Universidad Santo Toms Facultad de Ciencias de la Salud

Stem cell:

Prof. Jos Daz G

Valentin Hcker's 1892 Stammbame Stammzelle

Artur Pappenheim's 1905

Ensayo CFU-S
CFU-S8 CFU-S12

LTRA
Lung

Esophagus

Stomach

Colon

Bile duct cyst

skin Krause D et al Cell 105: 369-377, 2001

Plasticidad de CT

Clula troncal

Tejido convencional que forma

Clulas sanguneas

Tejido no convencional que puede formar

Nervioso, epitelial heptico y muscular esqueltico cardiaco

Hematopoytica

Neuronal

Nervioso

Sangre y msculo

Muscular

Muscular

Nervioso y Sangre

Mesenquimtica

Oseo, cartlago, adiposo, Estroma hematopoytico,

Musculo, nervioso, pulmn renal

Zuk et al. Tissue Engineering 7 : 211-228, 2001

Definicin conceptual (CT-CTH)

Poblacin celular que reside en la (MO) de un individuo adulto y que es responsable del origen de todas las clulas (sanguneas maduras)
Multi-potencialidad Potencial de diferenciacin amplio Dogma-Plasticidad

Wagers y Weissman, Cell 116:639, 2004

Currently Available Methods to Generate Pluripotent Stem Cells from Adult Somatic or Germ Cells

Cell Stem Cell 1, July 2007

HSCs maintain self-renewing fate with reduced differentiation in response to purified Wnt3a

Fuchs Cell 116: 76-778, 2004 Alonso Genes Dev 17: 1189-1200, 2003

Nature 423, 448-452 (22 May 2003)

-catenin promotes growth of HSCs in vitro and maintains the immature phenotype of HSCs in long-term cultures.

Cell cycle stem cell

S/G2/M

S/G2/M

Nmero de clulas

Nature 423, 409-414(22 May 2003)

Cantidad de DNA/clula

Definicin conceptual (CT-CTH)

glycogen-synthase kinase 3beta

Multi-potencialidad Potencial de diferenciacin amplio Dogma-Plasticidad Auto-renovacin Proliferacin

Reguladores del ciclo celular

p15

G2
p16 p18 p19

G02

M
cdk2
PO4

Cdk4,6

Diferenciacin

Muerte

ciclina B

G2
E2F PO4 PO4

Rb
E2F PO4

ciclina D

G1
Cdk2 p27 p21 p53

G1

G01

Rb cdk2
PO4 PO4

ciclina E

ciclina A

Definicin conceptual (CT-CTH)

Divisin de CTH

Multi-potencialidad Potencial de diferenciacin amplio Dogma-Plasticidad Auto-renovacin Proliferacin Quiescentes G0

Frecuencia CTH 1/10.000 (pool) Generacin de clulas sanguneas a partir del pool de CTH sin variacin del pool.

Divisin de CTH asimtrica

Gen notch

Divisin de CTH simtrica

Clulas Troncales Hematopoyticas

Estudio CTH

Stem cell pool (autorenovacin-Diferenciacin)

Long-term reconstituting LT-HSC Short-term reconstituting ST-HSC Clulas con baja capacidad de autorenovacin y con potencial de diferenciacin a un solo linaje

Estudios in vivo e in vitro permiten poner de manifiesto la propiedad de las CTH para diferenciarse a clulas maduras e inmaduras hematopoyticas.
In vitro: miden actividad de las clulas maduras CFU-C high proliferative potential colony-forming-cell HPPCFC In vivo: miden actividad de clulas mas primitivas injerto o transplante----progenie LTRA

Ensayos in vitro

Cultivo independiente de estroma

Ensayo de UFC-C (cultivo)
Detecta el crecimiento de clulas hacia una poblacin mas madura, comprometida al linaje eritroide o mieloide. Las colonias se desarrollan entre el 5to-14to da Medio de cultivo semislido Factores de crecimiento (1 o ms) S la clula posee la capacidad de multilinaje y alto potencial proliferativo en cultivo HPP-CFC (high proliferative potencial colony-forming-cell) Colonias > 5 mm de diametro Varias clulas de la linea mieloide

Ensayos in vitro

Ensayos in vivo

Cultivo dependiente de estroma

Ensayo LTC-IC long term culture initiating cell
Cultivo dependiente del estroma por largos periodos de tiempo Clulas primitivas cultivadas sobre una capa de clulas estromales progiene en 12 semanas de cultivo Se debe remover semanalmente para evitar su sobrecrecimiento auto-renovacion.

