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[MICROSCOPIE OPTIQUE THORIQUE ET APPLIQUE AUX SCIENCES BIOMDICALES]

2 novembre 2009

MICROSCOPIE OPTIQUE THEORIQUE ET APPLIQUEE AUX SCIENCES BIOMEDICALES


SOMMAIRE
Introduction.................................................................................................................................................... 1 1 La microscopie optique (photonique) fond clair ..................................................................................... 3 1.1 1.2 1.2.1 1.2.2 2 2.1 2.1.1 2.1.2 2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.4 3 3.1 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.4 3.1.5 3.2 3.3 3.3.1 3.3.2 3.4 3.5 Principe du microscope optique compos ....................................................................................... 3 Principaux lments du microscope fond clair .............................................................................. 6 La partie mcanique ................................................................................................................... 6 Les parties optiques.................................................................................................................... 7 Selon loptique gomtrique............................................................................................................ 7 Trajet des rayons dclairage ...................................................................................................... 7 Trajet des rayons de formation de limage ................................................................................... 9 Selon loptique physique ................................................................................................................. 9 Quelques notions sur les ondes lectromagntiques visibles ...................................................... 9 Interfrence ...............................................................................................................................10 Diffraction ..................................................................................................................................11 Thorie dAbbe ..........................................................................................................................12 Les objectifs ..................................................................................................................................13 Limite de sparation et pouvoir sparateur .................................................................................13 Ouverture numrique .................................................................................................................14 Aberrations ................................................................................................................................16 Autres caractristiques ..............................................................................................................16 Objectifs corrigs linfini ..........................................................................................................17 Le condenseur du microscope photonique fond clair ...................................................................18 Les oculaires .................................................................................................................................19 Principales caractristiques .......................................................................................................19 Oculaire micromtriques et mesure au microscope ....................................................................20 Collecteur et source de lumire .....................................................................................................20 Lclairage de Khler et lutilisation du microscope photonique fond clair ....................................21

La formation de limage ........................................................................................................................... 7

Connatre et utiliser les diffrents lments du microscope optique ........................................................13

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Les autres techniques microscopiques photoniques utilises en sciences biomdicales .........................22 4.1 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.2 4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.3 4.3.1 4.3.2 4.4 4.4.1 4.4.2 4.5 La microscopie fond noir .............................................................................................................22 Principe .....................................................................................................................................22 Elment optique spcifique ........................................................................................................22 Domaine dutilisation..................................................................................................................23 La microscopie en contraste de phase ...........................................................................................23 Principe .....................................................................................................................................23 Elments optiques spcifiques ...................................................................................................24 Domaine dutilisation..................................................................................................................24 La microscopie Contraste Interfrentiel Diffrentiel (DIC) ............................................................24 Principe .....................................................................................................................................25 Domaine dutilisation..................................................................................................................25 La microscopie fluorescence (classique) .....................................................................................26 Principe .....................................................................................................................................26 Elments optiques spcifiques ...................................................................................................26 La microscopie confocale ( balayage laser) ..................................................................................26

Annexes .......................................................................................................................................................28 Liste simplifie des principaux sigles inscrits sur le corps des objectifs (extrait du site Le microscope optique fond clair par Jean-Pierre GAVERIAUX) .................................................................................................28 Longueur du tube optique et principe de la correction linfini des microscopes rcents ............................29 Les couleurs (Extrait de http://www.iconeoclaste.com/index.php)...............................................................29 Lutilisation du microscope photonique fond clair ....................................................................................30 Rfrences bibliographiques .........................................................................................................................34 Ouvrages ..................................................................................................................................................34 Ressources numriques ............................................................................................................................34 Documents en ligne ...............................................................................................................................34 Sites de fabricants de matriel pour la microscopie optique (liste non exhaustive) ..................................34

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MICROSCOPIE OPTIQUE THEORIQUE ET APPLIQUEE AUX SCIENCES


BIOMEDICALES
INTRODUCTION La microscopie permet grce l'utilisation de microscopes d'observer des objets trop petits pour tre vus l'il nu en fournissant des images agrandies de ces derniers.
Anciennement deux grandes classes d'instruments de microscopie taient dcrites selon la nature plutt ondulatoire (notion de longueur d'onde lambda) ou corpusculaire (photons, lectrons ...) des faisceaux de radiations1 utiliss pour former ces images agrandies. Aujourd'hui cette classification simplifie ne tient plus ; certains instruments utilisent les proprits des ondes acoustiques, d'autres lexistence de nuages dlectrons au voisinage des surfaces conductrices (effet tunnel), ou bien encore les champs de forces attractives entre corps proches (force atomique) ou les proprits des ondes lumineuses dites vanescentes. En microscopie optique l'utilisation d'ondes du domaine du visible, de l'ultraviolet et du proche infrarouge ncessite de prendre en considration la fois les aspects ondulatoires et corpusculaires de ces radiations lectromagntiques dans la formation de l'image.

FIGURE 1 : SPECTRE DES ONDES ELECTROMAGNETIQUES

Ainsi nous verrons que l'optique gomtrique 2 qui ne prend pas en compte la dualit ondulatoire et corpusculaire de la lumire ne permet pas d'expliquer compltement la formation de l'image d'objet microscopique ; C'est l'optique ondulatoire (ou optique physique) qui a permis au physicien Ernst ABBEa de concevoir les systmes optiques retrouvs dans nos microscopes modernes.

La nature corpusculaire est la caractristique principale des radiations de petite longueur d'onde alors que la nature ondulatoire caractrise les radiations de grande longueur d'onde. 2 En optique gomtrique : a. les rayons lumineux restent indpendants les uns des autres (pas dinteraction entre eux) ; b. dans un milieu homogne, transparent et isotrope, les rayons lumineux sont des lignes droites ; c. la surface de sparation de deux milieux, les rayons lumineux obissent aux lois de Snell-Descartes (pour la rflexion et la rfraction) et suivent le principe du retour inverse (rciprocit source - destination)
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Enfin nous verrons que malgr la diversit des techniques misent en uvre dans le domaine des sciences biomdicales (microscopie photonique fond clair, fond noir, contraste de phase et fluorescence pour les principales), le microscope optique est toujours constitu des lments suivants: o o o o une optique d'clairage (source et un dispositif de focalisation de rayonnement lumineux sur l'objet; une optique de formation de l'image (association de plusieurs lentilles assurant la fonction d'agrandissement); un dtecteur permettant l'observation ou l'enregistrement de l'image (il, cran, camra, appareil photographique, ) ; une partie mcanique de prcision (permettant le dplacement et le positionnement prcis de l'chantillon microscopique).

En biologie, l'chantillon est le plus souvent partiellement transparent la lumire et est positionn entre l'optique d'clairage et l'optique de formation de l'image ; on parle d'observation en transmission (diascopie). Autour de ce principe gnral, les microscopes modernes peuvent prsenter une grande varit d'clairements et de modes d'observation.

FIGURE 2 : MICROSCOPE OPTIQUE (DROIT)

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FIGURE 3 : MICROSCOPE OPTIQUE INVERSE

LA MICROSCOPIE OPTIQUE (PHOTONIQUE ) A FOND CLAIR

Dans la microscopie photonique fond clair l'image forme par la lumire dvie est vue sur un fond de lumire non dvie.

1.1

P RINCIPE DU MICROSCOPE OPTIQUE COMPOSE

La loupe est un instrument doptique assimilable une lentille convergente simple ; elle est classiquement utilise pour observer : des objets opaques ; et fournie par rflexion (piscopie) une image relle 3 situe classiquement dans une gamme de grossissement allant de x2 x50. Dans un microscope optique (compos) lassociation de lentilles convergentes (objectif puis oculaire) permet dobserver : par transparence (diascopie) des objets trs petits (le plus souvent invisibles lil nu) grce une distance objet - objectif (1re lentille convergente) trs faible (infrieure la distance focale de lobjectif) ; et fourni une image relle3 situe classiquement dans une gamme de grossissement allant de x100 x1000.
3

Terme utilis en optique pour dsigner toute image qui se forme aprs la face de sortie d'un instrument d'optique (dans le sens de parcours de la lumire). Si un cran est plac au lieu o se forme l'image, elle devient alors gnralement visible.
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La formation et les caractristiques de limage dun objet fournie par une lentille convergente dpendent : o de sa distance focale4 o et de la position de lobjet par rapport cette lentille.

