MARCADORES GENETICOS Los marcadores genticos se definen como cualquier diferencia fenotpica controlada genticamente y utilizada en hacer anlisis

gentico. El gen por otra parte es una estructura especfica, operacionalmente particulada, definida linealmente por una secuencia ordenada de elementos que tienen la propiedad de autoduplicarse y transmitirse en el espacio y en el tiempo en forma casi invariable y determinar en el interior de la clula de produccin de protenas funcionales y estructurales que caracterizan la vida. Los genes son, por lo tanto, responsables de la vida de cualquier organismo. Estos conocimientos que forman parte de la Ciencia Gentica han sido y son utilizados en la prctica agropecuaria para mejorar animales y plantas con el objeto de obtener, a travs de seleccin, organismos con alto ndice de rendimiento, rusticidad y resistencia a enfermedades y/o condiciones ambientales extremas. Desde el punto de vista de la Salud o de la Produccin Pecuaria, sabemos que existen organismos con alto o con bajo rendimiento. Sabemos tambin que el esfuerzo de la Seleccin Animal est dirigido a encontrar genes o combinaciones de genes que generen organismos de alto rendimiento y que sean de ptima condicin. El problema radica en el 'como visualizar' los genes ptimos o adecuados para poderlos manejar y mediante cruzamientos dirigidos obtener los organismos esperados. Visualizamos los genes a travs de sus productos proteicos y cada vez que a travs de algn mtodo evidenciamos una protena estamos revelando el gen encargado de elaborarla.

Mtodos Los mtodos ms empleados para evidenciar protenas y/o glicoprotenas en los tejidos o en los lquidos orgnicos son las tcnicas inmunolgicas de: aglutinacin, precipitacin o lisis (aplicadas en grupos sanguneos y lectinas) o la electroforesis ( aplicada para visualizar y separar isoenzimas, seguida de tincin histoqumica); tcnicas que en la actualidad se consideran como mtodos de eleccin para revelar marcadores genticos que resultan de la actividad gnica. El estudio de los marcadores genticos tiene varias aplicaciones prcticas, entre las cuales es interesante analizar las siguientes: - Identificacin de los individuos desde el punto de vista genotpico. - Verificacin de parentezco. - Estudio y participacin en la definicin biolgica de las razas animales. Conocimiento del nivel de consanguinidad de un hato o un criadero. - Correlacin entre los genes revelados por los marcadores genticos y la resistencia y/o susceptibilidad a determinadas enfermedades. - Conocimiento de la estructura gentica de las poblaciones de animales silvestres que constituyen reservas genticas y que forman parte de nuestro patrimonio. Dada la importancia que Grupos Sanguneos, Lectinas e Isoenzimas tienen, la actividad de investigacin que en torno a ellos se hace se centraliza en una Sociedad Internacional de Grupos Sanguneos Animales (ISABR), la que normaliza y controla los reactivos que se elaboran. Adems edita una Revista: 'Animal Genetics' (previamente 'Animal Bloocis Groups and Biochemical Genetics') como el rgano oficial de la misma.

Grupos sanguneos Los Grupos Sanguneos son marcadores genticos ampliamente conocidos y se hacen evidentes en la membrana celular. Una gran cantidad de investigadores y publicaciones en el rea inmunolgica han llevado finalmente al concepto que la membrana plasmtica cumple, adems de sus mltiples funciones en la vida de la clula, con ser el sitio que evidencia en su superficie 'seales' caractersticas de cada individuo (individualidad biolgica, 'self'). Estas seales son glicoprotenas y/o lipoprotenas cuya estructura es consecuencia de la actividad de los genes del individuo. Debido a la variedad de estructuras encontradas, y segn el modelo de Singer y Nicholson se considera a la membrana plasmtica como formada por un mosaico de antgenos ('seales') que emergen en su superficie, evidenciando lo propio. Este concepto es fundamental para lo que nos preocupa porque permita formarse la idea que en la superficie celular emergen numerosos antgenos de morfologa diversa que son consecuencia de la actividad gnica, y que adems cada individuo tiene un mosaico particular, distinto al de cualquier otro individuo, excepto su gemelo. Un excelente ejemplo de la manera en que se elabora un antgeno o tambin en que forma se establece la relacin gen-estructura, lo constituyen los antgenos del Sistema ABO constituidos por oligosacridos de superficie unidos a glicolpidos de la membrana plasmtica. Estos oligosacridos son estructurados secuencialmente mediante glicosiltransferasas especficas, durante la biosntesis del antgeno, en una secuencia semejante a la de una va metablica, como se indica en la Figura N1.

