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Introduo
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pigmento! No caso, houve o inesperado silenciamento do transgene e do gene endgeno das clulas dessas flores. O mecanismo molecular que levava ao silenciamento gnico permaneceu desconhecido por alguns anos, at que, trabalhando com o verme nematoide Caenorhabditis elegans, os grupos dos pesquisadores americanos Andrew Z. Fire e Craig C. Mello descobriram que molculas de RNA dupla fita (RNAdf) poderiam silenciar a expresso de genes (Fire et al., 1998). Os experimentos realizados para essa descoberta so extremamente simples: ao analisarem o efeito de silenciamento gnico de molculas de RNA simples fita antissenso e tambm senso (em relao ao sentido da molcula do RNA mensageiro do gene-alvo), os pesquisadores descobriram que o uso da molcula dupla fita tinha um efeito cem vezes maior. Pela capacidade do RNAdf de interferir na expresso gentica, o mecanismo comeou a ser chamado de RNA interferncia ou simplesmente RNAi.
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do RNA-guia e do RNAm, e normalmente ocorre na regio 3 no traduzida (3UTR), resultando no silenciamento do RNAm-alvo, seja por degradao desse, seja pelo bloqueio da traduo em protenas. No caso de bloqueio de traduo, a complementaridade no necessita ser completa, o que indica que um nico miRNA pode regular centenas de genes, e cada gene-alvo pode ser regulado por mltiplos miRNA, demonstrando a complexidade dessa rede de regulao gnica. A Figura 1 apresenta um esquema que descreve de forma simplificada como funciona o mecanismo de RNA interferncia (para uma reviso, ver Liu, 2008).
Figura 1 Ao de RNA interferncia em clulas animais. A) Esquema do mecanismo de RNA interferncia, indicando as principais protenas/complexos proteicos envolvidos; B) esquema mostrando como podemos empregar esses mecanismos para provocar silenciamento de genes de forma dirigida, com duplexes de RNA (siRNA), ou vetores virais ou no para expresso de shRNA.
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A descoberta do processo de regulao gnica atravs de RNA interferncia revolucionou tambm a forma como se estuda o papel de genes especficos na biologia. O uso de molculas de RNAdf exgenas como ferramenta pode reduzir a expresso de genes especficos (efeito conhecido como knock-down), de forma que as alteraes causadas por essa estratgia possibilitam avaliar quais funes esse gene desempenha na clula. Nesses experimentos, a sequncia da molcula de RNAdf definida pelo pesquisador para interferir no seu genealvo preferido. Essa estratgia tambm pode ser usada diretamente in vivo (em animais ou mesmo em humanos), e da a possibilidade de desenvolvimento de frmacos (Tiemann & Rossi, 2009). Basicamente, duas abordagens distintas podem ser usadas. Na primeira, vetores genticos, em geral derivados de vrus (como adenovrus, retrovrus ou vrus adenoassociados), so transduzidos nas clulas, de modo a expressar genes que so transcritos em molculas de RNAdf na forma de grampo (similares aos miRNA). Essas molculas so conhecidas como shRNA (do ingls short hairpin RnA) e tm como alvo o gene que se deseja silenciar. O shRNA clivado pela protena Drosha e assim processado pela maquinaria de RNA interferncia celular. Apesar de esse tipo de abordagem requerer a produo de vetores virais, o que no um processo simples do ponto de vista de produo de frmacos, ainda assim, como veremos adiante, h algumas estratgias teraputicas que esto sendo testadas, como protocolos clnicos em humanos, empregando vetores que expressam shRNA. Em uma segunda abordagem, pequenas molculas de RNAdf podem ser introduzidas diretamente nas clulas em cultura, visando degradao especfica do gene-alvo. Essas molculas so conhecidas como siRNA (small interfering RnA) e podem ser introduzidas na clula, por vrios tipos de metodologias, para o silenciamento de seu gene-alvo. Atualmente, vrias empresas de biotecnologia oferecem molculas de siRNA, para qualquer gene humano (ou camundongo) que o pesquisador pretenda silenciar. Uma caracterstica importante o tamanho da duplex que deve ter de 19 a 30 pares de base, uma vez que tamanhos maiores podem induzir respostas interferon inespecficas em clulas animais. Em cultura de clulas, a introduo de molculas de siRNA , em geral, feita atravs da formao de complexos dessas duplexes com polmeros qumicos ou lipdeos, normalmente catinicos. O complexo endocitado pelas clulas e as duplexes de RNA so liberadas no citoplasma, sendo processadas pela maquinaria de RNA interferncia, promovendo o silenciamento do gene-alvo. A utilizao de siRNA tem sido largamente empregada em estudos de genmica funcional e em distintos testes clnicos em razo do silenciamento gnico especfico e robusto induzido por essas molculas. A fcil manipulao e a existncia de sequncias de siRNA para qualquer gene do genoma humano tornaram acessvel o uso dessa ferramenta por diferentes grupos de pesquisa bsica e aplicada.