FIGURE 4 : LENTILLE CONVERGENTE ET FORMATION D'IMAGE

A : pour un objet situ plus de deux fois la distance focale (loin de la lentille convergente) une image relle inverse et rduite de lobjet est obtenue ; B : pour un objet situ exactement deux fois la distance focale on obtient une image inverse de dimension identique lobjet ; C : pour un objet situ entre une et deux fois la distance focale on obtient une image relle agrandie et inverse (cas de lobjectif du microscope) ; D : Aucune image pour un objet situ exactement une fois la distance focale de la lentille ; E : pour un objet situ moins dune fois la distance focale de la lentille une image virtuelle agrandie est obtenue (situation de loculaire du microscope).

La distance focale d'un systme optique est la mesure de sa puissance de convergence (focus) ou divergence (diffusion) de la lumire. Un systme avec une longueur de focale plus courte a plus de puissance optique qu'un autre avec une longue focale. Les distances focales, respectivement objet et image, d'un systme optique centr convergent ou divergent sont, par dfinition, les distances algbriques sparant respectivement le plan principal objet H (ou centre optique pour les lentilles minces) du foyer objet F et le plan principal image H (ou centre optique pour les lentilles minces) du foyer image F. Elles sont souvent notes respectivement et .
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Le microscope optique compos est form de deux groupes de lentilles, lobjectif et loculaire que lon peut assimiler deux lentilles convergentes.

FIGURE 5 : PRINCIPE SIMPLIFIE DE FORMATION DE L'IMAGE AVEC UN MICROSCOPE OPTIQUE

Lobjectif du microscope est un premier systme convergent de trs courte distance focale (mesure en mm) qui fourni de lobjet (AB) une image relle intermdiaire agrandie et inverse de lobjet (A1B1), lintrieur du tube oculaire mais au-del du foyer objet 5 de ce deuxime systme optique (entre le foyer et le centre optique6 de loculaire) ; Loculaire est alors un second systme convergent de distance focale moyenne (quelques cm) qui agit comme une loupe sur limage relle fournie par lobjectif et permet finalement lobservateur de voir une 7 image virtuelle inverse trs agrandie de lobjet (A2B2). Dans son principe le microscope peut tre compar au projecteur de diapositive pour lequel un objet transparent de taille rduite (la diapositive) est travers par les rayons lumineux dune source (diascopie) pour fournir via un systme de lentilles (lobjectif) une image agrandie et inverse sur un cran (image relle inverse contenue dans le tube oculaire). Remarque : Cette analogie permet de deviner quen microscopie comme en matire de projection de diapositive, la qualit de limage observe est trs directement lie aux qualits de lobjet et de lobjectif
5

En optique, un foyer est un point vers lequel convergent les rayons lumineux issus d'un point aprs leur passage dans un systme optique. Le foyer objet est le point objet dont l'image se trouve l'infini sur l'axe optique principal 6 Point particulier d'un systme tel qu'un rayon lumineux incident en ce point n'est pas dvi. 7 Terme utilis en optique pour dsigner toute image qui se forme avant la face de sortie d'un instrument d'optique (dans le sens de parcours de la lumire) et ne peut donc pas tre visualise sur un cran.
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(vritable cur du microscope) mais aussi aux conditions dobservation (en limitant par exemple au maximum la lumire parasite).

1.2

P RINCIPAUX ELEMENTS DU MICROSCOPE A FOND CLAIR

1.2.1 L A PARTIE MECANIQUE


Elle est constitue : o o o o o du statif compos dun pied et dune potence ; de la platine porte objet surmonte dun chariot guide objet ; du tube binoculaire ; du revolver porte objectif ; des vis macromtriques et micromtriques de mise au point.

Dans le dtail la partie mcanique comprend :

FIGURE 6 : ELEMENTS DE LA PARTIE MECANIQUE DU MICROSCOPE A FOND CLAIR

1 : tube binoculaire 2 : vis de blocage du tube binoculaire 3 : potence du statif 4 : sur platine (ou chariot) guide objet 5 : vis micromtrique de mise au point 6 : vis micromtrique de mise au point 7 : vis de dplacement bidirectionnel du chariot guide objet 8 : pied du statif 9 : vis de centrage du collecteur 10 : vis de rglage de hauteur du condenseur 11 : platine porte-objet 12 : chevalet de fixation de lame porte-objet 13 : revolver porte-objectif.

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1.2.2 L ES PARTIES OPTIQUES


On trouve : o Une optique dclairage compose principalement dune source lumineuse (lampe halogne) intensit dclairage rglable et surmonte dun collecteur et dun condenseur ; o Une optique de formation de limage comprise entre la lentille frontale de lobjectif et le verre dil de loculaire Dans le dtail ces lments sont :

FIGURE 7 : ELEMENTS DES PARTIES OPTIQUES DU MICROSCOPE A FOND CLAIR

1 : potentiomtre de rglage de lintensit lumineuse 2 : diaphragme de champ 3 : cage de la source lumineuse 4 : collecteur de lumire 5 : filtre bleu ou lumire du jour 6 : diaphragme douverture 7 : condenseur 8 : lentille frontale dobjectif 9 : corps de lobjectif 10 : glissire de rglage de lcartement inter pupillaire 11 : oculaire rglage dioptrique 12 : verre dil de loculaire.

2
2.1

LA FORMATION DE LIMAGE
S ELON LOPTIQUE GEOMETRIQUE

Dans les sciences biologiques, le microscope fond clair permet de projeter sur la rtine de lobservateur une image, transmise par lobjet microscopique illumin par la lumire de la source (diascopie). Nous savons que ce microscope permet grce lassociation objectif oculaire, la formation en deux stades dune image agrandie relle de lobjet sur la rtine de lobservateur ( 1.1.). Dans le cas du microscope photonique fond clair, la formation de limage sur la rtine de lobservateur ncessite de considrer dune part le trajet des rayons dclairage et dautre part ceux de formation de limage.

2.1.1 TRAJET DES RAYONS DECLAIRAGE


Lassociation collecteur condenseur permet lobtention dun fond uniformment clair (en labsence dobjet); chaque point de la source claire lensemble du champ dobservation et de la rtine.

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Le rglage convenable du collecteur et du condenseur ( systmes optiques diaphragms) permet de former successivement trois images de la source8 (S) : S1. Dans le plan focal du condenseur ; S2. Dans le plan focal arrire de lobjectif ; S3. Dans le cristallin.

FIGURE 8 ET 8 BIS : TRAJET DES RAYONS D'ECLAIRAGE DU MICROSCOPE A FOND CLAIR

En pratique Lobtention dune image correctement contraste et fidle de lobjet microscopique observ, ncessite doptimiser le trajet optique des rayons dclairage en rglant correctement le couple collecteur condenseur aprs la mise au point sur lobjet microscopique ; C'est--dire une fois que la longueur du trajet optique des rayons de formation de limage est fixe. Lclairage de Khler est une procdure permettant de rationaliser et doptimiser lutilisation du couple collecteur condenseur de loptique dclairage du microscope.

Les plans de formation de ces images sont qualifis de combinaison optique car chaque plan cre une image optique du prcdent
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2.1.2 TRAJET DES RAYONS DE FORMATION DE LIMAGE


Lassociation collecteur condenseur focalise la lumire de la source de telle sorte que chaque point de lobjet (I1) est clair par lensemble de la source et conduit un point : dans limage intermdiaire agrandie inverse fournie par lobjectif (I2); dans limage relle finale projete sur la rtine via loculaire (I3)

FIGURE 9 ET 9 BIS : TRAJET DES RAYONS DE FORMATION DE L'IMAGE DANS LE MICROSCOPE A FOND CLAIR

Pour un microscope photonique fond clair correctement rgl on observe que le trajet optique des rayons dclairage et le trajet optique des rayons de formation de limage ont des parcours croiss se terminant tous les deux sur la rtine de lobservateur.

2.2

S ELON LOPTIQUE PHYSIQUE

2.2.1 QUELQUES NOTIONS SUR LES ONDES ELECTROMAGNETIQUES VISIBLES


Loptique gomtrique permet de prvoir le trajet des rayons lumineux entrant en interaction avec des surfaces lisses ; le trac des rayons lumineux ( lignes droites ) permet de positionner limage dun objet fournie par un systme optique mais ne fournie pas dlments sur les qualits ou proprits de cette image. Pour expliquer de faon satisfaisante la formation des images microscopiques il est ncessaire de dcrire dans quelles mesures les rayons lumineux ou ondes lumineuses sont affectes par lobjet microscopique. Loptique physique ou ondulatoire permet dapprhender linteraction des ondes lectromagntiques lumineuses avec les objets.

