Desarrollo de una mezcla nutritiva in Vitro para bioestimulacin de bacterias degradadoras de hidrocarburos

Chvez V-S 1. y Ferrufino E.2 Universidad Catlica Boliviana San Pablo , Av. Gral. Galindo No. 5381, Cochabamba, Bolivia 2 Centro de Biotecnologa. Universidad Mayor de San Simn. Cochabamba, Bolivia Calle final Sucre frente al Parque La Torre (Campus universitario) Tel/Fax. 4-4542895 e-mail: scarlet.vogel@gmail.com1 - nanferru@hotmail.com 2

Palabras clave: Hidrocarburos, fertilizantes, Bacterias, bioestimulacin, biomasa

Resumen
El objetivo de este trabajo fue estimular la formacin de biomasa de cinco cepas bacterianas degradadoras de hidrocarburos a travs del desarrollo de una mezcla nutritiva. Para esto, se combinaron tres fertilizantes con tres mezclas de sales y crudo de petrleo. Se evalu la biomasa visible como indicador de consumo del carbono proveniente del crudo. El crecimiento de las colonias fue evaluado utilizando una escala nominal. Esta escala asigna un valor a las caractersticas de las colonias formadas tomndose en cuenta el rea de cobertura y el desarrollo de las colonias. Se determin si existe formacin de biomasa en el medio nutritivo sin crudo, para determinar si la formacin de biomasa es atribuible exclusivamente al consumo del hidrocarburo. Los resultados mostraron que: existe un efecto sinrgico entre sales y fertilizantes, la combinacin de sales que induce la mayor formacin de biomasa en todas las cepas es QM y 18-46-0 (r2>0,727,Pr<0.05).

Desarrollo de una mezcla nutritiva in Vitro para bioestimulacin de bacterias degradadoras de hidrocarburos Chvez V-S 1. y Ferrufino E.2 1 Universidad Catlica Boliviana San Pablo , Av. Gral. Galindo No. 5381, Cochabamba, Bolivia 2 Centro de Biotecnologa. Universidad Mayor de San Simn. Cochabamba, Bolivia Calle final Sucre frente al Parque La Torre (Campus universitario) Tel/Fax. 4-4542895 e-mail: scarlet.vogel@gmail.com1 - nanferru@hotmail.com 2

1.

Introduccin

La biorremediacin, es un tratamiento biolgico, en el que se estimula el metabolismo de los hidrocarburos por parte de los microorganismos. La degradacin de los contaminantes es parte del proceso metablico de los microorganismos. El flujo de electrones entre sustratos donadores y receptores es esencial para crear y mantener la biomasa activa. Los sustratos donadores y receptores involucrados directamente con el proceso se denominan primarios [6,10]. Para la bacteria activa en la degradacin de hidrocarburos, el donante de electrones primario puede ser uno de los compuestos a mineralizar. Aunque, no siempre resulta de esta manera. Porque, dicho compuesto puede ser tambin un sustrato secundario [6,10]. La biorremediacin se puede llevar a cabo de dos maneras: incorporando bacterias (bioaumento) o estimulando el metabolismo de las bacterias nativas, mediante la adicin de nutrientes (bioestimulacin). En tratamientos por bioestimulacin se usan fertilizantes para mejorar la cintica de remocin de los hidrocarburos [5,7,10,11]. Sin embargo, los costos relacionados con el proceso de seleccin de nutrientes pueden alcanzar fcilmente los 6 mil dlares. En el presente trabajo se busca una forma econmica para estimular la formacin de biomasa de cinco cepas bacterianas degradadoras de hidrocarburos a travs del desarrollo de una mezcla nutritiva.

2.

