LABORATORIO N 3 DETERMINACIN DE GLUCOSA POR MTODOS CUALITATIVOS Y CUANTITATIVOS 1. Aspectos tericos.

En estado de post-absorcin la concentracin de glucosa sangunea en el hombre vara entre 70 -110 mg/100mL. La mantencin de valores estables de glucosa en la sangre es uno de los mecanismos ms finamente regulado. En esta regulacin participan el hgado y varias hormonas. Cuando la glucosa sangunea alcanza valores relativamente altos, el rin tambin ejerce un efecto regulador. La glucosa filtrada continuamente por los glomrulos es habitualmente reintegrada por completo a la sangre por el sistema de resorcin de los tbulos renales. La resorcin de glucosa est enlazada con el aprovisionamiento de ATP en las clulas tubulares. La capacidad del sistema tubular para absorber glucosa est limitada a una tasa aproximada de 350 mg/min. Cuando la cantidad de glucosa en la sangre sobrepasa la que puede ser reabsorbida el exceso pasa a la orina producindose glucosuria. En los individuos normales la glucosuria ocurre cuando la concentracin de glucosa en la sangre venosa es superior a 170 180 mg/100 mL. [glucosa]normal en sangre [glucosa]normal en orina 70 110 mg/dL 1 15 mg/dL ( 3,9 6,1 mmol/L). ( 0,06 0,8 mmol/L).

Mtodo cualitativo: tiras colorimtricas. La glucosa puede ensayarse cualitativamente con el uso de tiras colorimtricas. Este test usa glucosa oxidasa que cataliza la oxidacin de D-glucosa a cido glucnico con formacin de H2O2. En presencia de loa enzima peroxidasa, el H2O2 generado oxida un cromgeno (orto-dianicidina), produciendo un cambio de color, que indica la presencia de glucosa. Este mtodo es especifico para la glucosa y la detecta cuando su concentracin est sobre el rango normal. Mtodos cuantitativos. Mtodo qumico: o-toluidina. La o-toluidina se condensa inicialmente con el grupo aldehdo de la glucosa para formar una mezcla en equilibrio de la glucosilamina y la base de Schiff correspondiente. Las reacciones que tienen lugar despus de la condensacin original producen una mezcla de cromgenos verdes con una longitud de onda analtica a 630 nm.

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Mtodo enzimtico: Trinder 100 (Sigma). El mtodo enzimtico se basa en la especificidad de la enzima glucosa oxidasa (GOD) por la -D-glucosa. La enzima cataliza la oxidacin de la glucosa por oxgeno molecular dando el D-gluconato y perxido de hidrgeno (H 2O2, agua oxigenada) (Rxn. 3.1). Para detectar y cuantificar esta oxidacin se ocupa una reaccin acoplada (Rxn. 3.2). En forma cuantitativa el H 2O2 es oxidado por un reactivo comercial (4-aminofenazona (4-AF) y 4-hidroxibenzoato), reaccin catalizada por la enzima peroxidasa, para dar como producto un compuesto coloreado rojo (quinonimina) que se cuantifica midiendo la absorbancia a 505 nm.
D glu cos a + enzima FAD D gluconolac tona + enzima FADH 2 enzima FADH 2 + O 2 enzima FAD + H 2 O 2 D gluconolac tona + H 2 O D glu cos a + O 2 + H 2 O
D gluconato + H +
GOD D gluconato + H + + H 2 O 2

Reaccin 3.1
H 2 O 2 + 4 - AF + 4 - hidroxibenzoato
peroxidasa

quinonimina (roja)

Reaccin 3.2 2. Objetivos. Detectar glucosa en una muestra biolgica mediante tiras colorimtricas. Cuantificar glucosa en una muestra mediante un mtodo qumico (o-toluidina) y un mtodo enzimtico (Trinder-100). 3. Parte experimental. 3.1 Materiales espectrofotmetro/ celdas trpode/ rejilla / mechero bao termostatizado cronmetro 15 tubos de ensayo 2 gradillas 2 pipetas graduadas de 1 mL 1 pipeta graduada de 5mL 1 pipeta graduada de 2 mL 1 pizeta 1 matraz de aforo de 100 mL 1 vaso precipitado de 250 mL 1 vaso precipitado de 500 mL termmetro micropipeta de 20 L, puntas tira colorimtrica 14