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Les ondes lectromagntiques peuvent tre en partie dcrites par diffrents paramtres tels que lamplitude q, la longueur donde (lambda) et la phase.

FIGURE 10 : ONDE ELECTROMAGNETIQUE (OSCILLATION COUPLEE DU CHAMP ELECTRIQUE ET DU CHAMP MAGNETIQUE)

Dans le domaine du visible : La longueur donde dtermine la couleur de londe lectromagntique ; Le carr de son amplitude dtermine lintensit lumineuse de londe lectromagntique ; La phase nest pas toujours perue par lil.

2.2.2 INTERFERENCE
Linterfrence peut sobserver pour des ondes de frquence identique dans un mme milieu lorsquelles se combinent pour former une nouvelle onde unique.

FIGURE 11 : PRINCIPE DE L'INTERFERENCE ENTRE ONDES ELECTROMAGNETIQUES

Lorsque deux ondes voluent dans la mme direction et sont en phase, leurs amplitudes s'ajoutent. L'intensit de la lumire produite par la nouvelle onde sera gale la somme des deux ondes initiales. On parle dinterfrence constructive. Si ces deux ondes voluent avec une diffrence de phase, amplitudes positive et ngative s'ajoutent. Dans le cas particulier dun dphasage dune demi-longueur donde, l'amplitude de l'onde rsultante sera zro, tout comme l'intensit lumineuse. On parle dinterfrence destructive.

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2.2.3 DIFFRACTION
Lorsquune onde rencontre un objet qui ne lui est pas totalement transparent, on peut considrer que chaque point de lobjet est susceptible dentrainer une diffusion de cette onde. Cest le phnomne de diffraction. La thorie (simplifie) de la diffraction, considre que chaque point atteint par une onde se comporte comme une source secondaire qui rmet une onde sphrique de mme frquence, mme amplitude et mme phase. Les figures de diffraction rsultent de l'interfrence des ondes sphriques mises par l'ensemble des sources secondaires.

FIGURE 12 : PRINCIPE DE LA DIFFRACTION

Ainsi lorsquune onde lectromagntique visible passe par un trou (une fente) de taille quivalente sa longueur donde le phnomne de diffraction permet dobserver des figures de diffraction gomtriques particulires : - une succession danneaux clairs et sombres concentriques pour un trou ; - une succession de bandes claires et sombres pour une fente.

FIGURE 13 ET 13 BIS : REPRESENTATIONS DE LA FIGURE DE DIFFRACTION OBTENUE PAR UN TROU

FIGURE 14 ET 14 BIS : REPRESENTATIONS DE LA FIGURE DE DIFFRACTION OBTEBUE PAR UNE FENTE

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Les zones claires sont dfinies comme des maxima, tandis que les zones sombres sont des minima. Le maximum central correspond l'image de la fente (ou du trou) et correspond la lumire non diffracte (directe) ; ces rayons sont dit d'ordre zro et limage cre suit les lois de l'optique gomtrique. Les maxima suivants sont dits de 1er, 2me, 3me ordre, prcds d'un signe + ou sont caractriss par les lois de l'optique des ondes. Langle de diffusion des rayons diffracts augmente avec le numro dordre du maxima considr.
FIGURE 15 : ANGLES DE DIFFUSION ET MAXIMUM DE 1 ORDRE OBTENUS PAR UNE SERIE DE FENTES
ER

ET 2

ND

2.2.4 THEORIE DABBE


Pour expliquer la formation de l'image microscopique, Ernst Abbea assimile lobjet microscopique un ensemble de trous et de fentes ( fin rseau) sources secondaires dondes sphriques (Cf ciavant) lorigine de rayons diffracts de diffrents ordres. Un tel objet va ainsi diviser la lumire incidente qui le traverse en : Une lumire non dvie ( rayons dordre 0 non diffracts) que lon peut assimiler un clairage du fond ne contenant pas dinformation sur l'objet ; Un cne de lumire dvie ( ensemble de rayons diffracts de diffrents ordres) contenant des informations concernant l'objet. Lobjectif (systme optique convergent parfait) permet la lumire non dvie (maxima dorde 0 ; image primaire) et la lumire dvie (maxima dordre suprieur ; images secondaires) dinteragir ( dinterfrer). La formation dune image agrandie fidle et complte ( avec ses variations dintensit) de lobjet microscopique dans le plan image intermdiaire du tube optique rsulte de la formation de la figure de diffraction dans le plan focal arrire de lobjectif et des interfrences constructives et destructives de lensemble de ces rayons convergents.

FIGURE 16 : PRINCIPE DE LA FORMATION D'IMAGE EN MICROSCOPIE SELON LA THEORIE D'ABBE Acadmie de Grenoble Formation continue STI-BIO-BGB | La formation de limage Page 12 sur 36

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La qualit de l'image perue travers l'oculaire est lie au nombre dimages secondaires ayant interfres avec limage primaire ; une image convenable peut tre obtenue ds que les faisceaux dvis correspondant au maximum de premier ordre sont passs travers l'objectif pour interfrer avec la lumire non dvie. En pratique Pour obtenir un nombre d'images secondaires lev, il faut un objectif avec un angle dadmission suffisant ; c'est--dire une grande O.N.

3
3.1

CONNAITRE ET UTILISER LES DIFFERENTS ELEMENTS DU MICROSCOPE OPTIQUE


L ES OBJECTIFS

Cest lobjectif qui fourni limage agrandie inverse qui sera grossie et vue via les oculaires par lobservateur ; la qualit de cette image est fixe par les caractristiques de lobjectif qui se trouve ce titre tre llment principal dterminant la qualit dun microscope optique.

3.1.1 L IMITE DE SEPARATION ET POUVOIR SEPARATEUR


Les phnomnes de diffraction limitent le pouvoir sparateur du microscope optique en ne donnant pas une image ponctuelle dun point objet mais une tache de diffraction. Limage dun trou parfaitement circulaire donne disque lumineux entoure danneaux concentriques alternativement clairs et sombres ; cette figure de diffraction est appele tache dAiry ou disque de confusion9.

FIGURE 17 : LIMTE DE RESOLUTION ET FIGURES DE DIFFRACTION DE DEUX FENTES PROCHES

De A C le rapprochement des deux fentes conduit pour une fusion des taches de diffractions pour ne former plus quune image unique des deux fentes.
9

Le rayon du disque d'Airy (rayon du 1 zro cercle sombre) est li la longueur d'onde et l'ouverture numrique O.N. du dispositif optique.
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Ainsi deux points trs proches donneront des images qui vont se chevaucher pouvant mme fusionner en une tache unique ; la distance entre ces deux points objet est alors infrieure la limite de sparation (note d) du microscope. (i)

Le pouvoir sparateur du microscope (ou rsolution), c'est--dire la capacit distinguer deux points adjacents comme distincts est linverse de la limite de sparation. Il augmente donc avec la diminution de la limite de sparation. Pour un objectif donn ayant un angle dadmission des rayons marginaux laxe optique fix ( soit 2 pour lamplitude du cne de lumire pntrant lobjectif), le pouvoir sparateur du microscope dpend donc : de la longueur donde utilise ; et de lindice de rfraction n du milieu qui spare lobjet microscopique de la lentille frontale de lobjectif.

FIGURE 18 : ANGLE

ET OUVERTURE NUMERIQUE

3.1.2 OUVERTURE NUMERIQUE


L'ouverture numrique ON (ou numerical aperture NA) a pour dfinition : (ii) O. N. = n sin

O n est l'indice de rfraction dans le milieu d'observation (1 pour l'air), et est l'angle entre l'axe optique et le rayon (le plus cart de l'axe optique) qui entre dans la lentille (le demi-angle d'ouverture). Do (i) et (ii) d = 0,6 / O. N.

Lhuile immersion permet daugmenter n (de 1 1,52) et donc le pouvoir sparateur. Les objectifs focale trs courte ont un plus grand angle ; plus est grand, meilleures sont la luminosit (plus de rayons lumineux se trouvent collects) et la rsolution. Pour un objectif distance de travail D (ou working distance WD) et profondeur de champ z sont aussi des caractristiques lies lO.N. les meilleurs objectifs grande ouverture numrique (1,0<NA<1,45) possdent une distance de travail limite (90 180 m) et une profondeur de champ rduite.

