Los anticuerpos monoclonales

Brevsima historia. En 1975 Georges Khler y el investigador argentino Csar Milstein fusionaron por primera vez linfocitos con clulas de un mieloma y obtuvieron un hibridoma: una lnea celular inmortal capaz de producir anticuerpos especficos (monoclonales). Por este trabajo, que no patentaron, recibieron el premio Nobel de Fisiologa y Medicina en 1984. La importancia de la produccin de anticuerpos monoclonales no se evidenci hasta 1987 cuando estos anticuerpos se produjeron en forma regular en ratones y fueron utilizados en el diagnstico ya que son anticuerpos de pureza excepcional capaces de reconocer y unirse a un antgeno especfico. Los anticuerpos monoclonales se utilizan de rutina en muchos procedimientos diagnsticos como por ejemplo: mediciones de niveles de protenas y drogas presentes en el suero tipificacin de tejidos y de sangre identificacin de agentes infecciosos tipificacin de leucemias y linfomas identificacin de antgenos tumorales identificacin de clulas especficas involucradas en la respuesta inmune. identificacin y cuantificacin de hormonas.

Cmo surgi la idea de obtener anticuerpos monoclonales? Qu mejor respuesta que recurrir a las palabras del Dr. Milstein1: Imaginemos una gran mezcla de sustancias qumicas entre las cuales nos interesa slo una de ellas. Una sustancia entre millones y millones. Es como una aguja en un pajar. Si tenemos un anticuerpo especfico contra una sustancia, ese anticuerpo puede funcionar como un imn capaz de ignorar la existencia del pajar y reconocer exclusivamente la aguja. A los ojos de un anticuerpo, el pajar no existe. Este simple concepto dio lugar a lo que se dio en

llamar Inmunoensayos (ver captulo 9) que permitieron la medicin precisa de hormonas y otras muchas sustancias no slo en medicina sino en qumica analtica en general. Los inmunoensayos introdujeron los anticuerpos para su uso como herramienta analtica de importancia fundamental en reas que nada tenan que ver con la inmunologa. El problema era que para preparar un anticuerpo especfico era necesario utilizar agujas puras. Algo ms sobre los anticuerpos Vimos en el captulo 9 la estructura bsica de los anticuerpos, vamos a repasar y agregar aqu, una serie de conocimientos sobre esas molculas mgicas. Las inmunoglobulinas o anticuerpos o abreviados (Ab) son una mezcla heterognea de protenas que presentan dos tipos de variaciones estructurales. Cambios sutiles en la estructura de los sitios de combinacin al antgeno (regiones variables) que determinan la especificidad de unin al antgeno (reconocimiento de un antgeno entre varios parecidos) y diferencias estructurales fuera de la regin de unin al antgeno, en las llamadas regiones constantes que se relacionan con otras funciones del anticuerpo denominadas efectoras. Estas actividades efectoras son por ejemplo: activar al complemento o unirse a ms de un receptor conocido con el nombre de Fc que estn presentes en las membranas de los monocitos y granulocitos (ver captulo 7). Existen cinco clases de inmunoglobulinas que adems de las IgG incluyen a las IgA, IgD, IgE, e IgM. Cada clase de anticuerpos se distinguen entre s por algunas de sus funciones efectoras y constitucin estructural. No vamos a complicar las explicaciones pero para dar una idea concreta diremos que el primer tipo de anticuerpos que aparece en una persona infectada con un virus es del tipo IgM y que recin pasado cierto tiempo aparecen las IgG que son ms duraderas. Como las molculas son estructuralmente diferentes se pueden distinguir fcilmente mediante procedimientos de rutina en el laboratorio clnico. Esta situacin es vital para el diagnstico clnico. Volviendo al virus de la rubola si una mujer embarazada tiene un contacto con un enfermo de rubola es importante averiguar si ya est protegida o no. Si se le detectan anticuerpos IgM se trata de una infeccin reciente y hay que preocuparse por el porvenir del beb ya que el virus de rubola es teratognico (puede producir malformaciones en el embrin). Si la mujer tiene anticuerpos IgG la infeccin fue anterior y no hay de qu preocuparse. Modo de obtencin de los anticuerpos monoclonales.

