UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CINCIAS AGRRIAS CURSO DE AGRONOMIA DISCIPLINA: BIOTECNOLOGIA EXTRA O E AN LISE DE DNA VEGETAL1

Parte pr t ica

O DNA pode ser extrado de diferentes materiais, desde fsseis e amostras herbarizadas a tecidos frescos (exs.: razes, folhas, sementes, embries, endosperma, plen, cultura de calos ou de clulas em suspenso). Em linhas gerais, o objetivo de qualquer protocolo de extrao consiste em obter DNA de alta qualidade, em quantidade, de forma rpida e eficiente. Os protocolos de extrao devem evitar a degradao do DNA pelas DNAses, eliminar os polissacardeos que inibem a ao de enzimas, e eliminar as substncias fenlicas ou outros compostos secundrios que podem danificar o DNA. A extrao de DNA de boa qualidade de qualquer amostra de tecido vegetal um passo crucial para o desenvolvimento de qualquer tcnica de anlise direta da molcula de cido desoxirribonucleico, seja para seqenciamento, restrio enzimtica ou amplificao via PCR. Para o isolamento e purificao de cidos nucleicos, necessrio separ- los efetivamente dos outros constituintes celulares. No caso especial dos cidos nucleicos, tambm fundamental manter a integridade das molculas, que devem permanecer inalteradas durante o procedimento de extrao, pois as informaes contidas tanto no DNA quanto no RNA dependem da sua sequncia. Existem vrios mtodos descritos na literatura, e a escolha depende do balano entre a praticidade, qualidade requerida a finalidade de uso do cido nucleico. O processo de extrao de DNA vegetal consta inicialmente, do rompimento da parede celular e membranas celulares, liberando a molcula de DNA. O rompimento da parede celular e membranas celulares de grande quantidade de material pode ser feito por macerao aps o congelamento do tecido em nitrognio lquido ou diretamente no tampo de extrao em tubo de microcentrfuga, quando a quantidade de tecido pequena. Todavia, junto molcula de DNA, molculas de protenas, polissacardeos, RNA e outras so extradas. Para que o DNA possa ser considerado de boa qualidade, essas molculas devem ser eliminadas, utilizando tampes de extrao, que so compostos por elementos que as eliminam da amostra de DNA. Detergentes (CTAB, Sarcosil, SDS) so utilizados para auxiliar na liberao de componentes celulares por lise das membranas celulares. Juntamente com NaCl, esses detergentes ajudam na precipitao do DNA ao final do processo e reduzem a contaminao da amostra com polissacardeos.
1

