Fluorescencia

Utilidad: alta sensibilidad a cambios en las propiedades estticas y dinmicas de biomolculas y complejos intermoleculares. Qu es? De dnde proviene?

Principles of Fluorescence Spectroscopy Joseph R. Lakowicz J. Lakowicz Format:Textbook Hardcover, 2nd ed., 698pp. ISBN: 0306460939 Publisher: Kluwer Academic Publishers Pub. Date: January 1999

Topics in Fluorescence Spectroscopy Joseph R. Lakowicz (Editor) (Kluwer Academic/Plenum Publishers ) Volume 1: Techniques January 1992 Volume 2: Principles Volume 3: Biochemical Applications Volume 4: Probe Design and Chemical Sensing Volume 5: Nonlinear and Two-Photon Induced Fluorescence Volume 6: Protein Fluorescence November 2000

Biophysical Chemistry. C. R. Cantor and P.R. Schimmel. Vol. II, (1980), Freeman, New York. Applications of Fluorescence in the Biomedical Sciences. Eds. D. L. Taylor, A. S. Waggoner, F. Lanni, R. F. Murphy, and R. R. Birge. (1986), Alan R. Liss, Inc., New York.

1. L. Stryer and R.P. Haugland. Energy Transfer: A spectroscopic ruler. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 58, 719- 726 (1967). 2. L. Stryer. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Ann Rev. Biochem. 47, 819846 (1978). 3. Murchie, A.I. H. et al. Fluorescence Energy Transfer shows that the four w DNA junction is a - ay right- h anded cross of antiparallel molecules. Nature, 341, 763- 766 (1989). 4. Tuschl, T et al. A three d - imensional model for the hammerhead ribozyme based on fluorescence measurements. Science, 266, 785- 789, (1994). 5. T. Heyduk and J. C. Lee. Solution studies on the structure of bent DNA in the cAMP receptor protein lac DNA complex. Biochemistry, 31, 5165- 5171 (1992). 6. T. Heyduk and J.C. Lee. Application of fluorescence energy transfer and polarization to monitor E. coli cAMP receptor protein and lac promoter interaction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 17441748 (1990). 7. T. Heyduk et al. CAP interacts with RNA polymerase in solution in the absence of promoter DNA. Nature, 364, 548- 549 (1993)

Resumen
Interaccin de la luz con la materia Espectros, propiedades Fluorforos intrnsecos y extrnsecos Sensibilidad al medio. Quenching, polarizacin. Transferencia de energa Algo ms sobre fluorforos

EFTINK MR THE USE OF FLUORESCENCE METHODS TO MONITOR UNFOLDING TRANSITIONS IN PROTEINS BIOPHYS J 66 (2): 482 5 FEB 1994 - 01 ROSS JBA, SCHMIDT CJ, BRAND L TIME R ESOLVED FLUORESCENCE OF THE 2 TRYPTOPHANS IN HORSE LIVER ALCOHOL DEHYDROGENASE BIOCHEMISTRY U 20 (15): 4369 4 1981 S - 377

La luz
A =Amplitud V = frequencia fase
v = c/ (C = 3 x 108 m.s-1) Frequencia se pude convertir en energia (e): e = hv (h = 6.63 x 10-24 J.s ) escala 1 nm = 10-7 CM = 10

Interaccin de la luz con la materia

Puede causar transiciones entre los estados de energa de tomos o molculas. Estas transiciones ya sean electrnicas, vibracionales o rotacionales tienen energia cuantizada (definida).
Tipo de radiacin Rayos gama Rayos X ultravioleta visible Infrarrojo cercano infrarrojo microondas Ondas de radio rango <1 pm 1 nm 1pm 400 nm 1nm 750 nm 4 nm 00 2.5 m 7 nm 50 25 m 2 m .5 1 mm 2 m 5 >1 mm tipo de transicin nuclear electrones internos electrones externos electrones externos electrones externos vibraciones vibraciones moleculares rotaciones, cambios de spin cambios spin nuclear

= longitud de onda X

Niveles electronicos

Niveles vibracionales

1eV

Cromoforos son componentes de las moleculas que absorben luz (generalmente anillos aromaticos)
nuclear displacement

Diagrama de Jablonski
Conversin interna : en fases condensadas las moleculas rapidamente relajan al estado vibracional mas bajo del primer estado electrnico excitado

S0

S1

S1

S0

S2
(10-12s)