Figura N1: Esquema de la relacin que existe entre los genes y una va metablica para la biosntesis de un antgeno de membrana. (A) Sustancia precursora; (B) Compuesto intermediario y (C) Producto final (antgeno). La relacin entre los genes de Grupos Sanguneos, sus productos y la sustancia de Grupos Sanguneos o antgeno, se muestra en la Figura N 2.

Figura N2: Relacin entre genes y grupos sanguneos del sistema ABO. Los genes h* O* son amorfos es decir, no tienen efecto detectable en el precursor. Un poco ms de detalle apreciamos en la Tabla N1, en que se observan tres sistemas genticos no ligados, y designados por ABO, Hh y Lewis que codifican para las enzimas (glicosiltransferasas) que determinan la estructura de estos sistemas. Para poner en evidencia estos antgenos se emplean anticuerpos naturales o inducidos, islogos o heterlogos. La presencia del antgeno se revela por aglutinacin, precipitacin o tisis. Mediante antisueros y cruzamientos dirigidos se han evidenciado los sistemas de Grupos Sanguneos que corresponden a los diversos productos de la actividad de genes que forman series allicas. Cada producto o antgeno se puede caracterizar a su vez por uno o ms anticuerpos (isotipos) dirigidos a identificar uno o ms factores (epitopos) que forman el antgeno. Este hecho le da a estos Sistemas una considerable complejidad. TABLA N 1 Sistemas genticos, alelos y productos gnicos responsables de las especificidades ABH y Lewis Azcar del que se G.S. agrega al precursor A

Sistema Gnico Alelos

Producto gen

ABO

IA

N Acetil D Galactosamina Gal Nac transferasa D galactosil D Gal. transferasa No hay producto gnico funcional L Fucosil Fucosa transferasa No hay producto gnico funcional L fucosil Fucosa transferasa No hay producto -

Hh Lewis -

IB i H h Le le

B O H Lewis -

gnicofuncional Para diagnosticar los antgenos se emplean antisueros y cruzamientos dirigidos que revelan segregacin y asociacin independiente cuando se evidencian sistemas. Los Grupos Sanguneos han sido estudiados en las especies domsticas desde comienzos de 1900 cuando se emplearon para establecer relaciones taxonmicas o para solucionar problemas de patologa clnica. Captulo aparte lo constituyen los antgenos leucocitarios que se inician con los estudios de Gorer P.A. (1936) en el ratn. A partir del ao 1960 estos comienzan a se estudiados en los animales domsticos y hoy constituyen un importante captulo dentro del rea de la Gentica. (Gotze D., 1977). GRUPOS SANGUNEOS DEL CABALLO En el se describen isoanticuerpos naturales que en un comienzo se pens, podran ser de utilidad en la identificacin del fenotipo. Primero Podliachouk L. posteriormente C. Stormont et al., (1964), establecen que el mtodo de la isoinmunizacin o de la heteroinmunizacin son ms adecuados para elaborar sueros reactivos que permitan diagnosticar el fenotipo (Grosclaude F. 1980). Actualmente se emplean en la identificacin del fenotipo del caballo 7 sistemas de Grupo Sanguneo que junto a las isoenzimas del suero garantizan un 96% de seguridad en el diagnstico del fenotipo individual. (Bowling T.A. comunicacin personal). Los sistemas A y D son los ms complejos y se caracterizan por la existencia de 7 factores (epitopos) para el Sistema A y de 10 factores para el Sistema D. Es interesante hacer notar adems, que en el caballo se describe una enfermedad hemoltica semejante a la que presenta el sistema Rh del hombre. (Mancilla et al., 1986). Por ltimo, los trabajos ms recientes estudian el comportamiento de algunos factores (Bowling T.A., 1986), la aparicin de otros o el empleo de los mismos para distinguir distintas razas. GRUPOS SANGUNEOS DEL BOVINO La investigacin en Grupos Sanguneos del bovino ha sido mucho ms intensa que en las otras especies. El primer estudio gentico lo realiza Stormont C. el que posteriormente (Stormont C. 1978) publica una muy interesante y clsica revisin en esta especie con excelente y abundante informacin. Actualmente se admite la existencia de 11 sistemas, que se sealan en la Tabla N II. TABLA N II Sistema de Grupos Sanguneos en bovinos, con sus correspondientes factores y subtipos Sistemas Grupos Sanguneos A B C de Factores 4 31 4 Subtipos 2 31 9