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Figura 2 Principais vias utilizadas para silenciamento gnico atravs de ao direta em protocolos humanos com RNA interferncia.
por injeo intraocular garante um efeito direto nesse rgo, com a vantagem de o olho ser um compartimento de tamanho limitado, o que possibilita o uso de poucas molculas, que ainda so efetivas no silenciamento gnico. Tambm tem tido muito sucesso o emprego de aplicao de duplexes de RNA atravs de inalao quando o alvo so as vias areas. Alm disso, molculas de siRNA tm sido aplicadas diretamente na pele, o que possibilita um alcance em vrios pontos do organismo, ainda que preferencialmente em tecidos mais superficiais. Em geral, essas aplicaes in vivo utilizam, como em cultura de clulas, complexos com polmeros ou lipdeos (poliplexos ou lipossomos) que constituem as nanopartculas que so endocitadas para interiorizao das duplexes nas clulas. Curiosamente, no entanto, em vrias aplicaes, solues salinas de siRNA so diretamente usadas e essas ainda so eficientes, promovendo o silenciamento do gene-alvo no organismo. Entretanto, bastante provvel que, em muitos desses casos, o uso das nanopartculas melhore a eficincia do frmaco. Nos casos de shRNA, em geral so empregados vetores genticos derivados de vrus para sua expresso nas clulas. Como em outros procedimentos de terapia gnica, alguns dos casos so diretamente aplicados in vivo (por aplicao intravenosa, por exemplo), mas tambm h casos de aplicao ex vivo, que permite a modificao de clulas-tronco do prprio organismo com o vetor que expressa o shRNA (e promove o silenciamento do gene-alvo). Posteriormente, a clula modificada reintroduzida no organismo, de modo a obter o benefcio teraputico.
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lentivrus, so capazes de se integrar permanentemente no genoma das clulas, as quais so ento reimplantadas nos pacientes. Esse processo de transplante autlogo produz clulas (e principalmente linfcitos T4, alvo do vrus HIV) resistentes aos vrus, o que permite a recuperao do paciente. Dados tm sido promissores indicando que, mesmo dezoito meses aps incio da terapia, as clulas implantadas continuam a expressar o shRNA (Singh & Gaur, 2009). Alm dos protocolos clnicos citados aqui, a tecnologia de RNA interferncia ainda est sendo empregada em protocolos clnicos para outras doenas, como hepatite B, diferentes tipos de tumores (incluindo melanoma), hipercolesterolemia, injria renal aguda etc. Vrios so os genes-alvo testados para combate o cncer: oncogenes, mediadores de ciclo celular e apoptose, genes envolvidos em degradao e estabilidade proteica, angiognese, molculas relacionadas invaso metasttica e adeso celular. Alm disso, nossa proposta o uso de siRNA como coadjuvantes nos tratamentos teraputicos com radiao ionizante e agentes quimioterpicos. Para tanto, estamos testando o silenciamento de genes-alvo como aqueles que codificam protenas antiapoptticas, de multirresistncia a drogas e mesmo envolvidas no reparo de DNA. Certamente, pelo nmero de testes pr-clnicos que esto sendo realizados, a lista de doenas-alvo a serem testadas diretamente em humanos, empregando diferentes estratgias de uso de RNA interferncia, dever ser bastante ampliada.