=
Cruce intersistema: prohibido (S0)

Fotones emitidos Fotones absorbidos

S1
(10-9s- 10-8s) (10-15s)

Tiempo de vida media

kr = f .k r ki
1 = f
i

T1
(10-6-102s)

Rendimiento cuntico

hA S0

hf

ki

= f

Absorpcin

Fluorescencia
(sin cambio de spin)

Fosforescencia
(prohibida (S0))

absorbancia

I0

Absorption spectrum

Absorcin

Medicin del espectro de fluorescencia

Longitud de onda

Intensidad de Fluorescencia

I A = log(T ) = log I 0

l
antraceno
1.2

1 2
M1=fijo

I 0 = I + I abs

(no reflected light)

detector

Absorbancia

I abs = I 0 1 10 A A = .l.C

Fl. Emisin

1.4

0.8

(M2) Intensidad de Fluorescencia

3 4

0.6

0.4

: coeficiente de extincin (M-1.cm-1)

l: largo de la celda (cm) C: concentracin (M) A=Absorbancia, T= Transmitancia

0.2

M1: monocromador de excitacin M2: monocromador de emisin

250 300 350 400 450 500

0 200

Longitud de onda (nm)

Fl. Excitacin

M2=fijo

(M1)

Resumen
Interaccin de la luz con la materia Espectros, propiedades Fluorforos intrnsecos y extrnsecos Sensibilidad al medio. Quenching, polarizacin. Transferencia de energa Algo ms sobre fluorforos

Propiedades de la emisin de fluorescencia:

1- El espectro de absorcin refleja los niveles vibracionales del estado excitado. El espectro de fluorescencia refleja los niveles vibracionales del estado fundamental 2- Corrimiento de Stokes : emission > absorpcin (aun para la transicin 0 0) 3- El espectro de emision no depende de la longitud de onda de excitacin porque hay relajacin muy rapida al nivel vibracional ms bajo del estado excitado. Excepcin: azuleno, puede emitir de S1 y S2. 4- La regla del espejo. El espectro de emisin a menudo se parece a la imagen especular del espectro de absorcin.

Corrimiento de Stokes
es la diferencia de energa entre el pico de excitacin y el de emisin.

Resumen
Interaccin de la luz con la materia Espectros, propiedades Fluorforos intrnsecos y extrnsecos Sensibilidad al medio. Quenching, polarizacin. Transferencia de energa Algo ms sobre fluorforos

Intensidad de Fluorescencia Unidades arbitrarias (u.a.)

Fluoresceina

Corrimiento de Stokes es 25 nm 495 nm 520 nm

Wavelength

Fluorescencia intrnseca de macromolculas

max.f

Fluorescencia de protenas
Triptofano es el fluorforo intrnseco dominante. Esta generalmente presente en aproximadamente 1mol% en las protenas. Una proteina puede tener uno o varios resudios triptofano. Si tiene uno o dos se facilita la interpretacion de los datos espectrales. Tryp es muy sensible al entorno. Es posible ver cambios en los espectros de emisin en respuesta a cambios conformacionales, asociacin de subunidades, unin de sustratos, desnaturalizacin y cualquier cosa que afecte el entorno local del anillo indol. Tambien, Trp es muy sensible al quenching colisional tanto por quenchers externos como por grupos vecinos en la protena. Trp puede ser excitado selectivamente a 295 3 nm. (para evitar la excitacin de la - 05 Tyr)

Mximo de emision y vidas medias para proteinas con un solo residuo triptofano
Usualmente determina la fluorescencia de las proteinas. Tyr es a menudo quencheado por triptofanos prximos

Protein Azurina RNaseT1 HAS Nuclease Monellina Glucagon ACTH

max(nm) 308 324 342 334 342 352 352

0(nsec) 4.0 3.5 6.0 5.0 2.6 2.8 3.1

Sensibilidad al medio
Efectos generales del solvente o medio: Relajacin de solvente (10-10s) Lippert
Espectro de emisin de la protena azurina de Pseudomonas fluorescens Pfl. Para la excitacin a 275 n se - m observa un pico de un residuo tirosina
2 2 1 n 2 1 ( E G ) ( A F ) = + constante hC 2 + 1 2n 2 + 1 a3

Fluorescencia

e
Absorcin

Trp propiedades espectroscopicas complejas: debido a la presencia de dos estados excitados casi isoenergticos. Las transiciones a estos estados tienen diferente absorcin y emisin y tienen diferente sensibilidad al entorno.