FIGURE 19 : ANGLE ALPHA, DISTANCE DE TRAVAIL ET PROFONDEUR DE CHAMP Acadmie de Grenoble Formation continue STI-BIO-BGB | Connatre et utiliser les diffrents lments du microscope optique Page 14 sur 36

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FIGURE 20 : OUVERTURE NUMERIQUE ET RAYONS DIFFRACTES CAPTES PAR L'OBJECTIF

FIGURE 21 : OBJECTIF A SEC ET OBJECTIF A IMMERSION

Lorsque lon augmente lO. N. dun systme optique (ici un objectif) on diminue la limite de sparation d (ou on augmente de pouvoir sparateur. LO. N. des objectifs les plus puissants ne dpasse pas 1,4. OBJECTIFS objectifs achromatiques objectifs semi-apochromatiques objectifs apochromatiques En pratique Les objectifs de faible grandissement (infrieur x 20) ont une faible ON (infrieure 0,75) mais ils possdent une grande distance de travail et une grande profondeur de champ. Les objectifs de grandissement suprieur x 40 ont une ON suprieure 0,75 et offrent une excellente rsolution mais une faible profondeur de champ. Les objectifs immersion ont une ON effective suprieure 0,75. La limite du pouvoir sparateur du microscope photonique pour une longueur donde lectromagntique moyenne de 550 nm (plage de 390 710 nm pour le domaine du visible), avec un objectif immersion (n = 1,5 et maximal) dO.N. = 1,4 est de : d = (0,6 x 550/1,4) = 236 nm soit ~ 0,2 m. La limite du pouvoir sparateur de lil humain est denviron 0,1 mm (ou 100 m) ; le pouvoir sparateur du microscope optique fond clair est 500 fois suprieur celui de lil humain. 4x 0,10 0,12 0,16 10 x 0,25 0,30 0,40 20 x 0,40 0,50 0,70 40 x 0,65 0,75 0,95 100 x 1,25 1,30 1,40

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3.1.3 ABERRATIONS
Les principes optiques et physiques de formation de limage dcrits prcdemment ont t noncs dans le cadre de lutilisation de lentilles parfaites ( sans dfauts) ; c'est--dire ne crant aucune aberration. Dans la ralit, diffrentes contraintes techniques font que mmes les systmes optiques les plus complexes et prcis (donc les plus chers) doivent chercher minimiser quatre types daberrations : aberration chromatique, aberration sphrique, aberration de planit et aberration de coma.

FIGURE 22 : LENTILLES ET ABERRATIONS COURANTES

A : Aberration chromatique lie la diffrence dangle de rfraction entre ondes lectromagntiques de longueur donde diffrente ; B : Aberration sphrique lie la plus forte rfraction des rayons lumineux en priphrie de la lentille ; C : Aberration de planit li au fait quune lentille forme une image courbe dun objet plan ; D : Images illustrant leffet daberration de planit sur un chantillon rptitif particulier. On trouve ainsi des objectifs corrigeant plus ou moins les aberrations chromatiques avec pour les plus perfectionns la correction des aberrations gomtriques : Les objectifs achromatiques sont corrigs pour le rouge et le bleu ; Les objectifs apochromatiques sont corrigs pour trois longueurs d'onde, le spectre secondaire totalement disparu ; ce sont les plus performants en ce qui concerne la rsolution et le contraste. Les objectifs semi-apochromatiques sont mi chemin entre ces deux catgories et donnent d'excellents rsultats en liminant le spectre secondaire grce l'utilisation de la fluorine qui donne un meilleur contraste et une meilleure rsolution, Pour les objectifs corrigeant les aberrations gomtriques le prfixe plan apparat dans le nom (plan-achromatiques ou planachromatiques, plan-semi-apo ou plan semiapochromatiques et enfin plan-apochromatiques ou planapochromatiques) pour indiquer la correction de la courbure de champ.

3.1.4 AUTRES CARACTERISTIQUES


La construction optique des objectifs est complexe et trs minutieuse. Une bonne qualit d'image ncessite 4 6 lentilles de diffrentes grandeurs et de diffrents verres, toutes tant petites minuscules, positionnes de manire parfaite, polies, surfaces, colles et centres. Les objectifs de haute qualit peuvent avoir jusqu' 14 lentilles.

FIGURE 23 : SCHEMA DE CONSTRUCTION OPTIQUE DE DIFFERENTS OBJECTIFS Acadmie de Grenoble Formation continue STI-BIO-BGB | Connatre et utiliser les diffrents lments du microscope optique Page 16 sur 36

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Le microscope optique moderne est constitu dlments prsentant des caractristiques normalises offrant une plus grande facilit dutilisation, de maintenance et de rparation.

FIGURE 24 : PRINCIPALES DISTANCES NORMALISEES (EN MM)

Les objectifs proposent des grandissements en progression gomtrique dun coefficient proche de 1,6 et sont parafocaux ; c'est--dire que la mise au point est pratiquement conserve (et lobjet reste centr) chaque changement dobjectif ralis avec le revolver porte objectif. Grandissement 2,5 4 6,3 10 16 25 40 63 100

En optique la notion de grandissement est associe au rapport de la taille de l'image dun objet travers un systme optique la taille de l'objet. Le grandissement de lobjectif (g) est le rapport de la taille de limage intermdiaire relle inverse forme dans le tube (A1B1) la taille de lobjet microscopique (AB) situ sur la lame porte objet. On retrouve grav sur le corps des objectifs de nombreuses informations : longueur du tube optique, paisseur du couvre objet, type de correction de lobjectif, milieu dimmersion, compatibilit avec diffrentes techniques de microscopie optique.

FIGURE 25 : EXEMPLE DINDICATIONS FOURNIES SUR UN OBJECTIF

3.1.5 OBJECTIFS CORRIGES A LINFINI


Initialement les microscopes optiques droits avaient classiquement (valeur standardise), un tube optique de 160 mm et les microscopes optiques inverss un tube optique de 250 m. Depuis le dbut des annes 1980, les microscopes modernes sont monts avec des objectifs corrigs linfini , ce qui permet dinsrer sur le trajet optique diffrents lments doptique : prismes, filtres le tube optique de ces microscopes contient un systme de lentilles supplmentaires : les lentilles de tube. Ces objectifs corrigs linfini fournissent des rayons parallles qui seront focaliss, par les lentilles de tube, sur le plan de formation de limage intermdiaire. Limage forme tant finalement grossie par loculaire pour tre projets sur la rtine de lil de lobservateur comme dans lancien microscope optique.

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3.2

L E CONDENSEUR DU MICROSCOPE PHOTONIQUE A FOND CLAIR

Le condenseur est un lment de loptique dclairage qui permet de contrler le cne de lumire qui claire la prparation et projette sur le plan focal arrire de lobjectif limage de la source lumineuse. Le cne de lumire convergente focalis sur la prparation devient divergent aprs celle-ci : cest le diaphragme douverture situ lentre du condenseur qui permet de contrler louverture du cne de lumire transmise pour que celui-ci soit compltement capt par la lentille frontale de lobjectif et participe ainsi dans son intgralit la formation de limage agrandie de lobjet. Louverture numrique du condenseur doit tre au moins gale celle de lobjectif de plus forte ouverture numrique. Cest le diaphragme douverture qui permet dadapter louverture numrique du condenseur aux diffrents objectifs ports par le rvolver porte-objectifs.

FIGURE 26 : (A) CONDENSEUR ACHROMATIQUE ; (B) CONDENSEUR A GRANDE O.N.

En microscopie photonique fond clair on peut donc tre amen utiliser diffrents condenseurs en fonction de la gamme dO.N. des objectifs monts sur le microscope mais aussi (comme pour tous systmes de lentilles) en fonctions des aberrations optiques corriges : Un condenseur particulier dit ultra-faible possdant une O.N. variant de 0,02 0,16 permet dexploiter correctement les objectifs de grandissement infrieur x10 ; lclairage correct de la zone priphrique du champ observ est alors possible. Il existe des condenseurs lentille escamotable permettent de couvrir une trs large plage dO.N.: 0,16 0,9

FIGURE 27 : CONDENSEUR A LENTILLE ESCAMOTABLE O.N. 0,16 - 0,9

Le condenseur dAbbe est le plus simple (deux trois lentilles) et courant. Les aberrations chromatiques et sphriques ne sont pas corriges et sont O.N. est denviron 1,2. Le condenseur achromatique possde est corrig pour les dfauts de chromatisme et son ouverture numrique est de 1,25 1.3. Le condenseur achromatique aplantique assure une correction maximale de toutes les aberrations. Son ouverture numrique atteint 1,4. Il est recommand pour les objectifs planachromatiques ; il permet de concentrer la lumire sur une surface trs petite et conserve une grande ouverture.

