilo inmvil, rectilneo, que se encuentra en la mucosa nasal, dermis y biopsias de lesiones de individuos con lepra. Son bacilos no esporulados, no flagelados ni capsulados. En el hombre da lugar a la lepra que es una enfermedad caracterizada por lesiones granulomatosas crnicas. Es de lenta evolucin que ocasiona lesiones desfigurantes y mutilantes en las zonas ms fras del cuerpo ya que el bacilo posee gran afinidad por el tejido cutneo y nervioso. Aparecen maculas plidas y ndulos grandes llamados lepromas acompaados de anestesia local. La afeccin de la cara da lugar a la cada de la cola de la ceja y a la destruccin del tabique nasal, es lo 112

que se denomina facies leonina o cara de len. La lepra se puede manifestar de dos formas: Lepra tuberuloide: de evolucin benigna y con tendencia a quedar latente con maculas cutneas, grave afectacin nerviosa y prueba de la lepromina positiva. Lepra lepromatosa: de curso maligno con aparicin de ndulos cutneos, amputacin y prueba de la lepromina negativa. 4.2. Epidemiologa Generalmente se necesitan ms de un contacto con enfermos de lepra activa. El material mas infeccioso son las secreciones nasales y el periodo de incubacin es de 26 aos. Es una enfermedad difcilmente de determinar por su elevado periodo de incubacin. Su periodo de invasin es poco especfico y con sntomas raros no asociables a la lepra. A veces se presenta picor, hormigueo, perdida de la sensibilidad en manos y pies y a partir de aqu de forma lenta y progresiva lesiones cutneas. Suele durar toda la vida y su evolucin ms o menos grave depender del grado de inmunidad del husped. 4.3. Prueba de la lepromina o Mitsuda Existe una prueba que indica el estado inmune del individuo frente a la enfermedad que se denomina Mitsuda. Se toma un extracto de la lesin leprosa y se pasa por el autoclave, posteriormente se inyecta en el antebrazo. Puede ocurrir despus de 25 das: Aparece una induracin de ms de 25 mm de dimetro: Esto indica que estamos frente a un organismo inmunizado frente a micobacterium. Induracin de menos de 3 mm: individuos sensibles por no haber tenido contacto o por tener una lepra lepromatosa. Induracin entre 35 mm: son de resultado dudoso (nos fijaremos en la sintomatologa). 4.4. Toma de muestra Se realiza un raspado de la mucosa del tabique nasal o se hace una biopsia de un leproma en la oreja, ganglio nervioso o trozo de nervio afectado. 4.5. Tratamiento Se utilizan sulfanos y rifampicinas.

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5. ACTINOMICETOS 5.1. Introduccin Son bacilos gram positivos aunque se tien con dificultad siendo mas caracterstico porque algunas especies son baar positivo debido a la composicin de la pared celular (cidos miclicos y componentes creos), dan positiva la prueba de la catalasa y el microorganismo se ve de forma variable dependiendo de los gneros, pudiendo ser: cocobacilos, filamentosos La morfologa filamentosa se asemeja a la de los hongos, de ah el nombre de actinomiceto. Estos microorganismos se encuentran en el suelo, plantas y vegetales generalmente, aunque tambin pueden aislarse en piel, orofaringe y tracto gastrointestinal del hombre y animales. El hombre puede infectarse por inhalacin o contacto de una herida, son inmviles no esporulados y no capsulados. 5.2. Especies ms importantes (ver fotocopias tabla 11.2) 5.3. Aislamiento y caractersticas bioqumicas Toma de muestras: esputo, secreciones virulentas, LCR, liquido pleural. Tinciones: gram positivas (se ven con dificultad) principalmente BAAR, Niehl Ziensen y RodaminaAuramina positivas. Medios de cultivo: agar infusin cerebro corazn, Mueller Milton y medio de Lovestein Jensein. La T de cultivo 2027 que impide que se desarrollen otras bacterias. Pruebas bioqumicas: (tabla 11.2) Pruebas serologicas: fijacin del complemento, Elisa, aglutinacin, precipitacin. 5.4. Patologa Cualquier infeccin pulmonar causada por estos microorganismos se considera nocardiosis. Gran parte de los estudios de nocardiosis parecen apuntar a infecciones de carcter oportunistas, es decir que se requiere de una enfermedad subyacente previa o que el paciente est inmunolgicamente debilitado. 114

El gnero Nocardia no producen toxinas pero tiene en su pared bacteriana una alta proporcin de lpidos muy relacionados con su virulencia ya que le van a conferir a las bacterias alta resistencia frente a los sistemas de defensa del husped. Tiene la capacidad de crecer y multiplicarse en el interior de los tejidos y macrfagos de aqu que se hayan considerado parsitos intracelulares. Las manifestaciones clnicas mas frecuentes son: Nocardiosis pulmonar: causada por Nocardia, asteroides que producen lesiones pulmonares con abscesos, inflamacin diseminada semejante a la tuberculosis, pudiendo dar reas de necrosis y a partir de aqu la diseminacin general por sangre a otros rganos. Tambin pueden diseminarse por el sistema linftico, rara vez puede afectar al hgado, bazo y miocardio, pero cuando afecta puede ser grave o mortal, se le denomina pulmn del granjero como consecuencia de hipersensibilidad a Ag de los actinomicetos. Nocardiosis cutneo: generalmente se debe a la manipulacin de tierra y plantas contaminadas con actinomicetos apareciendo celulitis pustular. Micetomas: infeccin crnica supurativa cutnea y subcutnea que afecta a tendones, huesos y msculos. La localizacin ms frecuente son las extremidades. El origen puede ser la inoculacin de las bacterias procedentes del suelo o vegetacin. Es una enfermedad tpica en climas tropicales principalmente la especie Brasiliensis. 5.5. Tratamiento Trimetropin Sulfametosazol combinado con Rifampicina y aminoglucosidos. En el caso de micetoma y otras formas graves de Nocardiosis cutnea es necesario recurrir a la intervencin quirrgica adems de la administracin de antgenos. TEMA 18. MICROORGANISMOS ANAEROBIOS 1. INTRODUCCIN 2. SIGNOS CLNICOS DE INFECCIN POR 115

ANAEROBIOS 3. CLASIFICACIN DE LAS BACTERIAS ANAEROBIAS 4. BACTERIAS ANAEROBIAS ESPORULADAS. GNERO CLOSTRIDIUM 4.1.Introduccin 4.2.Clasificacin Accin neurotoxica. Accin histolgica. Accin sobre el aparato digestivo. Responsables de cuadros purulentos. 5. AISLAMIENTO Y CARACTERSTICAS BIOQUMICAS 6. TOMA DE MUESTRAS, TRANSPORTE, ETC. 1. INTRODUCCIN. Todas aquellas bacterias incapaces de crecer y/o mantenerse en contacto con el oxigeno a la presin atmosfrica se consideran anaerobias o anaerobias estrictas. A estos microorganismos se les considera que tienen un metabolismo anoxibiotico, es decir incapaz de utilizar el oxigeno como aceptor final de electrones, utilizando como aceptor sustratos orgnicos. Se sabe que estas bacterias no tienen cierto enzimas llamados metaloporfirinicos que en los mecanismos aerobios transportan oxigeno. Nos encontramos bacterias anaerobias para los que la presencia de oxigeno es altamente toxica o bactericida, mientras que para otras bacterias es bacteriosttico de tal forma que cuando se establezcan de nuevo las condiciones de anaerobiosis las bacterias crecen. Las bacterias anaerobias forman parte de la flora normal (tabla 16.1) y dan lugar a patologas. 2. SIGNOS CLNICOS DE INFECCIN POR ANAEROBIOSIS (Ver tabla 16.2) 116

3. CLASIFICACIN DE LAS BACTERIAS ANAEROBIAS (Ver tabla 16.1) 4. BACTERIAS ANAEROBIAS ESPORULADAS. GNERO CLOSTRIDIUM 4.1. Introduccin Dicho gnero tiene ms de 30 especies y muchas son peligrosas para el ser humano. Este gnero se caracteriza por la formacin de toxinas que responden a sustancias proteicas solubles. 4.2. Clasificacin Se clasifican en los siguientes grupos: De accin neurotoxica, en este grupo se encuentra Clostridium tetanis (produce ttanos) y Clostridium botulium (produce botulismo). De accin histotxica, en este grupo se encuentra Clostridium perfringes (produce gangrena gaseosa) y otros Clostridium. De accin sobre el aparato digestivo, destacaremos el Clostridium perfringes, Clostridium dificille y Aclostridium. Responsables de cuadros purulentos, destacaremos a Clostridium pyogenes, Aclostridium, Clostridium perfinges y Clostridium ramosum. Clostridium Tetanis Es un bacilo gram +, pequeo, con capacidad de formar esporas terminales dando a las bacterias un aspecto de cerillas o palillo de tambor. Su hbitat se encuentra fundamentalmente en la tierra y en intestinos de hombres y animales. Posee 3 toxinas de accin neurotoxica y son transportados por va sangunea hasta el SNC bloqueando la liberacin de neurotransmisores, esto origina convulsiones y parlisis apareciendo a nivel perifrico en exceso de liberacin de acetilcolina en el msculo esqueltico que constituye el cuadro clnico caracterstico de parlisis, as mismo se ve alterado el sistema contraccin relajacin muscular, de forma que este entra en una fase de contraccin y no se recupera (rigidez tetnica).

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Para que se produzca el ttano es necesario que el microorganismo se encuentre en condiciones de anaerobiosis. Tras una herida mas o menos profunda ya sea cortante, punzante, mordedura, araazo, quemaduras, lceras por decbito e incluso heridas superficiales como rozaduras que se pudieran infectar y formar costra facilitan la infeccin anaerobia. Si las condiciones son favorables el periodo de incubacin es de 5 7 das y se origina la reaccin patgena. Podemos hablar de 2 formas clnicas: Local Tetnica, que es la ms grave. El ttanos afecta principalmente a pases subdesarrollados, es importante el diagnostico precoz y las medidas profilctica (vacunas DTT). De no ser as el ndice de mortalidad es muy elevado. Clostridium Botulium Son bacilos gram +, anaerobios estrictos, grandes, no capsulados, mviles, debido a su flagelacin peritrica. Presentan esporas de carcter subterminal y en general es capaz de formar toxinas, las toxinas que se denominan con letras (A ! G). Las ms peligrosas y potentes para el hombre son las neurotoxinas A, B. y E. Clostridium Botulium presenta una estructura antignica tpica debida a los Ag flagelares y a los Ag de esporas. Se encuentra ampliamente distribuido en muchos ambientes como aire, suelo, alimentos. Si las condiciones son las adecuadas las esporas germinan facilitando la proliferacin de Clostridium Botulium. Es importante destacar su presencia en las conservas y pescados. El efecto patgeno es debido a dichas neurotoxinas y son venenos biolgicos que se conocen muy bien, una pequea cantidad del microorganismo es suficiente para causar la muerte. Las condiciones para que germine la espora ser de anaerobiosis, T aproximada 30 C y un pH neutro o ligeramente cido. Estas toxinas son de carcter proteico y termolabiles, de tal forma que se destruyen con facilidad a T altas (100C 15 min., 70 C 30 60 min.) 118