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do mundo inteiro. Pequenas empresas montadas por pesquisadores esto sendo adquiridas por empresas multinacionais, que esto investindo bilhes em pesquisas de desenvolvimento, acreditando que as drogas e estratgias desenvolvidas com a abordagem de RNA interferncia possam ter sucesso no s para doenas especficas, como tambm criem modelos para outras doenas. Esses investimentos tm sido to flagrantes que parecem uma nova corrida do ouro no uso do conhecimento adquirido com dcadas de estudo do genoma humano, na elaborao de novos frmacos. Entretanto, a aplicao de terapia baseada em RNA interferncia deve ser analisada com cautela, visto que ainda requer intenso trabalho de pesquisa em todo o processo de elaborao de protocolos teraputicos. O Brasil continua incipiente nesses estudos, de modo que apenas alguns grupos de pesquisa, nas universidades, tm o domnio da tecnologia para uso de RNA interferncia. Um nmero ainda menor est envolvido diretamente no desenvolvimento de tecnologias novas empregando essa abordagem. Se esse verdadeiro silenciamento intelectual continuar na rea, teremos que pagar caro pelas patentes e pelo uso dos novos medicamentos que muito provavelmente nos sero vendidos nas prximas dcadas.
Referncias
de vInCenZo, J. et al. a randomized, double-blind, placebo-controlled study of an Rnai-based therapy directed against respiratory syncytial virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.107, p.8800-5, 2010. eLBasHIR, s. M. et al. duplexes of 21-nucleotide Rnas mediate Rna interference in cultured mammalian cells. Nature, v.41, p.494-8, 2001. FIRe, a. et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded Rna in Caenorhabditis elegans. Nature, v.391, p.806-11, 1998. HuBsCHMan, J. P. et al. age-related macular degeneration: experimental and emerging treatments. Clin. Ophthalmol., v.3, p.167-74, 2009. LIu, J. Control of protein synthesis and mRna degradation by microRnas. Curr. Opin. Cell Biol., v.20, p.214-21, 2008. sInGH, s. K.; GauR, R. K. Progress towards therapeutic application of Rna interference for HIv infection. BioDrugs, v.23, p.269-76, 2009. tIeMann, K.; RossI, J. J. Rnai-based therapeutics-current status, challenges and prospects. EMBO Mol. Med., v.1, p.142-51, 2009. a descoberta de que nossas clulas dispem de um mecanismo de silenciamento gnico empregando Rna interferncia ainda muito recente. apesar disso, em menos de uma dcada a investigao cientfica j alcanou progresso, suficiente para muito brevemente nos apropriarmos desse conhecimento com fins teraputicos. duplexes de Rna so potenciais frmacos e h investimentos altos nessa nova abordagem. aparentemente, a promessa de terapia gnica parece finalmente atingir sua maturidade com essas novas ferramentas.
resumo
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palavras-chave:
feco viral.
abstract
the discovery of gene silencing mechanisms in our own cells using Rna interference is very recent. However, in less than a decade, the scientific investigation have progressed enough to make us see that, very soon, we will use this knowledge for therapeutic purposes. Rna duplexes are potential pharmaceutical drugs and there are high investments in this new strategy. the promising gene therapy seems to finally reach maturity with these new tools.
Rna interference, Gene silencing, Cancer, Gene therapy, viral infection.
keywords:
Carlos Frederico Martins Menck professor do departamento de Microbiologia do Instituto de Cincias Biomdicas (ICB) da universidade de so Paulo. @ cfmmenck@usp.br Recebido em 21.9.2010 e aceito em 27.9.2010.
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