Acizi nucleici

Tipuri de acizi nucleici Componeni structurali ai acizilor nucleici Structura primar covalent a acizilor nucleici Conformaia moleculei de ADN Denaturarea i renaturarea ADN Hidroliza ADN Organizarea superioar a ADN

Ce sunt acizii nucleici ?

Sunt produi de policondensare a nucleotidelor; Pstreaz i mijlocesc transferul de informaie genetic n lumea vie.

Dogma central a biologiei moleculare

ADN conine informaia genetic sub forma unor secvene de nucleotide
Replicare

ADN

Transcriere

ARNm

Traducere

Proteine

Revers transcriere

Toat informaia din celula parental este transferat celulelor fiice.

Tipuri de acizi nucleici

ADN stocheaz ntr-o form compact, o cantitate mare de informaie cu privire la biosinteza proteinelor, care poate fi accesat imediat ARN (mesager, de transport, ribozomal, de mici dimensiuni)

Componenii structurali ai acizilor nucleici

Pentoza sub forma ciclic -furanozic Acidul fosforic Bazele azotate: purine i pirimidine
6 1N 2 N 3 4 Purin 5 7 N 8 NH 9 4 3N 2 5 6 N 1 Pirimidin

Tautomeria lactam lactim a bazelor azotate

Formele lactam sunt mai stabile
O C NH forma lactam OH C N forma lactim

Tautomerie imino-amino
NH2 N C forma amino NH NH C forma imino

Purine

NH2 N N HN

NH N H2 N N

OH N NH HN H2 N

O N NH

NH NH N N Amino Imino Adenina (6-amino purina)

Lactim Lactam Guanina (2-amino-6-hidroxi purina)

Pirimidine
OH N HO HN HO O N OH CH3 HN O CH3

N O NH Lactim Lactam Uracil (2,4-dihidroxi-pirimidina) NH2 N HO N Lactim

N O NH Lactim Lactam Timina (5-metil-uracil) NH2 N

NH Lactam

Citozina (2-hidroxi-4-amino-pirimidina)

Nucleozide (ribo- i dezoxiribonucleozide)

Ribonucleozidele
NH2 N N HO H2 C N 9 N O N O NH NH2 9 5` N N HO H2 C O 1` 4` 2` 3` OH OH Adenozin (A) NH2 N 1 5` O N HO H2 C O 4` 1` 3` 2` Citidin (C) OH OH 1 N O Uridin (U) OH OH

OH OH

Guanozin (G) O NH O

HO H2 C

Dezoxiribonucleozidele
NH2 O N N HO H2C O N 9 N N NH NH2 9 5` N N HO H2 C O 1` 4` 2` 3` OH H Dezoxiadenozin (dA) NH2 N O 5` HO H2 C O 1` 4` 3` 2` OH H Dezoxicitidin (dC) 1 N

HO

H Dezoxiguanozin (dG) O

H3C 1 N O

NH O

HO H2C

OH H Dezoxitimidin (dT)

Nucleotidele
Sunt esteri fosforici ai nucleozidelor
NH2 O O
-

O O P OO

O P OO

N 5` O 4` 1` 2` 3` OH X N N

Adenin

P O-

X=H Dezoxiriboz X=OH Riboz

Adenozin sau Dezoxiadenozin (nucleozide)

AMP (adenozinmonofosfat) ADP (adenozindifosfat) ATP (adenozintrifosfat)

Proprietile fizice ale nucleotidelor i nucleozidelor

La 5<pH<9 nucleozidele sunt neutre Solubilitatea nucleotidelor n ap este mai mare dect a nucleozidelor Nucleozidele i nucleotiodele sunt stabile n mediu bazic Nucleotidele prezint absorban maxim la 260 nm, la pH = 7

Conformaia nucleotidelor i nucleozidelor

Determinat de:- flexibilitatea ribozei
PO
4` 5` 2`

PO Baz
1`

5` 4`

3`

O
3`

O
2`

Baz
1`

. 7,0 A

PO

C-2` endo "South"

. 5,9 A

PO C-3` endo "North"