La posicin y estructura del espectro sugiere que el residuo indol esta en una regin no polar de la protena. Estos resultados coinciden con los datos cristalogrficos que muestran que el residuo esta en la regin hidrofbica de la protena. En presencia de un agente desnaturalizante, la emisin pierde su estructura y se corre a 351 nm, caracterstica de un residuo Trp totalmente expuesto Cambios en los espectros de emision pueden utilizarse para seguir el folding.
+ polaridad de solvente

Fluorforos extrnsecos Fluor extr

Prodan has both an electron dnor and an electron a - o - cceptor substituent, resulting in a large excited s dipole moment and - tate extensive solvent polaritydependent fluorescence shifts

1,8-ANS has proved to be a sensitive probe for partially folded intermediates in protein folding pathways. The basis of these applications is the strong fluorescence enhancement exhibited by these amphiphilic dyes when their exposure to water is lowered. Consequently, fluorescence of ANS increases substantially when proteins to which it is bound undergo transitions from unfolded to fully or partially folded states that provide shielding from water. Molten globule intermediates are characterized by particularly high ANS fluorescence intensities due to the exposure of hydrophobic core regions that are inaccessible to the dye in the native structure.

www.probes.com

Normalized emission spectra of prodan in 1) cyclohexane, 2) dimethylformamide, 3) ethanol, and 4) water

The spectral sensitivity of Prodan fluorescence excitation and emission spectra to the phase state of phospholipid multilamellar vesicles has been compared in vesicles composed of pure gel, pure liquid c - rystalline, and an equimolar mixture of the two phases
Biophys J, April 1998, p. 1984-1993, Vol. 74, No. 4

Fluorescence enhancement of 1,8-ANS (1anilinonaphthalene-8-sulfonic acid, upon binding to protein. The image shows aqueous solutions of 1,8-ANS excited by ultraviolet light. Addition of protein (bovine serum albumin) to the solution in the cuvette on the left results in intense blue fluorescence. The fluorescence of uncomplexed free dye in the cuvette on the right is negligible in comparison.

Fluorescence emission spectra of equal concentrations of 1,8-ANS in ethanol:water mixtures. The labels adjacent to each curve indicate the percentage of ethanol in the solvent mixture.

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Quenching
de proteinas ha sido utilizado extensamente para estudiar el grado de exposicion de residuos Trp a agua. El quenching colisional requiere que el fluorforo y el quencher se encuentren en contacto molecular. Un quencher polar o inico, soluble en agua no penetrar facilmente la matriz hidrofbica de la proteina. kQ refleja la eficiencia de quenching o la accesibilidad de los fluoroforos al quencher. El quenching controlado por difusin resulta tipicamente en valores de kQ ~ 1010 M-1s-1.

F
*

hexc kr

F*
Apoazurina Ade tiene dos residuos Trp, uno superficial y otro interno. En presencia de ioduro (quencher colisional), el espectro se parece a la emisin estructurada vista en medios no polares. El espectro del Trp quencheado se puede ver restando ambos espectros experimentales (antes y despues de quenchear).

F F + hem Fluorescencia kQ[Q] F *+Q F + Q Quenching kIC * F F + heat Conversin

interna

= 0

kr

k r + k IC + kQ [Q] kr kr + k IC

sin quencher

Stern-Volmer
kQ I 0 [Q ] = 1 + 0 kQ [Q ] = 0 = 0 = 1+ k r + k IC I
[ O2 ] , (M)

El bromuro de etidio es uno de los colorantes ms utilizados. Se intercala entre las bases aromicas del ADN de doble cadena. BE es muy poco fluorescente en agua y su intensidad aumenta como unas 30 v - eces al unirse a ADN. Otros colorantes como acridina tambien se unen por intercalacin.