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FIGURE 28 : CONDENSEUR APLANETIQUE ACHROMATIQUE (MONTAGE EN MILIEU HOMOGENE )

En pratique Le bon rglage du centrage, de la hauteur et du diaphragme douverture sont indispensables pour exploiter pleinement un microscope optique fond clair ; dans ces conditions la qualit de lobservation sera principalement limite que par les caractristiques de la prparation et celles de lobjectif. Pour un condenseur ayant une O.N. gale ou suprieure 0,9 la lentille suprieure du condenseur touche presque la surface infrieure de la lame. Le rglage adquat de lO.N. du condenseur saccommode le plus souvent dune valeur correspondant au trois quart de celle de lobjectif utilis ; ce rglage donne un bon contraste et prserve une certaine profondeur de champ. Cette remarque permet dexpliquer que lutilisation dun condenseur classique dO.N. 0,90 est encore adapte pour utiliser un objectif x100 immersion ayant une O.N. de 1,25. En labsence dindication concernant lO.N. sur le corps du condenseur, le rglage correct du diaphragme douverture peut ncessiter denlever les oculaires pour vrifier la position correspondant la pleine ouverture dclairage pour lobjectif utilis. Cette vrification douverture ( disque lumineux) est lie lO.N. de lobjectif ( nombre) Pour utiliser pleinement les condenseurs douverture numrique de 1,25 1,40 avec les objectifs dO.N. adaptes, il est ncessaire de travailler en immersion ; on parle de technique dobservation en milieu homogne. Une goutte dhuile immersion (peu fluide) est insre entre le condenseur ; lobjectif immersion de grande ouverture numrique ncessitant lui aussi entre la lamelle couvre objet et sa lentille frontale une goutte dhuile immersion.

3.3

L ES OCULAIRES

3.3.1 PRINCIPALES CARACTERISTIQUES


Loculaire grossit limage intermdiaire forme par lobjectif et corrige certaines aberrations (chromatisme, planit). Il est caractris par son grossissement et son indice de champ (fix par son diaphragme de champ ; de 12 25 mm pour les oculaires grand champ).

FIGURE 29 : SCHEMA DE PRINCIPE DE DIFFERENTS OCULAIRES Acadmie de Grenoble Formation continue STI-BIO-BGB | Connatre et utiliser les diffrents lments du microscope optique Page 19 sur 36

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Loculaire du microscope est une loupe qui projette sur la rtine, une image grossie, relle et nette (sans accommodation de lil), de limage agrandie de lobjet produite par lobjectif (A1B1). Son grossissement G est donn comme pour une loupe par la relation : G = d/f O d = 250 mm distance minimale de vision distincte (punctum proximum) et f la distance focale de loculaire. Le grossissement du microscope (Gm) est gal au produit du grandissement de lobjectif par le grossissement de loculaire : Gm = g x G En pratique En microscopie photonique fond clair on ne dpasse gnralement pas un grossissement (Gm) de 1000 ; la qualit premire dun microscope est son pouvoir sparateur pas son grossissement. Avec les meilleurs microscopes optique fond clair, quips dobjectifs apochromatiques, ayant une ouverture numrique de 1,4 et pleinement exploite par un condenseur achromatique-aplantique louverture numrique suffisante on peut obtenir un pouvoir sparateur de d= 0,2 m pour une observation en milieu homogne ( prsence dhuile immersion entre le condenseur et la lame porte objet comme entre la lamelle couvre objet et lobjectif)

3.3.2 OCULAIRE MICROMETRIQUES ET MESURE AU MICROSCOPE


Cest au niveau du diaphragme de champ (plan de formation de limage intermdiaire) que sont placs les dispositifs de mesure (micromtre), de reprage et de pointage. Lutilisation dun oculaire micromtrique (ou micromtre oculaire), chelle de 100 graduations quidistantes, ncessite son talonnage pour chaque objectif laide dun micromtre objet. Le micromtre objectif (ou micromtre objet) est une lame possdant classiquement une chelle gradue de 2 mm, subdivise en 100 graduations par mm ; soit une graduation tous les 10 m.

3.4

COLLECTEUR ET SOURCE DE LUMIERE

Le microscope photonique fond clair utilis en sciences biologiques est le plus souvent quip dun clairage diascopique fourni par une lampe halogne basse tension externalise du pied du statif (pour viter lchauffement) et accompagne dun collecteur muni dun diaphragme de champ. Ce dispositif optique constitu de lentilles et dun miroir inclin 45 et est parfois surmont dun filtre bleu . Il permet de fournir un faisceau cylindrique de lumire blanche dont les rayons parallles sont projets perpendiculairement la face dentre du condenseur.

FIGURE 30 : COLLECTEUR ET AUTRES ELEMENTS DE LA SOURCE D'ECLAIRAGE (DIASCOPIQUE)

(1) Ampoule halogne intensit lumineuse rgule par un potentiomtre ; (2) Rflecteur ; (3) Capot diffuseur de chaleur ; (4) Lentille collectrice ; (5) Verre anticalorique ; (6) Filtre correcteur ; (7) Diffuseur ; (8) Diaphragme de champ ( contrle du diamtre de la zone claire au niveau de la prparation) ; (9) Miroir inclin 45 ; (10) Lentille de champ ; (11) Flux lumineux cylindrique perpendiculaire la face dentre du condenseur

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Le diaphragme de champ limite le diamtre du cylindre de lumire ascendant permettant ainsi de nclairer que la surface correspondant au diamtre de la lentille frontale de lobjectif. Lintensit lumineuse et donc la clart est rgule par un potentiomtre contrlant lalimentation de la lampe halogne. Le filtre bleu attenue la dominante jaune-orange de la lumire mise par cette source de lumire artificielle pour se rapprocher des caractristiques de la lumire du jour. Ce filtre peut se trouver situ lentre du condenseur ou bien encore avant la sortie du collecteur. En microscopie fluorescence lclairage est piscopique.

FIGURE 31 : ECLAIRAGE EPISCOPIQUE (MICROSCOPIE A FLUORESCENCE)

3.5

LECLAIRAGE DE KHLER ET LUTILISATION DU MICROSCOPE PHOTONIQUE A FOND CLAIR

Une bonne observation impose un clairage correct de lobjet ; En microscopie photonique fond clair l'image forme par la lumire dvie par lobjet est vue sur un fond de lumire non dvie. La mthode de Khler permet dadapter loptique dclairage (couple collecteur condenseur) aux limitations de loptique de formation de limage (essentiellement lobjectif) pour obtenir de faon simple et reproductible une observation optimise (image rsolue et contraste). A chaque changement dobjectif certains de ces rglages sont donc systmatiquement modifier. Dun point de vue pratique la mthode de Khler assure : Une rpartition homogne de la lumire dans le champ Lexploitation maximale de l'O. N. de lobjectif (chaque objectif) Llimination la fois des rayons marginaux et de la lumire diffuse Lobtention de rsultats dobservation reproductibles Cette mthode permet ainsi : De voir lobjet et non les dfauts de lclairage Dassurer une cohrence partielle entre lclairage et la limite de rsolution De limiter la lumire parasite Lutilisation du microscope photonique fond clair avec la mthode de Khler suit les tapes suivantes : 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Mettre au point avec lobjectif utilis pour lobservation finale Rgler la vision binoculaire (rglage inter pupillaire voir dioptrique) Centrer le diaphragme de champ Rgler la hauteur du condenseur Rgler l'ouverture du diaphragme de champ Centrer et rgler la source (si possible et/ou ncessaire) Rgler l'ouverture du diaphragme d'ouverture Rgler la luminosit et affiner la mise au point
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Lclairage de Klher proprement dit concerne les tapes qui une fois la mise au point effectue assure le rglage correct du couple collecteur condenseur diaphragms (tapes 3 7). Tout changement dobjectifs (mme parafocaux) doit conduire reconsidrer au moins les rglages des diaphragmes de champ (du collecteur) et douverture (du condenseur).

