Avaliao do potencial citotxico de 2-piridiniformamida tiossemicarbazonas e de seus complexos de Fe(III) utilizando Artemia salina

ANDRIOLLI, A. C.1; SANTOS, D. da S.1; TEIXEIRA, S. C. G.1; TEIXEIRA, L. R.2; BERALDO, H.3; *ZIOLLI, R. L.1 1 Laboratrio de Estudos Ambientais (LEA) Departamento de Qumica Pontifcia Universidade Catlica do Rio de Janeiro PUC-Rio Rua Marqus de So Vicente, 225 Gvea Rio de Janeiro RJ CEP 22453-900 2 Laboratrio de Pesquisa em Qumica Inorgnica Departamento de Qumica Pontifcia Universidade Catlica do Rio de Janeiro PUC-Rio 3 Departamento de Qumica Universidade Federal de Minas Gerais Av. Antnio Carlos, 6.627 Pampulha Belo Horizonte MG CEP 31270-901 e-mail: *rlziolli@rdc.puc-rio.br Entrada: 4/6/07 Aceite: 7/11/07

Resumo: Tiossemicarbazonas e seus complexos metlicos possuem significativa atividade in vitro perante vrias linhagens de clulas tumorais humanas. No entanto, por tratar-se de compostos insolveis em gua, essas tiossemicarbazonas e seus complexos so menos promissores para testes in vivo. Com o objetivo de melhorar a solubilidade em gua, preparamos tiossemicarbazonas derivadas de 2-piridinoformamida e seus complexos de Fe(III), a partir de FeCl3.6H2O. Neste trabalho, os potenciais citotxicos de 2-piridinoformamida tiossemicarbazona (H2Am4DH) e de seus derivados N(4)-metil (H2Am4Me) e N(4)-etil (H2Am4Et), assim como de seus complexos de Fe(III), solveis em gua, foram testados utilizando Artemia salina. Os ligantes apresentaram menores valores de DL50 que seus respectivos complexos, sendo o H2Am4Me o mais ativo, com DL50 = 5,46 mg L-1. Pela complexao os valores de DL50 aumentaram, o que pressupe menor citotoxicidade. Entre os complexos testados, o [Fe(2Am4Me)2]Cl mostrou ser o mais promissor, com DL50 = 7,17 mg L-1. Testes preliminares indicam que as tiossemicarbazonas e seus complexos de Fe(III) tm atividade citotxica, sugerindo que poderiam igualmente apresentar ao antitumoral. Palavras-chave: Artemia salina; atividade citotxica; 2-piridinoformamida tiossemicarbazonas; complexos de Fe(III). Abstract: Thiosemicarbazones and their metal complexes possess substantial in vitro activity against various human tumor lines. However, due to their lack of solubility in aqueous solutions, these compounds are less promising for in vivo testing. In this work, the cytotoxic activity of 2-pyridineformamide thiosemicarbazone (H2Am4DH) and its N(4)-methyl (H2Am4Me) and N(4)-ethyl(H2Am4Et) derivatives as well as of their water soluble iron(III) complexes were tested using Artemina salina. The ligands exhibit lower values of LD50 than the complexes, H2Am4Me being the most active with LD50 = 5.46 mg L-1. Upon complexation the values of LD50 increase, indicating lower cytotoxicity. Among the three complexes, [Fe(2Am4Me)2]Cl proved to be the most promising (LD50 = 7.17 mg L-1). These results reveal these thiosemicarbazones and their iron(III) complexes as potential antitumoral agents. Keywords: Artemia salina; cytotoxic activity; 2-pyridineformamide thiossemicarbazones; Fe(III) complexes.

Introduo
Artemia salina um crustceo da ordem Anostraca (sem carapaa) que vive em lagos de gua salgada e em salinas de todo o mundo. Est adaptado para sobrevivncia em corpos de gua que sofrem grandes variaes sazonais e pode tolerar salinidades que flutuam de 3,5 a 70.