Dra. Adriana Cibele de Mesquita Dantas, acmdantas@cca.ufsc.br

Para manter o pH em um valor que impea a ao das nucleases que degradem o DNA, utiliza-se um tampo especfico (geralmente Tris-Cl), para manter o pH em torno de 8,0. Tambm a adio de EDTA inibe a ao das DNAses, pois esse composto um quelante de ctions bivalentes, como o Mg+2 e o Ca+2 , que so cofatores das enzimas. A desnaturao de protenas e eliminao de polifenis oxidantes da molcula de DNA feita pela adio de 2- mercaptoetanol e polivinilpirrolidona (PVP) ou polivinilpolipirrolidona (PVPP),pois possuem efeito antioxidante, assim como a eliminao dos polissacardeos pela adio de PVP, PVPP ou soroalbumina bovina (BSA) e o RNA eliminado pela adio de RNAse. A adio de clorofrmio:lcool isoamlico 24:1 (CIA) promove a extrao de lipdios, protenas e polissacardeos, que so dissolvidos nesse solvente orgnico (inferior), enquanto o DNA permanece na fase aquosa (superior), fases estas separadas aps centrifugao. Essas duas fases so ento separadas por centrifugao e o sobrenadante contendo o DNA retirado do tubo. Alguns protocolos incorporam ainda fenol ou proteases (proteinase K) para facilitar a separao do DNA das protenas da cromatina. Recuperao dos cidos nucleicos totais por precipitao em lcool (isopropanol e/ou etanol) desidratam a molcula de DNA e na presena de NaCl permitem sua precipitao ao final do processo, formando um sedimento visvel na fase lquida do tubo. A eliminao do RNA obtida por digesto com RNAse, ou separao de RNA e DNA por solubilidade diferencial em sais. Sob condies de alta concentrao de sais (ex.: 7,5 M de Acetato de sdio), DNA e os RNA pequenos permanecem em soluo, enquanto que o RNA (> que 60 bases) precipita. Os cidos nucleicos so polinicos solveis em gua. Os sais de sdio e potssio de cidos nucleicos so insolveis na maioria dos solventes orgnicos, incluindo numa mistura de etanol e gua, mas eles no so desnaturados por solventes orgnicos. O detergente catinico CTAB solubiliza membranas celulares, e dependendo da concentrao de NaCl no tampo, CTAB forma um complexo com o DNA, e utilizado para precipitar DNA seletivamente. Para a anlise de DNA, com a utilizao da digesto por enzimas de restrio (ex. RFLP, AFLP), existe a necessidade obter-se DNA de boa qualidade. Contaminantes (polifenis, polissacardeos, etc.) interferem na atividade dessas enzimas, reduzindo a eficincia das mesmas. A contaminao por polissacardeos consiste na principal contaminao afetando a pureza do DNA extrado de plantas. Esses carbohidratos podem inibir a atividade de vrias enzimas usadas em manipulaes biolgicas de DNA, tais como ligases, polimerases e enzimas de restrio. A maioria dos mtodos de extrao empregados no separam eficientemente o DNA dos polissacardeos provavelmente devido a similaridade estrutural entre esses dois tipos de polmeros. A contaminao de polissacardeos depende da espcie, tecido, condies fisiolgicas da planta. Certas espcies

produzem um DNA muito contaminado por polissacardeo, tomando difcil a r ssuspenso do e pellet. (DNA precipitado). A maior parte dos protocolos de extrao disponveis derivam basicamente do mtodo descrito por Dellaporta et al. (1983) e aqueles que utilizam CTAB (brometo de hexadeciltetrametilamnio) (Doyle e Doyle, 1987, 1990) onde o DNA solvel sob altas concentraes de sal. Para maiores detalhes consultar Brasileiro e Carneiro (1998).

PROTOCOLO EMPREGADO: CTAB (DOYLE E DOYLE, 1987) Este protocolo mais utilizado em espcies vegetais, pois possibilita a extrao de DNA a partir de pequenas amostras de tecido, no exige preparao prvia do tecido e adaptvel a vrios tipos de materiais. O CTAB um detergente catinico (cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide) que solubiliza as membranas celulares, formando um complexo com o DNA, que facilita uma posterior precipitao diferencial desse complexo.

PROTOCOLO DE EXTRAO DE DNA VEGETAL (Doyle e Doyle, 1987) a) PREPARAO INICIAL: 1. Inicialmente prepare a soluo de extrao 2% CTAB. As solues a serem utilizadas durante a extrao, elas devem estar preparadas e disponveis (CIA 24:1, CTAB 10%, isopropanol, lcool 70% e absoluto, bem como tampo TE). 2. Ligue o banho maria, ajustando a temperatura para 60 C. 3. Calcule a quantidade de tampo necessria para o nmero de amostras, considerando que em cada amostras adiciona-se 800 ul de tampo. Adicione ao volume de tampo 2- mercaptoetanol, na proporo de 2 ? L por mL de tampo (Manter o tampo de extrao aquecido em placa aquecedora dentro da capela). 4. Coletar as amostras de fo lhas jovens e saudveis das plantas, evitando reas atacadas por pragas e doenas. De modo geral deve-se lavar as folhas em gua corrente, usando, sempre que necessrio gua sanitria e/ou sabo. Enxaguar, e em seguida rinsar em gua destilada, e secar em papel toalha. Esse material pode ser congelado, liofilizado, seco em estufa, ou usado diretamente, mantendo-as 4?C. 5. Pese aproximadamente 150 mg de tecido vegetal de cada amostra, ou 50 mg de folhas liofilizadas ou secas. Se estiver utilizando folhas corte-as o mais fino possvel, acondicione nos tubos eppendorf devidamente identificados, ou em cadinhos.