Ensayo CFU-S
Colony-forming unit-spleen assay Till y McCulloch

Ensayo LTRA
Ensayo de repoblacin por largos periodos de tiempo
Long term repopulation assay

Obtencin de CTH

Obtencin de Sangre perifrica

De Mdula Osea
Mximo 15ml/kg donante Clulas nucleadas 2- 4x108/Kg paciente CD 34+ 3x106/Kg paciente

Movilizacin
G-CSF 5-18 mcg/kg c/24 hrs (citoquinas o quimioterapias) Da +4 (3-7) si CD34+ >5000 x mm3, afresis da +5

Afresis
3 volemias CD 34+ > 2,5 x106/kg

Aislamiento e identificacin de CTH

Separacin por densidad y tamao

Ensayos de velocidad de sedimentacin y centrifugacin por gradientes de equilibrio
7,3-9,2 m de diametro proliferantes 7,0 m de diametro las no proliferantes Vinblastina o 5-FU

CD34 CD38 HLA-Dr Thy-1 Lin

+ + -

FACS fluorescence-activated cell sorter

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Posibles usos teraputicos de CT Criopreservacin

Clulas troncales
Neuronal Cardiacas Productoras de insulina Hematopoyticas Mesenquimticas Hepticas Epiteliales Retina Dentales Sangre de Cordn

Patologas posibles de tratar

Parkinson, Alzheimer, esclerosis mltiple IAM, ICC Diabetes Cncer, inmunodeficiencias, leucemias, hemopatologas hereditarias Osteoartritis, distrofia muscular, osteoporosis Hepatitis, Cirrosis Quemaduras, cicatrizaciones, implantes Degeneracin de la mcula Estructuras dentales Leucemias

Tcnicas para conservar tejidos vivos a bajas temperaturas.

1949. Glicerol como crioprotector. 1951. Clulas madre en sangre perifrica en ratones 1964. Progenitores SP en humanos 1977. Primer transplante de Progenitores SP en perros 1986. Primer transplante de Progenitores SP y criopreservacin en humanos 1993. Con seleccin de clulas CD34+

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Causas de dao celular por congelacin Nucleacin

Dao mecnico por formacin de hielo intray extracelular. Dao mecnico por expansin trmica. Hiperosmolaridad extracelular y deshidratacin. Cambios en el pH. Desnaturalizacin de protenas.

Teora de la congelacin
Propiedad coligativa de los solutos.

Solucin eutctica (con menor punto de congelacin).

0C 0C

Solucin superenfriada. Centros de nucleacin de hielo.

0C 0C

Solucin eutctica con ms solutos segregados (an con menor punto de congelacin).

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Lesin por congelacin

Dao osmtico deshidratacin
Espacio extracelular normosmtico. Salida de agua intracelular.

Lesin por congelacin

Dao mecnico
Centros de nucleacin de hielo intracelulares.

0C

0C

Clula normosmolar.

Clula

Clula deshidratada.

Centros de nucleacin de hielo. Clula destruida. Espacio extracelular hiperosmolar.

Centros de nucleacin de hielo.

Crioproteccin
Mecanismo coligativo
Espacio extracelular normosmtico.

Crioproteccin
Mecanismo de la envoltura cristalina
Espacio extracelular normosmtico.

Molcula de DMSO.

Molcula de HES.

0C

0C

Clula sangunea. Clula Centros de nucleacin de hielo. Espacio extracelular ligeramente hiperosmolar. Clula sangunea con ligera deshidratacin. Espacio extracelular hiperosmolar. Envoltura cristalina de HES. Centros de nucleacin de hielo.

Clula con poco estrs osmtico.