La toxina puede llegar al hombre a travs de alimentos contaminantes, en el tubo digestivo producir in situ una toxiinfeccin alimentaria. A partir de aqu a travs de va sangunea y linftica llega al sistema nervioso perifrico donde acta sobre terminaciones nerviosas bloqueando la liberacin de acetilcolina y originando como consecuencia parlisis del msculo esqueltico, as como otras manifestaciones neurolgicas como: visin borrosa, fotofobia, disfagia, sequedad en boca y faringe y debilidad en los msculos incluyendo los respiratorios que pueden llegar a paralizarse y en muchas ocasiones es frecuente la muerte por fallos respiratorios y arritmias cardiacas. Su periodo de incubacin est en torno a las 1636 horas despus de la ingestin de alimentos contaminados. Los cuadros ms graves se originan a las 2448 horas. Algunos autores hablan del Botulismo del lactante que se produce por la elaboracin de toxinas en el colon tras la ingestin de esporas. El cuadro clnico puede ser desde leve a grave y se manifiesta por dificultad muscular, en la alimentacin, estreimiento, disminucin del reflejo de succin e insuficiencia respiratoria. El diagnstico del botulismo es fundamentalmente clnico ya que el microbiolgico puede retrasarse. Se puede mostrar presencia de toxinas en sangre por pruebas serolgicas. El tratamiento consiste en combatir los sntomas, limpieza a fondo de heridas, administracin de antitoxina botulnica y Ab. Tambin frmacos relacionados con el funcionamiento de al acetilcolina. Clostridium que afecta a los tejidos. Clostridium perfringes Es un bacilo gram positivo y anaerobio estricto. Se caracteriza porque est ampliamente distribuido por la naturaleza, especialmente en el suelo cuya concentracin habitualmente sobrepasa las 50 mil bacterias /gramos de tierra, especialmente en tierras hmedas y abonadas con estircol.De aqu a travs de heridas puede pasar al hombre produciendo gangrena gaseosa. Es poco frecuente pero muy grave. 119

La gangrena gaseosa consiste en necrosis tisular (muscular)y signos de toxicidad sistmica debido a la produccin de toxinas histolgicas. Se caracteriza por un intenso dolor en la herida seguido de aparicin de lesiones cutneas como edemas, ampollas, etc, que se extienden rpidamente y evolucionan a necrosis y destruccin celular. El diagnstico se realiza por cuadro clnico y presencia en tincin de gram realizada principalmente en pus o tejidos afectados. El tratamiento es quirrgico y altas dosis de penicilina. Existe una toxina , que es la principal responsable de este dao, y otras toxinas y H que son responsables pero en menor medida. Clostridium que afecta a tracto digestivo. Clostridium perfringes Adems de provocar gangrena gaseosa puede dar lugar a infeccin toxialimentaria producida por ingestin de carne contaminada. En el intestino delgado germinan las esporas dando un cuadro caracterstico con diarreas, vmitos, dolor abdominal, etc, pudiendo llegar a estados de shock. El cuadro es generalmente benigno y el diagnstico se realiza mediante deteccin del microorganismo en el alimento o heces del paciente. Clostridium responsable de cuadros purulentos. Clostridium pyogenes Suele ir acompaado de otras bacterias anaerobias. Las toxinas no actan ejerciendo efectos patgenos salvo cuando hay complicaciones. 5. AISLAMIENTO Y CARACTERSTICAS BIOQUMICAS Toma de muestras: Se ha de realizar en condiciones de asepsia. Tinciones: Tincin gram y de esporas (Clostridium tetani) Medios de cultivo: Medios especficos como agar TSM a base de carne, sangre, huevos, tripticasa trisulfato y neomicina. Pruebas bioqumicas: Se utilizan muchas siendo las ms importantes: hidrlisis de 120

gelatina, produccin de indol y pruebas de fermientacin de HC. Otras pruebas de identificacin: Para Clostridium tetani: pruebas de inoculacin en animales, cromatografa de gases, HPLC, etc. Para Clostridium perfringes y Clostridium botulium: las mismas que para Clostridium tetani adems de RIA e inmunofluorescencia. 6. TOMA DE MUESTRAS, TRANSPORTE, ETC. La incubacin se lleva a cabo con un sistema de campana, la atmosfera anaerobia se consigue mediante la introduccin en la misma de un sobre generador de gas (CO2) y un catalizador. Se incluir siempre un medidor de anaerobiosis, que cambia de color en ausencia de aire, para comprobar que el sistema ha funcionado. El sobre generador de gas se activa introduciendo en l 10 ml de agua del grifo, lo que da lugar a la liberacin de H2 y CO2. El oxgeno del interior de la campana se une al hidrogeno y forma agua que se deposita en forma de gotas en las paredes del recipiente. El CO2 generado procuce el crecimiento de algunos anaerobios. Los sobres e indicadores de anaerobiosis son de un solo uso. (Ir a la pregunta 6 de las fotocopias) TEMA 19. RICKETTSIA, CLAMIDIAS Y MICOPLASMA. 1. FAMILIA RICKETTSIACEAE Introduccin. Gneros y especies ms importantes: Rickettsias: R. Prowazekii, R. conorii y R. rickettsi. Coxiella burnetii. Ehrlichia. 1.3 Aislamiento y caractersticas bioqumicas 121

2. CLAMYDIAS 2.1 Introduccin. 2.2 Especies ms importantes: C. tracomatis, C. psitacci y C. pneumoniae. 2.3 Tratamiento. 2.4 Aislamiento y caractersticas bioqumicas. 3. MICOPLASMA. 3.1 Introduccin. 3.2 Micoplasma neumoniae. 3.3 Micoplasma genitalis: Ureaplasma urealiticum y M. Hominis. 3.4 Acholeplasma. 3.5 Aislamiento y caractersticas bioqumicas. 4. FORMAS L 1. FAMILIA RICKETTSIACEAE 1.1. Introduccin. Son microorganismos procariotas que precisan de clulas vivas para poder desarrollarse, es decir son microorganismos intracelulares que se encuentran adaptados a un parasitismo celular. Morfolgicamente son cocos o cocobacilos gram que presentan una dotacin enzimtica muy escasa de ah que necesiten microorganismos o clulas a las que parasitar. Producen en el hombre enfermedades epidmicas o endmicas transmitidas por vectores (piojos, pulgas, caros, etc.). Esta familia comprende 4 gneros importantes: Rickettsias. 122

 Coxiella Ehrlichia. Rochalimaea. 1.2. Gneros y especies ms importantes Rickettsias. Son cocobacilos gram y cuyo dimetro es igual a 0,30,5m y 0,82m de longitud. Dentro de estas tenemos: Rickettsias prowazekii: produce el tifus epidmico, lo transmite el piojo, la va de entrada en el hombre a travs de la picadura que tras el rascado produce la penetracin. El periodo de incubacin es de 13 semanas, los sntomas que produce son: escalofros, fiebres muy altas, dolores generalizados e inflamaciones que afectan sobretodo a capilares, arteriolas y vnulas, as como a piel y msculo. Pueden crear estados obstructivos que dificulten la corriente sangunea debido a la formacin de ndulos y en casos graves pueden provocar gangrena en extremidades. Lo ms probable es que en la piel aparezcan manchas rosadas que luego se vuelven papulosas y petequiales. Esta enfermedad es transmitida de persona a persona produciendo gran epidemias en guerras. Puede ser grave (incluso muerte) en condiciones adversas. Tratamiento: tetraciclinas y cloranfenicol, siendo muy importante y decisivo la lucha contra el piojo (vector) con insecticidas. Puede presentarse recadas al cabo de muchos aos llamndose entonces enfermedad de BrillZinsser. Rickettsias conorii: produce la fiebre botonosa, se transmite a travs de la garrapata. Es una enfermedad endmica en la cuenca mediterrnea, en general es de curso benigno y da lugar a manchas negras en el lugar donde muerde la garrapata. Sus sntomas en primer 123

lugar es macular y posteriormente papular y botonosa. La enfermedad se mantiene durante 820 das. Tratamiento: tetraciclinas. Rickettsia Rickettsi: Produce la llamada fiebre de las montaas rocosas, transmitida por garrapatas, periodo de incubacin 3 6 das aparecen fiebres muy altas que presentan mialgias y manchas negras en la zona de picadura. COXIELLA BURNETTI Produce la llamada enfermedad de la fiebre Q. La va de entrada principalmente por inhalacin aunque puede haber otros. Es un microorganismo bacilar de pequeo tamao de 0,3 micrmetros de dimetro y o, 41 micrmetros de longitud. Afecta al ganado, presentando un tropismo especial por las placentas siendo excretado en el parto. Las manifestaciones clnicas son sntomas generales del estado febril, mialgias y afectacin pulmonar en la mitad de los casos, por lo que se considera agente de neumona atpica, puede dar tambin afectacin heptica. El tratamiento es cloranfenicol y tetraciclinas. 1.3. Aislamiento y caractersticas bioqumicas En estados de fiebre las Rickettsias se mantienen abundantemente en sangre, as pues ser la muestra de eleccin. A partir de sangre heparinizada y centrifugada se usar el sedimento para obtener una muestra mas concentrada. Posteriormente realizaremos: Tincion directa: Ej.; Giemsa, apareciendo la Rickettsias de color prpura. Tincion de Jimnez: que se ven de color rojo sobre fondo verde. Si hacemos un gram se vern 124

negativo. Tambin podemos realizar tcnicas de inmunofluorescencia. Medio de Cultivo: se pueden inocular en cultivos celulares o embriones de pollo. Pruebas serolgicas: principalmente reacciones Ag Ac, las pruebas mas usadas son las seroaglutinacin, inmunofluorescencia indirecta y la tcnica de Weil Flix que consiste en que a partir de diluciones de suero problema con esta bacteria ponerlas en contacto con una cantidad fija de Ag de Rickettsia. 2. CLAMYDIAS 2.1. Introduccin Son microorganismos procariotas que hasta hace poco se consideraban ms bien virus que bacterias. Son procariotas intracelulares estrictos ya que no pueden sintetizar ATP. Morfolgicamente son cocos gram , inmviles y tienen 2 tipos de cidos nucleicos: ADN y ARN, se multiplican por divisin binaria, dato que aleja a las Clamydias de los virus. 2.2. Especies ms importantes (ver tabla 12.2) Clamydia Tracomatis Puede producir distintas enfermedades: Tracoma: que es una queratoconjuntivitis, causa ms importante de ceguera en el mundo, principalmente en pases subdesarrollados. Linfogranuloma venreo: que es una E.T.S. para su deteccin se realiza inmunofluorescencia. Clamydia Psitacci Puede producir neumona atpica, la transmisin suele esta mediada por contacto con aves, el diagnostico principalmente es por fijacin del complemento. 125

Clamydia Pneumoniae Es un patgeno de reciente descubrimiento que produce neumona. 2.3. Tratamiento Sulfamidas. 2.4. Aislamiento y caractersticas bioqumicas Toma de muestra: secreciones oculares o genitales segn el caso. Tinciones: Giensa, Jimnez, Gram. Tcnicas citolgicas: para observar clulas del epitelio conjuntivas y genital con el fin de verificar los grnulos ricos en glucogeno. Cultivos: embriones de pollo aunque sta tcnica no es muy frecuente por el riesgo de infeccin en el laboratorio. Pruebas serolgicas: principalmente radioinmunoensayos y fijacin del C. 3. MICOPLASMA 3.1. INTRODUCCIN Da los microorganismos ms pequeos y se caracteriza porque carece de pared celular. Presenta divisin binaria. El carecer de pared celular le confiere una serie de propiedades tales como: sensibilidad a la presin osmtica del medio en que se encuentra que puede facilitar su lisis pleomorfismo resistencia a antibiticos como cefalosporinas y penicilina no se tien con gram Estn ampliamente distribuidos en la naturaleza y pueden afectar al hombre, principalmente Micoplasma neumoniae. Requiere medios enriquecidos y apartir de medios lquidos pueden visualizarse en microscopio ptico de campo oscuro o contraste de fase. 126