3.2 Reactivos glucosa 16 mg/dL o-toluidina glucosa estndar (ensayo enzimtico Trinder) reactivo de trabajo Trinder-100

4. Procedimiento. 4.1 4.2 Tiras colorimtricas. Introduzca una tira de prueba en el tubo que contiene la muestra. Remueva inmediatamente el exceso de muestra de la tira. Espere 10 minutos exactos para el desarrollo del color. Compare el color de la tira con la escala de colores que indica el nivel de glucosa. Descarte cambios de colores despus del tiempo indicado. Mtodo de la o-toluidina

De acuerdo a la tabla 3.1: Prepare una batera de tubos rotulados. Agregue el volumen indicado de la solucin estndar de glucosa (16 mg/dL) a los tubos 2S 6S. Agregue 0,5 ml de las diferentes muestras problemas a los tubos 7MP 9MP. Complete el volumen de los tubos a 0,5 mL agregando el volumen indicado de agua destilada. Agregue 3,0 mL de la o-toluidina con una pipeta graduada de 5 mL. Tape los tubos con bulbos de vidrio. Homogenice y lleve los tubos a un bao de ebullicin por 10 minutos Enfre y lea la absorbancia a 630 nm. El color es estable por 30 minutos.
TABLA 3.1

TUBO 1B 2S 3S 4S 5S 6S 7MP 8MP 9MP

Glucosa (ml) 16 mg/dL 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 -------

Glucosa M. P. (mL) ------------0,5 MP1 0,5 MP2 0,5 MP3

Volumen H2O (mL) 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 0,0 0,0 0,0

o-toluidina (mL) 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 15

De acuerdo a los datos: Calcule la concentracin de glucosa en los tubos (2S 6S). Complete la tabla con los valores de absorbancia y concentracin. Construya una grfica absorbancia versus concentracin de glucosa. Obtenga la ecuacin de la recta por regresin lineal y el coeficiente de regresin. Calcule las concentraciones de las muestras problemas (tubos 7MP 9MP) en la cubeta mediante la ecuacin 1.5. Calcule las concentraciones de las muestras problemas en las soluciones originales considerando las diluciones realizadas en el ensayo (Ecuacin 1.6). 4.3 Mtodo enzimtico Trinder 100 De acuerdo a la tabla 3.2: Prepare una batera de tubos de ensayo marcados, B (blanco), S (estndar), MP1, MP2 y MP3. Agregue con una micropipeta el volumen indicado de la solucin estndar de glucosa (150 mg/dL) al tubo S. Agregue con una micropipeta el volumen indicado de las diferentes muestras problemas a los tubos correspondientes. Agregue el reactivo de trabajo con una pipeta aforada de 2 mL. Homogenice e incube los tubos por 5 minutos en un bao termostatizado a 37C. Lea la absorbancia a 505 nm, llevando el equipo a absorbancia cero con el blanco.
TABLA 3.2

Estndar ( 150 mg/mL) ( L) Muestra problema ( L) Reactivo de trabajo (mL)

B -----2.0

S 20 --2.0

MP1 20 2.0

MP2 20 2.0

MP3 20 2.0

De acuerdo a los datos: Calcule la concentracin de glucosa en las muestras problemas de acuerdo a la ecuacin 3.1.
Glucosa (mg/dl) = (D/S) [estndar

Ecuacin

3.1 donde: D y S son las absorbancias obtenidas de cada muestra problema y del estndar, respectivamente. 5. Bibliografa Robert Bohinski, 1991. Bioqumica, 5 Edicin, Addison-Wesley, Iberoamericana. 16

Preguntas 1. Es el test cualitativo un mtodo adecuado para el control de glucosa urinaria en pacientes diabticos? 2. Qu ventajas presenta el mtodo de la glucosa oxidasa con relacin al de o-toluidina en la cuantificacin de glucosa en un fluido biolgico? 3. Calcule el coeficiente de extincin para el mtodo de o-toluidina considerando las unidades de concentracin: mg/mL, mg/ dL, g/L, g/100 mL, M y mM. Nota : PM Glucosa = 180 g/mol 1 dL = 0,1 L = 100 mL

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