FLAVONIDES ISOLAMENTO E IDENTIFICAO Os solventes usados nos isolamentos das plantas relacionam-se com a polaridade dos flavonides: os solventes

mais polares (acetona, alcois diludos e a gua) para os hetersidos; os menos polares (benzeno, clorofrmio, acetato de etilo) para extrair as geninas. As antocioninas solubilizam-se na gua ligeiramente acidulada pelo cido clordrico, pois dado o seu carter aninico so insolveis em meio neutro ou alcalino. Recomenda-se proceder purificao prvia da matria-prima por uma solvente apolar (ter de petrleo) a fim de eliminar gorduras, ceras, esteris, carotenos e clorofilas pelo menos em parte. Nestas circunstncias, os flavonides livres dissolvem-se em conjunto com aquelas substncias. Conhecem-se diversos

processos para purificar as solues extrativas. Um dos primitivos, diversas vezes ensaiado em qumica vegetal, preconiza: evaporar a soluo extrativa, esgotar o resduo pelo etanol e precipitar diversos constituintes pelo acetato de chumbo; separar o precipitado, que contm os flavonides e decomp-lo, finalmente, suspenso na gua, pelo cido sulfdrico ou sulfrico. Experimentaram-se as resinas catinicas acondicionadas em colunas: os compostos fenlicos contidos nas solues aquosas fixam-se nas resinas: os hetersidos eluem-se, por fim, com solues alcolicas diludas e os flavonides livres por solues concentradas. O carvo animal emprega-se tambm nas purificaes: dissolvem-se depois os compostos adsorvidos no lcool metlico, na soluo de fenol a 7% ou na gua a ferver. As tcnicas cromatogrficas utilizam-se de diversos modos. Nos isolamentos aconselham-se tcnicas preparativas; pelo contrrio, nas identificaes e dosagens podem usar-se apenas alguns microgramas de substncias. Um outro aspecto da anlise, consiste em isolar e identificar os hetersidos naturais e ento deve proceder-se de modo a evitar a hidrlise ( conveniente juntar um pouco de carbonato de clcio ao solvente da extrao para neutralizar os cidos naturais). Pelo contrrio, pode interessar o conhecimento das geninas e ento procede-se hidrlise dos hetersidos contidos nas solues extrativas primitivas,

por aquecimento com cidos minerais diludos. A hidrlise diasttica assume um aspecto especfico. A hidrlise alcalina (saponificao) emprega-se para decompor os steres naturais, para simplificar a estrutura de alguns flavonides.Os compostos aglicnicos libertos das suas cadeias glucdicas separam-se, em meio cido, por um solvente voltil imiscvel na gua (ter, acetato de etilo, lcool isoamlico). O isolamento dos diversos flavonides existentes sempre nas misturas naturais, nas plantas, efetua-se em geral por tcnicas cromatogrficas. A cromatografia em coluna de adsorventes nem sempre soluciona o problema do isolamento individual dos flavonides, porm, um processo simples e adapta-se separao em larga escala. Experimentaram-se diversos adsorventes: a alumina fixa-os de maneira irreversvel ou cede-os com dificuldade; obtiveram-se os melhores resultados com cido silcico, silicato de magnsio hidratado, celulose, poliamide, sulfato de clcio, etc. O sphadex usa-se particularmente como crivo molecular para separar os hetersidos das geninas. Na cromatografia em camada delgada de adosrventes usa-se tambm o cido silcico e, ainda, uma substncia plstica em p denominada poliamide. Empregamse diversos desenvolventes conforme a natureza qumica dos flavonides, livres e combinados. Os reagentes reveladores so comuns cromatografia em papel. Divulgou-se, inicialmente, a cromatografia em papel nas suas modalidades, de preferncia a tcnica ascendente, mono ou bidimensional. Os desenvolventes propostos, muito numerosos, variam segundo o seu estado: para os hetersidos usa-se a gua acidulada pelo cido actico, por vezes saturada de butanol; as geninas exigem cidos menos diludos, tambm o butanol actico (por vezes juntamlhes um pouco de bissulfato para evitaro xidaes de alguns flavonides). A revelao pode realizar-se j pela prpria cor dos constituintes luz diurna (auronas, chalconas); quando as quantidades depositadas so to pequenas que no pode revelar-se esta sua qualidade particular, recorre-se ao exame no ultravioleta. Deve efetuar-se sempre o ensaio da fluorescncia no UV, pois o comportamento diferente nas mesmas circunstncias permite, por vezes, distinguir grupos particulares de flavonides. Adaptaram-se microanlise diversas reaes cromticas com o objeto de visualizar as manchas: vapores de amonaco,