-orientarea bazelor azotate fa de legtura N-glicozidic

Conformerii anti i syn

O NH 1 N HO H2 C O O O HO H2C O HN 1 N O

Uridin (U) OH OH Anty O N 9 N O 1` NH N NH2

Uridin (U) OH OH Syn NH H2 N N 5` HO H2 C 4` 3` Guanozin (G) Syn

N 9 N O 1` 2` OH OH

5` HO H2C 4`

2` 3` OH OH Guanozin (G) Anty

Nucleotide naturale libere

Rolurile lor n esuturi: -compui macroergici (ATP, GTP); -componeni structurali ai coenzimelor (FAD, NAD+, NADP+); -acceptori de fosfat n fosforilarea oxidativ (ADP); -efectori alosterici ai activitii enzimelor; -mesageri secunzi (AMPc i GMPc); -donori ai gruprilor metil (S-adenozilmetionina).

NH2 N CH3 S
+

NH2 N N N O O- P O 3` O OH 5` H2 C O N 9 N HN H2 N O O- P O O

O N N H2 C 3` OH 5` O 9 N

N H2 C O

CH2 CH2 CH NH2 COOH S-Adenozilmetionin OH OH

Adenozin-3`,5`-monofosfatul (AMP ciclic, AMPc)

Guanozin-3`,5`-monofosfatul (GMP ciclic, GMPc)

Metilxantinele
O HN 1
3 7

N NH NH Xantina (2,6-dioxipurina)

H3 C O

O N N CH3

CH3 N N Cofeina (1,3,7-trimetilxantina)

CH3 N

O H3 C O N N CH3 N HN NH Teofilina (1,3-dimetilxantina) O N CH3 O

N Teobromina (3,7-dimetilxantina)

Analogi structurali sintetici ai bazelor azotate, nucleozidelor i nucleotidelor

Inhib sinteza ADN Sunt folosii n chimioterapie
O F N 5 O HO H2C O SH 2` OH N3 OH Azidotimidina 5-Iodo-2`-deoxiuridin H2 N N 6 N N NH HN N 5 O I N SH 6 N 9 NH

NH O 5-Fluorouracil HO H2C Timin O

N 6-Mercaptopurina

6-Tioguanina

O HN O HO H2 C O N 6N O HO H2 C N

NH2

O HN 6 N
8N

CH3 N N S N 6 NO2 N
8

N O HO

H2 N

NH

8-Azaguanina HO N 6 9 N NH

OH OH 6-Azauridin

OH Arabinozil citozin

N Alopurinol

NH N Azatioprin

Structura primar covalent a acizilor nucleici

Nucleozidele legate fosfat diesteric formeaz: -oligonucleotide -polinucleotide Polinucleotidul ARN conine: -Riboz i A, G, C, U Polinucleotidul ADN conine: -Dezoxiriboz i A, G, C, T

N
O O
-

NH
G

P
O
-

5`

N
O
3`

5` GCA 3`
NH2

NH2

X
O O C O
-

N CH2
3`

P
O

N
O

NH2
X O

N
A O

NH

P
O
-

CH2

N
O

3`

3`

OH

Polaritatea catenei
5`

O CH2 5` 3` B1 B1 3` P B2 B2 5` P B3 B3 5` O 5`

3`

P
5` 3` 3`

P
5`
3`

3` O

3` CH2 O

5`

Conformaia moleculei de ADN; tipuri de conformaii

Structura secundar de dublu-helix a ADN a fost propus de Watson i Crick -analiza cromatografic a stabilit c n toate tipurile de ADN numrul de baze purinice este egal cu cel de baze pirimidinice (A+G=T+C); -difracia razelor X, efectuat pe cristale de ADN, a demonstrat existena a dou perioade de identitate de-a lungul axei lungi a moleculei: una mare de 34 i una mic de 3,4 .

Dou catene antiparalele (una cu polaritate 5-3 i cealalt antiparalel cu polaritatea 3-5) formeaz o dubl helice cu orientare dreapt
O H2C O N O H Dezoxiguanozin H G N N H O O Dezoxicitidin CH2 O O H2 C O N O H O Dezoxiadenozin O Dezoxitimidin H2 C O N A N H N T N H O N H N H O N H N C N H O N O H N H

Caracteristici structurale ADN forma B

Dou catene complementare NU identice, formeaz o scar n spiral cu 10 trepte; Scheletul extern al dublului helix este format din ciclurile monozaharidului legate ntre ele prin resturi fosfat care la pH fiziologic sunt ionizate i ncrcate negativ; Bazele azotate, sunt orientate spre interior i perpendicular pe axul helixului.