b) PROCEDIMENTO DE EXTRAO 1. Identificar cada amostra no lado e na tampa do tubo (utilizar caneta cuja tinta no saia com a gua e lcool) 2. Macerar o material vegetal com nitrognio lquido; OBS: Cuidado com o manuseio do N2 lquido pois a temperatura de 196 C e pode provocar queimaduras. 3. Adicionar 700 ? l de soluo de extrao e agitar os tubos para homogeneizao das amostras (executar esta operao dentro da capela, pois a soluo de extrao contm ? -mercaptoetanol, que possui um odor bastante desagradvel bastante txico). 4. Misturar nos tubos e incubar em banho-maria a 60C por 45 min 1 hora (homogeneizar as amostras a cada 15 min). 5. Adicionar de 600 ? l de clorofrmio:lcool isoamlico (CIA) (24:1,v/v) em cada amostra; (A adio de clorofrmio-lcool isoamlico (CIA) promove a extrao de lipdios, protenas e polissacardeos, que so dissolvidos nesse solvente orgnico, enquanto o DNA permanece na fase aquosa). 6. Agitar levemente os tubos por inverso at a formao de uma emulso; Cuidado para que os tubos estejam limpos de clorofrmio. 7. Centrifugar a 12.000 RPM por 5 min; Balancear os tubos na centrfuga antes de centrifugar. Ateno: o restante do material no fundo do tubo contm clorofrmio que um solvente orgnico muito forte, portanto no pode ser descartado no lixo comum. Deve ser armazenado em uma garrafa de vidro prpria para es te fim que se encontra no interior da capela. CUIDADO REDOBRADO: o Clorofrmio derrete alguns tipos de plsticos e acrlico. 8. Transferir a maior quantidade possvel da fase aquosa (sobrenadante) para um novo tubo (? 540 ? l); 9. Adicionar de 1/10 do volume de soluo de CTAB 10%, (deixado anteriormente em banho-maria para dissolver) misturando gentilmente por 5 min; 10. Repetir a extrao com 600 ? l de CIA (24:1); 11. Agitar levemente os tubos por inverso at a formao de uma emulso; 12. Centrifugao a 12000 RPM por 5 min; Balancear os tubos novamente. Retire a fase aquosa superior e transfira para um novo tubo. 13. Adio de 400 ? l de isopropanol a 20 C; 14. Incubar no freezer a 20 C para a precipitao do DNA;

As amostras permaneceram a -20 C por aproximadamente 30 minutos para completa precipitao. Essa uma etapa onde se pode interromper o procedimento caso no seja possvel continuar no mesmo dia. Pode ser necessrio deixar os tubos pelo menos por 1 h e 30 min no freezer, ou os tubos podem permanecer over night no freezer. 15. Centrifugar a 7.000 RPM por 5 min; O DNA precipitado centrifugado a 7.000 rpm, durante 5 minutos para formao do pellet. Aps descartar o sobrenadante, com cuidado de no perder o pellet 16. Descartar o sobrenadante; Virar o tubo com cuidado para no perder o pellet de DNA. Os tubos so colocados de cabea para baixo, sobre um papel absorvente e dentro da cmara de fluxo durante 5 minutos, sendo aps deitado sobre esta superfcie e mantido durante 15 minutos, para que o pellet seja seco. Para saber se esta seco, basta observar a ausncia de lcool, e a transparncia do pellet que antes era branco. 17. Lavar o pellet de DNA em etanol 70% por 5 min; 18. Lavar o pellet de DNA em 1 ml de 95% etanol absoluto por 3 min; 19. Deixar escorrer o tubo invertido por 5 a 10 min para sair todo o lcool; 20. Colocar os tubos na posio normal sobre a bancada pelo tempo que for necessrio para a evaporao de todo o lcool ou secar com a bomba de vcuo; (No mais que 30 minutos). 21. Solubilizar em TE + RNAse (10 ? g/ml de RNAse); Aproximadamente 50 ? l de TE por tubo (depende da quantidade de DNA presente no tubo). 22. Incubar em banho-maria por 30 min a 37 C ou deixar 24 h em bancada a temperatura ambiente; 23. Armazenar em freezer a 20 C.