F J L M S Z R' T'

4 1 1 2 7 3 2 1

4 2 7 2 1

Objeto de un buen nmero de trabajos ha sido la llamada sustancia J del bovino que ha sido homologada en cuanto a su origen al antgeno H humano y R ovino. Se sabe que esta sustancia es un constituyente normal del suero que puede ser adquirida por los glbulos rojos de tal manera que stos son lisados por sueri anti J. La cantidad de sustancia J presente en el suero o en las clulas de un individuo es constante pero sufre fluctuaciones estacionales. Desde este punto de vista la sangre del bovino puede ser dividida en 3 grupos: JCS tiene sustancia J en el suero y clulas, JS slo en el suero, ja aquellos sin sustancia J pero cuyo suero puede contener anti J. La herencia de estas 3 clases se explica mediante una serie allica de 3 genes: JCS, JS y Ja en ese orden de dominancia. Finalmente, debemos decir que en Chile probablemente el nico trabajo en este aspecto es el de Roa H. (1971) quien realiz diagnstico de parentezco en bovinos, mediante antisueros obtenidos en ISABR. GRUPOS SANGUNEOS DEL CERDO Desde las investigaciones de Szymanowski Z. et al., y confirmados por Andresen E. (1978), se describen en el cerdo 3 tipos de individuos de acuerdo a la presencia o ausencia del factor A en las clulas y tambin en base a la presencia del anticuerpo correspondiente (anti A) en el suero. Se demostr que el factor A presenta similitud con el factor A humano y R de la oveja. Mediante la tcnica de isoinmunizacin y absorcin Andresen E. (1978) estableci una base ms amplia para los Grupos Sanguneos del cerdo; describi 10 sistemas (A, D, E, F, G, H, I, J, K, L) cada uno con un nmero variable de factores, siendo el sistema E el ms complejo. En 1961 Brauner-Nielsen describe el sistema M y durante la realizacin del Test Internacional de Comparacin de Grupos Sanguneos del cerdo en 1980 se agregan a los anteriores los Sistemas N y O (Society News 1981). Por ltimo resulta ilustrativo respecto a los avances que se hacen en este campo lo que comunica Brandt H. et al. (1986) quienes utilizan sistemas computacionales para entregar esta informacin a los criadores . Existe finalmente una abundante informacin respecto a la manera en que los Grupos Sanguneos concurren al conocimiento del genotipo del cerdo a travs de la confeccin de su Mapa Gentico. En Chile es necesario destacar el aporte de Hammerli F. et al. (1977) quienes elaboran isoantisueros, algunos de los cuales actan como marcadores al segregar en cruzamientod dirigidos.