ADN forma B
3,4 ; 34 ; 20

Caten parental

Caten parental

Caten parental

Catene fiice

Caten parental

O H2 C O N O H Dezoxiguanozin H G N N H O N H N N O H N

C N O

H O

Dezoxicitidin CH2 O

O H2 C O N
HO

H N A N H O O H2 C Dezoxitimidin N N H O H N T N

Formele structurale A i Z ale ADN

Conformaia de tip A : - dubl helice dreapt; -pasul helicei este de 28 ; - numrul de baze per tur 11; -predomin conformerii anty. Conformaia de tip Z: -corespunde la o helice stng; -12 perechi de baze per tur; -pasul helicei aproximativ 57 ; -ntr-o succesiune GC dezoxinucleotidul guaninei adopt conformaia syn iar cel al citozinei pe cea anti, ceea ce face ca lanul s evolueze n zig-zag ntre cele dou conformaii. Exist argumente (in vitro) c structura Z modific interaciunile ADNproteine, importante n replicare, transcriere, repararea leziunilor ADN.

Denaturarea ADN
creterea temperaturii; la valori extreme de pH (molecula de ADN este stabil la pH-uri cuprinse ntre 4 i 10); modificarea triei ionice. prezena formaldehidei Topire = denaturare ADN determinat de modificri de temperatur

Proprieti fizice ale ADN care se modific prin denaturare

scade vscozitatea; crete absorbana la 260 nm.

Efectul hipercrom
Prin denaturarea ADN-ului, creste capacitatea de absorbtie a acestuia la =260 nm.

Ruperea legturilor de hidrogen i a interaciunilor van der Waals dintre catenele moleculei ADN aflate n soluie.

Renaturare ADN

Denaturare ADN

Renaturare
Refacerea duplexului ADN prin legarea catenelor complementare Renaturarea depinde de: -temperatur; -concentraia catenelor complementare. Renaturarea este proces folosit n tehnica hibridrii -determinarea poziiei intronilor n molecula ADN -evidenierea deleiilor cromozomiale.

Hidroliza acizilor nucleici

Chimic sau Enzimatic ADN este rezistent la hidroliza bazic ARN este hidrolizat n mediu bazic
O H2C
5` O O O 5`

O H2C
2` O
-

O
2`

3`

B1

5` O O O
-

3`

H2C
B1 5` O

3`

2`
2-

B1

+ H2O

PO3

OH

+ OH B2 OH
5` 3` 2`

OH B2 OH
5`

B2

OH

Hidroliza enzimatic
Nucleaze: -exonucleaze -endonucleaze endonucleaze de restricie (restrictaze) evideniate la bacterii recunosc secvene nucleotidice numite palindroame taie ADN dublu catenar nemetilat la resturile de A sau C

Enzima BamH I BglII EcoR I EcoRV Hind III Hpa I Pvu II Taq I

5`-T 5`-CAG 5`-GTT 5`-GAT 5`-A 5`-G

Secvena recunoscut Sursa Bacillus GATCC-3` amyloliquefaciens H GATCT-3` Bacillus globigii AATTC-3` Escherichia coli RY13 ATC-3` Escherichia coli B946 Haemophilus influenzae AGCTT-3` Rd Haemophilus AAC-3` parainfluenzae CTG-3` Proteus vulgaris CGA-3` Thermus aquaticus

5`---AAGCTT---3` 3`---TTCGAA---5` Hind III 5`---A 3`---TTCGA 5`

5`

5`---TGGCCA---3` 3`---ACCGGT---5` Bal I

5`---GAGCTC---3` 3`---CTCGAG---5` Sst I C---3` 5`---GAGCT3` 3`---C 3`TCGAG ---5`

AGCTT---3` A ---5`

5`---TGG 3`---ACC

CCA---3` GGT---5`

Formare ADN recombinant

ADN1 5`---GAATTC---3` 3`---CTTAAG---5` EcoRI 5`---G 3`---CTTAA AATTC---3` G---5` 5` 3` 5` 3` ADN2 GAATTC CTTAAG EcoRI G AATTC CTTAA G 3` 5` 3` 5`