Materiales y mtodos

Segn Pardo et al. (2004), el rango de temperaturas ptimo para el metabolismo de hidrocarburos se encuentra entre 30 y 40C. En base a esta informacin y en el presente trabajo, la temperatura de incubacin de las cepas fue mantenida a 30C. Durante la preparacin de los medios de cultivos, se llev el pH a 7. Muchos autores recomiendan mantener en este valor de pH para el proceso de remediacin de hidrocarburos [2,7,11]. Lugar de origen de los microorganismos y algunas caractersticas: Las cepas bacterianas usadas provienen del Centro de Biotecnologa (CBT) de la Universidad Mayor de San Simn (Cochabamba Bolivia). Estas cepas estn codificadas como II1, II3, P10, P12 y P2, provienen de un proceso de aislamiento y purificacin de muestras de suelos empetrolados en el Parque Nacional Carrasco, Cochabamba-Bolivia [15]. El tiempo de crecimiento de las cepas II1 y II3 en el que forman colonias visibles, en medio slido, es aproximadamente 8-10 horas. La cepa P2 crece aproximadamente a 12-16 horas. Las cepas P10 y P12 crecen en una semana.

Preparacin de los medios de cultivo: Se prepararon nueve tratamientos estructurados en factorial completo, estos se componan de dos niveles: fertilizantes (18-46-0, 15-15-15 o rea) y sales de medios de cultivo (HM, QM o PTYG). Durante la preparacin de las mezclas nutritivas se utilizaron slo las sales de los medios de cultivo QM, HM y PTYG. Los medios QM y HM fueron creados para bacterias halfilas quimiolittrofas y hetertrofas correspondiente [ghfh]. Sin embargo, en estudios preliminares (datos no reportados) estos medios han probado ser muy efectivos en la estimulacin del crecimiento de las cepas bacterianas usadas en este estudio. El medio PTYG es un medio para bacterias en suelos [hjjj]. El medio de cultivo QM contiene (por l): 20 g extracto de levadura, 10 g peptona, 8.7 g MgCl2, 3 g MgSO4 7H2O, 1.25 g KCl, 1 g Ac. Ctrico, 0.25 g CaCl2, 0.125 g NaBr, 0.05 g NaHCO3 y pH=7. El medio de cultivo HM contiene (por l): 5 g extracto de levadura, 2.5 g peptona, 1 g Glucosa, 0.25 g MgSO4 7H2O, 0.5 g KCl, 0.09 g CaCl2, 0.06 g NaBr y pH=7. El medio de cultivo PTYG contiene (por l): 5 g extracto de levadura, 5 g peptona, 10 g Glucosa, 5g de tryptona, 0.6 g MgSO4 7H2O, 0.06 g CaCl2 y pH=7. Para la preparacin de las mezclas nutritivas en medio slido las proporciones de las sales de los medios de cultivo se mantuvieron y se agreg 1.5% en peso de fertilizantes, previamente molido, y pH=7. La esterilizacin se realiz a 121 C durante 15 minutos. A la mezcla obtenida se agreg crudo al 1.5% en peso y se agit en la placa magntica durante 5 minutos hasta observar una mezcla homognea. Posteriormente, se trasvas el contenido a cajas petri y se dej enfriar a temperatura ambiente. Generacin de biomasa en ausencia de hidrocarburo: Para determinar si la generacin de biomasa se deba principalmente al carbono del hidrocarburo y no a algn aditivo de los fertilizantes. Se realizo una prueba en la cual se prepar tres mezclas nutritivas compuestas de los tres fertilizantes, pero slo con la mezcla de sales de QM. Esto ltimo porque esta mezcla es la que contiene todos los nutrientes de los otros dos medios y otros adicionales. Se prepararon los medios slidos modificados con 1,5% en peso de fertilizante y sales del medio QM. Se us un pre-inculo y un inculo con una densidad ptica (DO) de 0.5 de cada una de las cepas y se sembr extendiendo con un asa de vidrio. Cuando el crecimiento en las cajas petri se haba estabilizado (no aparecen nuevas colonias), se tomaron los datos de forma semi cuantitativa utilizando la escala nominal elaborada. Se tom en cuenta sus diferencias con respecto a la velocidad a la que crecen. Seleccin de medio nutritivo: Se us un diseo experimental completamente aleatorio con tratamientos estructurados en factorial completo para evaluar las mezclas nutritivas en cada cepa. Se probaron 9 tratamientos compuestos por dos niveles: los fertilizantes y las sales. Cada unidad experimental tuvo tres repeticiones. Se realizo un anlisis de la varianza y en el caso de que fuera necesario se procedi a una transformacin de datos para obtener una distribucin normal. Los datos fueron analizados con el paquete estadstico SAS con procedimientos de modelos lineales generalizados proc glm. La informacin se presenta en graficas, en las que se muestran slo el resultado de las interacciones entre ambos niveles y las desviaciones estndar en forma de barras de error. Se prepar el pre-inculo y el inculo para una cepa. Se prepararon los medios segn los nueve tratamientos y se los verti en cajas petri. Las pruebas se realizaron por triplicado. Se sembr por extensin y se incub hasta que el crecimiento se estabiliz, en ese momento se tom los datos segn la escala nominal creada. Se procedi de esta manera para todas las cepas exceptuando la cepa P2.