Las colonias son tpicas por su forma de huevo frito. Los principales gneros son: Micoplasma Ureplasma Acholeplasma 3.2. MICOPLASMA NEUMONIAE Principal agente causal de neumonas atpicas, con un periodo de incubacin de aproximadamente 3 semana considerando que es un microorganismo de lento crecimiento. Los sntomas son fiebres, mialgias, cefaleas y tos no productiva afectando principalmente a los escolares. En muchas ocasiones la infeccin es subclnica (no tiene sntomas claros) o de neumona suave, pero este micoplasma puede permanecer varios meses en el tracto respiratorio tras la infeccin. Existen otros micoplasmas que son flora normal como Micoplasma salivarium, Micoplasma orale y Micoplasma buccale. La infeccin por Micoplasma neumoniae no presenta distribucin estacionaria (no depende de las estaciones del ao). La enfermedad requiere un contacto estrecho. Puede tener pronstico benigno y aparecer manifestaciones extrapulmonares como por ejemplo erupciones cutneas. 3.3. MICOPLASMA GENITAL Comprenden este grupo Ureplasma urealyticum y Micoplasma hominis. Forman parte de la flora normal de las mujeres el 60% de Ureaplasma y el 20% de Micoplasma hominis. Se consideran patgenos oportunistas produciendo enfermedades uretrales y vaginales como vaginitis, prostatitis, etc. Pueden producir fiebre en el postparto. 3.4. Aislamiento y caractersticas bioqumicas Toma de muestras: mucosa faringea, 127

secrecin uretral, exudados, esputo, sangre, etc, segn la patologa. Tincin: de Giemsa principalmente, tambin tincin en campo oscuro con nigrosina. No se hace gram porque carece de pared celular. Medio de cultivo: medios especficos a 37C y ambientes aerobios. Pruebas serolgicas: inmunofluorescencia, RIA, fijacin de complemento. 4. FORMAS L No hay que confundirlas con micoplasma aunque tienen en comn carecer de pared celular. Son variantes de bacterias en los que ha ocurrido prdida de pared celular, que se puede inducir mediante sustancias que inhiben la sntesis de la pared. TEMA 20. VIBRIOS, CAMPYLOBACTER Y GNEROS RELACIONADOS 1. VIBRIOS 1.1. Introduccin 1.2. Especies ms importantes 1.3. Poder patgeno 1.4. Patologa 1.5. Tratamiento 1.6. Aislamiento y caractersticas bioqumicas 2. CAMPYLOBACTER 2.1 Introduccin 2.2 Especies ms importantes 2.3. Aislamiento y caractersticas bioqumicas 2.4. Patologa 2.5. Tratamiento 128

3. HELICOBACTER PILORI 3.1. Introduccin 3.2. Mtodos de deteccin Directos Indirectos Prueba de la urea rpida Prueba de la urea respiratoria Pruebas serolgicas 3.3. Poder patgeno 3.4. Patologa y Tratamiento 4. AEROMONAS 4.1. Introduccin 4.2. Patologa 4.3. Tratamiento 4.4. Aislamiento y caractersticas bioqumicas 5. PLESIOMONAS 1. VIBRIOS 1.1. INTRODUCCIN Son bacilos gram negativos, anaerobios facultativos, de morfologa curva, no esporulados y mviles gracias a su flagelacin loftrica. Crece bien en medios generales y son oxidasa positivo, prueba que nos va a permitir diferenciarlos de las Enterobacterias. Aguantan bien elevadas concentraciones de NaCl, por lo que se le denominan bacterias halofticas y su crecimiento se facilita en medio alcalino. Reducen nitratos a nitiritos. Se hallan muy distribuidos en la naturaleza. Son bacterias acuticas que habitan en ros, 129

lagos, etc. De las 34 especies conocidas slo 11 se han aislado en el hombre. 1.2. ESPECIES MS IMPORTANTES (ver tabla 14.2) Vibrio parahaemolyticus: Vive en ambientes marinos y se transmite al hombre a travs de alimentos como el pescado y el marisco. En el hombre produce cuadros gastrointestinales graves. Vibrio fluvialis: Produce cuadros gastrointestinales a travs de alimentos como el pescado y el marisco. Vibrio alginolyticus: Se asocia a conjuntivitis y otitis. Vibrio vulnificus: Agente causal de infeccin de heridas traumticas causadas en ambientes marinos. Vibrio cholerae: Es el ms patgeno para el hombre. Es el agente etiolgico del clera. Provoca diarreas graves hasta llegar a la deshidratacin, shock hipovolmico y si no hay tratamiento la muerte. 1.3. PODER PATGENO (Vibrio cholerae) Presenta 3 componentes antignicos responsables de su virulencia: Ag somtico O: Termoestable y de naturaleza polisacrida. Ag flagelar H: Termolbil. Exotoxinas: Son enterotoxinas de naturaleza proteica y sobre la que se desencadena el principal efecto patgeno del clera. Las cepas epidmicas de Vibrio cholerae, de las que existen ms de 100, se pueden separar en funcin de sus serotipos siendo los ms importantes el 01. 1.4. Patologa (Vibrio cholerae) El Vibrio cholerae penetra en el organismo por va oral a tavs de agua y alimentos contaminados, principalmente productos 130

marinos crudos. Debe se capaz de eludir el medio cido del estmago, hecho que sucede cuando se ingiere ms de 100 millones de grmenes, circunstancia que se facilita en epidemias sobre todo si se tiene en cuenta que pueden encontrarse 106 grmenes/ml de agua contaminada. Adems de estas condiciones, Vibrio cholerae deber traspasar la barrera del estmago para producir diarrea que da lugar a una prdida de agua y electrolitos que provoca una deshidratacin que sin tratamiento puede causar shock hipovolmico y la muerte. El mecanismo por el que produce la deshidratacin es provocado por la enterotoxina que se encuentra en las microvellosidades intestinales. Dicha enterotoxina se divide en dos fracciones: la fraccin a y la fraccin b. La fraccin b es la encargada de seleccionar los receptores especficos a los que se une, y una vez unida la enterotoxina, la fraccin a actuar activando una enzima, la adenilciclasa, lo que supone que el ATP de las clulas que infecta se transforma en AMP. Como consecuencia de las elevadas concentraciones de AMP se producir una inhibicin de la absorcin de Na por parte de las clulas intestinales y una liberacin de agua, cloruros, bicarbonatos, K y que en los casos ms graves puede perderse de 1015 litros al da. El periodo de incubacin es de 14 das y los sntomas clnicos nauseas, vmitos, dolor abdominal, diarrea, etc. Las heces contienen moco, clulas y gran cantidad de Vibrio. La muerte sobreviene en pocas horas si no se restablece l equilibrio electroltico. 1.5. TRATAMIENTO El tratamiento es sintomtico y encaminado a la reposicin de lquidos. Vibrio cholerae es sensible a tetraciclinas y trimetroprimsulfametoxazol.

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El uso de antibiticos ha dado lugar a la aparicin de cepas resistentes. Se trabaja en la elaboracin de vacunas. 1.6. AISLAMIENTO Y CARACTERSTICAS BIOQUMICAS Las muestras de heces que no se procesan inmediatamente se transportan en medio de CaryBlair donde los Vibrios se mantienen viables hasta 4 semanas. Se debe evitar la exposicin al aire ya que son muy sensibles a la desecacin. El vibrio se desarrolla bien en agar sangre y Mckonkey, pero el ms selectivo es el medio TCBS (triptona, citrato, bilis y sacarosa) donde Vibrio cholerae crece dando colonias amarillas. Tambin se puede utilizar como caldo de enriquecimiento a partir de heces agua peptonada al 1% de NaCl. El tiempo de incubacin es de 1622 horas a 3537C. 2. CAMPYLOBACTER 2.1. INTRODUCCIN Son bacilos gram negativos, cortos, con forma espiral, alas de gaviota o coma. Son microaerfilos, mviles, con un flagelo polar, no esporulados, no fermentan HC y dan posita la oxidasa y catalasa. Habitan en el tracto gastrointestinal de un gran nmero de animales. En el hombre se asocia a infecciones gastrointestinales y cada vez ms a infecciones extraintestinales como meningitis, endocarditis, artritis, etc, especialmente en pacientes con SIDA. 2.2. ESPECIES MS IMPORTANTES ( ver tabla 14.1) Las especies ms importantes de Campylobacter son: Campylobacter jejuni Campylobacter coli Campylobacter hyointestinalis 2.3. AISLAMIENTO Y CARACTERSTICAS BIOQUMICAS 132

Hay dos tipos de muestras: Muestra de heces Emplea medios selectivos que poseen antibiticos para reducir la flora acompaante (medio Skirrow, Campy o Buzler). Uso de atmosfera reducida en oxgeno (ambiente de CO2) y temperatura de 42C. Un medio alternativo para el aislamiento de Campylobacter en heces es filtrar las heces para eliminar los coliformes y otra flora acompaante. Los filtros son de acetato de celulosa y se colocan sobre una superficie de agar, se pone una gota de heces, se incuba toda la noche, se retira el filtro y se vuelve a incubar la placa. Muestra de sangre En sangre se han aislado como agente etiolgico se sepsis en pacientes inmunodeprimidos y con SIDA. 2.4. PATOLOGA Campylobacter jejuni se ha asociado a infecciones en el hombre asociadas con gastroenteritis con eliminacin de sangre por las heces. El microorganismo se adquiere por va oral, por la ingestin de comidas o bebidas contaminadas, o por el contacto con aves. Es sensible al pH gstrico por lo que se debe ingerir un inculo muy elevado de microorganismo. Se multiplica en el intestino delgado e invade el epitelio, produce inflamaciones, en ocasiones pasa a sangre y origina fiebre. La diarrea que produce se acompaa de dolor intestinal, dolor de cabeza, fiebre, nauseas, etc. 2.5. TRATAMIENTO La infeccin es autolimitada resolvindose en una semana sin necesidad de administrar antibitico. Los casos ms graves se tratan con eritromicina.

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Existe una especie la Campylobacter hyointestinalis que causa infeccin intestinal y es comn en individuos homosexuales. 3. HELICOBACTER PILORI 3.1. INTRODUCCIN En 1982, se aislaron por primera vez en pacientes con lesiones gstricas y lceras peptdicas unos bacilos gram negativos con forma de espiral y gran actividad ureasa. 3.2. MTODOS DE DETECCIN a. Mtodos directos Helicobacter pilori se encuentra en los pliegues de la mucosa gstrica. Si el estudio no se va a hacer de inmediato es til como medio de transporte solucin glucosada al 20% o solucin salina, mantenindose viable en estos medios durante 5 horas a 4C. Las muestras recibidas pueden usarse para realizar un gram. Las biopsias se cortan en trozos o se machacan en un mortero estril con solucin glucosada al 20% y se siembra en los siguientes medios: agar BHI (infusin cerebro corazn) agar MellerHinton agar Brucella al 1% de almidn soluble, agar sangre o chocolate Para el aislamiento de Helicobacter pilori es importante incluir medios selectivos con antibiticos. La incubacin es de carcter microaerfilo que se puede conseguir con las jarras de CO2 y la temperatura ptima es de 37C, no desarrollndose a 25,30 y 42 C. La identificacin de Helicobacter pilori se realiza por la tincin de gram y pruebas bioqumicas como catalasa, oxidasa y ureasas positivas, teniendo en cuenta que la temperatura de crecimiento es muy selectiva. b. Mtodos indirectos

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 Prueba de la urea rpida: Un trozo de biopsia se inocula en un medio con altas concentracin de urea y un indicador de pH. Un viraje del indicador a un medio alcalino por hidrlisis de la urea es significativo de Helicobacter pilori. Prueba de la urea respiratoria: El paciente ingiere urea marcada y tras un periodo de tiempo se mide el nivel de CO2 espirado. Se emplea urea marcada con C13 o C14 que se detecta en un espectrofotmetro de masas. Pruebas serolgicas: principalmente ELISA para detectar presencia de IgG e IgA en individuos con Helicobacter pilori. 3.3. PODER PATGENO Se seala al produccin de ureasa capaz de crear un entorno alcalino que protege a los microorganismos de la acidez gstrica hasta que se localiza en las capas de la mucosa gstrica. Tambin las proteasas modifican el pH gstrico de la mucosa y disminuyen la capacidad del cido de difundir al mucus. 3.4. PATOLOGA Y TRATAMIENTO Helicobacter pilori es el agente etiolgico de gastritis aguda y crnica. En relacin a ulceras peptdicas se asla en el 100% de los casos y el ulcera duodenal en el 77% . Parece ser que la presencia del microorganismo no es suficiente para desarrollar la ulcera aunque se cree que colabora. Es importante tener en cuenta que hasta el 50% de la poblacin adulta es portadora desconocindose el mecanismo de transmisin. Tratamiento: Es sensible a succionato de bismuto y sucsalicato de bismuto y muy resistente a antibiticos. El tratamiento es difcil y nunca se emplea monoterapia. Suelen administrarse varios frmacos juntos y an no se erradica el microorganismo habiendo recadas.