Renaturarea fragmentelor ADN si sudarea lor de ctre ADN-ligaz 5`---GAATTC 3`---CTTAAG 3` 5` 5` 3` GAATTC---3` CTTAAG---5`

Molecule de ADN recombinant

Separarea fragmentelor ADN rezultate din aciunea enzimelor de restricie

Electroforeza pe gel de poliacrilamid pentru fragmente <500 perechi de baze Electroforaza pe gel de agaroz pentru fragmentele cu dimensiuni mai mari Hri de restricie

Distribuia i dimensiunile ADN

ADN are form liniar sau circular Moleculele ADN dintr-o celul alctuiesc cromozomii acelei celule. Gene = fragmente cromozomiale care conin informaia genetic cu privire la sinteza unui singur lan polipeptidic sau a unei singure molecule de ARN. Genom = totalitatea genelor din cromozomii unei celule.

Dimensiunile ADN
La procariote, o molecul ADN circular = un cromozom cu 4 x 106 perechi de baze -la E. coli ( 4,6 x 106 ) lungimea conturului ADN cromozomial este de ~ 1,6 mm -diametrul celulei de E. coli este de ~ 2 m La om, cel mai scurt cromozom 34 x 106 p.b. cel mai lung 263 x 106 Lungimea moleculelor ADN dintr-o singur celul uman este de ~ 2 m

Distribuie ADN
La procariote:
-ADN cromozomial

Plasmide (ADN extracromozomial, circular)

-molecule mici care trec uor prin membrana celulei gazd -conin o cantitate redus de informaie genetic -conin gene care specific proteine, ce confer bacteriei rezistent la antibiotice -sunt instrumente ideale de manipulare a genelor

-manifestnd adesea autonomie fa de ADN cromozomial, plasmidele se

autoreplic extrem de rapid.

La eucariote
Cea mai mare cantitate de ADN se afl n nucleu. -numrul cromozomilor depinde de specie In mitocondrii se afl ADN circular de dimensiuni mici (1% din ADN celular total) Genele sunt formate din exoni i introni (discontinuitatea genelor) Dup gradul de repetare:secvene unice de ADN (60%), cu grad mediu de repetare, cu grad foarte mare de repetare (centromere i telomere).

Desrsucirea unei spire

Legare capete

ADN circular cu suprarsucire pozitiv spre dreapta

ADN normal ADN partial desrsucit

Axa de suprarsucire

Axa de suprarsucire

Topoizomeraza II
Necesit ATP i face incizii n ambele catene.

Etapa 1

Etapa 2

Etapa 3

ADN giraza, o topoizomeraz II

prezent numai la procariote, ADN giraza (topoizomeraza II) introduce n molecula ADN supertorsiuni negative,, astfel nct supertorsiunile pozitive generate de avansarea bifurcaiei de replicare sunt n mare msur contracarate. Cantitile de topoizomeraz I i II sunt reglate pentru a menine n celulele vii un grad potrivit de superhelicitate negativ. Anumite antibiotice ca: acid nalidixic (negram) i derivaii si fluorurai (norfloxacin, ciprofloxacin), suprim creterea i dezvoltarea bacterian prin inhibarea ADN-girazei.

Cromozomii eucariotelor
Cromatina (cromozomii interfazici): -ADN; proteine; ARN Cromozomii sunt complexe ADN-proteine rezultate prin condensarea cromatinei n timpul mitozei Histonele = proteine bazice interacioneaz ionic cu ADN

Sunt 5 tipuri de histone

Histone bogate n lizin: H 2 A i H 2B Histone bogate n arginin: H3 i H 4 care intr n structura nucleozomului Histone de legtur H1 care leag nucleozomii ntre ei.

