S-U02-1172 : UE Chromatographie

Partie 4 :

Analyses quantitatives en chromatographie

Licence de chimie L3S5

Carole Mathe de Souza
carole.mathe@univ-avignon.fr
I. Introduction
- Développement considérable de la chromatographie quantitative.
- Fiabilité et précision.
- Repose sur la répétabilité des séparations et la relation entre la masse injectée et l'aire du
pic correspondant.
- Logiciel de traitement de données permet d'automatiser les tâches de calcul.
- Pour calculer la concentration massique :
• Disposer du composé à doser (référence) et déterminer la sensibilité du
détecteur/composé.
• Disposer d'un appareil donnant les aires des différents pics d'élution (à défaut les
hauteurs).
- Toutes les méthodes de quantification partent de ces deux conditions.

Partie IV – Analyses quantitatives en chromatographie

Pour un réglage donné de l'appareil, on admet qu’il existe pour chaque pic une relation linéaire entre
l'aire et la quantité du composé correspondant dans l'échantillon.

mi = K i x A i

mi : masse du composé i injectée dans la colonne

Ki : coefficient de réponse absolu du composé i (à ne pas confondre avec K : coef. de partition et
dépend du chromatographe et pas paramètre intrinsèque au composé).
Ai : aire du pic d'élution du composé i

Cette relation est bornée par :

- Quantité détectable pour les concentrations les plus faibles.
- Limite de linéarité pour les concentrations les plus élevées.

Partie IV – Analyses quantitatives en chromatographie

Pour calculer le coefficient de réponse absolu Ki du composé i, il faut connaître la masse mi injectée (via
le volume).
Il est difficile de déterminer avec précision cette masse (vs volume) injecté(e) qui dépend de l'injecteur
et de la précision de la seringue ou de la boucle d'injection.
Ki dépend du réglage du chromatographe.

• Logiciels de chromatographie :
Nécessaires pour calculer l’aire des pics notamment (mais aussi : ω, , hauteur…)
Logiciel de traitement de données installé sur un ordinateur muni d'une carte électronique relié à la
sortie du détecteur.

Le signal analogique est échantillonné, au rythme d'une centaine de fois par seconde.

La cadence doit être suffisante pour évaluer correctement les pics les plus fins.

Partie IV – Analyses quantitatives en chromatographie

Le chromatogramme, mémorisé sous forme de nombres, correspond à un histogramme.

Les trois principales méthodes de quantification sont décrites ci-après.

Partie IV – Analyses quantitatives en chromatographie

1. Méthode de l’étalonnage Externe (ESTD)
- Permet de calculer la teneur d'un ou de plusieurs constituants élués au sein d'un
chromatogramme, même très encombré.
- Teneur en concentration ou de pourcentage massique.
- Processus basé sur la comparaison de deux chromatogrammes obtenus successivement sans
changer les conditions de réglage de l’appareil.
- Solution de référence (Créf), volume V, aire Aréf du pic correspondant.

1er chromatogramme de référence acquis à partir d’une solution de référence (conc. Créf) dans un
solvant, du composé qui fait l’objet du dosage. Injection d’un volume V de cette solution et on repère
sur le chromatogramme l’aire Aréf du pic correspondant.
2sd chromatogramme résulte de l’injection d’un volume identique V de l’échantillon en solution,
contenant le composé à doser (conc. Céch) avec Aéch l’aire du pic correspondant.
Puisque les volumes injectés sont égaux, il y a proportionnalité entre les aires, qui dépendent des
masses injectées, et les concentrations correspondantes (mi = C i · V).

Partie IV – Analyses quantitatives en chromatographie

1er chromatogramme de référence acquis à
partir d’une solution de référence (conc. Créf)
dans un solvant, du composé qui fait l’objet
du dosage. Injection d’un volume V de cette
solution et on repère sur le chromatogramme
l’aire Aréf du pic correspondant.
2sd chromatogramme résulte de l’injection
d’un volume identique V de l’échantillon en
solution, contenant le composé à doser
(conc. Céch) avec Aéch l’aire du pic
correspondant.

Partie IV – Analyses quantitatives en chromatographie

Puisque les volumes injectés sont égaux, il y a proportionnalité entre les aires, qui dépendent
des masses injectées, et les concentrations correspondantes (mi = C i · V).

mréf = Créf . V = K . Aréf méch = Céch . V = K . Aéch

Céch = Créf é𝒄𝒉

𝒓é𝒇

Partie IV – Analyses quantitatives en chromatographie

Etalonnage possible avec un seul point de mesure : la « droite d’étalonnage » passe donc par l’origine.

Amélioration de la précision :

• Si les concentrations des solutions "référence" et "échantillon" sont du même ordre de grandeur.

• Utilisation d’un passeur d’échantillon automatique : enchaînement de plusieurs dosages sans

intervention humaine et permettant de compenser une éventuelle dérive de l’instrument (ré-
injections programmées de contrôle).

• Lorsqu'on utilise plusieurs solutions afin d'obtenir une droite d'étalonnage avec calcul de la
moyenne des aires obtenues à partir de plusieurs injections identiques : multilevel calibration et
tracé de la courbe d’étalonnage A = f(C).

Partie IV – Analyses quantitatives en chromatographie

- Méthode faisant appel aux coefficients de réponse absolu.