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4. AEROMONAS 4.1. Introduccin Son bacilos gram , anaerobios facultativos, oxidasa + y fermentan la glucosa con o sin produccin de gas, la mayor parte son mviles y crecen a temperaturas de 440C. habitan en aguas dulces y saladas donde infectan a los animales, generalmente peces y anfibios. En el hombre se asocian a infecciones intestinales en heridas e infecciones sistmicas. 4.2. Patologa Produce una diarrea aguda (diarrea del viajero) que suele ser autolimitada. Puede dar lugar a celulitis o infecciones de heridas por contacto de mucosas, por la tierra o aguas contaminadas. Septicemias en pacientes inmunodeprimidos. Otras (endocarditis, peritonitis, meningitis,etc.). 4.3. Tratamiento Tetraciclinas, aminoglucosidos y cefalosporinas. 4.4. Aislamiento y caractersticas bioqumicas Toma de muestras: lquidos orgnicos (sangre o exudados). Medios de cultivo: agar sangre y agar Mc konkey y ms selectivos: agar tripiticasa de soja al 5% y agar sangre con ampicilina. 5. PLESIOMONAS Comprenden una sola especie que es la sigeloide. Es un bacilos gram , anaerobio facultativo, mvil o inmvil, catalasa y oxidasa + que fermenta glucosa sin producir gas y reduce nitratos a nitritos. La temperatura ptima es de 37C aunque 136

crece bien entre 844C. se aisla bien en el intestino de peces de agua dulce y no sobrevive en agua del mar. En el hombre se asocia a diarrea en zonas tropicales y subtropicales. Crece bien en agar sangre y agar SS. TEMA 21. ESPIROQUETAS: TREPONEMAS, BORRELIAS Y LEPTOSPIRA 1. INTRODUCCIN A LAS ESPIROQUETAS 2. TREPONEMAS 2.1. Introduccin 2.2. Especies ms importantes: Treponema pallidum Patologa Epidemiologa Aislamiento y caractersticas bioqumicas Tratamiento 3. BORRELIAS 3.1. Introduccin 3.2. Especies ms importantes 3.3. Patologa Fiebre recurrente Enfermedad de Lyme 3.4. Tratamiento 3.5. Aislamiento y caractersticas bioqumicas 4. Leptospira 4.1. Introduccin 4.2. Especies ms importantes 4.3. Patologa 4.4. Tratamiento 137

4.5. Aislamiento y caractersticas bioqumicas 1. INTRODUCCIN A LAS ESPIROQUETAS Existe una serie de bacterias con morfologa espiral y flexible denominadas espiroquetas. Presentan una movilidad caracterstica no asociada a flagelos, sino a un filamento axial que se extiende longitudinalmente por debajo de la envoltura externa. Presenta una pared muy fina y flexible de naturaleza liposacrida y lipoproteica donde se vana a encontrar la mayor parte de los Ag especficos. Son gram negativas, pero presentan muchas dificultades para teirse. Se tien con impregnacin argntica, tincin de Giemsa o microscopa de fases. Presentan metabolismo fermentativo u oxidativo siendo aerobios o aerobios facultativos. Se encuentran muy difundidos en la naturaleza, en el agua, suelo y mucosas del hombre y animales. Dentro de la familia Espiroquetaceae existen 5 gneros: Treponema Borrelia Leptospira Espiroqueta Cristipira 2. TREPONEMA 2.1. INTRODUCCIN Comprende especies patgenas que afectan al hombre y otras que forman flora normal del tracto intestinal, boca y tracto genital. Son espiroquetas muy helicoidales, finas, pequeas y mviles. Son anaerobias facultativas y presentan un metabolismo fermentativo. Se tien difcilmente con gram utilizndose 138

giemsa e impregnacin argntica. No crece en cultivos in vitro y requiren un medio in vivo. 2.2. ESPECIES MS IMPORTANTES La especie ms importante es Treponema pallidum, que produce la sfilis. Afecta principalmente a adultos. Es de distribucin mundial. Es una ETS, siendo una infeccin congnita. Produce lesiones destructivas e infecta a todos los tejidos. PATOLOGA Es el agente causante de la sfilis. Es un microorganismo que no es capaz de resistir fuera del organismo humano. La sfilis comienza con un primer contacto (sexual, ETS), con lesiones primarias ricas en treponemas presentes en la mucosa. Despus de un periodo de incubacin de 1090 das, con termino medio de 20 das, aparece en la zona genital un chancro primario, es lo que se denomina Periodo primario de Sfilis, con abundantes treponemas que poco despus se diseminan por va sangunea y linftica a otras localizaciones convirtindose en una enfermedad sistmica. Es frecuente su multiplicacin en los ganglios linfticos prximos a la zona genital originando pequeos tumores. Transcurrido un tiempo corto (26 semanas) estos signos desaparecen espontneamente y entran en fase de latencia. Transcurrido un tiempo (2 meses2 aos) surge la Sfilis secundaria o florida. De forma sbita hay una espiroquetemia en genral muy abundante y que da lugar a manchas en la piel y mucosas muy ricas en treponemas y altamente infecciosas. Tambin se pueden producir lesiones en otros rganos, fiebre, y en ocasiones pstulas o ppulas ricas en treponemas. Si esto se produjese nos encontraramos con una forma eruptiva, pero la mayor parte de los casos no aparece debido a la fuerte respuesta inmunitaria. Este cuadro clnico de carcter sistmico 139

remite a las pocas semanas (26 semanas) volviendo a entrar en fase de latencia. Transcurrida la fase de latencia (330 aos), surge la Sfilis terciaria, forma muy grave y mal pronstico si los pacientes no han sido tratados. El nmero de treponemas en sangre es muy escaso y abundante en ganglios, hueso, bazo, sistema cardiovascular, SNC, etc. Cuando afecta al SNC se denomina Neurosfilis, formndose tambin unas lesiones granulomatosas denominadas grummas. Recientemente de distingue entre: Sfilis precoz: menos de 1 ao de evolucin Sfilis tarda: mas de 1 ao de evolucin EPIDEMIOLOGA La transmisin ms frecuente es la sexual, pudiendo aparecer lesiones en labios, boca, tronco, etc. Otra modalidad de transmisin es la transplacentaria, llamada Sfilis congnita, que para evitarla se hace un estudio serolgico durante la gestacin. Tambin se realiza este estudio a donantes de sangre para evitar contagio por va transfusional. En la actualidad han disminuido los contagios por una buena metodologa del diagnostico y tratamiento eficaz aunque se est lejos de la erradicain. Tambin se le denomina Lues venerium. AISLAMIENTO Y CARACTERSTICAS BIOQUMICAS Toma de muestras: Se realiza exprimiendo el chancro primario o condiloma (mancha que aparece en la piel en la sfilis secundaria) Medios de cultivo: No crece en medios in vitro, solo en medios in vivo como testculos de conejo. Tinciones: de Giemsa e Impregnacin argntica. Diagnstico: Puede ser directo o indirecto: Directo: Buscamos microorganismos en tinciones. 140

 Indirecto: Pruebas serolgicas donde se busca en el suero del paciente Ac frente Treponema pallidum por medio de distintas pruebas: Pruebas reagnicas o no treponmicas: Son baratas, rpidas y ofrecen buena indicacin de la actividad de la enfermedad, pero son inespecficas, ya que dan falsos positivos. Tambin se denominan pruebas cardiolipnicas, ya que el Ag utilizado no el es Ag de treponema sino la cardiolipina, que es un lpido extrado de tejidos de mamferos (generalmente corazn de buey). Esta prueba es positiva entre las 23 semanas de infeccin no tratada. Existen 2 pruebas: Prueba de la floculacin o VRDL o RPR: La cardiolipina que acta de Ag se combina con la reagina (Ac tipo Ig E) que el husped produce para dar aglutinacin visible. Prueba de Wassermann o Fijacin de complemento: Las reaginas del suero fijan el complemento en presencia de cardiolipinas . Estas pruebas no treponmicas tienen gran sensibilidad.

Prue trepo Se utiliz para 141

conf Los Ag utiliz son trepo y se utiliz test de fluor deno prue FTA y de aglut (TPH que tiene la venta de que es senc y no nece micr de fluor Tam se utiliz ELIS TRATAMIENTO Penicilina, siendo alternativas eritromicina, cefalosporinas y tetraciclinas. 3. BORRELIA 3.1 Introduccin Es una espiroqueta de mayor tamao, con espirales ms amplias e 142

irregulares, son mviles y existen especies patgenas para el hombre y animales, originndose fiebres recurrentes y endmicas. Es anaerobio con metabolismo fermentativo y se tien con facilidad, son gram , se cultivan in vitro con medios complejos y enriquecidos. 3.2 Especies ms importantes Todas las bacterias son transmitidas por artrpodos: Piojo: dando lugar a Borrellia recurrentis, que provoca fiebres recurrentes a nivel mundial. Garrapata: produciendo Borrellia hispanica que produce fiebres recurrentes endmicas en Espaa. Tambin por garrapatas se transmite la Borrellia turicatae y Borrellia hermsii que producen fiebres 143

recurrentes en Estados Unidos. Borrellia burgoloferi produce la enfermedad de Lyme, etc. 3.3 Patologa 1. Fiebres recurrentes: Se manifiesta como una enfermedad septicmica febril con periodo de incubacin de 315 das, la fiebre persiste y continua con periodos afebriles de varios das o semanas pudindose repetir las recidivas hasta 10 veces en pacientes no tratados. Esto ocurre por las variaciones antignicas que se van produciendo en el microorganismo. A causado grandes epidemias en la 2 guerra mundial con un milln de casos declarados, calculndose en ms de 9 millones las infecciones reales. Actualmente es anormal en nuestro pas. 2. Enfermedad de Lyme. Es una enfermedad cuyo agente etiolgico se conoce 144

desde 1981, que produce una reaccin inflamatoria que en su inicio aparece como un eritema crnico migratorio (ECM), acompaado de mialgias, fiebre y adenopatas semanas o meses ms tarde produce complicaciones como meningoencefalitis, artritis, miocarditis, etc. Se da en Espaa, pero las dificultades de su diagnstico hace que se detecten menos casos de los que se podran esperar. 3.4 Tratamiento Penicilinas y tetraciclinas. 3.5 aislamiento y Caractersticas bioqumicas Se toma la muestra de sangre en estados febriles y se realiza tincin de gram y giemsa, tambin se realiza inoculacin en animales de experimentacin por ejemplo ratas y en ocasiones tambin se realizan tcnicas serolgicas. 4. LEPTOSPIRA 4.1. Introduccin 145