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Crioprotectores ms utilizados
Glicerol. DMSO (dimetilsulfxido). Soluciones salino/glucosadas. Protenas. HES (hidroxietilalmidn)

Propiedades de los crioprotectores

No debe ser txico para las clulas a las concentraciones requeridas para la criopreservacin. La concentracin de los crioprotectores depender de la tolerancia de la clula al crioprotector. Debe de ser eliminable antes de la infusin o inocuo para el paciente.

Crioprotector
DMS y Glicerol

Crioprotector
Soluciones salino glucosadas

Crioprotectores coligativos previenen la deshidratacin y disminuyendo la cantidad de agua absorbida por los cristales de hielo. El DMSO es ligeramente txico. Actualmente se utiliza DMSO al 5% con HES al 6% y albmina srica humana al 4%.

Glucosa, manitol y sorbitol a concentraciones mayores de 0.1 molar Estabilizan la membrana celular durante la congelacin o deshidratacin. La glucosa protege contra la citotoxicidad celular a altas concentraciones de DMSO.

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Crioprotector
Protenas

Crioprotector
Hidroxietilalmidn HES

Aumentan la supervivencia de las clulas cuando se agregan a la solucin crioprotectora. Modifican la viscosidad y la temperatura de la transicin hialina de la solucin crioprotectora. La fuente puede ser autloga.

Sustancia polimrica con cadenas de diferentes pesos moleculares que no penetra la clula de forma libre. Protege a la clula formando una capa viscosa y hialina que retarda el movimiento de agua.

Almacenamiento
Congeladores mecnicos -120C a -86C. Congelador de nitrgeno lquido -196C a -142C.

Velocidad de congelacin.
Controlada
DMSO al 10 %. Concentracin celular 50x106/ml. Velocidad inicial de -1C/min. En -40C incrementar a -10C/min. En -80C colocar en la fase gaseosa de nitrgeno lquido hasta 146C.

Almacenamiento de clulas criopreservadas es en bolsas de plstico de PVC/poliolefin y en frascos de polietileno. Las bolsas se colocan en cassettes de aluminio.

No controlada
DMSO al 5 % con HES al 6 %. Concentracin celular de 109/ml. Colocan en bolsas de almacenamiento en un congelador mecnico a -80C. En los -80C incrementar a 10-16C/min la velocidad hasta 146C. Almacenar en la fase gaseosa de nitrgeno lquido.

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Descongelamiento
Descongelamiento rpido.
Velocidad >100C/min a 37C en bao Mara.

Control de calidad criopreservacin

Recuento de CD34 Recuento viabilidad Cultivos CFU

Se tiene mejor tasa de supervivencia celular con descongelamiento rpido (>100C/min) que con descongelamiento lento (<5C/min).

Afresis. Seleccin celular. Movilizacin. Criopreservacin.

Material complementario
Hematimetra Normal Lecturas complementarias
Edward A Copelan, Hematopoietic Stem-Cell transplantation N Engl J Med 2006; 354:1813-26 Perea J, Cien aos del colorante Giemsa Revista Biomdica 2003; 23: 5-18 Watson J, The Purdue University Cytometry Laboratories Vol 4, Detection Of Small Abnormal Population. Cases in Flow Citometry 25 Patient HG

Mieloestimulacin.

Quimioterapia y/o radioterapia.

Infusin. Dilucin y lavado.

Descongelamiento.

Protocolo de obtencin de progenitores hematopoyticos en sangre de cordn umbilical. Protocolo de recoleccin de stem cell perifrico.

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Buffer para la preparacin de la Tincin May Grnwald -Giemsa.

Realizar los clculos para un buffer fosfato con las siguientes caractersticas. pH 7,2 = 0.1
A partir de:
HNa2PO4 anhidro KH2PO4 anhidro

Calcule la cantidad en gramos necesaria de cada una de las sales para preparar 1 litro de Buffer.

Si requiere datos adicionales investigue. Es deseable que esta solucin tenga una osmolaridad fisiolgica 300 mOs, como se mide la osmolaridad de las soluciones? Entregar los clculos y respuesta a la pregunta el da lunes 18 de agosto antes de iniciar el laboratorio.

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