Para la cepa P2: Se prepar el pre-inculo y el inculo para esta cepa. Se prepararon los nueve tratamientos anteriores y se incluy 3 tratamientos adicionales sin hidrocarburo. Estos tres tratamientos son los mismos usados para la prueba de fuentes de carbono. Y se procedi de la misma manera que en las otras cepas. Para determinar si las cepas bacterianas siguen vivas despus de haber crecido en el medio con fertilizantes, sales e hidrocarburos se las sembr nuevamente en su medio de mantenimiento. Esta actividad sirvi tambin, para determinar en algunos casos, si ocurri crecimiento no fcilmente perceptible.

3.

Resultados

Elaboracin de la escala nominal para la evaluacin de biomasa visible: Los compuestos hidrocarbonados pueden ser sustratos primarios de los cuales las bacterias utilizan el carbono de las molculas para producir biomasa y energa [10]. Tomando en cuenta lo anterior, se evalu la formacin de biomasa como indicador principal de la degradacin de hidrocarburos. Para esto, primeramente, se determin si el crudo de petrleo se constitua en la nica o principal fuente de carbono para la formacin de biomasa para todas las bacterias utilizadas. Por esta razn, no se agregaron la glucosa, extracto de levadura, peptona y triptona. En la formulacin de la escala nominal en s, se tom en cuenta dos caractersticas notables que se observaban en el crecimiento microbiano. El nmero de colonias que crecen exitosamente hasta formar una colonia visible y el tamao de las colonias que llegan a formar. Como el objetivo principal es obtener la mayor formacin de biomasa a partir de los nutrientes suministrados. Se tena que tomar en cuenta que, a veces se obtena el mismo nmero de unidades formadoras de colonias pero el tamao de las colonias era notablemente diferente. Por tanto, no se estara cumpliendo el objetivo del trabajo, que es mejorar la formacin de biomasa. Por otra parte, el crecimiento de las colonias no era lo suficientemente grande para ser cuantificable y en algunos casos casi ni perceptible a simple vista. De esta manera se decidi trabajan con un inculo con una elevada densidad ptica. De esta manera sera ms fcil apreciar el efecto de los nutrientes en la formacin de biomasa, segn la cobertura y el grosor de las colonias.

Figura 1. Ejemplos de diferentes resultados obtenidos. A) No se observa crecimiento. Ntese los encharcamientos de crudo en la superficie del medio de cultivo. B) Se observa crecimiento en la superficie del mismo medio de cultivo en A pero con una cepa diferente. C) Crecimiento muy prolfico con la misma cepa que en B en diferente medio de cultivo. Ntese las diferencias morfolgicas de las colonias entre medios diferentes.

Generacin de biomasa en ausencia de hidrocarburo: Las cepas II1, II3, P12 y P10 no presentaron crecimiento (figura 2 A). La cepa P2 present crecimiento, por este motivo se incluy un testigo en la prueba de seleccin de la mejor mezcla de sales y fertilizante. El crecimiento de P2 es estimulado de la misma manera por los tres fertilizantes. Por lo tanto, se cree que el carbono usado por esta cepa proviene de algn aditivo de los tres fertilizantes.

