Ensb Lessons-Genetique-Genie Genetique

29/12/15
Programme du module
République Algérienne Démocra;que et populaire
Chapitre 1. Support de l’informa)on géné)que 4.3. Eléments géné;ques mobiles (transposons et
Ministère de l’Enseignement Supérieure et de la Recherche Scien;fique rétrotransposons).
1.1. Structure et dynamique de l’ADN
Ecole Na)onale Supérieure de Biotechnologie 1.2. Structure et organisa;on du génome dans le noyau. 4.4. U;lisa;on des transposons

Chapitre 5. Expression de l’informa)on géné)que et de

Chapitre 2. Muta)ons, Mutagénèse et Détec)on son contrôle.
2.1. Muta;ons géniques 5.1. Structure de l’ARN.
2.2. Mutagenèses physiques, chimiques et biologiques, 5.2. Transcrip;on et la matura;on de l’ARN.
Techniques de modifica;on du matériel géné;que. 5.3. Traduc;on et la matura;on des protéines
2.3. Détec;on et mise en évidence des muta;ons 5.4. Régula;on du fonc;onnement et de l’expression des
(diagnos;c génotypique). gènes

Chapitre 3. Transmission et main)en de l’informa)on 5.5. Voies de régula;on des gènes par les signaux
Cours Bio-‐005 : Biologie géné)que

3.1. La réplica;on de l’ADN et sa régula;on.

extracellulaires.
Chapitre 6. Méthodologie en biologie moléculaire
moléculaire
3.2. La répara;on de l’ADN et détec;on du pouvoir 6.1. Méthodes de caractérisa;on et analyse de l’ADN
mutagène 6.2. Amplifica;on, PCR et ses applica;ons : séquençage,
3.3. Les systèmes de restric;on-‐modifica;on, les cartes de restric;on et analyse des polymorphismes, interac;on
restric;on, intérêt et analyse du polymorphisme de avec les protéines.
restric;on.
Chapitre 7. Génie géné)que

Chapitre 4. Mécanismes moléculaires de la recombinaison 7.1. Les ou;ls du génie-‐géné;que.
4.1. Recombinaison homologue ; Cartographie ; Analyse et 7.2. Sources et prépara;on de l’ADN à cloner.
construc;on géné;que. 7.3. Transfert de l’ADN
4.2. Recombinaison à un site spécifique. 7.4. Criblage des banques de clones

Novembre 2015 Chapitre 7 : Génie géné;que 1 Novembre 2015 Chapitre 7 : Génie géné;que 2
Plan du cours
1. Défini)on du Génie Géné)que

1.1. Quelques dates clés
Cours Bio-‐005 : Biologie 1.2. Méthodologie
2. Les ou)ls du Génie Géné)que
moléculaire 2.1. Les ou6ls enzyma6ques
2.2. Les vecteurs
2.3. Les hôtes

Chapitre 7 : Génie géné;que 3. L’hybrida)on moléculaire

4. Le clonage moléculaire

5. Le criblage moléculaire

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Défini6on Défini6on
Quelques dates :
L’expression du génie géné;que s’applique à : •1972 : Début du génie géné;que : recombinaison d’ADN in vitro (Jackson,
1.la recombinaison du DNA in vitro Symons, Berg) Construc;on d’une molécule hybride d’ADN à par;r d’une
2.au transfert de cet ADN recombinant dans un hôte enzyme de restric;on (EcoR1) et de ligase 11.
•1973 : Electrophorèse de l’ADN sur gel d’agarose
A quel but ?
•1974 : Clonage de l’ADN u;lisant des banques d’ADN génomiques
1-‐Obtenir une grande quan;té d’un ou plusieurs gènes •1978 : 50 enzymes de restric;on sont connues : cartographie de l’ADN
•1977 : Construc;on du vecteur pBR322 (Bolivar)
2-‐ Obtenir à grande échelle l’expression d’un gène pour un produit •1977 : Séquençage de l’ADN (Sanger, Maxam et Gilbert)
d’intérêt (hormones, enzymes et vaccin)
•1978 : Expression de protéines humaines dans les bactéries
3-‐Modifier le phénotype d’un organisme vivant en lui insérant un ou •1980 : Expression de protéines humaines dans les cellules animales
plusieurs gènes provenant d’un autre organisme •1980 : Première plante transgénique
(plantes résistantes à des insectes -‐> OGM) •1981 : Première souris transgénique (Brinster)
•1983 : Amplifica;on spécifique d’ADN (PCR) (Mullis)
Méthodologie du génie géné6que Méthodologie du génie géné6que

1. Fragmenta;on et isolement du DNA et inser;on des fragments dans un 1. Fragmenta;on et isolement du DNA et inser;on des fragments dans un
vecteur. vecteur.
2. Incorpora;on du DNA recombinant dans une cellule hôte capable 2. Incorpora;on du DNA recombinant dans une cellule hôte capable
d’assurer sa réplica;on. d’assurer sa réplica;on.