Formada por espiroquetas finas con espiras regulares muy numerosas y apretadas con sus extremos ligeramente incursados. Son mviles. Se tien dbilmente con gram siendo gram tambin con Giensa e impregnacin argntica. Se pueden cultivar in vitro en medios ricos en albmina y con cidos grasos. Su metabolismo es oxidativo y necesitan condiciones aerobias. Existen en la naturaleza Leptospiras saprfitas y parsitas. En el hombre pueden originar lectosporiasis que originan cuadros febriles. El reservorio son animales y de hecho las lectosporiasis se consideran zoonosis. 4.2. Especies ms importantes Lectospira biflexia: no es patgena para el hombre y es abundante en agua. Lestospira interrogans: que da lugar a cepas 146

parasitarias. 4.3. Patologa Presentan cuadros clnicos variados de leves a muy graves y en ocasiones mortales. Tras incubacin de 5 das a 3 semanas surge una 1 fase febril, donde la Leptospira se disemina por el aparato circulatorio originando leptospiremia. Le sigue una 2 fase de lectospiuria y en algunos casos tambin aparece en heces. Cuando la gravedad es extrema aparece ictericia, hapetomegalia, hematuria, nefritis, es decir principal afectacin renal y heptica. 4.4. Tratamiento Tetraciclinas, penicilinas 4.5. Aislamiento y caractersticas bioqumicas Toma de muestra sangunea en periodos febriles. Si la toma es de orina se realizara a los 10 15 das de la enfermedad y recin cogida se intentara visualizar la Leptospira por examen directo as como aislarla en medios especficos 147

como Jonhson Harrys. Esto se realiza inmediatamente ya que la Leptospira se destruye con facilidad. Si la muestra es suero se recurre a muestras inmunolgicas para demostrar la presencia de Acs frente a Leptospira como pruebas de fijacin de complemento, ELISA, ect. TEMA 22. BACILOS GRAM NEGATIVOS NO FERMENTADORES DE GLUCOSA. PSEUDOMONAS. 1. INTRODUCCIN 2. PSEUDOMONAS 2.1 Caractersticas 2.2 Clasificacin Primer grupo (pigmentos fluorescentes) : P. Aeruginosa, P. Putria y P. Fluorescens. Segundo grupo (producen el muermo) : P. Mallei y P. Pseudomallei. Tercer 148

grupo (excepcionalmente patgenas) : P. Cepacea, P. Diminuta, P. Maltopila y P. Acidovorans. 2.3 Poder patgeno. Antigenos: Ag. somtico O, Ag. flagelar H y Ag. mucoide M. Toxinas: enterotoxina y eritrodermica. Piocianina. 2.4 Patologa. 1 A nivel respiratorio: sinusitis, neumona, faringitis, etc. 2 A nivel del aparato circulatorio: endocarditis en drogadictos y personas con SIDA. 3 A nivel del aparato digestivo: enterocolitis, principalmente pacientes con SIDA. 4 A nivel del sistema nervioso: meningitis 149

en neonatos e inmunodeprimidos. 5 A nivel del aparato urinario: pielonefritis. 6 A nivel de la piel: infecciones graves por quemaduras. 7 A nivel del sistema osteoarticular: artritis. 8 A nivel de ojos y odos: ceguera y sordera. En casos graves bacteriemia y muerte. 2.5 Aislamiento y caractersticas bioqumicas. 3. OTROS MICROORGANISMOS NO FERMENTADORES DE GLUCOSA. 1. INTRODUCCIN Son microorganismos que aparecen como saprofitos o como comensales de hombres y animales. En ocasiones se asocian a infecciones afectando sobretodo a inmunodeprimidos. Todos son 150

incapaces de fermentar la glucosa. El principal patgeno es Pseudomona aeruginosa, considerado como el segundo agente patgeno nosocomial despus de E.coli. 2. PSEUDOMONAS 2.1 Caractersticas Son bacilos gram , aerobios estrictos, oxidasa + y mviles, con flagelacin polar a excepcin de P. Mallei que es inmvil. No fermentan los hidratos de carbono, pero pueden usar los azcares oxidndolos. Es catalasa + y salvo alguna excepcin no forman cpsula, no son esporulados. De 27 especies slo 8 tienen importancia clnica por el posible efecto patgeno que podran desencadenar. 2.2 Clasificacin Primer grupo: se caracteriza por dar pigmentos fluorescentes. Se pueden 151

encontrar de forma saprofita en piel y tubo digestivo, aunque puede crecer en rganos debilitados (quemados, graves infecciones) provocando cuadros graves y mortales (septicemias). Segundo grupo: generalmente se asocian a zoonosis, aunque se podran aislar en el hombre. P. Mallei es el agente causal del muermo (zoonosis transmitida generalmente por equinos que produce alteraciones cutneas, cuyo agente causal es P. mallei). 2.3 Poder patgeno (Pseudomonas aeruginosa). Presentan 3 antgenos: Antgeno somtico O. Antgeno flagelar H. 152

 Antgeno mucoide M. Presenta tambin toxinas: Enterotoxina, que provoca nauseas, vmitos, dolor abdominal, etc. Eritrodermica. Y en ocasiones tambin toxinas con mecanismo de accin parecido a la toxina diftrica que disminuye el consumo de oxigeno. Tambin es capaz de formar ciertas sustancias, como la piocianina que es un pigmento azulado de accin bactericida o la fluorescena de color verde amarillo o incluso pigmentos melnicos de color marrn. 2.4 Patologa Depender de que los cuadros sean graves o muy graves, del carcter oportunista, es decir, de las caractersticas del husped. 1. A nivel respiratorio: 153

 sinusitis neumona faringitis, etc. 2. A nivel del aparato circulatorio: endocarditis en drogadictos y personas con SIDA. 3. A nivel del aparato digestivo: enterocolitis, principalmente pacientes con SIDA. 4. A nivel del sistema nervioso: meningitis en neonatos e inmunodeprimidos. 5. A nivel del aparato urinario: pielonefritis. 6. A nivel de la piel: infecciones graves por quemaduras. 7. A nivel del sistema osteoarticular: artritis. 8. A nivel de ojos y odos: ceguera y sordera. En casos graves bacteriemia y muerte. 2.5 Aislamiento y caractersticas 154

bioqumicas Se realizar un frotis y tincin de gram (si la pus es azulada se sospechar de la existencia de P. aeruginosa). Tambin tincin de flagelos o tincin con anticuerpos fluorescentes para poder visualizar piocianina o pioverdina. Se cultiva a 37C. Es importante el estudio de los pigmentos pudiendo distinguir 4: Piocianina: color azulado que puede adquirir el medio y es caracterstico de P. Aeruginosa es el nico que la posee). Pioverdina: color verde. Eritorgeno: color rojo. Melenico: color marrn. Se pueden presentar distintas colonias: R: rugosas. S: lisas. M: mucoide. Medio de cultivo: Agar 155

cetrimida. En otros medios como Mckonkey, agar sangre, podemos ver hemlisis con olor caracterstico a fruta, debido a la produccin de aminoacetofenona, lo que ayuda a su identificacin. Toma de muestras: generalmente se realiza de cualquier producto patolgico de carcter purulento. Caractersticas que ayudan a la identificacin de Pseudomonas aeruginosa 1 En agar sangre aparicin de colonias azuladas y olor afrutado. 2 Catalasa, oxidasa y reduccin de nitratos + . 3 Crecimiento a 42C. 4 Oxidacin de glucosa y hidrlisis de arginina. 5 Tolerancia a la cetrimida. 156

TRATAMIENTO Es resistente a la mayor parte de los antibiticos, excepto aminoglucosidos, carbencilinas y colistina. 3. OTROS BACILOS GRAM NO FERMENTADORES DE GLUCOSA. (Ver pregunta 5 de fotocopia) TEMA 23. ENTEROBACTERIAS I 1. INTRODUCCIN. 2. CARACTERSTICAS MS IMPORTANTES. 3. ESTRUCTURA ANTIGNICA. 3.1 Antgenos: O, H y K (capsular). 3.2 Toxinas: exotoxinas, endotoxinas, hemolisinas y colimicinas. 4. GNEROS. 4.1 Fermentadores rpidos de lactosa. 4.2 Fermentadores lentos de lactosa. 4.3 No 157

fermentadores de lactosa 5. PRUEBAS BIOQUMICAS. 6. AISLAMIENTO Y CARACTERSTICAS BIOQUMICAS. 6.1 Medios de cultivo: Diferenciales poco selectivos: McKonkey y EMB. Diferenciales selectivos: SS, XLD y Hektoen. Complejos diferenciales: KIA y TSI. 6.2 Caldos de enriquecimiento: Selenito. Tetrationato. 6.3 Prueba de la DNAasa. 1.INTRODUCCIN. Son bacilos gram , aerobios y/o anaerobios facultativos, mviles (con flagelacin) o inmviles que en la ltima edicin del manual de Bergey's se clasifican en la familia Vibrionaceae. Se caracterizan por ser fermentadores de glucosa, suelen 158

ser huspedes habituales del tracto gastrointestinal de hombres y animales, producindose en muchas ocasiones efectos patgenos, en otros casos puede actuar como saprofito de la flora intestinal. Se pueden encontrar en agua y suelo y se pueden comportar como oportunistas. 2. CARACTERSTICAS MS IMPORTANTES. Son cocobacilos gram . Aerobios y/o anaerobios facultativos. Mviles o inmviles. Oxidasa . Catalasa +. Fermentadores de glucosa. Reducen nitratos a nitritos. Son muy importantes las pruebas del INVIC, KIA y TSI. Pueden producir gran cantidad de fermentos como gelatinazas, descarboxilasas, ureasas y 159

galactosidasas. Algunos pueden producir sulfhdrico. Presentan gran similitud biolgica con los vibrios, por eso se estudian conjuntamente aunque los vibrios son oxidasa +. 3. ESTRUCTURA ANTIGNICA 3.1. ANTGENOS Antgeno somtico O: Termosestable, ligado a la pared bacteriana siendo una endotoxina que presenta una parte proteica responsable del poder antignico, y una parte lipdica responsable, en parte de la toxicidad. Antgeno capsulado K: De naturaleza polisacrida con propiedades antiparasitarias. 160

 Antgeno flagelar H: De carcter proteico y responsable de la accin patgena de las bacterias. 3.2. TOXINAS Exotoxina: son enterotoxinas. Endotoxinas: responsables del shock txico. Hemolisinas: las producen algunas cepas. Colimicinas: susutancias son efecto antibitico (son txicas para las cepas de la misma o distinta especie de las cepas que las producen). 4. GNEROS DE ENTEROBACTERIAS Las enterobacterias siempre han sido clasificadas en funcin de su capacidad de fermentar la lactosa. Hay tres grupos: Fermentadores rpidos de lactosa: en l se encuentran Escherichia coli, Klebsiella y 161

Enterobacter. Fermentadores lentos de lactosa: se encuentran Citrobacter,Serratia, Yersinia y Shigella sonnei. Estos dos grupos de les denomina coliformes por su capacidad de fermentar la lactosa. No fermentadores de lactosa: son no coliformes, se encuentran Salmonella, Shigella y Proteus. 5. PRUEBAS BIOQUMICAS (Ver tabla 13.2) 6. AISLAMIENTO Y CARACTERSTICAS BIOQUMICAS 6.1. MEDIOS DE CULTIVO Los medios ms utilizados son: 1. Medios diferenciales poco selectivos: Permiten ver las diferencias entre fermentadores y no fermentadores de lactosa. Se utilizan:

Mackonkey (MK): donde los fermentadore aparecen formando colonias 162

rosas y los no fermentadore colonias incoloras EMB (Medio eosina azul de metileno o Levine) 2. Medios diferenciales ms selectivos: Son: Agar SS Medio XLD Medios Ektoen 3. Complejos diferenciales: Son: KIA (agar triple Fe): contiene lactosa y glucosa TSI (triple azucar Fe): contiene lactosa, glucosa y sacarosa Tanto TSI como KIA son medios slidos en tubo que constan de 2 partes: a. Parte superior acabada en pico de 163

flauta que permite ver el crecimiento aerobio b. Parte inferior que permite ver el crecimiento anaerobio. La siembra se hace a partir de una colonia bien aislada, tanto en la inclinacin como en el fondo. Las reacciones que pueden tener lugar y sus interpretaciones son: Parte Fondo aerbica

Alcalino cido

Inclinaci roja y fon amarillo, hay fermenta de la gluc

Parte Fondo aerbica

Amarillo Amarillo, cido cido fermenta de glucos lactosa. Rojo / Ro Alcalino Alcalino hay fermenta Indica inclinaci / fondo naranja, n Sin hay Alcalino cambio fermenta de azucar nicamen utiliza las peptonas

164

Los medios KIA y TSI permiten observar si hay produccin de gas en cuyo caso aparecer burbujas de aire o elevacin del medio y en ocasiones desquebrajamiento del medio. A las bacterias productoras de gas se les denomina aerognicas y las no productoras anaerognicas. La produccin de sulfhdrico se pone de manifiesto con la aparicin de coloracin negra, debido a las sales ferrosas como consecuencia de la reaccin del sulfhdrico con Fe 3+. Por tanto KIA y TSI ponen de manifiesto tres caractersticas: Capacidad para fermentar la lactosa (KIA) o lactosa y sacarosa (TSI). Produccin de gas por fermentacin de azucares. Produccin de sulfhdrico. 6.2. Caldos de enriquecimiento 165