GRUPOS SANGUNEOS DE LA GALLINA Landsteiner K. y Miller C.P. pusieron en evidencia 8 antignos mediante un suero anti de conejo absorbido con glbulos rojos. Posteriormente Tood C.H. estudio el de elaboracin de reactivos sricos utilizables como marcadores genticos mediante isoinmunizacin. (Citados por Briles W.E. 1950). Briles W.E. es tal vez el principal investigador en esta especie, junto a sus colaboradores (1950) y mediante sueros isoinmunes pudo distinguir 11 locignicos. En la actualidad se admiten para la gallina 10 Sistemas de Grupos Sanguneos estos son A, B, C, D, H, I, K, L, N, y P. En nuestro pas es necesario mencionar el aporte hecho por H. Roa (1971). Posteriormente, Alay F. (1975), Arriagada A. (1982) y Mella P. (1984) iniciaron una lnea de investigacin en gallinas comenzando por la elaboracin de inmunsueros y su comparacin con inmunsueros elaborados por ISABR; hicieron la caracterizacin' de diversas lneas de gallinas en funcin de las frecuencias gnicas para determinados reactivos sricos; procedieron a la verificacin de parentezco en descendientes cuyos padres se desconocan, etc., siendo por lo tanto, hasta ahora, la especie que ms se ha estudiado bajo este aspecto en Chile. Isoenzimas Constituyen otro importante grupo de marcadores genticos. El trmino fue ideado por Market C. y Moller como una definicin operacional que engloba mltiples formas enzimaticas. Las isoenzimas se definen como enzimas que cumplen la misma funcin pero difieren ligeramente en su estructura primaria y por lo tanto, en su carga elctrica. El mtodo de separacin de protenas, que difieren ligeramente entre s, es el electrofortico. Smithies introdujo el almidn como medio de soporte y defini por primera vez la nocin de polimorfismo gentico en las protenas sricas. Nocin definitivamente demostrada mediante el determinismo mendeliano en la transmisin de esta variacin. Dos aos ms tarde Hunter M. y Markert C. idearon aplicar a los geles de almidn mtodos histiqumicos de coloracin para la deteccin de enzimas despus de realizada le electroforesis. Este mtodo permite localizar muy precisamente en el gel aquellas molculas que presentan la actividad estudiada (autores anteriores citados por Harry H. et al. 1977). El enorme inters de esta tcnica radica en que revela el producto de la actividad de un sistema gentico elemental, es decir de un locus. Si en un gel se colocan varias muestras (provenientes de distintos individuos), es posible realizar un verdadero anlisis locus por locus y comparar diversos organismos. El anlisis se basa en que aparecen patrones de bandas cuyo nmero y caractersticas dependen de la estructura de la enzima que en ese momento se estudia (homomrica, dimrica, trimrica o tetramrica), de la constitucin genotpica de individuo (homocigotoo heterocigoto) y de la presencia o no de mutaciones que alteren la estructura primaria de la enzima determinando una migracin diferencial. (Harry H. et al., 1977). En las especies domsticas las isoenzimas son objeto de intensos estudios por su facilidad de observacin y porque no requieren de la elaboracin de sueros reactivos como ocurre con los Grupos Sanguneos. La literatura en este aspecto es cada da ms abundante. El estudio de las isoenzimas en las especies domsticas revela que en el bovino, por ejemplo, se describen 25 locignicos polimrficos utilizables como marcadores genticos, los que se

expresan como sigue: 10 en el plasma, 8 en los glbulos rojos y 7 en los glbulos blancos. A modo de ejemplo respecto a su notacin en esta especie citamos la Albmina plasmtica: smbolo del locus Al; smbolo de sus alelos (G), A, (D,E,F), B, (C), (Los parntesis indican que la nomenclatura no est aceptada internacionalmente). Es importante hacer notar que Womack J.E. et al. (1986) emplean 28 de estos marcadores asociados a la tcnica de hibridacin celular (hamster/ bovino) para confeccionar el mapa gentico del bovino. En el caballo, en cambio, el nmero de polimorfismos descritos es menor. En el suero se describen 7 isoenzimas polimrficas y en los glbulos blancos 3 siendo la serie ms larga la del locus transferrina del suero (Tf) con 6 alelos. Anderson L. y Sandberg K. utilizan estos marcadores para confeccionar el mapa gentico y para hacer anlisis de ligamiento o tambin para establecer frecuencias gnicas en algunas razas equinas de USA (Bowling A.T., 1986). En el cerdo se describen 7 loci polimrficos ampliamente utilizados en la confeccin de mapas genticos. Algunos de estos marcadores han siod asociados a la prediccin de la susceptibilidad al sndrome de stress porcino (Mabry J.W. et al., 1983). En la gallina se describen isoenzimas en el suero, en los glbulos rojos o en la yema del huevo. La literatura seala hasta el momento 7 enzimas polimrficas que han sido utilizadas para la confeccin del mapa gentico o para asociarlo a determinadas enfermedades. En nuestro pas estos mtodos parecen no haber sido utilizados en las especies domsticas pero s en otras (Montoya R. et al., 1984, Alay F. et al., 1983). Lectinas Son protenas o glicoprotenas llamadas tambin 'Fitohemoaglutininas' que presentan la propiedad de unirse a los azcares de la superficie celular (Sharon N., 1981). Dicha unin es semejante a la de las enzimas con su sustrato y/o a las de anticuerpo con su antgeno. Una lectina es una protena o glicoprotena multivalente, que se une en forma especfica y reversible a ciertos azcares, que aglutina clulas animales y vegetales y/o precipita polisacridos, glicoprotenas o glicolpidos. Su nombre lo debe a sus caractersticas de selectividad y deriva del latn legere: 'escoger'. Debido a la selectividad de la respuesta de agutinacin, las lectinas sirven como sustancias de prueba para la identificacin o localizacin de la distribucin de los azcares que forman parte en la superficie de la clula. Pueden distinguir glbulos rojos que pertenezcan a diferentes grupos sanguneos, clulas malignas de normales, estimular la divisin de linfocitos actuando como una sustancia mitognica, razn por la cual son una herramienta muy importante para estudios inmunolgicos (Sharon N. 1981). En los ltimos aos se han ampliado hacia aspectos cromosmicos. Respecto a la propiedad de aglutinar glbulos rojos humanos hay lectinas especficas para los Grupos Sanguneos A, A1, B, M, N y H, que se unen a los determinantes antignicos presentes en la superficie de los eritrocitos.