3. Détec;on et isolement du clone cellulaire contenant le gène intéressant et 3. Détec;on et isolement du clone cellulaire contenant le gène intéressant et
éventuellement la culture sur vaste échelle pour extraire le produit de ce éventuellement la culture sur vaste échelle pour extraire le produit de ce
gène gène
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Méthodologie du génie géné6que Les ou6ls du génie géné6que

1. Fragmenta;on et isolement du DNA et inser;on des fragments dans un
vecteur. 1-‐ Les ou6ls enzyma6ques
2. Incorpora;on du DNA recombinant dans une cellule hôte capable
d’assurer sa réplica;on. § Couper

3. Détec;on et isolement du clone cellulaire contenant le gène intéressant et 1. Les enzymes de restric6ons
éventuellement la culture sur vaste échelle pour extraire le produit de ce 2. Les endonucléases
gène 3. Les exonucléases

§ Copier
1. ADN polymerase
2. ARN polymerase
3. ADN polymerase ARN dépendante

§ Coller
Les ligases
Les ou6ls du génie géné6que Les ou6ls du génie géné6que
1-‐ Les ou6ls enzyma6ques 1-‐ Les ou6ls enzyma6ques
§ Couper § Couper
1. Les enzymes de restric6ons 2. Les endonucléases

-‐ Endonucléases bien spécifiques en des sites de 4 à 8 pb (site de restric;on). -‐ Nucléase, qui coupe un acide nucléique en fragments plus courts
-‐ Produites par les bactéries pour se protéger de l’ADN étranger (ex : phages). • La DNase du pancréas de bovin : endonucléase de l’ADN double brin et
-‐ Il existe 4 Types d’enzymes de restric;ons: type I, type II, type III et type IV. simple brin. Elle effectue des coupures tout à fait au hasard, sans
-‐ Les extrémités de fragments de restric;on peuvent être formés de : reconnaissance d’un site spécifique et génère des oligonucléo;des de tailles
• 2 brins d’égales longueur (bouts francs) variées.
• un brin plus long que l’autre (bouts collants ou cohésifs) • La nucléase S1 : extraite d’un champignon et n’akaque que l’ADN simple
brin.
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§ Couper § Copier
3. Les exonucléases 1. L’ADN polymérase

-‐ L’exonucléase est une enzyme qui coupe les acides nucléiques (ADN, ARN) au -‐ Enzyme qui synthé;se un brin de polynucléo;des d’ADN, le plus souvent en
niveau de ses extrémités 3’ ou 5’. u;lisant un brin complémentaire comme matrice, dans le sens 5’ vers 3’ en
-‐ Exemple : formant une nouvelle liaison phosphodiester entre le 3'-‐OH du brin allongé et le
5'-‐phosphate du nucléo;de triphosphate ajouté.
• L'exonucléase III fonc;onne à par;r de l'extrémité 3‘ et agit sur des ADN
double brins.
• L’exonucléase lambda fonc;onne sur l’ADN double brin dans le sens 5’ -‐>
3’
§ Copier § Copier
2. L’ARN polymérase 3. L’ADN polymerase ARN dependante (transcriptase reverse)

-‐ Enzyme capable de la synthèse de l’acide ribonucléique, le plus souvent en -‐ Enzyme est surtout présente chez les rétrovirus (virus à ARN).
u;lisant un brin complémentaire d’ADN comme matrice. Ce processus s’appel : la -‐ Elle permet de fabriquer à par;r d’un ARN messager (mARN) un ADNc (ou
transcrip;on séquence d’ADN complémentaire d’un mARN).
-‐ Elle possède les propriétés suivantes :
• C’est une ADN pol qui synthé;se le nouveau fragment dans le sens 5’ à 3’.
• Elle est ARN-‐dépendante.
• Elle est dépourvue d’ac;vité exonucléasique 3’ à 5’ (donc de fonc;on
d’édi;on) et peut donc insérer des bases par erreur.
• Elle a une ac;vité RNAse.
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§ Coller § Cas par)culier : Enzymes enlevant ou ajoutant des groupes
Ligases phosphates