Problemas que hubo que resolver: Pasaje de la heterogeneidad a la homogeneidad o del anticuerpo policlonal al anticuerpo monoclonal. Mientras algo de la heterogeneidad de los anticuerpos deriva de la existencia de clases y subclases de Ig lo ms importante radica en la naturaleza polimrfica de sus regiones variables. Se han hecho estimaciones del nmero de anticuerpos diferentes que pueden producir las clulas B del organismo y se llega al fantstico nmero de ms de 10 millones. En resumen: la respuesta del sistema inmune a cualquier antgeno por ms simple que sea ste, es una respuesta policlonal. Lo que quiere decir que el sistema fabrica anticuerpos contra un rango amplio de estructuras presentes en el antgeno que involucran tanto a la regin de unin al antgeno como a las zonas efectoras. Por otro lado, MacFarland Burnet (premio Nobel 1960) postul la teora clonal de la generacin de anticuerpos es decir la generacin de molculas idnticas en su estructura y en su capacidad de reconocer a un antgeno (qu alivio!, gracias a Dolly todos saben qu es un clon). Cada clula plasmtica B (clon B) fabrica un solo tipo de anticuerpo. Este hecho vino en ayuda de Milstein y Khler que pensaron que si aislaban clones de clulas B y las cultivaban en placas de plstico de cubetas mltiples, el anticuerpo que produciran las clulas sera monoclonal. Pero... haba un gran inconveniente, las clulas B mueren a los pocos das de ser cultivadas in-vitro. Entonces, se les ocurri que si las fusionaban con una clula con potencial de inmortalidad, los hbridos de ambas clulas podran fabricar anticuerpos monoclonales casi indefinidamente. Efectivamente fue as, obtuvieron hibridomas la clave para producir anticuerpos monoclonales. Fusin celular La fusin celular es un procedimiento que permite que dos clulas se fusionen entre s al poner en contacto sus membranas externas citoplasmticas. En el esquema que sigue se muestra el caso de la fusin celular mediada por un virus, pero tambin se puede producir la fusin por otros mtodos utilizando algunos reactivos qumicos. A los efectos de entender el procedimiento vale tanto un virus como una sustancia qumica. Como vemos hay dos clulas cuyos diferentes ADN nucleares se pintaron en amarillo y rojo para diferenciarlos. La fusin de las membranas permite la obtencin de una clula con dos ncleos. Cuando se produce la mitosis algunas de las clulas hijas van a heredar los cromosomas de ambos padres, estos son los hibridomas.

Clulas de mieloma. Una clula B, como cualquier clula del organismo, puede convertirse en cancerosa, cuando esto ocurre la proliferacin de un cultivo de estas clulas invitro se mantiene por perodos prolongados, casi para siempre, a menos que alguna razn accidental lo impida. Khler y Milstein para salvar el escollo de la vida efmera de las clulas B en cultivo tuvieron la idea de fusionarlas con clulas de un mieloma. De este modo combinaron el potencial de crecimiento ilimitado con la especificidad de un anticuerpo producido por clulas normales B presentes en el bazo de un ratn inmunizado. Esta tcnica se conoce con el nombre de hibridizacin de clulas somticas que da lugar a un hibridoma. El procedimiento se detalla en el dibujo siguiente. Se inmuniza un ratn con un antgeno, al cabo de un tiempo se sacrifica, se extrae el bazo, se separan las clulas y se cultivan in-vitro en placas de plstico u otro material apropiado (circulitos rojos). Se dispone de un cultivo de clulas de un mieloma (circulitos azules) y se procede a fusionar ambos cultivos.

