Facultad de Ingeniera Qumica Bioqumica Industrial 23 de febrero de UADY 2011 ELECTROFORESIS EN GEL DE MUESTRAS DE ADN.

Introduccin La electroforesis se aplica para el anlisis de ADN y de protenas, esta nos permite separar estas molculas de acuerdo con su tamao. El principio de esta tcnica es muy simple: si sometemos una molcula con carga electrosttica a la accin de un campo elctrico, las molculas tendern a moverse: las de carga negativa hacia el electrodo negativo. La velocidad a la que se mueva depender de la carga que tengan y del tamao que sean. Adems, se puede mejorar la separacin poniendo obstculos en su camino. Aqu las molculas ms pequeas se podrn mover ms gil y rpidamente que las grandes 1. En la actualidad se utilizan varios polmeros que forman tales enrejados o mallas y adems impiden la difusin o prdida de resolucin de la separacin. Estos polmeros forman geles, especie de gelatinas que permiten mantener un registro estable de las molculas que se mueven dentro de ellos1. En forma rutinaria, las molculas de ADN se analizan mediante electroforesis en gel. El gel es una red compleja de molculas polimricas y la distancia que el ADN migra a travs del gel refleja su tamao, el cual se puede estimar usando fragmentos de ADN marcador como referencia. La agarosa se usa en el anlisis de molculas de varios cientos hasta 20 000 pares de bases. El ADN se observa usando luz UV despus de teirlo con bromuro se etidio 2.

Objetivos Ensayar la separacin de ADN por medio de electroforesis en gel de agarosa. Ensayar la revelacin de un gel de agarosa con bromuro de etidio.

Material y equipo Cmara para electroforesis horizontal Fuente de poder Transluminador Charola para tincin de geles Micropipetas de 5 y 200 L Puntas nuevas y estriles para micropipetas de 5 y 200 L. Preparacin de soluciones

Soluciones Buffer TAE 1x Agarosa Solucin de bromuro de etidio Marcador de peso molecular Hind III Muestras de ADN

Solucin de bromuro de etidio. Preparar una solucin concentrada de 5 mg/mL. Para teir los geles se utiliza una solucin diluida de 0.5 g/mL.

Desarrollo Gel de agarosa 1%. 1. Pesar 0.4 g de agarosa y disolverlo en 40 mL de buffer TAE 1X, calentar la mezcla agitando constantemente hasta la disolucin completa de la agarosa. 2. Adicionar 4 L de la solucin de bromuro de etidio y agitar lentamente. 3. El contenido se vierte en el molde con el peine previamente colocado para formar los pozos de inyeccin de las muestras. 4. Una vez que el gel ha solidificado se retira el peine. Electroforesis en gel. 1. Con la ayuda de la charola, colocar el gel en la cmara de electroforesis. De tal forma que los pozos de inyeccin queden cerca del electrodo negativo (el de color negro). 2. Posteriormente se vierte el buffer TAE 1X, verificando que este cubra el gel. 3. Corta un pedazo de parafilm, separarlo del papel encerado y colocar la pelcula sobre la mesa de trabajo 4. Tomar 5 L de colorante y colocarlo sobre la pelcula del parafilm. 5. Tomar 5 L del ADN extrado y colocarlo sobre el colorante. Con la ayuda de la micropipeta se mezcla el contenido absorbiendo y descargando el contenido por tres ocasiones. 6. Tomar la mezcla e inyectarlo en el gel ya colocado en la cmara de electroforesis. De acuerdo a lo siguiente. Pozos 1 Marcador de peso molecular Hind III 2 Muestra de ADN 3 Muestra del equipo 1 4 Muestra del equipo 2 5 Muestra del equipo 3 6 Muestra del equipo 4 7 8

7. 8. 9. 10. 11. 12.

13. 14. 15.

Colocar la tapa de la cmara y conectar las terminales a la fuente de poder. Encender la fuente de poder ajustando el voltaje a 100. Oprimir el botn de inicio y dejar correr la electroforesis por un tiempo de 30 min. Transcurrido el tiempo se detiene la electroforesis y se retira la tapa. Tomar el gel con la ayuda de la charola y llevarlo al recipiente de tincin. Verter con cuidado el gel. Aadir 60 mL de la solucin de bromuro de etidio con mucho cuidado, tomando todas las medidas de precaucin (usar guantes). Ya que el bromuro de etidio es un agente mutagnico. Dejar teir el gel por un tiempo de 10 a 15 min. Transcurrido el tiempo, colocar el gel con mucho cuidado (utilizando guantes) en el transluminador de luz UV. Utilizando la tapa protectora de UV. Se enciende la lmpara UV. Observar los resultados e interpretarlos.

Resultados

Cuestionario 1. 2. 3. 4. Cules son los otros mtodos que existen para la separacin de ADN? Qu otros tipos de geles se utilizan para realizar electroforesis? Qu es un marcador de peso molecular? Cul es la funcin el bromuro de etidio? Menciona alguno de los cuidados que se deben tener en cuenta cuando se emplea.

Discusin

Conclusin

Referencias
1

Sobern Mainero Francisco Xavier. La ingeniera gentica, la nueva biotecnologa y la era genmica. Fondo de cultura econmica. 1996. Tercera edicin.
2

Scragg A. Biotecnologa para ingenieros. Sistemas biolgicos en procesos tecnolgicos. Ed. Limusa. 2007.