-‐ Enzyme présent chez les rétrovirus (virus à ARN) ou les bactéries
-‐ capables de lier par une liaison ester un fragment avec un groupement phosphate Enzymes enlevant les groupes phosphates
en 5’ et un groupement OH en 3’ et ceci en présence d’ATP.
-‐ Elles peuvent effectuer des ligatures sur des fragments d’ADN avec bouts francs -‐ Ces enzymes sont appelées phosphatases. Les phosphatases alcalines sont
ou des bouts cohésifs. Exemple : ac;ves à pH alcalin et permekent d’enlever le groupement phosphate situé en
• ADN ligase d’E.coli 5’ d’une chaîne d’ADN. Elles sont u;lisées pour préparer de l’ADN
• L’ADN ligase des phages T4 recombinant.
• Taq ADN ligase
• ARN ligase Enzymes ajoutant des groupements phosphates

-‐ Les kinases permekent de fixer un groupement phosphate en présence d’ATP.
Ces kinases sont extraites de bactéries.
2-‐ Les vecteurs
2-‐ Les vecteurs

Vecteur type
Défini)on

-‐Molécule d’ADN stable, de pe;te taille capable de se répliquer d’une façon
autonome (réplicon)

-‐Ils supportent l’inser;on d’un fragment d’ADN

-‐Le vecteur recombinant est introduit dans une cellule hôte où il sera répliqué
pendant la division.

-‐Trois caractéris;ques principales:
•Origine de réplica;on
•Des marqueurs de sélec;on
•Région à sites mul;ples « polylinker ».
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2-‐ Les vecteurs 2-‐ Les vecteurs
Marqueurs de sélec)on: exemple des gènes amp et lac Z
les différents types

Vecteur hôte Insert (longueur max)
Plasmide Bactérie 15 Kb
Cosmide Bactérie 44 Kb
Phage Bactérie 30 Kb
BAC Bactérie 300 Kb
YAC Levure 1000 Kb
BAC: Bacterial Ar;fical Chromosome

YAC: Yeast Ar;ficial Chromosome

les plasmides les phages
-‐Permekent le clonage de fragments d’ADN plus grands
-‐Molécule d’ADN circulaire, bicaténaire, extrachromosomique d’origine bactérienne. -‐une région non essen;elle est éliminée et remplacée par un fragment d’ADN donneur
-‐ le plasmide recombinant est introduit dans une cellule bactérienne par transforma*on -‐L’ADN linéaire ainsi formé est empaqueté dans la tête du phage
-‐le phage recombinant est introduit dans une cellule bactérienne par infec*on suivie
par une lyse cellulaire
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les cosmides les cosmides
1. C osmide présentant un site cos (carré noir)
-‐ Deux fois plus d’ADN qu’un phage 2. Les cosmides sont coupés en un site de restric;on unique par
-‐ Vecteurs hybrides de: l'ac;on d'une enzyme de restric;on.
• phage lamda (extrémités cos lui permekant de s’empaqueter dans la tête du 3. On mélange alors les molécules linéarisées avec les fragments
d'ADN cons;tuant l'insert (lignes poin;llées) coupés avec la
phage) Les cosmides sont des plasmides dans lesquels a été inséré le site cos du phage
même enzyme.
lambda. 4. Cosmides et fragments s'unissent au hasard et, dans certains
cas, un fragment sera flanqué de deux cosmides (au centre).
• plasmide (origine de réplica;on et résistance aux an;bio;ques) 5. Un clivage enzyma;que aux sites cos (têtes de flèche) crée des
bouts collants et, en présence des composants du phage,
-‐ Le site cos rend possible l'empaquetage (in vitro) du plasmide (porteur d'un insert) l'empaquetage des molécules recombinantes s'effectue.
dans la tête du phage lambda. L’ADN d’un cosmide est encapsidé in vitro dans des 6. Après addi;on de la queue, la par;cule peut injecter son ADN
par;cules de phage et est introduit dans une cellule bactérienne par transduc*on recombinant dans une bactérie (exactement comme un phage
lambda ordinaire).