Por ser amplamente utilizado como alimento vivo para peixes e outros crustceos, seus ovos podem ser encontrados com facilidade em lojas de aquaristas. Alm disso, os ovos no eclodidos so metabolicamente inativos e podem ser conservados por longos perodos se mantidos desidratados e de preferncia em vcuo e a baixas temperaturas (IPIMAR, 2007). Quando reidratados, os ovos de Artemia salina eclodem em cerca de 24 horas, se em condies ambientais adequadas, chegando

19

Avaliao do potencial citotxico de 2-piridiniformamida tiossemicarbazonas e de seus complexos de Fe(III) utilizando Artemia salina

fase adulta com 20 a 30 dias de vida. Esse ciclo de vida relativamente curto favorece seu uso em testes de toxicidade aguda e crnica. O ensaio de toxicidade aguda com Artemia salina rpido, de baixo custo, eficiente e requer uma pequena quantidade de amostra (2-20 mg). A simplicidade desse teste, que no necessita de mtodos asspticos nem de equipamentos especiais, favorece sua utilizao rotineira, podendo ser desenvolvido no prprio laboratrio (Siqueira et al., 1998). McLaughlin et al. (1998) informam que esse ensaio tem boa correlao com atividade citotxica em alguns tumores humanos slidos e levou descoberta de Annonaceous acetogenins como nova classe de agentes antitumorais ativos. Os mesmos autores verificaram que os valores de ED 50 encontrados para citotoxicidade eram em geral 1/10 dos valores de LC50 observados nos testes realizados com Artemia salina, sugerindo que tal teste pode ser empregado como uma primeira anlise do potencial citotxico de novos compostos. Neste trabalho utilizamos Artemia salina para verificar o potencial citotxico de 2piridinoformamida tiossemicarbazonas e de seus complexos de Fe(III). As tiossemicarbazonas e seus complexos metlicos apresentam um amplo perfil farmacolgico e constituem uma importante classe de compostos cujas propriedades tm sido extensivamente estudadas na Qumica Medicinal, especificamente na Qumica Medicinal Inorgnica, em razo de sua capacidade quelante e do papel de coordenao no seu mecanismo de ao. As tiossemicarbazonas so hoje a segunda classe mais importante de compostos antitumorais depois dos derivados do cis-diaminodicloroplatina(II), o cisplatina (Beraldo & Gambino, 2004). Tiossemicarbazonas derivadas de 2-formil, 2-acetil e 2-benzoilpiridina e seus complexos de cobre(II) possuem atividade in vitro contra vrias linhagens de clulas tumorais humanas. No entanto, por tratar-se de compostos insolveis em gua, essas tiossemicarbazonas e seus complexos so menos promissores para testes in vivo (West et al., 1999). Com o objetivo de melhorar a solubilidade em gua, sintetizamos tiossemicarbazonas derivadas de 2-piridinoformamida (H2Am4R figura 1), nas

quais um grupo amino substitui um alquil ou aril em C(7) e seus complexos de Fe(III), a partir de FeCl3.6H2O. Os complexos obtidos so octadricos, solveis em gua, do tipo [Fe(2Am4DH)2]Cl (1), [Fe(2Am4Me)2]Cl (2) e [Fe(2Am4Et)2]Cl (3) (figura 2).

Figura 1 Estrutura de 2-piridinoformamida tiossemicarbazonas. R=H (H2Am4DH), R=CH 3 (H2Am4Me) ou R=CH3CH2 (H2Am4Et)

Figura 2 Estrutura dos complexos de Fe(III) de 2piridinoformamida tiossemicarbazonas (R=H, CH 3 ou CH3CH2)

Materiais e mtodos
A metodologia utilizada para os ensaios de toxicidade com Artemia salina foi baseada em Meyer et al. (1982), em Nascimento & Arajo (1999) e nas normas da CETESB-SP (1991).
Incubao

Em um recipiente retangular de 13,0 X 8,0 X 7,0 cm, com uma divisria contendo furos de aproximadamente 0,02 cm de espessura, espaados por 0,5 cm e distribudos uniformemente, foram adicionados 350 mL de soluo de sal marinho sinttico (Tropic Marin). O recipiente foi colocado dentro de uma incubadora iluminada por lmpada

20

Revista Sade e Ambiente / Health and Environment Journal, v. 8, n. 2, dez. 07

fluorescente. Em um dos lados do recipiente, adicionaram-se cerca de 46 mg de cistos de Artemia salina, tomando-se o cuidado para que eles no ultrapassassem a divisria. A parte do sistema com os cistos de Artemia salina foi coberto com papelalumnio, para que os organismos, ao nascerem, fossem atrados pela luz do outro lado do sistema, forando-os a atravessar a divisria. Tal procedimento visa a uma homogeneizao das condies fsicas dos organismos-teste. A incubao foi feita por um perodo de 48 horas. Durante todo o ensaio a temperatura foi monitorada.
Exposio

apresentassem qualquer tipo de movimento quando observados prximos a uma fonte luminosa. S foram levados em conta os testes nos quais o controle apresentou uma mortalidade igual ou inferior a 10% da populao. Os resultados foram submetidos a tratamento estatstico com uso do PROBIT, o qual forneceu os valores de DL50.