LES AUTRES TECHNIQUES MICROSCOPIQUES PHOTONIQUES UTILISEES EN SCIENCES


BIOMEDICALES

Les principales limitations de la microscopie photonique fond clair sont le faible contraste de la plupart des chantillons biologiques et une rsolution trs moyenne due au flou cr par les zones de lobjet situes hors du plan focal. A cot des nombreuses techniques de prparation des chantillons permettant de lever partiellement ces limitations des amliorations et/ou transformations - adaptations du microscope photonique fond clair dautres modes dobservation, ce sont dveloppes.

4.1

L A MICROSCOPIE A FOND NOIR

4.1.1 PRINCIPE
La lumire non dvie est exclue, la lumire dvie produit l'image ; cette technique dobservation permet daugmenter considrablement le contraste (contraste extrme) des chantillons transparents car seule la lumire diffuse par l'chantillon est collecte et intervient dans la formation de limage. Si le fond de la prparation ne diffuse pas la lumire, il apparat noir ; seules les zones (objets microscopiques) diffusant la lumire apparaitront lumineuses. La limite de rsolution nest gnralement pas modifie. La faible intensit lumineuse peut tre une limitation propre cette technique microscopique. Le systme dclairement utilise un condenseur particulier qui lorsquil est prcisment centr et rgl interdit tous les rayons lumineux de la source non diffracts de pntrer dans lobjectif.

4.1.2 ELEMENT OPTIQUE SPECIFIQUE


Un condenseur pour fond noir comprend un diaphragme annulaire qui laisse passer un cylindre creux de lumire transform par un systme de miroirs en cne creux qui converge sur la prparation ; les rayons dordre zro ne pntrent pas dans lobjectif.

FIGURE 32 : CONDENSEUR A FOND NOIR

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4.1.3 DOMAINE DUTILISATION


Lobservation directe dchantillons frais, non prpars mais suffisamment fins et petits est le principal domaine dapplication de cette technique dobservation. Cela autorise la microcinmatographie sur chantillon vivants sur montage dit ltat frais . Lobservation en fond noir est performante et mme spectaculaire pour observer des objets rguliers (opaques comme les diatomes ou non), punctiformes ou linaires trs fins (cils, bactries du groupe des spirochtes ). Cette technique na pas dintrt pour les prparations (coupes et frottis) fixes et colores.

4.2

L A MICROSCOPIE EN CONTRASTE DE PHASE

4.2.1 PRINCIPE
Le principe de la microscopie en contraste de phase est bas sur l'obtention d'une image damplitude partir dun objet de phase ; l'il humain est sensible aux diffrences d'amplitude (luminosit) et de longueur d'onde (couleur). Les images observes en microscopie photonique fond clair sont des images dobjets damplitude. En sciences biologiques de nombreux objets microscopiques ne produisent pas de changements apprciables d'intensit ou de couleur sur la lumire qui les traverse mais induisent seulement des changements de phase ; de tels objets sont qualifis dobjets de phase. Loptique physique (ondulatoire) explique que ces objets de phases incompltement transparents aux ondes lectromagntiques produisent des dphasages lis aux retards engendrs par les diffrences de longueur de chemin optique (paisseur de lobjet de phase) et d'indice de rfraction (contenu de lobjet de phase). En retardant suffisamment les rayons nayant pas travers lobjet de phase (rayons non diffracts) au niveau de lobjectif (aprs la prparation), les phnomnes dinterfrence (destructive) entre ondes permettent de construire une image damplitude relle agrandie inverse de lobjet au niveau du tube optique du microscope.

FIGURE 33 : PRINCIPE DU CONTRASTE DE PHASE

S : onde des rayons dordre zro nayant pas rencontre dobjet (environ 20 fois plus intense et dcale denviron 90 par rapport londe diffracte D ) ; D : onde de lumire diffracte ayant traverse lobjet de phase ; P : onde rsultant de la sommation de S et D. Figure 32A : situation en microscopie photonique fond clair ; Figure 32B : D et S ont des intensits comparables aprs lanneau de phase qui a attnu et retard dun quart de longueur donde, les ondes non diffractes S ; Figure 32C : le dcalage de phase entre les ondes S et D engendre des interfrences destructives maximales et forme une onde P quivalente zone sombre.

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4.2.2 ELEMENTS OPTIQUES SPECIFIQUES


Dans son principe de mise en uvre lobservation en contraste de phase ncessite dapparier condenseur et objectif. En effet, l'objectif possde un disque annulaire spcial ( disque de phase) au niveau de son plan focal arrire, dont les dimensions correspondent l'image du diaphragme annulaire du condenseur de phase situ sur la face dentre de celui-ci. Chaque changement dobjectif implique un changement de diaphragme annulaire au niveau du condenseur de phase; lalignement du couple condenseur de phase objectif est aussi indispensable que le respect de lappariement condenseur de phase objectif.

FIGURE 34 : COUPLE CONDENSEUR - OBJECTIF EN CONTRASTE DE PHASE

4.2.3 DOMAINE DUTILISATION


Lobservation en contraste de phase permet de rvler en labsence de traitement de lchantillon (fixation coloration) des dtails invisibles en microscopie fond clair. Cette technique sapplique toutes les observations dobjets microscopiques faiblement contrasts ; elle est particulirement intressante en culture cellulaire pour lobservation directe laide dun microscope invers de cultures en flacon pour culture cellulaire (Falcon).

4.3

L A MICROSCOPIE A CONTRASTE INTERFERENTIEL DIFFERENTIEL (DIC)

En sciences biologiques une des microscopes interfrentiels 10 le plus spectaculaire est un microscope diascopique lumire polarise donnant des images au relief saisissant : le microscope contraste interfrentiel diffrentiel (DIC)

10

La microscopie en lumire polarise trs utilise dans ltude des roches (analyse des minraux) est en fait une forme de microscopie d'interfrence.
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4.3.1 PRINCIPE
Comme la microscopie en contraste de phase, la microscopie d'interfrence transforme des dphasages dondes traversant des objets incompltement transparents en diffrences damplitude (intensit coloration). Le principe du contraste interfrentiel diffrentiel (DIC) repose sur la division dun rayon lumineux polaris en deux rayons de mme longueur donde, mais polariss orthogonalement et spars spatialement dune distance trs courte (une fraction de la longueur donde). La sparation en deux rayons est ralise par un Wollaston (assemblage particulier de deux cristaux birfringents). Ces deux rayons (nomms respectivement ordinaire et extraordinaire) traversent lobjet microscopique en deux points diffrents mais trs proches ; les milieux diffrents traverss par chacun des deux rayons, entranent un dphasage diffrent. Aprs lobjectif les deux rayons sont recombins par un second Wollaston et viennent interfrer sur un filtre polariseur. Suivant la diffrence de phase entre les rayons, un contraste positif ou ngatif sera cr rvlant ainsi les structures intracellulaires invisibles en fond clair .

FIGURE 35 : PRINCIPE MICROSCOPIE A CONRASTE INTERFERENTIEL DIFFERENTIEL (DIC)

4.3.2 DOMAINE DUTILISATION


Le contraste interfrentiel diffrentiel (DIC) aussi appel contraste Nomarski est trs performant pour lobservation de prparations non colores dobjets trs peu contrasts en microscopie photonique fond clair.

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4.4

L A MICROSCOPIE A FLUORESCENCE (CLASSIQUE)

4.4.1 PRINCIPE
Certaines molcules fluorescentes (fluorophore ou fluorochrome) possdent la proprit : d'absorber de l'nergie lumineuse (lumire d'excitation) ; et de la restituer rapidement (quelques nanosecondes) sous forme de lumire fluorescente (lumire d'mission de longueur donde diffrente toujours plus grande), lors du retour de cette molcule de ltat excit un tat plus stable. La microscopie en fluorescence repose sur la formation d'une image par dtection de cette lumire mise. Suivant les cas la fluorescence peut tre : primaire ou auto fluorescence ou directe (chlorophylles, paroi de kystes de parasites ) secondaire un marquage plus ou moins spcifique, immunologique (direct ou indirect) voir gntique (ex. protine recombinante fluorescente avec la Green Fluorescent Protein ou GFP) permettant alors dobserver la fluorescence directement dans les cellules vivantes.