SOLUO DE EXTRAO Reagentes 2,0% CTAB 1,4 M NaCl 20 mM EDTA (pH 8,0) 100 mM Tris-HCL (pH 8,0) 1,0% Polyvinylpyrrolidone Para 100 mL 2,0 g do produto 8,12 g do estoque 5M de NaCl 4 ml de soluo estoque 0,5M, pH 8,0 10 ml de soluo estoque 1M, pH 8,0 1g do produto

Adicionar a uma alquota do tampo a ser usado, pouco antes do uso: 0,2% 2-? -mercaptoethanol (50 ? g ml-1 de proteinas K) 2 ? L/ml de tampo

Etapa 1

Etapa 2

Etapa 3

Etapa 5

Etapa 4

ETAPA 1 MACERAR TECIDO ETAPA 2 FILTRAR, BANHO MARIA - CIA ETAPA 3 - PRECIPITAO COM LCOOL ETAPA 4 PESCAR PELLET ETAPA 5 QUANTIFICAO DNA ESTIMATIVA DE CONCENTRAO DE DNA A estimativa da concentrao de DNA depende do tipo e quantidade de amostra disponvel. Para amostras com certo grau de pureza, com baixo nvel de contaminao por protenas, fenis, polissacardeos, lcool, ou outros cidos nucleicos, a estimativa por espectofotmetro, medida pela absorbncia das bases a 260 nm consiste num mtodo simples, rpido e com certa preciso. Para quantificao de DNA, as leituras devem ser feitas entre 230 e 320 nm. A leitura A260nm permite o clculo da concentrao de cidos nuc leicos na amostra. Uma DO (densidade ptica) de 1 corresponde aproximadamente a 50 ? g ml-1 para oligonucleotdeos. A relao entre A260nm e A280nm (DO260 /DO280 ) fornece uma estimativa da pureza dos cidos nucleicos. Solues puras de DNA e RNA possuem valores de DO260 /DO280 de 1,8 e 2, respectivamente. Se

existe contaminao por fenis ou protenas, a relao DO ser muito menor, e preciso nas quantidades de cidos nucleicos ser baixa. O uso de protocolos de extrao de DNA simplificados, que utilizam pouco material de origem, ou possuem poucos passos de purificao, tendem a produzir cidos nucleicos com maior contaminao. Em plantas lenhosas, existe um grande problema de contaminao com polifenis e polissacardeos. Nesse casos, a estimativa por espectofotometria no permitem uma determinao acurada da concentrao de DNA. Nesse caso, o mtodo de escolha consiste na fluorometria. A amostra de DNA a ser estimada tratada com um corante especifico para DNA dupla fita (ex. Hoechst 33258), e esse corante excitado a um comprimento de onda (365 nm) e com emisso de 460 nm proporcional a concentrao de DNA. RNA, protenas e nucleotdeos no afetam as leituras. Outros mtodos empregados utilizam a caracterstica da fluorescncia em ultravioleta induzida pela intercalao de brometo de etdeo na dupla fita de DNA. A fluorescncia proporcional a concentrao de DNA, e pode-se determinar a quantidade de DNA numa mostra por padres conhecidos em gel de agarose. A comparao de fluorescncia pode ser feita num mini- gel, que permite tambm a separao de DNA do RNA.