En las especies domsticas estos estudios se inician con Scheinberg S.L. et al., quien a partir de extractos de Phaseolus vulgaris identifica el antgeno 'Hi' en el glbulo rojo de la gallina. Sellel J. estudia el efecto de una lectina de Helix pomatia en los glbulos rojos de bovino; Ikemoto S. et al. a partir de extractos de Tulapia gesneriana separa glbulos rojos de oveja en positivos y negativos y detecta el antgeno T que se heredar como autosmico dominante; Mizutani M. define 2 aglutingenos en glbulos rojos de gallina mediante una lectina aislada de Solanum tuberosum (autores citados por Sharon N. 1981). En nuestro pas Alay F. et al., (1974-19771987) informa de la existencia de lectinas en numerosas plantas autoctonas y su posible utilizacin como marcadores genticos por su capacidad de aglutinar los glbulos rojos del hombre y animales, y que adems podran en el caso de evidenciar segregacin, reemplazara los antisueros islogos o heterlogos. Consideraciones generales Antes de terminar esta breve exposicin sobre los diversos marcadores genticos que se emplean en Medicina Veterinaria es necesario insistir en la importancia que ellos tienen en la descripcin del genotipo, en el anlisis de parentesco, en la confeccin de mapas genticos y, lo que es ms importante, en los esfuerzos que se hacen para relacionar estos marcadores genticos con rasgos de importancia econmica. En este aspecto no slo juegan su rol los marcadores genticos mencionados, sino tambin los que forman el Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MC.) que actualmente se describe en todas las especies domsticas (Gotees D., 1977). En la XX Conferencia Internacional sobre Grupos Sanguneos Animales y Polimorfismos Bioqumicos realizada en 1986, Vaiman M. hizo una revisin y puesta al da de los mismos. Por otra parte en esta revisin se mencionan numerosos ejemplos que relacionan el M.H.C. con caracteres de importancia econmica en diversas especies. En la gallina est demostrada la resistencia a la enfermedad de Marek que presentan algunos haplotipos de M.H.C. o en la oveja la resistencia a nematodes la asociacin en el bovino entre estos marcadores y la resistencia a la mastitis o por otra parte la asociacin entre Grupos Sanguneos y velocidad y resistencia en el caballo. Respecto al M.H.C. (p) del ratn es necesario mencionar la abundante produccin cientfica de los colegas Hoecker G. y Pizarro O. (citados por Vergara U.1982) quienes han contribuido en forma muy importante al conocimiento de este locus, fundamental en la inmunologa moderna. Finalmente y en funcin de la brevedad, cabe sealar que en esta revisin no hemos incluido a ovinos, caprinos, felinos, cnidos,etc. en los que tambin se describen estos polimorfismos genticos (Goetze D. 1977). Por ltimo, debemos hacer notar que la difusin y empleo de estas tcnicas en el campo de la certificacin de transacciones de reproductores de valor, en los programasde seleccin animal y en la prevencin de patologas darn un lugar prominente al grupo profesional encargado de manejarlas y arbitrarlas.