pentacloreto de antimnio, cloreto de ferro, ferricianeto de potssio e cloreto frrico, nitrato de prata, sais de diaznio, etc. As tcnicas cromatogrficas, em camada delgada e no papel, simplificaram a anlise deste grupo de matrias corantes naturais nos diversos aspectos do isolamento, verificao de pureza, identificao (pelos valores de Rf e coloraes obtidas com reveladores) e at na dosagem. Notvel, ainda, a sensibilidade manifestada, pois permitiu reconhecer novos constituintes em misturas que os mtodos qumicos anteriores nunca puderam acusar. Uma outra variante da cromatografia de partilha a sua execuo em macro-escala, denominada preparativa. Procurou-se aproveitar a sensibilidade manifestada de modo a isolar os constituintes em quantidades relativamente mais elevadas. possvel tambm o emprego da cromatografia na fase gasosa dos flavonides desde que sejam transformados antecipadamente em derivados mais volteis, teres e steres. Recomenda-se em particular a sililao. Nesta anlise preferem-se cromatgrafos munidos do detectos de captura de eltrons, de sensibilidade duas a trs vezes superior manifestada pelo detector de ionizao chama. A cromatografia permite ainda a identificao dos flavonides desde que seja possvel reproduzir sempre as mesmas condies experimentais pelos valores de Rf ou dos tempos de reteno. Na impossibilidade de observar aquela exigncia ou na falta de tabelas com os valores das unidades referidas empregamse padres de flavonides puros para cromatografar em paralelo nos mesmos ensaios: a igualdade de valores deve corresponder mesma substncia. Utilizam-se outros mtodos de identificao e estruturao: dispondo-se de quantidade aprecivel de substncia isolada e purificada determinam-se os pontos de fuso e os espectros no UV e IV; nos micro-ensaios, os aspectros de massa e de ressonncia magntica do proto. Os problemas analticos dos flavonides livres so mais simples do que aqueles relativos aos seus hetersidos.

TANINOS IDENTIFICAO Os taninos vegetais tm sido quantificados por diversos tipos de ensaios, como precipitao de metais ou protenas e por mtodos colorimtricos, sendo esses ltimos mais comuns. Os mtodos mais apropriados para determinao de taninos so os ensaios com precipitao de protenas. Alguns ensaios colorimtricos so usados para quantificar grupos de taninos especficos, muito embora estes mtodos sejam amplamente usados para analisar taninos de uma maneira geral, como no caso de taninos hidrolisveis; eles detectam somente grupos galoil e

hexaidroxidifenis (HHDP). Apesar destas crticas, alguns autores afirmam que no h mtodo ideal e reforam que os mtodos colorimtricos so os mais utilizados para a anlise de taninos. Entre os mtodos colorimtricos, o mtodo de Folin-Denis bem reconhecido e largamente usado, mas no faz distino entre compostos fenlicos e outros materiais redutores ou antioxidantes, como o cido ascrbico, formando precipitados que interferem na leitura espectrofotomtrica32. O mtodo Folin-Denis foi aperfeioado e modificado para o Folin-Ciocalteau33. Estudos realizados para a avaliao de mtodos quantitativos nas folhas de conferas, usando Azul da Prssia e Folin-Ciocalteau, revelaram que esse ltimo apresenta maior sensibilidade, para os polifenis, usando como solvente acetona 50%. Os autores mostraram, ainda, que o mtodo Azul da Prssia apresentou elevada dependncia do tempo de reao, comparado ao Folin-Ciocalteau34. Para quantificar taninos condensados os mtodos mais utilizados so o butanol-HCl e o vanilina. De acordo com Schofield e colaboradores 32, o mtodo vanilina depende da reao da vanilina com os taninos condensados para formao de complexos coloridos. O sucesso deste ensaio depende do tipo do solvente usado, da concentrao e natureza do cido, do tempo da reao, temperatura e concentrao da vanilina. O maior problema para o mtodo vanilina parece ser a reatividade de subunidades de polmeros de taninos, o que caracteriza a falta de especificidade, para taninos condensados32. A raiz das dificuldades analticas est na complexidade e variabilidade das estruturas dos taninos condensados 32.

Em ensaios colorimtricos, o mtodo mais apropriado para a reao com galotaninos e elagitaninos o mtodo KIO3, sendo o mtodo Rodanina especfico para steres de cido glico31,37. Em espcies de Acer, a reao do reagente-KIO3 produz com galo e elagitaninos um complexo de colorao rosa. Mueller-Harvey31 acrescentou que para misturas complexas de taninos este ensaio no vivel por formar uma reao marron antes da rosa e ser extremamente dependente da temperatura e durao da reao. Willis e Allen38 introduziram modificaes no mtodo KIO3, recomendaram a investigao de um tempo timo de reao (dependendo de cada espcie estudada) e que no necessrio o resfriamento das amostras para o teste, como se acreditava. Por essas molculas apresentarem uma grande variabilidade de estruturas, tanto em taninos condensados como hidrolisveis, alta reatividade de suas subunidades com materiais oxidativos e complexao com macromolculas, o processo de isolamento, identificao e quantificao torna-se bastante complexo.

REFERNCIAS MONTEIRO, J. Taninos: uma abordagem da qumica biologia. Disponvel em http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0100-40422005000500029&script=sci_arttext Acesso em 15/11/2010 COSTA, A. F. FARMACOGNOSIA. 5 ed. Lisboa: Gulbenkian, 2002. II volume.