Anticuerpos monoclonales Ahora hay que seleccionar los clones que sean hibridomas (1) y esto no es tan simple como hacer pur de papas. Las clulas de mieloma que eligieron los investigadores perdieron la capacidad para sintetizar la enzima hipoxantinaguanina-fosforribosil-transferasa. (HGPRT). Por eso son HGPRT- (negativas para HGPRT) (ver dibujo) y a raz de ello se cultivan en un medio especial llamado HAT ( contiene hipoxantina/ aminopterina/ timidina) porque la enzima de la que carecen las clulas sintetiza purinas utilizando como fuente precursora a la hipoxantina. La ausencia de la enzima no perjudica el crecimiento de estas clulas de mieloma ya que en ausencia de la enzima utilizan un camino metablico alternativo para sintetizar purinas. Sin embargo, la presencia de aminopterina en el medio HAT anula la posibilidad de sobrevida y hay una total dependencia del compuesto (HGPRT). Qu va a ocurrir despus de la fusin y cultivo en medio carente de HGPRT? Las clulas de mieloma no fusionadas no pueden crecer porque carecen de la enzima HGPRT, las clulas provenientes del bazo no pueden multiplicar porque tienen una vida corta en cultivo. Slo van a persistir los hibridomas porque tienen la enzima HGPRT heredada de las clulas del bazo y las de mieloma aportan la inmortalidad. En el paso 2 se prueban los sobrenadantes por la presencia de los anticuerpos deseados. Debido a que los cultivos iniciales de hibridomas se pudieron haber iniciado con ms de un clon es necesario clonar nuevamente los cultivos productores de anticuerpos y subcultivarlos (paso 3). En el paso (4) se testean los cultivos por la presencia de anticuerpos y dado que las clulas productoras constituyen un clon los anticuerpos son monoclonales lo que significa que cada cultivo secreta una sola clase de molcula de anticuerpo dirigida a un solo determinante antgnico de un antgeno preseleccionado. A continuacin (paso 5) se realiza un escalamiento (cultivo mayor) de los

hibridomas, que cultivados apropiadamente, se mantendrn para siempre ya sea in-vitro con un rendimiento de 10-60 mg/ml o in-vivo en un ratn en el que la concentracin de anticuerpo en el suero puede alcanzar valores de 1-10 mg /ml. Sin embargo, hay que tener en cuenta que hay un movimiento mundial tendiente a no utilizar animales en investigacin que combate activamente el uso de ratones. Tecnologa de la produccin de anticuerpos monoclonales (AbM) y aplicaciones. Como vimos el primer paso para producir AbM es inmunizar a un ratn con un antgeno. Cuando el ratn comienza a producir anticuerpos contra el antgeno se le remueve el bazo. Luego se fusionan las clulas del bazo con clulas de una lnea de mieloma que no sea productora de anticuerpos y que se mantenga en cultivo. La nueva lnea celular proveniente de la fusin que s produce anticuerpos se inyecta en el peritoneo de otro ratn y el fluido asctico que contiene los anticuerpos se cosecha. Entre los factores que afectan la pureza del antgeno se encuentran la edad, el sexo del ratn y la tolerancia inmunolgica de cada animal y otros factores que afectan la produccin, por eso se estila utilizar adyuvantes para estimular la respuesta inflamatoria. Test de ELISA y aplicaciones. Este ensayo biolgico descripto en el captulo 9 fue desarrollado por Engvall y Perlman en 1971. En este ensayo con anticuerpos monoclonales stos se pegan a la superficie de la placa plstica. La presencia de este anticuerpo se detecta mediante el uso de un anticuerpo policlonal unido a un producto coloreado, si el test es positivo para el monoclonal aparece el color. Los usos comerciales de estos ELISA son de gran demanda as por ejemplo: el test o prueba de embarazo consiste en un anticuerpo monoclonal preparado contra una protena presente en la orina de mujeres embarazadas. A esto podemos agregar tests para diabetes, para la presencia de antibiticos residuales en la leche y otros. Otras aplicaciones, no tan universales como las que se han descripto, es utilizar los anticuerpos monoclonales como proyectiles dirigidos a los receptores de la membrana de las clulas cancergenos, asociados a sustancias radiactivas para matar las clulas. Nos queda recorrer un solo tema, la humanizacin de los anticuerpos monoclonales, como estos anticuerpos se producen en el ratn puede que

administrados al hombre con fines teraputicos, su organismo los rechace, para eso se ha aplicado ingeniera gentica y se han unido regiones de los genes que codifican por la protena de mieloma humano con regiones de un anticuerpo de ratn. Pero la explicacin detallada de estas tcnicas no las consideraremos aqu. La tecnologa del ADN amerita la escritura de nuevos captulos. Glosario: adjuvante: una sustancia que ayuda a aumentar la respuesta antignica produciendo una inflamacin que retiene al antgeno en el sitio de inoculacin fluido asctico: lquido de caractersticas similares al suero que se acumula por extravasacin en la cavidad peritoneal del abdomen. hipoxantina: derivado natural de una purina raramente se la puede encontrar formando parte de la cadena de ADN. mieloma: tumor de clulas B que se origina en la mdula sea. purina: compuestos orgnicos aromticos heterocclicos que forman los cidos nucleicos. En el ADN existen dos bases purnicas que son la adenina y la guanina. secretar: segregar.