Anisotropa de Fluorescencia

Fotoseleccin

Dipolo de transicin de la excitacin Dipolo de transicin de la emisin

= cos 2

Probabilidad de absorcin = cos

2

Anisotropa de Fluorescencia
I || (t ) I (t ) I || (t ) + 2 I (t )

Efecto de la difusin rotacional

I
ns timescale -

I//

r (t ) =

Polarizador De excitacin

I Polarizador de emisin

Polarizacin:
P(t ) = I|| (t ) I (t ) I || (t ) + I (t )

r0 = (3 cos 2 1) / 5
P= 3r 2+r
Muestra

kT 1 1 = (1 + f ) r r0 Vh
1 r
1 r0
T

3 factores: Orientacin del dipolo de absorcin Orientacin relativa entre los dipolos de absorcin y emisin Ordenamiento de la muestra

f 1 1 = (1 + ) r r0 c c = Vh / kT

A
Molcula 1
Intensidad

FRET
Molcula 2 Emisin
DONOR ACEPTOR

D*

A*

Cuando un antgeno marcado con un grupo fluorescente se une al anticuerpo su anisotropa cambia de 0 a 0.4. Por qu?

D*

(Emisin)

Absorcin

Absorcin

1-10 nm Emisin del donante debe superponerse con la excitacin del aceptor E varia con la 6th potencia de la distancia Donante-Aceptor Consecuencias Intensidad del donante decrece Vida media del donante decrece Intensidad del aceptor aumenta

Longitud de onda

Aceptor

Transferencia de Energa Energ

FRET: Frster

Usos en biologa Informacin estructural

Sentido de giro Helicoidal del ADN E. Jares-Erijman, &T. M. Jovin; J. Mol. Biol. 257, 597 (1996).
D

Donante

Donante

kT

9000 (ln10) 2 QD FD()A() d 128 54NR6D 4

FRET A

R06

9000 (ln10) 2 QD FD()A() d 128 54N 4 Estructura de la ribozima cabeza de martillo Tushl, T., Eckstein, F., Science 257, 597 (1996).

E=

kT kT+kr+knr

1 + (R/Ro) 6

Usos en biologa Dinmica

Cambios conformacionales en quinesina Por unin de nuclesidos. Rice et al. uni nucle sidos. al. Nature 402, 778-784 (1999). 402, 778-

Usos en biologa Interacciones entre biomolculas

433 nm 476 nm FRET 527 nm

Unin de calmodulina al Uni Calmodulin binding peptide (CBP). Tsien et al. Science 280, al. 280, 1954-1955 (1998). 1954-

Rotacin de subunidades en el canal de Rotaci potasio Shaker producido por un cambio en el potencial de membrana. Cha et al. Nature 402, membrana. al. 402, 809-813 (1999). 809

Propagacin de seal del receptor ErbB1 en la membrana plasmtica; Verveer, P. J., et al. Science 290, 1567-1570 (2000). Interaccin del receptor EGF y Grb2 visualizado por FRET Sorkin, A., et al., Current Biology 10, 1395-1398 (2000).

Aplicaciones

Molecular beacons

Interaccin protenaprotena

Cambio conformacional

FRET

Fluorforos
Intrnsecos: triptofano Extrnsecos: colorantes Clase especial Codificados geneticamente: GFP y camaleones; FlAsH

CCPGCC codificado por fusin a la protena de inters

Monomeric VPs

Ro for FRET between GFP variants and dsRED

Acceptor Donor Blue Cyan
Brand1.mov

Ro (nm) Yellow 3.8 4.9 5.6 5.1 3.1 dsRed 3.2 4.2 4.7 4.9 3.5 4.1 4.8 4.7 3.3 2.8

Blue 2.6

Cyan 3.8 3.3 1.9 1.0 1.4

Green

Green (EGFP) Yellow DsRed

from George Patterson, David Piston & B. George Barisas Anal. Biochem. 284:438-400 (2000) Zhang et al. Nature Rev. Cell Molec. Biol. 3: 906-918 (2002)

Fluorforos extrnsecos: Sondas para iones: Ca 2+ Fluor extr nsecos:

Calcium imaging has potential for both investigating the molecular mechanisms that underlie calcium flux and regulation and visualizing the activity of excitable cells by monitoring the calcium responses A pyramidal neuron from rat hippocampus was first exposed to Alzheimers a - myloid peptide and then to the excitatory amino acid glutamate. Confocal laser s - canning microscopy imaging using the intracellular Ca2+ indicator fluo 3 shows that a - myloid peptide destabilizes the neurons calcium homeostasis and increases its vulnerability to excitotoxicity. False c image of free Ca2+ concentration - olor in a Purkinje neuron from embryonic mouse cerebellum. Neurons were grown in dispersed tissue culture for 12 days, loaded with the pentapotassium salt of fura 2(F 1 - 200) using a microelectrode and then challenged with trans ACPD, an agonist of metabotropic glutamate receptors, in the absence of extracellular Ca2+. The composite image, which represents the ratio of images obtained with excitation at 340 nm and 380 nm, reveals the mobilization of internal Ca2+ stores without contribution from Ca2+ influx.