- Facilité d’exécution, rapidité mais nécessite une parfaite reproductibilité des

volumes injectés (ce que permettent les injecteurs automatiques).

- Donne des résultats très fiables avec des chromatographes performants.

Partie IV – Analyses quantitatives en chromatographie

2. Méthode de l’étalonnage interne

- Utilisation du coefficient de réponse relatif de chaque composé vis-à-vis d'une référence.

- Permet de s'affranchir de l'imprécision concernant les volumes injectés.

- Réalisation de deux chromatogrammes (pour le calcul des coefficients et pour l'analyse).

- Aires des pics comparées à celle du composé de référence : étalon interne.

Partie IV – Analyses quantitatives en chromatographie

 Etalonnage Echantillon

Aréf Créf A'éch C'éch

E A1 C1 E A'1 C'1 ?
1 A2 C2 1 A'2 C'2 ?
2 AE CE A'E
solvant

solvant

m1= K1 x A1 m'1= K1 x A'1

m2= K2 x A2 m'2= K2 x A'2
mE= KE x AE m'E= KE x A'E

Partie IV – Analyses quantitatives en chromatographie

 Calcul des coefficients de réponse relatifs

Soit : m1 K1 A1 et m2 K2 A 2
mE KE AE mE KE AE
• Faire apparaître les coefficients K1/E et K2/E :
et
K1 m1 AE K2 m2 AE
K1/E K2/E
KE mE A1 KE mE A2
ou exprimés en fonction des concentrations

C1 AE et C2 AE
K1/E K2/E
CE A1 CE A2
Calcul des concentrations :
• analyse de l'échantillon dans lequel est ajouté une quantité connue d‘étalon
interne E
• soient A'1, A'2 et A'E les aires du nouveau chromatogramme
• dans les mêmes conditions opératoires on aura :
et

m'1 A'1 m'2 A'2

K1/E K2/E
m' E A' E m' E A' E

Partie IV – Analyses quantitatives en chromatographie

A partir des coefficients relatifs calculés et de la concentration de l‘étalon interne, on accède ainsi à :

A'1 A'2
C'1 C' E K1/E C'2 C' E K2/E
A' E A' E

En généralisant, on peut calculer la concentration massique du composé i :

A' i
C' i C' E Ki/E
A' E

Partie IV – Analyses quantitatives en chromatographie

 Méthode générale et reproductible qui exige un bon choix de l'étalon interne :

• L’étalon doit être pur et ne pas se trouver initialement dans l'échantillon

• Son pic d'élution bien résolu.

• Sa concentration doit être proche ou supérieure à celles des autres solutés pour être dans les
conditions d'une réponse linéaire du détecteur.

• Son temps de rétention doit être proche de celui (ou de ceux) du (ou des) soluté(s) à doser.

• Inerte vis-à-vis des composés de l'échantillon.

Partie IV – Analyses quantitatives en chromatographie

3. Méthode par normalisation interne

• Egalement appelée "100% normalisée" .

• Réservée aux mélanges dont on a identifié tous les constituants (bilan complet).

• Supposons qu'il s'agisse de trouver les concentrations massiques d'un mélange de

trois composés 1, 2 et 3.

• Réalisation de deux chromatogrammes (pour le calcul des coefficients et pour

l'analyse).

Partie IV – Analyses quantitatives en chromatographie

 Etalonnage Echantillon

Aréf Créf A'éch C'éch

2 2
1 3 A1 C1 A'1 C'1 ?
A2 C2 1 A'2 C'2 ?
A3 C3 A'3 C'3 ?
solvant

solvant

On choisit l'un des composés comme substance de normalisation interne, le composé 3 par exemple

Partie IV – Analyses quantitatives en chromatographie

 Calcul des coefficient de réponse relatifs

Déterminer les coefficients K1/3 et K2/3 :

K1 m1 A3 K2 m2 A3
K1/3 K2/3
K3 m3 A1 K3 m3 A2
ou exprimés en fonction des concentrations

C1 A3 C2 A3
K1/3 K2/3
C3 A1 C3 A2

Partie IV – Analyses quantitatives en chromatographie

Calcul des concentrations :
• Injection du mélange à doser contenant les constituants 1, 2 et 3.
• En posant A'1, A'2 et A'3 les aires des pics, on a accès à la composition centésimale
massique :

Ki/3 A' i
xi% 100
K1/3 A'1 K2/3 A'2 A'3
La condition de normalisation étant que :

x1 x2 x3 100

Partie IV – Analyses quantitatives en chromatographie

En extrapolant à n solutés :
• par rapport à un soluté j de référence, on a pour expression générale :

Ci Aj
Ki/j
Cj Ai

A'i désigne l'aire du pic d'élution du composé i :

Ki/j A' i
xi% n
100
Ki/j A' i
i 1
 Méthode générale et reproductible exige un bon choix du composé de référence :

• se trouver initialement dans l'échantillon.

• pic d'élution bien résolu avec un temps de rétention proche de ceux des solutés à
doser.

Échantillons dont la composition évolue peu.

Pas de traitement de l'échantillon : avantage par rapport à la méthode par étalonnage

interne.

Partie IV – Analyses quantitatives en chromatographie