Figura 2. Los valores en la escala nominal de cada tratamiento representan el valor promedio de las tres repeticiones A) Se observa la valoracin del crecimiento de la cepa P2 en los medios sin hidrocarburo.(Desviacin estndar (DS)=0.61).B) Crecimiento de la cepa II1, la combinacin de 18-46-0 y QM causa la mayor formacin de biomasa (DS=0.69). C) Crecimiento de la cepa II3 La combinacin de 18-46-0 y QM causa la mayor formacin de biomasa (DS=0.46). D) Crecimiento de la cepa P2 el fertilizante 18-46-0 juntamente con las sales de QM y el fertilizante rea con las sales de QM, causan la mayor formacin de biomasa (DS=0.24). E) Crecimiento de la cepa P10 Las combinaciones de fertilizante 18-46-0 con sales de QM, 15-15-15 con sales de QM y 18-46-0 con sales de PTYG maximizan la formacin de biomasa (DS=0.41). F) Crecimiento de la cepa P12 las combinaciones de fertilizante 18-46-0 con sales QM o el fertilizante 15-15-15 con sales PTYG o HM maximizan la formacin de biomasa (DS=0.48).

Seleccin de mezcla de sales y fertilizante: El anlisis de varianza para el crecimiento de la cepa II1, II3, P2, P10 y P12 indica que existe interaccin entre las sales y los fertilizantes (Pr< 0,05). De acuerdo con los valores de las medias y las pruebas de hiptesis, el fertilizante 18-460 conjuntamente con las sales de QM producen el mejor efecto sobre el crecimiento de II1(r 2= 0,727, Pr<0,05), y II3 (r2=0,845, Pr<0,05). Los valores obtenidos durante las pruebas se pueden observar en la figura B y C para las cepas II1 y II3 respectivamente. El crecimiento de la cepa P2, (Figura 2 D) fue mayor utilizando el fertilizante 18-46-0 juntamente con las sales de QM y el fertilizante rea con las sales de QM (r 2=0,963, Pr<0,05). El testigo sin hidrocarburo presenta menor crecimiento en comparacin a otros tratamientos (Pr < 0,05). El efecto observado entre testigos es el mismo (Pr < 0,05) por tanto, la mezcla de sales no contribuye a la formacin de biomasa. Se puede atribuir la formacin de biomasa generada a algn componente de los fertilizantes. En la figura 2 E se pueden observar los promedios de la evaluacin del crecimiento de la cepa P10. Las combinaciones de fertilizante 18-46-0 con sales de QM, 15-15-15 con sales de QM y 18-46-0 con sales de PTYG maximizan la formacin de biomasa (r 2=0,977, Pr<0,05). El anlisis de varianza para el crecimiento de la cepa P12, indica que las combinaciones de fertilizante 1846-0 con sales QM o el fertilizante 15-15-15 con sales PTYG o HM maximizan la formacin de biomasa (r2 = 0,919, Pr < 0,07) (figura 2 F). Al modificar los medios enriquecidos y quitar la glucosa, peptona, triptona y extracto de levadura y aadir el hidrocarburo se ha sometido a las bacterias a un estrs por aminocidos y fuente de carbono. Por lo tanto, se esperaba una modificacin en la morfologa de algunas cepas. Las bacterias suelen modificar su morfologa cuando existen cambios en el contenido nutritivo de su medio o algn otro cambio en las condiciones. Durante esta prueba se determin que los cambios observados en las cepas bacterianas no eran permanentes. Y recuperaban sus anteriores caractersticas al ser trasladados nuevamente a su medio de mantenimiento.

4.

Conclusiones

Como resultado en comn se ha observado que la mezcla de sales de QM y el fertilizante 1846-0 maximizan en todos los casos el crecimiento de las cinco cepas (r2 > 0,727, Pr<0.05). Recomendndose el uso de esta mezcla de nutrientes para las pruebas posteriores.

Referencias Bibliogrficas
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