Resultados e discusso
A tabela 1 mostra, para as 2-piridinoformamida tiossemicarbazonas e seus complexos de Fe(III), os valores de DL50 e os limites de confiana obtidos da mdia das triplicatas para cada ensaio de toxicidade, assim como a mdia dos valores de DL50, o desvio-padro e a co-varincia (%) obtidos em cada composto.
Tabela 1 DL 50 para as 2-piridinoformamida tiossemicarbazonas e seus complexos de Fe(III)

Aps o perodo de incubao, os organismosteste (nuplios de Artemia) foram expostos s drogas de interesse por 48 horas, utilizando-se tubos de ensaio graduados, cada um com dez nuplios de Artemia salina, previamente selecionados. Os testes foram feitos em triplicata para cada concentrao de cada composto. Alm disso, cada droga foi testada ao menos trs vezes, totalizando um mnimo de nove ensaios por concentrao do composto. Determinou-se a faixa de concentrao a ser testada, buscando sempre a maior concentrao em que se observasse 0% de mortalidade e a menor concentrao em que se deflagrasse 100% de mortalidade. As demais concentraes foram distribudas dentro desse limite (Veiga et al., 1989), de modo a obter a DL50 (dose letal para 50% da populao) do composto testado. As solues dos compostos a serem testadas foram preparadas em 1% de DMSO (dimetilsulfxido) e avolumadas com soluo salina. Os testes para o controle tambm foram realizados em triplicata, com uso de uma soluo de DMSO 1% diludo em soluo salina. Os controles foram utilizados tambm para se ter certeza de que a mortalidade observada nos nuplios de Artemia salina foi resultante da toxicidade aos compostos e no por causa da falta de alimentao (Carballo et al., 2002).
Contagem

Aps 48 horas de exposio, procedeu-se contagem de nuplios vivos e mortos, sendo considerados vivos todos aqueles que

DL50 = dose letal para 50% da populao; DP = desvio-padro; CV = co-varincia

21

Avaliao do potencial citotxico de 2-piridiniformamida tiossemicarbazonas e de seus complexos de Fe(III) utilizando Artemia salina

Observa-se que em geral no houve grandes variaes nos valores de DL50 entre as replicatas de um mesmo composto. Os coeficientes de variao das replicatas ficaram entre 6,40 e 20,16%. Sabe-se pela literatura que os resultados dos testes de toxicidade variam consideravelmente. Em trabalho desenvolvido com Lytechinus variegatos (Nipper et al., 1993) foi encontrado um coeficiente de variao de 40,3% entre testes de toxicidade realizados com embries. Outros autores relatam ndices de variao em torno de 30%. Portanto, os ndices de variao obtidos neste trabalho so aceitveis, indicando que a metodologia utilizada forneceu dados que podem ser considerados repetveis. A tabela 2 resume os resultados mostrando o valor mdio de DL50 para os compostos estudados. Os ligantes H2Am4DH, H2Am4Me e H2Am4Et mostraram-se txicos nas concentraes de 6,88 mg L-1, 5,46 mg L-1 e 7,12 mg L-1, respectivamente. Os complexos 1 e 2 apresentaram toxicidade nas concentraes de 14,46 mg L-1 e 7,17 mg L-1, respectivamente. O complexo 3 no apresentou toxicidade at a concentrao de 48 mg L-1. Quanto menor o valor de DL50, mais txico o composto perante um organismo-teste e maior a sua atividade citotxica, sugerindo maior potencial como antitumoral.
Tabela 2 DL50 (valor mdio) para as 2-piridinoformamida tiossemicarbazonas e seus complexos de Fe(III)