Para que las bacterias se multipliquen y crezcan podemos utilizar caldos de enriquecimiento, ej.: caldo selenito ! Salmonella caldo tetrationato ! Salmonella y Shigella. Estos caldos son muy utilizados en las pruebas de heces, se toma con una torunda la muestra y se disuelve en dicho caldo 24 48 h. 6.3. Prueba de la ADNasa Se realiza sobre un agar que contiene verde de metilo como indicador y ADN como sustrato. Los organismos que producen ADNasa se identifican por la produccin de una zona clara alrededor de la colonia. TEMA 24. ENTEROBACTERIAS II 1. SALMONELLA 1.1. Introduccin 1.2. Epidemiologa 1.3. Accin patgena e inters 166

clnico Fiebres tifoideas Fiebres paratifoideas Infeccin gastrointestinal 1.4. Tratamiento 1.5. Aislamiento y Caractersticas bioqumicas 2. SHIGELLA 2.1. Introduccin 2.2. Accin patognica e inters clnico Ag O y K Exotoxinas (neurotoxina, citotoxina y enteroinvasiva) 2.3. Tratamiento 3. ESCHERICHIA COLI 3.1. Introduccin 3.2. Clasificacin segn cuadro clnico Enteropatgenas Enterotoxgena Enterohemorrgica Enteroinvasiva 3.3. Profilaxis y tratamiento 3.4. Aislamiento y Caractersticas bioqumicas 4. YERSINIA 167

4.1. Introduccin 4.2. Especies ms importantes Yersinai pestis (bubnica, pulmonar y septicmica) Yersinia pseudotuberculosis Yersinia enterocoltica 4.3. Aislamiento y Caractersticas bioqumicas 5. OTRAS ENTEROBACTERIAS (OPORTUNISTAS) 1. SALMONELLA 1.1. INTRODUCCIN El gnero Salmonella es el responsable de un gran nmero de gastroenteritis por los alimentos. Es mvil, con flagelacin pertrica, no coliforme, no esporulado y casi nunca capsulado. Tiene un carcter ms o menos patgeno segn las especies. 1.2. EPIDEMIOLOGA Las fuentes ms frecuentes de infeccin son las 168

aves (pollos, patos, etc.) y sus productos (huevos). Los brotes suelen aparecer por ingestin de alimentos que contienen huevos crudos o carnes poco hechas, dado que la Salmonella es sensible al cido gstrico se tienen que ingerir un gran nmero de microorganismos (106109 o/ml. o gr.) para que aparezcan los sntomas, multiplicndose en el intestino delgado. 1.3. ACCIN PATOGNICA E INTERS CLNICO Su accin patognica va a ser dependiente de los antgenos estructurales y toxinas. Poseen 3 antgenos: Antgeno somtico O. Antgeno flagelar H. Antgeno capsular K. Tambin posee una endotoxina y una enterotoxina responsable del efecto irritante y en ocasiones citotxico sobre el tracto intestinal.

169

Las especies del gnero Salmonella pueden actuar sobre el hombre y animales, los ms importantes son: S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis y S. enteritidis. Los principales cuadros clnicos son: a. Fiebres tifoideas(S. Typhy) y Fiebres paratifoideas(S. paratyphi) La Salmonella tras ser ingerida llega al intestino delgado y penetra por endocitosis destruyendo parte de la mucosa intestinal. Una vez dentro la Salmonella son fagocitadas por macrfagos originando una primera bacteriemia que tiene una duracin de 815 das, a partir de aqu hay un comienzo brusco de signos y sntomas de la enfermedad. La Salmonella en sangre es de nuevo captada por los mononucleares y de aqu pasa al bazo, hgado, etc. produciendo la multiplicacin de nuevas Salmonellas, 170

volviendo de nuevo al intestino donde provocan unas placas ulceradas con necrosacin denominadas placas de peyer y en casos ms graves pueden originar perforacin y hemorragias. Las fiebres pueden alcanzar 40C y durar varias semanas. Van acompaadas de dolores de cabeza, anorexia, debilidad, dolor muscular, etc. El germen se elimina a travs de las heces (Salmonella en heces es patgeno) b. Infecciones gastrointestinales Es la infeccin ms frecuente en caso de Salmonella. El periodo de incubacin es de 848 horas de haber ingerido el alimento contaminado. Aparecen nauseas, vmitos, etc. El sndrome requiere tratamiento de aproximadamente 6 das. Puede ser que no existan bacterias en sangre , sin embargo s aparecen en heces. Las personas ms propensas a padecer 171

la infeccin son nios, ancianos e inmunodeprimidos. Tras una infeccin de fiebres tifoideas un 13% se vuelven portadores crnicos eliminndolo en las heces durante largos periodos de tiempo. Desde el punto de vista epidemiolgico tiene gran importancia dado que de este modo se contribuye a la diseminacin del patgeno. En las salmonelosis no tifoideas menos del 1% de los pacientes van a seguir excretando el bacilo por heces. 1.4. TRATAMIENTO Ampicilina, cloranfenicol, trimetropim, sulfametoxazol y cefalosporinas. 1.5. AISLAMIENTO Y CARACTERSTICAS BIOQUMICAS Toma de muestras Se realiza en alimentos contaminados, sangre y heces. En caso de enfermedades 172

gastrointestinales son importantes los coprocultivos y alimentos sospechosos. En casos de fiebres tifoideas y paratifoideas las muestras se obtienen de sangre, orina y heces. 2. SHIGELLA 2.1. INTRODUCCIN Bacilo gram , no esporulado, no flagelado, no produce desaminasas, ni gas, ni H2S. 2.2. ACCIN PATOGNICA Se debe a los factores antignicos 0 y K y a la produccin de toxinas, principalmente exotoxinas que presentan propiedades citotxicas, neurotoxicas y enteroinvasivas. La toxina esta compuesta por 2 subunidades: subunidad b, que acta adheriendose a las clulas del epitelio gastrointestinal (efecto 173

enteroinvasivo). subunidad a, cuyo mecanismo consiste en el bloqueo de la sntesis proteica (efecto citotxico que origina un estado de necrosis celular con la consiguiente formacin de ulceras, hemorragias y perforaciones, siendo un cuadro clnico muy grave. Cualquier especie de Shigella al llegar al intestino comienza a ejercer la accin toxica para pasar despus al coln complicando el proceso, lo que origina neurosis y en general los signos y sntomas anteriormente descritos. Los cuadros diarreicos van acompaados de dolor clico, nauseas, vmitos, fiebre y deposiciones cada vez ms sanguinolentas (disentera bacilar), con moco y pus, los ms afectados son 174

los nios. 2.3. TRATAMIENTO El mismo que para Salmonellas y tambin fluoroquinolonas. 3. ESCHERICHIA COLI 3.1. INTRODUCCIN Y CLASIFICACIN SEGN EL CUADRO CLNICO Bacilo gram negativo, no esporulado, mvil con flagelos perticos, raramente capsulado y su capacidad antignica se debe a los Ag O y K confirindole propiedades antifagocitarias y de resistencia frente a sustancias bactericidas, proporcionndole con ello alto poder invasivo. Tambin presenta distintos tipos de toxinas, as los cuadros clnicos de las cepas patognicas para el hombre son ms o menos variables segn el tipo de toxina que la origina: 175

 Escherichia coli enteropatgena: forma una enterotoxina citotxica con cuadros diarreicos en brotes epidmicos que afecta principalmente a nios y lactantes. Escherichia coli enterotoxgena: forma una enterotoxina semejante a la del Vibrio cholerae, provocando procesos diarreicos que afecta a nios y adultos. Produce la diarrea del viajero. Escherichia coli enterohemorrgica: es similar a Shigella disenteriae que produce procesos diarreicos graves de tipo hemorrgico (sangre). Escherichia coli enteroinvasiva: se presenta principalmente en nios y adultos produciendo cuadros diarreicos graves con fiebre, dolor abdominal, diarreas con gran contenido de moco junto con leucocitos y PMN. En Escherichia coli no se recomienda dar profilaxis antibitica para diarrea del viajero con el fin de evitar cepas resistentes, s es conveniente 176

tomar precauciones como tomar agua embotellada, no consumir hortalizas crudas, etc. En caso de padecer esta infeccin se proceder a la restauracin del equilibrio electroltico. 3.2. TRATAMIENTO El tratamiento en lactantes es neomicina y en adultos fluorquinolonas. 3.3. AISLAMIENTO Y CARACTERSTICAS BIOQUMICAS Escherichia coli es saprofito del tubo digestivo y en general su presencia en agua y alimento es indicativo de contaminacin fecal reciente. A parte de trastornos gastrointestinales puede originar otras lesiones urinarias, biliares, infeccin de heridas y lesin en meninges principalmente en neonatos. Es uno de los principales microorganismos productores de infecciones nosocomiales. 177

En cuanto a las pruebas bioqumicas, destacar: las de la tabla 13.2 las pruebas del IMVIC Kliger 4. YERSINIA 4.1. INTRODUCCIN Bacilo o cocobacilo gram negativo con flagelacin peritrica, moviles a 25 C e inmoviles a 37C. No fermentan la lactosa, no forman esporas y excepcionalmente pueden presentar capsula. 4.2. ESPECIES MS IMPORTANTES Son: Yersinia pestis Yersinia pseudotuberculosis Yersinia enterocolitica 1. YERSINIA ENTEROCOLITICA Afecta principalmente a animales aunque tambin al hombre y principalmente a nios. Es un patgenos capaz de crecer a temperaturas de 178

refrigeracin (4C), por lo que es un microorganismo a tener en cuenta en industria alimentaria. Se requiere un inculo de 109 o /gr para adquirir la infeccin. Tras un periodo de incubacin de 47 das aparecen sntomas clnicos como: dolor abdominal, fiebre y en ocasiones diarrea. En los casos en los que no hay diarrea se confunde la yersioniosis con apendicitis aguda. Afecta a nios de 515 aos y principalmente en Europa.

Es sensible a aminoglucosidos, cloranfenicol y trimetroprimsulfametoxaz No se recomienda la utilizacin de Ab en caso de que los sntomas solo sean gastrointestinales, ya que la infeccin suele ser autolimitada. 2. YERSINIA PESTIS Es el agente causal de la peste en el hombre. Se origina de forma epidmica, da lugar a cuadros agudos y febriles con alta inflamacin 179

de ganglios linfticos, hemorragias internas, petequias y cuadros septicmicos y de neumona. Es grave y muy contagiosa aunque para ello es necesario la presencia de ratas y roedores, encargados de su diseminacin. Se origina en lugares de salubridad baja. Los factores de virulencia que determinan la gravedad de Yersinia pestis son: Toxina murina: de carcter proteico; bloquea la utilizacin de oxgeno por parte de ciertas clulas y en general slo se liberan al medio cuando muere la bacteria. Endotoxinas: liberadas por la bacteria en el transcurso de la enfermedad; estn relacionadas con el 180

proceso febril. Antgeno V: le confiere propiedades antofagocitarias. Coagulasas y fibrinolisinas. A Yersinia pestis tambin se le denomina Yersinia bubnica; Llega al hombre a travs de pulgas infectadas por ratas con peste. Tras la picadura de la pulga atraviesa los vasos linfticos y de aqu a los ganglios donde se multiplica formando bubones (inflamacin de los ganglios). De aqu pasa a sangre y posteriormente se disemina por bazo, hgado, pulmones, piel y mucosas donde aparecen lesiones con carcter pigeno, hemorrgico, necrtico y edematoso. En casos graves puede aparecer coagulacin intravascular por accin de las coagulasas y hemorragias por accin de las fibrinolisinas, colapso circulatorio, toxemia generalizada y muerte. Existen varias 181

formas clnicas dependiendo de su localizacin. Las ms importantes son: Peste bubnica: Es la ms frecuente y tras un periodo de incubacin de 37 das aparecen los primeros sntomas con escalofros, vmitos, bubones en ingles, axilas y zona submaxilar. Si no hay tratamiento se produce la muerte. Peste pulmonar: Es una complicacin de la peste bubnica, producindose una afectacin pulmonar grave con insuficiencia respiratoria, siendo altamente mortal. Peste septicmica: Corresponde a los ltimos estados de la peste en cualquiera de sus formas, pulmonar o bubnica. Es generalmente mortal. 4.3. AISLAMIENTO Y CARACTERSTICAS BIOQUMICAS La toma de muestra es a travs de exudados purulentos, bubn, sangre, LCR, tejido pulmonar, esputo, etc. 5. OTRAS 182