On peut détecter sa présence dans la cellule, par l'expression de
gènes de résistance à des an;bio;ques, codés par le plasmide.
Les ou6ls du génie géné6que

Plan du cours
3-‐ Les hôtes
Les cellules qui sont habituellement transfectées par des vecteurs contenant des 1. Défini)on du Génie Géné)que
fragments d’ADN, sont des;nées à permekre d’amplifier ce vecteur en même 1.1. Quelques dates clés
temps que leur croissance. 1.2. Méthodologie
2. Les ou)ls du Génie Géné)que
§Cellules hôtes procaryotes 2.1. Les ou6ls enzyma6ques
Essen;ellement Escherichia coli pour le clonage. 2.2. Les vecteurs
Autres: Staphylococcus aureus 2.3. Les hôtes

§Cellules hôtes eucaryotes 3. L’hybrida)on moléculaire
Cellules de levure : Saccharomyces, Pichia pastoris…

Cellules d’insectes : Sf9
Cellules CHO (Chinese Hamster Ovary) 4. Le clonage moléculaire
Cellules HEK293 (Human Embryonic Kidney)
Cellules de plantes : tabac, caroke… 5. Le criblage moléculaire
Cellules souches embryonnaires (ESC)

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Figure 1: Rappel sur l’hybridation
Tm= température à laquelle 50% des fragments d'ADN d’une séquence

donnée sont sous forme simple brin.
Dénaturation = séparation des brins par rupture des liaisons hydrogènes
L’hybrida6on moléculaire L’hybrida6on moléculaire

Hybridation = Association par liaisons hydrogènes de 2 brins d’ADN
(ARN) au niveau de leur séquence complémentaire.
3-‐ L’hybrida6on 3-‐ L’hybrida6on

L’associa;on de 2 simples brins d'ADN par forma;on de
liaisons H entre ces deux brins.
On dis;ngues les hybrides:
ADN-‐ADN = Homoduplex
ADN-‐ARN = Hétéroduplex

La forma;on et la stabilité des duplex dépendent de nombreux
facteurs:
-‐la composi;on en bases
-‐longueur des duplex
-‐complexité de la séquence.




Sondes nucléiques
Les agents de marquage(sondes)
Est une séquences d'acides nucléiques simple brin (d'au moins 15 nucléo;des)
qui permet de rechercher de manière spécifique un fragment d’acide nucléique a) Isotopes radioac;fs: qui permekront de cons;tuer des
que l’on désire étudier, complémentaire de la séquence d'ADN recherchée sondes « chaudes »:
(ADN cible). ex: le P32 est le plus u;lisé pour l e marquage des nucléo;des.

Ceke réac;on sonde-‐fragment correspond à une réac6on d’hybrida6on
moléculaire. Inconvénients:
• Ils représentent un danger pour l'u;lisateur.
Pour les ARN, on parle de Ribosonde. • Il faut des autorisa;ons administra;ves pour les u;liser.
La sonde n'a pas besoin d’êtré aussi longue que l'ADN cible. • La durée de vie des marqueurs est faible

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Les agents de marquage(sondes)
b) Marqueurs non radioac;fs:

qui cons;tueront les sondes

« froides »:
réac;on enzyma;que ,un
produit coloré ou fluorescent
ou bien une produc;on de
photons.
L’hybrida6on moléculaire Le clonage moléculaire

4-‐ clonage

Un clone correspond à un grand nombre de molécules ou de cellules iden;ques
provenant d’une seule cellule.

L’opéra;on qui consiste à obtenir ce grand nombre de cellules ou de molécules
s’appelle le clonage.

Le clonage nucléique consiste en l'inser;on d'un fragment d'ADN dans un
vecteur, ce vecteur étant propagé dans une cellule hôte.

La culture de ceke cellule et la purifica;on ultérieure du vecteur permekent de
produire des quan;tés quasiment illimitées du fragment d'ADN cloné que l'on
désire étudier.
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Le clonage moléculaire Le clonage moléculaire

4-‐ clonage 4-‐ clonage
Chez les procaryotes

Le clonage consiste à:
1) insérer un fragment d'ADN
étranger à cloner (insert)
dans un vecteur de manière à Chez les eucaryotes
obtenir un vecteur
recombinant.
2) introduire le vecteur
recombinant dans une cellule
hôte.
3) amplifier le vecteur
recombinant par division de
la cellule hôte, afin d'obtenir
un clone recombinant.