Nucleozomii = unitatea de baz a cromatinei

grad de compactare pentru ADN egal cu 7 Cilindru: 11x11x5,5 nm
Miezul nucleozomului ADN de legtur
(H2A, H2B, H3, H4)2

ADN Histona H1

Solenoizii asigur o scurtare de 40 de ori a formei B a ADN

Protein nuclear Fibra de 30 nm

Cromozom

ADN

Octamerul histonic Histone + ADN

Histona H1

ADN

Caracteristicile structurale ale ARN

Structura primar: se leag covalent ribonucleozidtrisfosfai Structura secundar ARN este monocatenar cu poriuni bicatenare
Bucl cu baze nemperechiate

Segment cu baze complementare

Coninutul n A al ARN este diferit de cel n U i cel de G diferit de cel n C

Rolurile diferitelor tipuri de ARN

ARNr -caracteristici structurale
-sunt molecule flexibile i deformabile datorit zonelor dublu catenare, ntrerupte de zone monocatenare,. -ARNr este extrem de heterogen ca form i mrime. -n funcie de coeficientul de sedimentare (S): la procariote, se ntlnesc trei tipuri de ARNr (23S, 16S i 5S) la eucariote patru tipuri de ARNr (28S, 18S, 5,8S i 5S). -ARNr este tipul de ARN cel mai stabil metabolic i reprezint aproximativ 80% din totalul de ARN celular.

Ribozomii
ARNr intr n constituia ribozomilor avnd rol de component catalitic Ribozomii = complexe ribonucleoproteice (ARNr + proteine) -proteinele au roluri catalitice sau sunt implicate n recunoaterea i legarea ARNm i aminoacil~ARNt.

Rolul ribozomilor
Ribozomii constituie sediul biosintezei proteinelor Ribozomii permit conlucrarea ARNm, ARNt i ARNr, n vederea desfurrii procesului de sintez a proteinelor. Pe suprafaa fiecrui ribozom exist trei situsuri i anume: -situsul aminoacid, care leag ARNt purttor al unui aminoacid; -situsul peptid, care leag ARNt purttor al unui lan polipeptidic; -situsul de eliminare de pe care este eliberat ARNt liber.

Ribozom 70 S

ARNt
E. Coli conine aproximativ 75 tipuri de ARNt reprezentnd aproximativ 15% din masa ARN celular total Caracteristicile structurale ale ARNt.

-ARNt, numit i ARN solubil sau adaptor, conine ntre 75 i 90 ribonucleotide; -raportul A+G/U+C din ARNt este apropiat de 1; -ARNt nuclear, prezint o conformaie n foaie de trifoi -ARNt are cel mai mare coninut de baze minore. Dup sinteza complet a moleculei ARNt, anumite baze azotate pot fi modificate structural prin: metilri, tiolri, hidrogenri, rezultnd baze minore

O NH HO H2 C N
O

O H3C N O NH O HN HO H2 C

O NH O O

HO H2 C

OH OH Dihidrouridin (DHU)

OH OH Ribotimidin (T) S NH N O N O

OH OH Pseudouridin () O NH N

HO H2 C

N O

HO H2 C

HO OH 4-Tiouridin

OH OH Inozin

ARNm
Caracteristici structurale.

-ARNm: monocatenar, liniar, de lungime variabil;

-este sintetizat prin transcrierea uneia dintre cele dou catene ADN, desemnat drept matri sau template. -ARNm conine informaia n limbaj nucleotidic. ADN 5` - G C A T T A T G C - 3` 3` - C G T A A T A C G - 5` ARN 5` G C A U U A U G C 3`

-informaia depozitat n ARNm sub forma tripletelor de nucleotide numite codoni este decodificat la nivelul ribozomilor.

ARNm procariot
este poligenic sau policistronic; ntre gena transcris, ARNm i protein exist o relaie de colinearitate

ARNm eucariot
este monogenic; nu este relaie de colinearitate: gen-ARNm-polipeptid, ca la procariote; gena pentru sinteza ARNm cuprinde secvene codificatoare numite exoni (expressed regions) separate prin secvene necodificatoare numite introni (intervening sequences); ARNm matur care trec n citoplasm este prelucrat prin excizia intronilor; ARNm eucariot are o via de ordinul orelor, n timp ce ARNm bacterian are o via foarte scurt (2-3 minute)

ARN nuclear de mici dimensiuni (small nuclear RNA)

sunt mai multe specii moleculare (U1, U2, U4, U5, U6) bogate n uridin. se afl n nucleu, citosol i mitocondrie prin asociere cu proteine, genereaz ribonucleoproteine (small nuclear ribonucleoproteins) sau snRNP ( denumite snurps), cu rol n: -excizia intronilor din ARNm transcript primar; -controlul traducerii.