ENTEROBACTERIAS OPORTUNISTAS Klebsiella, Enterobacter y Serratia producen enfermedades nosocomiales. Klebsiella neumoniae es el agente etiolgico del 3% de las neumonas de origen bacteriano. Afecta principalmente a individuos con diabetes mellitus y alcohlicos con infeccin pulmonar crnica. Enterobacter se asocia a infecciones de heridas, quemaduras, e infecciones del tracto urinario y respiratorio. Serratia coloniza el tracto respiratorio y urinario de pacientes hospitalizados. Citrobacter se asocia a infecciones respiratorias y urinarias y, en ocasiones, 183

en neonatos se ha aislado en meningitis. Proteus, Morganella y Providencia se han relacionado con enfermedades del tracto urinario; tienen la capacidad de hidrolizar urea con liberacin de amoniaco produciendo la alcalinizacin de la orina que induce a la formacin de clculos renales. La movilidad de Proteus favorece la invasividad del tracto urinario. El gnero Providencia se ha asociado a bacteriemias en pacientes con catteres venosos. TEMA 25. LEGIONELLA, GARDNERELLA,SPIRILI HIMUS,STREPTOBACILL MOVILIFORMES Y 184

CALYNMATOBACTERIU GRANULOMATIS 1. LEGIONELLA NEOMOFILA 1.1. Introduccin 1.2. Hbitat natural y patogenia de la infeccin 1.3. Inters clnico 1.4. Aislamiento y Caractersticas bioqumicas 1.5. Tratamiento 2. GARDNERELLA VAGINALIS 2.1. Introduccin 2.2. Hbitat natural e inters clnico 2.3. Aislamiento y Caractersticas bioqumicas 2.4. Tratamiento 3. STREPTOBACILLUS MOVILIFORME (produce la Fiebre Norverhill) 4. SPIRILIUM HIMUS (produce la Fiebre de Sodoku)

5. CALYNMATOBACTERIU GRANULOMATIS (produce Granuloma inguinal 185

o Donovalosis) 1. LEGIONELLA NEOMOFILA 1.1. Introduccin Presenta 29 especies, tres subespecies y distintos subgrupos. De ella Legionella neomofila es el patgeno mas frecuente. Se aisl por 1 vez en 1976 a partir del tejido pulmonar en un brote de pulmona ocurrida en un grupo de legionarios de Philadelfia por lo que se conoce como la enfermedad de los legionarios. Es un bacilo gram , aerobio, de 0,5 2 micras que produce potentes citotxicas que pueden ser responsables de la lesin tisular del pulmn. La mayor parte de las especies posee flagelos. Todas las especies son catalasa y gelatina +, en general, no fermentan ni oxida HC y es nitrato y urea . Los aminocidos son su mayor fuente de energa y todas las especies necesitan N cistena para su crecimiento.

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1.2. Hbitat natural y patogenia de la infeccin El hbitat es el agua y a partir del agua se pueden contaminar residencias, cuarteles, hospitales Este microorganismo resiste T de hasta 60 C y se a aislado en agua fra y caliente, sistemas de aire acondicionado con desages. Los aerosoles que se generan en estos ambientes son la principal fuente de infeccin. Los pacientes de alto riesgo que pueden adquirir en enfermedades a travs de esta fuente en los hospitales. Legionella es un parsito intracelular facultativo, se desarrolla en el interior del citoplasma de clulas respiratorias, en ella se libera enzimas como lipasa, nucleasas, fosfatasas y potentes enzimas proteolticos que dan lugar a la destruccin celular. En el organismo humano se replica preferentemente en los macrfagos alveolares. 187

1.3. Inters clnico La enfermedad de los legionarios es una neumona aguda con manifestaciones multisistmicas que pueden presentarse como brotes epidmicas e infecciones nosocomiales. Tiene principal influencia en los meses de verano siendo mas frecuente en el hombre que en la mujer. El periodo de incubacin es de una semana. La enfermedad comienza con fiebre aguda, mialgia, debilidad y tos no productiva. Posteriormente comienza los sntomas respiratorios con esputo sanguinolento o purulento, disnea, dolor pleural, bradicardia, anorexia y en general un cuadro tpico de neumona atpica. Tambin va acompaado de sntomas extrapulmonares como confusin, desorientacin, vmitos, nauseas, diarrea La radiografa del trax muestra un 188

filtrado pulmonar y a menudo derrame pleural. Otras alteraciones analticas es un aumento de creatinina, hipolatremia, hipofosforemia y aumento de transaminasas sin ictericia, aumento de VSG e insuficiencia renal. Los factores que favorecen la infeccin son la inmunosupresin, ciruga reciente, edad elevada y tabaquismo. Adems produce un cuadro semejante a la gripe que se denomina fiebre de Pontiac, caracterizado por fiebre, tos, mialgia, dolor torcico, diarrea 1.4. Aislamiento y Caractersticas bioqumicas Toma de muestras: Generalmente son respiratorias aunque tambin existen muestras extrarespiratorias como liquido peritoneal, pericardico, exudados de heridas y en ocasiones hemocultivo. El esputo es una muestra valida para 189

el cultivo de Legionella ya que no forma parte de la flora normal. Si el paciente no expectora, se tomara una muestra por broncoscopia. En el transporte se debe evitar el uso con solucin salina porque el Na inhibe el crecimiento de Legionella. En cuanto al diagnostico microbiolgico destacaremos: Examen directo: se pueden hacer tinciones de gram, giensa, Jimnez aunque son muy tiles las tcnicas de inmunofluorescencia directa. El hecho la inmunofluorescencia sea negativa no excluye la enfermedad y es necesario realizar un cultivo. Pruebas serolgicas: principalmente RIA y ELISA el inconveniente es que no estn comercializadas. Tcnicas de hibridacin de ADN con PCR. En cuanto a los medios de cultivo el ms utilizado es: Bcye . Las placas se incuban a 35 C en atm. De 190

CO2 con humedad, un mnimo de 7 das algunos laboratorios incuban 2 semanas antes de desecharlas como , la identificacin de las colonias se hacen comparndola con una cepa control a las que se dan pases. 1.5. Tratamiento Principalmente eritromicina y en ocasiones rifampicina. 2. GARDNERELLA VAGINALIS 2.1. Introduccin Se suelen agrupar en bacilos gram pero se caracterizan por tener una pared laminar no tpica de gram + y gram , por tanto, es un bacilo gram variable, es anaerobio facultativo y oxidasa y catalasa . 2.2. Hbitat natural e inters clnico Se encuentra en flora vaginal de mujeres sanas de un 20 70 % este microorganismo desempea un papel importante en el sndrome de vaginosis 191

bacteriana caracterizado por: Exudado vaginal maloliente Ph vaginal mayor 4, 5 Flujo vaginal abundante Pruebas de las aminas +. Esta prueba consiste en mezclar una gota de KOH al 90% con una gota de exudado vaginal y si es + se aprecia un fuerte olor a pescado podrido. Presencia de clulas CLUE, que son clulas epiteliales recubiertas de bacterias. En vaginosis bacteriana el sndrome se caracteriza por la presencia de al menos 3 de los sntomas expuestos, tambin se ha descrito bacteriemia debido a Gardnerella vaginalis sobre todo en la fiebre post parto o post aborto. Tambin esta asociado a meningitis neonatal, 192

peritonitis, abscesos hepticos e infecciones urinarias. 2.3. Aislamiento y Caractersticas bioqumicas La toma de muestra se realizara de exudado vaginal y es preferible la toma de 2 muestras: para examen directo para cultivo que se realiza entre 48 72 h con medios semiselectivos con agar sangre humana con colistina y cido nalidsico. Para su determinacin se utilizan pruebas bioqumicas, enzimticos y cromatografitas acompaados de APIs. 2.4. Tratamiento Metromidazol, clindamicina y gentamicina. 3. STREPTOBACILLUS MOVILIFORMES Son bacilos gram pleomrficos y anaerobios 193

facultativos. Se encuentra en nasofaringe de ratas. El hombre adquiere la infeccin por mordedura, araazos de ratas u otros roedores. Produce la fiebre de Norverhill que se adquiere tras ingerir leche, agua u otra comida contaminada. La fiebre por mordedura de rata consiste en aparicin rpida de fiebre, cefaleas, nauseas y en un 75 % aparecen eritema primero macular papilar en la palma de la mano y planta del pie. Tambin puede haber diarreas y en la mitad de los pacientes poliartritis migratoria. En ocasiones existen complicaciones graves como neumonas, meningitis, endocarditis. Se asla en hemocultivos y lquido sinovial y crecen en medio con agar sangre y chocolate a 35 El tratamiento: penicilina, estreptomicina y 194

tetraciclina. 4. SPIRILiUM HIMUS Produce la fiebre de Sodoku, se produce por mordedura de rata y la sintomatologa va a ser igual que el del Streptobacillus moviliformes.

CALYNMATOBAC Son bacilos gram , pleomorficos, no mviles y capsulados. Produce la donovalosis o granuloma inguinal. La enfermedad se adquiere por va sexual y se caracteriza por aparicin de lesiones ulcerosas en el rea ano genital y algunas veces tambin en el rea extragenital. La mejor muestra es una biopsia donde se realiza tincin de giemsa. La donovalosis se caracteriza por la presencia de cuerpos de Donovan que consiste en reacciones donde el microorganismo aparecer como racimos teidos de azul oscuro o negro en el citoplasma de clulas mononucleares. 195

No existen medios de cultivo eficaces. Tratamiento es penicilina, tetraciclina y gentamicina. TEMA 26.IDENTIFICACIN BACTERIANA 1. PRUEBA DE IDENTIFICACIN Epidemiologa.(1 evaluacin) Morfologa.(1 evaluacin) Tinciones.(1 evaluacin) Pruebas de susceptibilidad.(tema de antibiticos) 2. SISTEMAS COMERCIALES Y SISTEMAS AUTOMTICOS 2.1 Sistemas multipruebas: Macrotcnicas: KIA y TSI. Microtcnicas: API, Tubos, otros. Sistemas rpidos: tiras reactivas, mtodos automticos. 2.2 APIS. Introduccin. Fundamento. Material. Reactivos. Tcnica: 1 Preparacin de la 196

galera. 2 Preparacin del inculo. 3 Realizacin de la inoculacin. 4 Periodo de incubacin. 5 Resultados e interpretacin. API Es un sistema de 1020 microtubos que contienen los medios deshidratados. Se cultivan con una suspensin bacteriana que los rehidrata. Durante la incubacin el metabolismo del microorganismo origina cambios en el color del medio o bien se produce al aadir reactivos. La interpretacin de estos cambios se produce mediante tablas de lectura u otros sistemas automticos. Si la practica la realizamos manualmente obtendremos un perfil numrico que nos servir para la identificacin de microorganismos. (Ver figura 17.15 y libros de Staphylococos y 197

Enterobacterias) TEMA 27. ANTIMICROBIANOS Y PRUEBA DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS 1. CLASIFICACIN 2. CONSIDERACIONES PRCTICAS 2.1. Eleccin de antibitocos 2.2. Controles durante la antibioterapia 2.3. Fallo en la respuesta 2.4. Asociacin de antibitocos 3. ANTIBITICOS EN SITUACIONES ESPECIALES 3.1. Embarazo 3.2. Lactancia 3.3. Antibiticos en insuficiencia renal 4. DEFINICIONES 4.1. Antibitico sensible 4.2. CMI 4.3. CMB 198