Le clonage moléculaire Le clonage moléculaire

4-‐ clonage 4-‐ clonage

Chez les eucaryotes

Les applica6ons du clonage

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BIOLOGIE MOLECULAIRE
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CHAPITRE III: Le Clonage
I) Définition:
Cloner un fragment d'ADN consiste à:

• isoler physiquement ce fragment.
• en augmenter le nombre de copie (cf: amplification)
II) Principe:
Criblage de banques Criblage de banques

Le clonage consiste à:
1) insérer un fragment d'ADN étranger à cloner (insert) dans un vecteur de manière à
obtenir un vecteur recombinant.
2) introduire le vecteur recombinant dans une cellule hôte.
5-‐Criblage 5-‐Criblage
3) amplifier le vecteur recombinant par division de la cellule hôte, afin d'obtenir un clone
recombinant.
ex: si le vecteur est un plasmide:

Plusieurs

techniques permekent de construire des banques. Il reste à les Les

banques
1) création du plasmide recombinant.
2) faire pénétrer le plasmide recombinant dans une cellule d'E. coli (CaCl2 ou
exploiter, même avec une banque d'ADNc, le nombre de clones est important et Electroporèse).
3) division d'E. coli => clone recombinant.
le tri représente la par;e la plus délicate des expériences de clonage. Une banque d'ADN (ou bibliothèque) est une collec;on de clones
recombinants renfermant
III)Notion de banquecd'ADN:
hacun un ADN étranger (insert) par;culier.
Lors de la sélec;on, on élimine tous les clones Une banque d'ADN (ou bibliothèque) est une collection de clones recombinants renfermant
non intéressants, le criblage permet de repérer chacun un ADN étranger (insert) particulier.

le clone intéressant.
!
riblage de banques Criblage de banques

5-‐Criblage 5-‐ Criblage
Criblage d’une banque d’expression avec un anticorps ou un ligand

Les

banques
Banque dans vecteur d’expression
Deux types de banque:

1. Banque d'ADN génomique:

On réalise des clones à par;r de la totalité de l'ADN chromosomique d'un organisme.

2. Banque d'ADNc:
Transfert des clones sur membrane
On réalise des clones à par;r d'ADNc provenant des ARNm d'un même type cellulaire.

Exemple: Si on voulait cloner le gène codant pour l'hormone de croissance humaine, soit:

• on le clone sous sa forme génomique. Donc on peut par;r de n'importe quelle cellule de
l'individu.
• on le clone sous sa forme ADNc. Il faut donc par;r de cellules où le gène s'exprime pour Détection -anticorps primaires, secondaires
extraire les ARNm des cellules de l'hypophyse et les conver;r en ADNc.
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Applica6ons du génie géné6que

A/ Dans le domaine pharmaceu;que

§Hormone de croissance
§Insuline
§Vaccin de l’hépa;te B

B/Dans le domaine
agronomique:
§Plantes résistantes à un
herbicide, un parasite, un virus…
Novembre 2015 Chapitre 7 : Génie géné;que 45
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Chapitre 5. Expression de l’informa)on géné)que et de

Cours Bio-­‐005 : Biologie géné)que

Chapitre 7. Génie géné)que

1. Déﬁni)on du Génie Géné)que

Méthodologie du génie géné6que Méthodologie du génie géné6que

Méthodologie du génie géné6que Les ou6ls du génie géné6que

BAC: Bacterial Ar;ﬁcal Chromosome

Les ou6ls du génie géné6que

Tm= température à laquelle 50% des fragments d'ADN d’une séquence

L’hybrida6on moléculaire L’hybrida6on moléculaire

3-­‐ L’hybrida6on 3-­‐ L’hybrida6on

L’hybrida6on moléculaire L’hybrida6on moléculaire

L’hybrida6on moléculaire L’hybrida6on moléculaire

b) Marqueurs non radioac;fs:

L’hybrida6on moléculaire Le clonage moléculaire

Le clonage moléculaire Le clonage moléculaire

Le clonage moléculaire Le clonage moléculaire

Chez les eucaryotes

Cloner un fragment d'ADN consiste à:

Criblage de banques Criblage de banques

ex: si le vecteur est un plasmide:

riblage de banques Criblage de banques

Applica6ons du génie géné6que

Novembre 2015 Chapitre 7 : Génie géné;que 45

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3-‐ L’hybrida6on 3-‐ L’hybrida6on