Fluorescence excitation spectra of fura 2in solutions containing 039.8 M free Ca2+. -

Fluorescence excitation ratio versus Ca2+ concentration curves for fura 2(red), fura 5 - F (orange), fura 4 (green) and fura 6 (blue). - F - F

Ca2+ d - ependent fluorescence excitation spectra of fura 4 - F

Elegans.mov

Acetoxymethyl (AM) ester loading Acid loading (particularly applicable to plant cells) ATP induced permeabilization Cationic liposome delivery Electroporation Hypoosmotic shock Our Influx pinocytic cell loading reagent -

Schematic diagram of the processes involved in loading cells using membrane p - ermeant acetoxymethyl (AM) ester derivatives of fluorescent indicators, in this case fura 2 Note the generation of potentially - . toxic byproducts (formaldehyde and acetic acid).

Pseudocolor movie of calcium transients in the pharyngeal muscle of an intact Caenorhabditis elegans. The calcium indicator is cameleon (Miaywaki et al., Nature 388:882), a ratiometric fluorescent calcium sensor containing CFP and YFP. An increase in calcium increases the YFP emission while decreasing the CFP emission. Color indicates calcium level on a rainbow scale: red hues correspond to high calcium (high YFP/CFP intensity ratio), while blue hues correspond to low calcium (low ratio). The graph displays average ratio (y axis) vs. frame number (x axis; 20 frames/sec). During contraction, the terminal bulb of the pharynx opens to let in food; note the simultaneous increase in calcium (red in images, upwards on graph). Details of the recording method have been published (Kerr et al. 2000. Neuron 26:583 94).

Fluoroforos sensibles a cambios en el potencial de membrana

Site-specific labeling
CCPGCC genetically fused to the protein

of interest forms a covalent complex with the As atoms in the dye

Cartoon of the mechanism for voltage sensing via FRET frame Coumarin to a mobile oxonol molecule in the membrane.

Structure and charge, at physiological pH, of N-(6-chloro-7hydroxycoumarin-3-carboxamidoacetyl) dimyristoylphosphatidylethanolamine

Small molecules vs. FP

Less steric bulk Faster rates of labeling Provide readouts other than fluorescence Membrane permeable

Pulse-chase experiments

Junctional plaque renewal over time

Quantum Dots

Features (advantages)
Photostability Brightness

(CdSe) (ZnS)

Narrow emission band size tuneable wavelength Broad excitation spectrum Streptavidin and other bioconjugates (Protein A, G; Ab,...) Non-toxicity FRET Blinking

Commercial sources: Quantum Dot Inc., Evident Technologies Patrick Frederix, Spectral Analysis in microscopy (FRET & single QD luminescence)
PhD, Utrecht Univ. 2002

QDots en biologa biolog

Core Espectro de excitacion ancho Emision angosta Alta fotoestabilidad

Qdots

Core Shell (mayor rendimiento cuntico y fotoestabilidad) Revestimiento polimrico Streptavidina 15-20 nm

3 nm

5.5 m

6:1 EGF-QD

erbB3-citrineFP A431 cells

QD-EGF binds to the endogenous non-fluorescent erbB1 receptors and activates

CHO cells erbB1-eGFP + 200 pM 6:1 QD-EGF 22 Confocal, 4 s period, 490 images 10 frames/s

LidkeMov1.mov

QuickTime and a decompressor are needed to see this picture.

LidkeMov3.mov

The QD-EGF-erbB1 complexes move down the filipodia; the directed motion continues after crossing the cell body periphery erbB3 remains on the cell surface it is not internalized with erbB1
Nature Biotechnology 22 (2), 198 2 2004. - 03,

Desirable Fluorophore
brilliance high absorption (, ) high fluorescence yield Qf high turnover number (kf) (short lifetime; unless one is measuring slow rotation) high photostability (low photobleaching rate)

other issues
want to exploit triplet) large (or small) Stokes shift high (for orientation or emFRET) or low (e.g. for distance-FRET) polarization Size?

low triplet population (unless

Jares-Erijman & Jovin FRET Imaging Nat. Biotechnol. (2003) 21:1387-1395