Pimenta et al., 2003). Os ligantes mostram menores valores de DL50 que os complexos, e H2Am4Me o mais ativo, com DL 50 = 5,46 mg L -1. Pela complexao os valores de DL50 aumentam, o que indica menor citotoxicidade. Entre os trs complexos, [Fe(2Am4Me) 2]Cl (2) o mais promissor (LD50 = 7,17 mg L-1). Embora os ligantes tenham mostrado maior toxicidade que seus respectivos complexos de Fe(III), estes possuem a vantagem de serem solveis em gua, o que permitir que essas drogas sejam testadas in vivo futuramente. Como dito anteriormente, o complexo 3 foi o nico que no apresentou toxicidade at a concentrao de 48 mg L-1. Uma possvel explicao seria a presena de um grupo mais volumoso no nitrognio terminal (ver figuras 1 e 2), que poderia dificultar a penetrao da droga na clula do organismo-teste.

Concluso
Testes com Artemia salina indicam que as 2-piridinoformamida tiossemicarbazonas e seus complexos de Fe(III) tm atividade citotxica, sugerindo que poderiam igualmente apresentar ao antitumoral.

Agradecimentos
Agradecemos ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq/ PIBIC).

Referncias
DL50 = dose letal para 50% da populao * Valor mdio

Os compostos estudados, com exceo do complexo 3, apresentam significativa toxicidade aguda perante Artemia salina, em baixas concentraes, quando comparados ao Lapachol, que a droga de referncia (DL50 = 68 mg L-1) (Santos

Beraldo H, Gambino D (2004). The wide pharmacological versatility of semicarbazones, thiosemicarbazones and their metal complexes. Mini-Reviews on Medicinal Chemistry 4:159-165. Carballo JL, Hrnandez-Inda ZL, Prez P Garca, Grvelalos MD (2002). A comparison between two brine shrimp assays to detect in vitro citotoxicity in marine natural products. BMC Biotechnology 2:17.

22

Revista Sade e Ambiente / Health and Environment Journal, v. 8, n. 2, dez. 07

CETESB So Paulo (1991). gua do mar T de este toxicidade aguda com Artemia. Norma Tcnica L5.021, So Paulo. Instituto de Investigao das Pescas e do Mar IPIMAR. Disponvel em: <http://ipimariniap.ipimar.pt/crips/estacao_piscicultura/ artemia.html>. Acesso em: 17 maio 2007. McLaughlin JL, Rogers LL, Anderson JE (1998). The use of biological assays to evaluate botanicals. Drug Information Journal 32:513-524. Meyer BN, Ferrigni NR, Putnam JE, Jacobsen LB, Nichols DE, McLaughlin JL (1982). Brine shrimp: a convenient general bioassay for active plant constituents. Journal of Medicinal Plant Research 45:31-34. Nascimento IA, Arajo MMS (1999). Testes ecotoxicolgicos marinhos: anlise de sensibilidade. Ecotoxicology and Environmental Restoration 2(1):41-47. Nipper MG, Prosperi VA, Zamboni NS (1993). Toxicity testing with coastal species of southeastern Brazil. Echinoderm sperm and embryos. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 50:646-652.

Santos Pimenta LPS, Pinto GB, Takahashi JA, Silva LGF, Boaventura MAD (2003). Biological screening of Annonaceous brazilian medicinal plants using Artemia salina (Brine Shrimp Test). Phytomedicine 10:209. Siqueira JM, Bomm MD, Pereira NFG, Garcez WS, Boaventura MAD (1998). Estudo fitoqumico de Unonopsis lindmanii Annonaceae, biomonitorado pelo ensaio de toxicidade sobre a Artemia salina Leach. Revista Qumica Nova 21(5). Veiga LF, Vital NA, Portela MR, Oliveira FF (1989). Avaliao de faixa de sensibilidade de Artemia salina ao lauril sulfato de sdio. Petrobrs/Cenpes/Supesq/Diter, Rio de Janeiro, 64 p. il. (Projeto 04.05.27). West DX, Swearingen JK, Valds-Martinez J, Hernandez-Ortega S, El-Sawaf AK, Van Meurs F et al. (1999). Spectral and structural studies of iron(III), cobalt(II,III) and nickel(II) complexes of 2pyridineformamide N(4)-methylthiosemicarbazone. Polyhedron 18:2919-2929.

23