GEL DE ELETRORESE

A eletroforese em gel permite a resoluo de cidos nucleicos, e possui um importante papel analtico, e as vezes um pape preparativo. A matriz de separao usada normalmente agarose. Outra possibilidade o gel de poliacrilamida, usada normalmente para a separao de molculas de baixo peso molecular. O poder de resoluo da poliacrilamida permite a deteco de diferenas de tamanho de at um par de bases, comumente usada em g is de sequenciamento e microssatlites. Os gis podem ser nativos (sem tratamento) ou desnaturantes (com a adio da uria, formamida, etc.) para evitar a formao de estruturas secundrias, evitando a interferncia na mobilidade atravs do gel. Os cidos nucleicos migram com base nas diferenas de peso molecular e estrutura tridimensional (conformao espacial). De modo geral, todos os cidos nucleicos possuem aproximadamente uma densidade de carga por base, e a conformao de molcula em geral semelhante. Portanto, a dificuldade de penetrao no gel proporcional ao peso molecular.

PARMETROS QUE AFETAM A MOBILIDADE DO DNA EM GEL DE ELETROFORESE 1. Concentrao de agarose: com maior concentrao de agarose, a separao de fragmentos maiores reduzida. Menores concentraes facilitam a separao de fragmentos de maior peso molecular. A faixa de trabalho encontra-se entre 0,5% at 2% de agarose.

2. Gradiente de voltagem: expressa em V/cm. Consiste no ponto crtico na

separao de

fragmentos de DNA. Uma corrida em gel sob alto gradiente, reduz significativamente a separao de fragmentos de alto peso molecular, apesar de ser aceitvel us-lo para testar a qualidade de digesto (teste mais rpido). Entretanto, a separao tpica de digestes usando enzimas de restrio melhor conduzida a baixos gradientes (1 a 2 v/cm) por 12 horas. O problema consiste na difuso de fragmentos de baixo peso molecular (< 1Kb) e resultam em bandas menos distintas. Esses fatores devem ser considerados dependendo do uso e anlise. sempre recomendvel incluir padres de peso molecular em todos os gis.

Gel para eletroforese (padro 300 ml de TBE 1X) Gel (%) 0,8 1,5 3,0 Agarose (gramas) 2,4 4,5 9,0 Destinado para: Quantificao DNA Eletroforese de produtos de RAPD Eletroforese de produtos de SSR

COMO CALCULAR O VOLUME DE GEL?

3 - 5 mm

0,5 - 1,0 mm

LxHxC Largura da cuba x altura x comprimento. Calcular as distncias e a altura em que o gel cubra sobre o pente. A quantidade de agarose em gramas obtida atravs da concentrao do gel em %, multiplicado pelo volume de gel desejado:

EX : volume de 600 ml x 1,5% (eletroforese) = 9 gramas de agarose em 600 ml de TBE 1X.

C) QUANTIFICAO DO DNA 1. Prepare um gel de agarose 0,8%. Gel para quantificao 0,8% - (300ml) 300ml de TBE 1x + 2,4 g de agarose

Ferver no microondas at completa diluio

(durante a fervura mexa por algumas instantes, vrias vezes, para homogeneizar a soluo, cuidado pois se a soluo ferve, parte dela pode ser jogada para fora do frasco). Aps esfriar, adicionar na capela 60 ? L de Brometo de Etdeo. 2. Verter o gel na forma fechada nas extremidades e com pente em posio. 3. Remover as bolhas com ponteiras e esperar esfriar. 4. Enquanto isto, prepara-se as amostras de DNA a serem quantificadas: 5. Em superfcie plana, e seca, disponha um pedao de parafilme, sobre ele faa bolinhas de 2 ? L de tampo de carregamento, se o ambiente estiver muito seco ( ar condicionado ligado) acrescente 2 ? L de gua miliq autoclavada. 4. Para cada bolinha acrescente de 2 a 3 ? L de uma amostra de DNA extrado, sendo que devera reservar algumas para acrescer os padres para comparao (Fago lambda). 5. Transfira o material preparado para os poinho do gel, com cuidado. 6. Conectar os eletrodos fonte e ligar, submeta a corrida de baixa voltagem (60V). Durante aproximadamente 4 horas. Os cidos nucleicos encontram-se no pH do tampo TBE carregados negativamente e migram para o positivo correm para o vermelho! 7. Observar sob luz ultravioleta no transluminador. Observar a presena de rastros indicadores de RNA; formao de banda simples de DNA; comparar a intensidade das bandas das amostras com a dos padres. Observar a presena de degradao e/ou contaminao nas amostras. 8. Aps a quantificao, o DNA diludo (segue em anexo os clculos para diluio) em H O 2 autoclavada, para uma concentrao aproximada de 3 ng/? l e requantificado com eletroforese em gel de agarose 0,8%.