4.4.2 ELEMENTS OPTIQUES SPECIFIQUES


En sciences biologiques le microscope fluorescence classique le plus courant permet une pi-illumination de lchantillon (piscopie). La source lumineuse est une lampe mercure qui produit un rayonnement intense (dont la chaleur est limite par un filtre anticalorique) qui traverse un filtre dexcitation (de type passe bande) ne transmettant que la longueur donde dsire. La fluorescence mise est collecte par lobjectif pour former une image relle grandie, dbarrasse des rayons excitateurs rflchis par le filtre darrt du tube (de type passe-haut), au niveau du plan image tube optique.

FIGURE 36 : EPI-ILLUMINATION EN FLUORESCENCE

4.5

L A MICROSCOPIE CONFOCALE (A BALAYAGE LASER)

Le microscope optique confocal peut raliser des images de trs faible profondeur de champ (environ 400 nm) appeles sections optiques . Cest un microscope qui fonctionne en lumire rflchie ou en fluorescence. Linformatisation du systme de dtection et la puissance de calcul des microprocesseurs, permet de raliser en dplaant le plan focal de lobjectif dans lpaisseur de lobjet, des sries dimages partir desquelles on peut obtenir une reprsentation tridimensionnelle de ce dernier. L'lment cl de ce microscope confocal est reprsent par une "fentre" ( pinhole aperture soit un stnop ou un iris confocal) place devant le dtecteur (dans le plan focal conjugu au plan focal de lobjectif plans confocaux) qui limine la fluorescence (ou la lumire rflchie) provenant des rgions non focales. La plupart du temps, la source lumineuse est un laser (monochromatisme, contrle et filtrage mieux maitriss que pour dautres sources) ; on parle alors de microscope confocal balayage laser MCBL (en anglais CLSM pour confocal laser scanning microscope). L'observation de signaux de fluorescences repose sur cinq lments : La plupart du temps, on utilise un laser comme source de lumire.

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FIGURE 37 : MICROSCOPIE CONFOCALE (A BALAYAGE LASER)

A : Un stnop est plac devant le dtecteur ; B : Principaux lments du MCBL

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ANNEXES
L ISTE SIMPLIFIEE DES PRINCIPAUX SIGLES INSCRITS SUR LE CORPS DES OBJECTIFS (EXTRAIT DU SITE L E MICROSCOPE OPTIQUE A FOND CLAIR PAR JEAN-PIERRE GAVERIAUX)
A ; Achro ; Achromat = objectifs achromatiques Apo ; Apochromat = objectifs apochromatiques DIC ; NIC = obj. pour contraste interfrentiel (Contraste de Nomarski) ELWD = obj. pour extra longue distance de travail Epi = objectifs pour pi-illumination Fl ; Fluo ; Neofluar ; Fluotar ; Semi-apo = objectifs la fluorine = obj. semi-apochromatiques Fluo-plan ; Pl-Fl = objectifs plans semi-apochromatiques ou plans la fluorine G.F. = objectifs grand champ Gly = Immersion dans la glycrine H = pour utilisation avec une platine chauffante. HI = Immersion homogne I ; Iris ; W/Iris = objectif muni dun diaphragme permettant la modification de louverture numrique (exemple lors de lutilisation avec condenseur pour fond noir). Korr ; Corr, W/Corr ; CR = objectif avec bague permettant lajustement lpaisseur de la lamelle. LU = Obj. (Nikon) universel pour fond clair, fond noir, contraste de phase et lumire polarise. LWD = Obj. pour grande distance de travail (Long-Working-Distance) M = objectifs pour mtallographie (nutilisant pas de lamelle couvre-objet). NCG = objectifs pour observation sans lamelle couvre-objet (No-Cover Glass) Oil ; Oel = obj. ncessitant limmersion dans lhuile. P ; Pol = objectifs spciaux pour lumire polarise P ; Pol ; SF = objectif sans contrainte (strain free) utilis pour avoir une lumire polarise de haute qualit. Ph ; Phaco = objectifs pour contraste de phase en association avec un condenseur spcial Plan ; Pl ; NPl = objectifs planachromatiques Planapo ; Apoplan = objectifs planapochromatiques SLWD = obj. pour trs longue distance de travail (Super-Long-Working-Distance). UPLAN = Obj. (Olympus) universel pour fond clair, fond noir, contraste de phase et lumire polarise. UV = obj. ayant un traitement particulier des surfaces des verres spciaux afin de permettre le travail dans lultraviolet ( < 400 nm).Water ; WI ; Wasser = Immersion dans leau. Les lettres sont noires pour les types standards, rouges pour les objectifs destins la lumire polarise et vertes pour le contraste de phase.

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L ONGUEUR DU TUBE OPTIQUE ET PRINCIPE DE LA CORRECTION A LINFINI DES MICROSCOPES


RECENTS

FIGURE 38 : TUBE OPTIQUE "CLASSIQUE"

FIGURE 39 : TUBE OPTIQUE "INFINI"

L ES COULEURS (EXTRAIT DE HTTP://WWW .ICONEOCLASTE.COM/INDEX.PHP)


La reproduction de tout le spectre de la couleur sensible l'il humain (~de 400 nm 700 nm) se fait par le mlange de trois couleurs primaires et de trois couleurs secondaires : - Les trois primaires : Rouge - Bleu - Vert - Les trois secondaires ou complmentaires : Cyan - Jaune - Magenta . La synthse additive : Deux couleurs sont dites complmentaires lorsque leur addition (mlange additif) donne le blanc. Sur le schma ci-contre sont reprsentes les trois couleurs primaires et opposes les trois couleurs complmentaires. Exemple : - Le Rouge + le Cyan (Bleu + Vert) = Blanc - Le Bleu + le Jaune (Vert + Rouge) = Blanc - Le Vert + le Magenta (Rouge + Bleu) = Blanc

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LUTILISATION DU MICROSCOPE PHOTONIQUE A FOND CLAIR

1. Mettre sous tension la source de lumire aprs stre assur que le potentiomtre de rglage de lintensit lumineuse se trouve sur sa position minimale.

Les lampes halognes supportent mal les variations brusques de tension. Les rglages du microscope prennent du temps et les prparations microscopiques supportent mal lchauffement du une intensit lumineuse trop leve

2. Ouvrir les diaphragmes de champ (au-dessus du collecteur de lumire situ aprs la lampe) et douverture ( lentre du condenseur).

3. Positionner la prparation observer sur la platine porte objet.


Le rglage de ces diaphragmes dpend de lobjectif utilis et des caractristiques de la prparation observe (objet +/- pais et +/- color, paisseur variable de la lame porte objet et ventuellement de la lamelle couvre objet).

4. Prparer la mise au point un faible grossissement en amenant la prparation moins dun millimtre de la lentille de lobjectif x40. Le technicien regarde sur le cot du microscope, ses yeux ne sont pas sur les oculaires. Tourner le revolver porte objectif pour (ventuellement) positionner un objectif de faible grandissement (x10).
Tous les microscopes nont pas de systme de rglage de la pr focalisation. La recherche de la mise au point en aveugle ( les yeux sur les oculaires sans pr focalisation pralable) : - augmente le risque de toucher lobjectif avec la prparation (trs petits objets ncessitant demble lobjectif x40) ; - est trs laborieuse (longue) pour le novice qui ne sait pas quelle distance dun objectif court (x4 ou x10) se trouve la plage de mise au point.

5. Les yeux sur les oculaires, on ajuste lintensit lumineuse (potentiomtre sur le pied du statif) et on recherche la mise au point (vis macromtrique puis micromtrique) en loignant lentement la platine porte objet de la lentille de lobjectif. 5 bis. Si la mise au point nest pas trouve, il est prfrable de remonter la platine porte objet en regardant sur le cot du microscope et reprendre ltape 4.
Eviter le choc objectif - prparation. Permettre ventuellement de dplacer la lame porte objet vers une zone apparaissant lil nu plus colore.

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6. Rgler lcartement inter pupillaire des oculaires pour obtenir une parfaite superposition des deux images vues par chaque il. On observe alors une seule image circulaire.

7. Affiner la mise au point en ne regardant quavec lil ne disposant pas doculaire rglable (lautre il tant ferm). 7 bis. Sans toucher la mise au point (vis macro et micromtrique) jouer sur loculaire rglage dioptrique pour obtenir une image nette avec lil prcdemment ferm (lil ayant initialement servi affiner la mise au point tant alors ferm).
Permettre lutilisateur ayant une diff rence dacuit visuelle entre ses deux yeux de profiter du confort de lobservation binoculaire.