4.4. Coeficiente teraputico 4.5. Resistencia 5. MTODOS DE ANTIBITICOS 5.1. Dilucin Slido Lquido 5.2. Difusin. Fuentes de error son debidas a: Medio Antibiticos Microorganismo Observador 5.3. Eluccin de discos 6. RESISITENCIA A LOS ANTIMICROBIANOS 6.1. Alteracin de permeabilidad 6.2. Alteracin de blanco o diana 6.3. Inactivacin enzimtica 6.4. Reflujo 6.5. Bloqueo 1. CLASIFICACIN 1.1. LACTMICOS En su estructura qumica presentan un anillo lactmico. 199

Su mecanismo de accin se basa en la inhibicin de la formacin de peptidoglucano componente esencial de la pared celular. Para ello se fijan a las PDP/PFD (protenas fijadoras de penicilina). Su accin suele ser bactericida y los grupos principales son: Penicilinas Cefalosporinas Carbapenemas Monobactamas INBIL (inhibidores de lactamasa) 1. PENICILINAS La base se estos compuestos es el 6amino penicilnico (6APA). Dentro de las penicilinas hay varios grupos: Penicilina G y V: Se suelen administrar oralmente. Son tiles para gram positivos como neumococo, streptococo, strptococo pyogenes, anaerobios, espiroquetas y enterococo. No es activa frente a enterobacterias. Presenta baja toxicidad y se asocian a procana 200

y benzatina para prolongar la semivida plasmtica (concepto de tiempo de activacin de los Ab en el organismo), tambin se puede unir al probenecid que bloquea su excrecin por los tbulos renales. Aminopenicilinas: Se destacan la ampicilina y amoxicilina. Son de amplio espectro (pueden actuar sobre gram positivos y gram negativos). Actan bien sobre enterobacterias aparece resistencia en cepas de Escherichia coli. Isoosazolil: Son penicilinas resistentes a penicilasas y son muy tiles como tratamiento de eleccin para Staphylococos aureus. Las principales son: oxacilina, cloxacilina y meticilina. Carboxipenicilinas: Se recomiendan para gram negativos, principalmente para Enterobacterias y Psudomonas. La principal es la carbenicilina. Ureidopenicilinas: Muy utilizado frente a enterococos y streptococos, 201

destacando la piperacilina. 2. Cefalosporinas El ncleo es el 7aminocefalosporamico (7ACA) Proceden de productos de fermentacin de hongos del genero Cefalosporium cuyo anillo bsico es el anterior. Se clasifican por generaciones estando en desarrollo la 4 generacin; 1 generacin: actan sobre gram + y tiene una accin moderada sobre gram . Destacan: cefalotina y cefactor. 2 generacin: tiles sobre gram y algunos anaerobios. Destacan cefoxitina y cefamandol. 3 generacin: aunque disminuye su actividad sobre gram + aumenta sobre gram . Destaca Cefotaxima. Hoy existen preparados activos sobre va oral como cefixima. 3. Carbapenemas El principal es IMIPENEM. Tiene la siguiente estructura: 202

Es inestable y destruido por dihidropeptidasas renales por lo que se une a lafilaxtatina para evitarlo. Tiene un gran espectro de accin generalmente todos los cocos gram + y gram , bacilos gram +, anaerobios y la mayor parte de enterobacterias y algunas pseudomonas son sensibles a l. Es resistente a Staphilococo Aureus y no se absorbe por va oral. 4. Monobactamas: Son derivados monociclicos cuyo principal representante es aztreonam cuya formula es: Se caracteriza por tener un espectro ms reducido siendo activo solo gram especialmente pseudomonas y enterobacterias 5. INBIL Inhibidor de lactamasa. Su actividad antimicrobiana es reducida pero su unin irreversible sobre algunos lactamasa impiden que estos destruyan los Ab 203

lactmicos por lo tanto estos inhibidores suicidas deben ir asociados a otros Ab lactmicos proporcionando un aumento de su espectro. Destaca el cido clavulanico, cuya estructura es: 1.2. INHIBIDORES DE LA SNTESIS PROTEICA Antibiticos que actan sobre la subunidad 30s de los ribosomas Aminoglucsidos: Son antibiticos naturales y semisintticos. Son potentes bactericidas y pueden derivar de Streptomyces o Micromonospora (son hongos). Los principales aminoglucosidos son: Streptomicina, Gentamicina, Trobamicina, Neomicina, Amikacina. El mecanismo de accin se centra en el ribosoma en la subunidad 30s, producindose una inhibicin de la 204

sntesis proteica o protenas defectuosas por error en la lectura del ARNm. Son muy activos sobre gram entre ellos Psudomonas, Acinetobacter y sobre gram + como Staphylococo aureus. Pueden presentar sinergismo con lactmicos, con los que frecuentemente se asocian. Las reacciones adversas ms importantes son toxicidad renal y auditiva. Tretraciclinas: Son antibiticos de amplio espectro bacteriosttico que se unen a la subunidad 30S del ribosoma inhibiendo la sntesis proteica. La ms utilizada es la Doxiciclina que presenta un amplio espectro sobre gram y + (Ej: Brucella, Vibrio, Micoplasma, Micobacterium, Clamidia, etc.). En la actualidad el nivel de resistencia de Neumococos y 205

Enterobacterias es elevado. No se utilizan en nios menores de 8 aos ya que pueden afectar a la denticin y huesos. Pueden provocar trastornos gastrointestinales y hepticos. 5

6 Tetraciclina CH2OH Clortetraciclina CH2OH Doxicilina OH CH3 Antibiticos que actan sobre la subunidad 50s de los ribosomas: Cloranfenicol: Su accin se sita en la subunidad 50s del ribosoma, impidiendo la transpeptidacin. Su espectro abarca gram y + (Ej: anaerobios, espiroquetas, micoplasmas, etc.), aunque se suelen reservar para infecciones graves ya que produce toxiinfeccin medular. Si: R es NO2 > Cloranfenicol. 206

R es CH2SO2> Tranfenicol

Macrlidos: Dentro de este grupo tenemos dos principalmente: Eritromicin que procede de Streptomyces Es un antibitico de medio espectro que acta a nivel de la subunidad 50s impidiendo la transpeptidac y translocacin inhibiendo la elongacin de la cadena proteica. Su espectro abarca gram +, Micoplasma, Trachomatis Legionella, siendo resistentes las Enterobacter 207

 Clindamicin es un antibitico frente a anaerobios y su espectro, mecanismo de accin y farmacologa es parecida a los macrlidos. Se considera por esto compuesto similar a los macrlidos. 1.3. QUINOLONAS Y FLOXACINAS Son quimioterpicos que se obtienen por sntesis qumica; su mecanismo de accin se basa en la inhibicin de la ADNgirasa, enzima necesaria para la duplicacin del ADN. Son bactericidas. El primero que se introdujo fue el cido nalidxico como antisptico de vas urinarias. La norfloxacina 208

supuso una ampliacin de espectro sobre gram positivos y pseudomonas. La Ciprofloxacina se puede utilizar en infecciones distintas de las vas urinarias debido a la buena concentracin que alcanza en los tejidos. Presenta buena actividad sobre parasitos intracelulares y amplio espectro. Puede actuar sobre Rickettsias, micobacterias, parsitos intestinales y genitales. Se puede utilizar por va oral. El uso desmedido de las quinolonas llevan a un aumento de la resistencia.

R1 Ac. Nalidxico CH2CH3 Norfloxacina CH2CH3 Ciprofloxacinol 1.4. GLUCOPPTIDOS Destacan la vancomicina y teicoplamina. Tienen actividad sobre los gram positivos. Presentan toxicidad renal y tica y no se absorben por oral. Estn reservados para infecciones por gram positivos resistentes. Su mecanismo de 209

accin se dirige contra la formacin de la pared celular inhibiendo la sntesis de peptidoglucanos. 1.5. SULFAMIDAS Y TRIMETROPRIM

Ambos inhiben a distintos niveles la sntesis de cido flico. Se utiliza el trimetroprimsulfametoxaz Las sulfamidas derivan del paraaminobencenosulfamida cuya estructura es: Suele administrarse por va oral. No se utiliza en neonatos porque compite con la bilirrubina. Presenta un amplio espectro que comprende gram positivos, gram negativos, actinomicetales, clamidias y algunos parsitos como toxoplasma, plasmodium, etc. 1.6. NITROIMIDAZOLES Destaca el metroimidazol que es bactericida. Acta sobre el ADN y es til sobre anaerobios y algunos parsitos como triquina, tricomonas y entamoeba.

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1.7. OTROS ANTIBITICOS Nitrofurantona: es un antisptico de vas urinarias y acta sobre gram positivos y gram negativos. cido fusdico: acta sobre Staphylococos aureus Rifampicina: esun antituberculoso; tambin acta contra el meningococo, gonococo, clamydias y haemophylus. Fosfomicina: de origen espaol, de amplio espectro que acta a nivel de la pared celular. 2. CONSIDERACIONES PRCTICAS 2.1. ELECCIN DEL ANTIBIOTICO Para elegir un frmaco hay que tener en cuenta: microorganismo condiciones de la 211

infeccin condiciones del paciente Siempre que sea posible, el tratamiento debe ser elegido o iniciado slo despus de que se haya determinado el agente etiologico; esto nos obliga a un conocimiento de los principales grmenes implicados en infecciones especficas as como el Ab ms especfico para cada grmen. Un punto importante a tener en cuenta son las condiciones del paciente. Tenemos que considerar la posible historia de hipersensibilidad, estado inmunitario, funcin heptica y funcin renal. Una vez determinadas dichas condiciones debemos elegir el Ab que debe cumplir los siguientes requisitos: ser el ms activo y especfico, a ser posible bactericida menos txico ms barato 2.2. CONTROL DURANTE LA ANTIBIOTERAPIA

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Son necesarios debido a la aparicin de efectos secundarios. Estas medidas son ms necesarias en aquellas condiciones en las que se prevea un mayor riesgo por edad, alteracin heptica, renal, etc. Estas medidas incluyen controles qumicos, hematolgicos, bioqumicos, bacteriolgicos, etc. 2.3. FALLOS DE RESPUESTA Ante este problema se debe plantear de nuevo toda la sistemtica relacionada con la eleccin del Ab. Si las causas son: Debidas al germen: Que no sea el agente etiolgico Que presente resistencia Que haya sobreinfeccin (haya ms de un microorganismo implicado en la infeccin) Debidas al antibitico: Que no sea el Ab 213

adecuado para el germen Que no sea la va de administraci adecuada Que no sea la dosis adecuada Debidas a caracterstica del paciente o de su infeccin: Prese de cuerp extra Acce insuf dren (la sang no llega al lugar de infec El pacie no cump el trata

2.4. ASO DE ANT 214

Los objet que se persi con la asoc de Ab son:

Es impo esco antib con distin meca de acci cuya acci tenga un efect sinr a ser posib bacte Se debe admi por sepa y cada uno en 215

su dosis terap

3. ANT EN SITU ESP

3.1. Emb

Las regla gene para el uso de Ab en gesta es el sigui

Cont abso de drog antiv Evita medi nuev Evita frm en el 1 trime Emp el meno n de frm en los mese sigui

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Se cons siem contr

Se suele utiliz amp eritr y mico

3.2. Lact

En la leche mate se alcan nivel simil a los sang con el uso de clora eritr sulfa y tetra

3.3. ANT en insu rena

En pacie con insuf renal 217

se debe evita los Ab mas txic y los de elim exclu renal

4. Con

4.1. antib Sens

Cuan un deter Ab alcan nivel plasm igual a la CMI en el lugar de la infec

4.2. CMI

La mni canti de antib que inhib el creci

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4.3. CMB

Es la conc mni bacte (mat al micr

4.4. Coef terap

Es la relac entre la conc en el lugar de la infec y CMI

4.5. Resi

Es cuan no inhib el creci

5. Mto de antib

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5.1. Dilu

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1. Prep diluc de antim a parti de la soluc madr por el caldo de Me

2. Se coloc en una serie de tubo de rosca 1 ml de cada soluc de antim e inocu con 1 ml de 221

susp de micr

3. Incu 37 C 18 24 h.

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