MTODO MINIGEL

Aplicar DNA - 2 ? L

Aplicar TC - 3 ? L

Carregamento em gel de agarose 0,8%

Amostras padro (20; 50; 100; 200 ng /? L)

Amostras de DNA

COMPARAR A INTENSIDADE DE FLUORESCNCIA DA AMOSTRA PADRO E ESTIMAR A QUANTIDADE DE DNA DA AMOSTRA

Amostras padro (50; 100; 200 ng/? L)

Amostras de DNA

bandas 50 100 200 1 2 3 4 5

Estimativa ( ng/? L) Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Amostra 4 Amostra 5 300 50 50 - 100 mais de 300 200

CLCULOS PARA DILUIO DO DNA APS QUANTIFICAO: 1) Calcular as diluies de DNA Os valore obtidos na leitura do gGel devem ser divididos pela quantidade pipetada, na quantificao. Para o clculo ainda tomando como base: C1. V1 = C2 . V2 onde C1 ser o valor obtido na primeiro passo, V1 a incgnita, C2 a concentrao desejada e V2 o volume desejado. EX= Leitura de 150ng, sendo que foram pipetado 3ul no gel temos 50ng/ul. Considerando 3ng a concentrao final desejada e 500 ul o volume temos, 50 . V1 = 3 . 500 V1 = 1500/50 V1 = 30ul Sero pipetados 30ul de DNA da soluo estoque, em 470 de gua miliq autoclavada. Se o valor obtido em V1 for superior ao volume de DNA estoque, faa o seguinte clculo: V1 -500 x pelo volume de estoque / pelo V1. EX = onde o V1 encontrado 60 ? L e o volume de estoque (descontando o volume pipetado para a quantificao) 48. 60 -500 x 48 /60 = 352ul de gua para 48 ? L de DNA estoque, finalizando concentrao de 3 ng/? L.

BIBLIOGRAFIAS RECOMENDADAS DELLAPORTA, S.L.; WOOD, J.; HICKS, J.B. 1983. A plant DNA minipreparation: version II. Plant Molecular Biology Reporter 1:19-21. DOYLE, J.J.T. E J.L. DOYLE. 1987. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12:13-15. FANG, G.; HAMMAR, S.; GRUMER, R. A quick and expressive method for removing polysaccharides from plant genomic DNA. Bioetchniques, v. 13, p. 52-54, 1992. HATTORI, J.; GOTTLOB-MCHUGH, S.G.; JOHNSON, D.A. The isolation of high- molecularweight DNA from plants. Analytical Biochemistry, v. 165, p. 70-74, 1987. MURRAY, M.G.; THOMPSON, W.F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleics Acids Research, v. 8, n. 19, p. 4321-4325, 1980. ROGERS, S.O.; BENDICH, A.J. Extraction of DNA from miligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues. Plant Molecular Biology, v. 5, p. 69-76, 1985. SAMBROOK, J.; FRITSCH, E. F.; MANIATIS, T. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2 ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989. STRAND A.E., J. LEEBENS-MACK E B.G. MILLIGAN. 1997. Nuclear DNA-based markers for plant evolutionary biology. Molecular Ecology 6:113-118.
SHILITO, R.D., SAUL, M.W. Protoplast isolation and transformation In: Shaw, C.H.. Plant molecular biology a pratical approach, IRL PRESS, p.181, 1988.