8. Reprer le champ le plus intressant en utilisant le chariot guide objet puis positionner lobjectif souhait pour lobservation. Ajuster ventuellement la mise au point (vis micromtrique). 8 bis. Les tapes suivantes de rglage des lments de loptique dclairage peuvent ventuellement se raliser en retirant la prparation en prenant garde de ne pas changer la mise au point
Il ne sert rien dchauffer inutilement la prparation.

9. Fermer progressivement les diaphragmes de champ et douverture (respectivement sur le collecteur et sous le condenseur) pour nclairer quune partie du champ observ. Le diamtre de la colonne de lumire qui monte de la source est plus petit que le champ prsent sous la lentille de loculaire.

9 bis. Si en fermant le diaphragme de champ, le faisceau dclairage nest pas centr par rapport au champ dobservation, il faut recentrer liris du diaphragme en jouant sur les vis situes sur les cots du systme dclairement (collecteur + diaphragme de champ) ou au niveau du condenseur (suivant les microscopes) Laxe du faisceau dclairage qui traverse lobjet et laxe de lobjectif doivent tre aligns.
Lorsque lon regarde des diapositives on fait en sorte que la seule lumire prsente dans la pice soit celle qui traverse la diapositive ( champ observ). Chaque point de la source claire lensemble de la prparation: on a un fond clair
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10. Rgler la hauteur du condenseur pour obtenir un bord net de la zone de champ claire lorsque le diaphragme de champ est partiellement ferm. Puis r ouvrir le diaphragme de champ pour clairer de nouveau tout le champ dobservation.
Tous les faisceaux lumineux se croisent sur lobjet. Chaque point de lobjet est clair par lensemble de la source de lumire et donne un point sur la rtine.

11 : Rgler et centrer la source lumineuse si le microscope le permet pour projeter limage de la source lumineuse (filament de tungstne) dans le plan du diaphragme douverture. Cette manipulation ncessite de supprimer les filtres dpolis entre la source et le condenseur, de centrer le filament laide des vis de centrage de la lampe et enfin de modifier la distance lampe collecteur pour que le filament couvre tout le champ.
En labsence dobjet, lobtention dun fond uniformment clair o chaque point de la source claire lensemble du champ dobservation et de la rtine ncessite davoir une source lumineuse rgle et centre ; le principe de l'clairage de Khler est de projet er l'image de la source lumineuse dans le plan du diaphragme d'ouverture .

12. Rgler le diaphragme douverture (situ lentre du condenseur) : Pour les objets trs contrasts ( colors) le meilleur pouvoir sparateur est obtenu lorsque louverture dclairage est gale louverture numrique de lobjectif. On parle de pleine ouverture dclairage . Pour les objets peu contrasts, il faut fermer le diaphragme douverture jusqu environ 3/4 ou 2/3 de la pleine ouverture dclairage . Cela permet daugmenter le contraste et la profondeur de champ (malheureusement le pouvoir sparateur est alors moins bon). Remarques : Lorsque lon change dobjectif il est ncessaire dajuster louverture du diaphragme douverture (chaque objectif une ouverture numrique diffrente). En labsence dindication sur le condenseur, le bon rglage est celui qui offre un bon contraste et donne une image bien dfinie.
Si le D.O. est trop ouvert des rayons diffracts ou diffuss hors de la zone observe pntrent dans lobjectif (ouverture dclairage suprieure louverture numrique de lobjectif) et diminue les contrastes. Si le D.O. est trop ferm limage est sombre et des franges de diffract ion apparaissent ; Dans les deux cas limage est de mauvaise qualit. A la pleine ouverture dclairage on observe quen retirant loculaire, le diamtre de limage du diaphragme est gal celui de lobjectif. Certains condenseurs possdent sur le cot une chelle indiquant en fonction de la position du D.O. louverture numrique du cne de lumire focalis sur la prparation. Pour les autres condenseurs il est toujours possible denlever loculaire pour ajuster louverture du D.O. au 3/4 de la pleine ouverture dclairage de lobjectif utilis.

13. La clart se rgle sur le potentiomtre de modulation de lintensit lumineuse. Cest le seul rglage quil faut modifier en attendant votre professeur : intensit lumineuse au minimum.

Jouer sur le diaphragme douverture pour ajuster la clart est une erreur car on touche alors systmatiquement la qualit de limage (contraste et pouvoir sparateur).

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14. Pour passer en immersion, on conserve la mise au point. Lobjectif x40 est dgag de laxe optique en tournant doucement le revolver porte objectif. Lorsque les objectifs x40 et x100 sont de part et dautre de la prparation on dpose une trs fine goutte dhuile immersion puis lobjectif x100 est positionn au-dessus de la prparation.
Aprs cette opration on ne peut plus retourner vers les objectifs de plus petits grandissements. Les autres objectifs ne doivent pas entrer en contact avec lhuile immersion. Il faut ajuster le rglage des diaphragmes au nouvel objectif.

15. Aprs utilisation : diminuer lintensit lumineuse au maximum (potentiomtre) puis teindre le microscope (interrupteur) essuyer lobjectif immersion avec du papier Joseph. coincer un carr de papier Joseph entre la lentille frontale de lobjectif immersion et la platine porte objet. remettre la house de protection sur le microscope
Maintenir la qualit du matriel et rduire les coups dentretien

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RFRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
OUVRAGES
Bioimaging: Current Concepts in Light and Electron Microscopy 1 edition Douglas E. Chandler Robert W. Roberson Editeur Jones and Bartlett Publishers 2009 978-0-7637-3874-7 Optical Imaging and Microscopy: Techniques and Advanced Systems nd 2 edition Peter Trk, Fu-Jen Kao Editeur Springer series in optical sciences 2007 ISBN 978-3-54069563-9 La microscopie : Techniques dtude en biologie Jean Pierre Pr Editeur Nathan universit sciences 128 1994 ISBN 209 190727 8
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RESSOURCES NUMERIQUES DOCUMENTS EN LIGNE


Le microscope optique fond clair par Jean-Pierre GAVERIAUX - secrtaire de la SMNF - L'utilisation du microscope optique en mycologie et lichnologie Techniques de lingnieur Rubrique : Mesures Analyses / Mtrologie optique et photonique / Microscopie optique Date de publication : 10 juin 1999 Grard ROBLIN : Directeur de recherche au Centre national de la recherche scientifique (CNRS) (ER), Docteur s sciences Cours et travaux dirigs en licence Sciences de la Vie module : Biologie et Physique - optique & microscopie de Arnauld Serg Matre de Confrences Biophysicien : Dpartement de Biologie Facult des Sciences de Luminy Universit de la Mditerrane (alias Aix-Marseille II) MicrOscOpieS : Le site des Microscopistes Amateurs Francophones Introduction la microscopie par Frithjof A. S. Sterrenburg (traduit par G.Vuille) Hosted by Micscape Magazine, the monthly magazine of Microscopy-UK.

SITES DE FABRICANTS DE MATERIEL POUR LA MICROSCOPIE OPTIQUE (LISTE NON EXHAUSTIVE)


Carl Zeiss http://www.zeiss.fr Zeiss Campus Education in Microscopy and Digital Imaging Nikon France http://www.nikon.fr MicroscopyU The source for microscopy education Leica Microsystems http://www.leica.com Olympus France http://www.olympus.fr Nachet http://www.nachet.com

Daprs http://fr.wikipedia.org/wiki/Accueil
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Ernst Abbe (23 janvier 1840 Eisenach - 14 janvier 1905 Ina) tait un physicien et un industriel allemand. Il fut professeur l'universit d'Ina en 1870, directeur des observatoires astronomiques et mtorologiques en 1878, associ puis successeur de Carl Zeiss (1866) la direction de sa socit. Il dveloppa la thorie de la formation de l'image microscopique (1872) et mit au point le condenseur pour amliorer la qualit de l'image. Il perfectionna le microscope grce ses travaux sur l'limination de l'aberration sphrique et la coma des lentilles. Il est l'inventeur du prisme d'Abbe. Il introduit le nombre d'Abbe qui est une grandeur essentielle en optique oculaire : le rapport de la rfraction avec la dispersion. Il tablit la condition d'aplantisme des systmes centrs (relation des sinus d'Abbe).

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