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TP Genetique Sv3 Version 11 12
TP Genetique Sv3 Version 11 12
GÉNÉTIQUE
TRAVAUX PRATIQUES
Année universitaire :
2011-2012
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GÉNÉRALITÉS
L’objectif des travaux pratique de génétique est de vous familiariser avec les matériaux et les méthodes les
plus courantes dans ce domaine.
Afin de participer à ces séances d’une manière rentable et efficace chaque étudiant doit se munir de :
- Une blouse blanche ;
- Une machine à calculer individuelle ;
- Et de tout matériel spécifique à certaines séances réclamé par voie d’affichage.
De plus, il est absolument nécessaire d’être familier avec la manipulation d’outils et de techniques dont les
plus importantes sont :
I- LE MICROSCOPE PHOTONIQUE
a- Conseils généraux :
Le microscope optique est un instrument de précision, il est conseillé de :
- le manipuler avec soin en évitant les chocs et les mouvements brusques (le porter pour
le déplacer et ne jamais le pousser ou le tirer) ;
- Eviter de l’exposer aux rayons directs du soleil ou à la poussière ;
- Ne jamais tourner en sens contraire les deux vis de mis au point ;
- Nettoyer les lentilles avec un papier absorbant pour enlever les traces grasses ou les
empreintes digitales.
b- La mise au point :
Il faut toujours :
- Vérifier que l’objectif dont la valeur numérique est la plus faible (x10) est au dessus de la
préparation.
- Abaisser la platine à son point le plus bas en tournant la vis macro métrique.
- Placer votre préparation sur la platine.
- Fermer le diaphragme pour avoir le minimum d’intensité lumineuse.
- Regarder dans les oculaires, les régler à ces yeux puis remonter la platine à l’aide de la vis
macro métrique jusqu’à apparition d’une seule image.
- Ajuster l’image en tournant la vis micro métrique dans un sens ou dans l’autre.
c- Le grossissement :
- Tourner le revolver à objectifs pour changer de grossissement (x40).
- Ajuster l’image en tournant uniquement la vis micrométrique.
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d- L’éclairage :
Un diaphragme à iris est placé sous la platine. Il permet de régler l’intensité lumineuse qui éclaire la
préparation. Pour faire varier l’éclairage, commence par l’intensité lumineuse la plus faible (diaphragme
fermé).
e- Fin de séance
- Baisser la platine ;
- Retirer la préparation (lame et lamelles à mettre dans un bac à savon) ;
- Mettre le petit objectif dans l’axe optique ;
- Eteindre le microscope et débrancher la prise électrique ;
- Mettre la house sur le microscope ;
- Nettoyer votre paillasse (tout déchets sur la paillasse et par terre dans la poubelle).
Le titre explicatif (des titres du genre « tableau des données » n’ont aucun sens) doit figurer au dessus du
graphe ou tableau. Les lignes et les colonnes des tableaux ainsi que les axes doivent être libellés, sans
oublier les unités de mesure surtout sur les graphiques.
- 5- Conclusion : confronter les résultats aux questions formulées dans le but et le principe.
Les éléments de la construction d’un compte rendu de TP se trouvent dans le polycopié correspondant
sous forme d’introduction, de description ou de questions. Cependant, il faut éviter de recopier ce document
qui ne suit pas nécessairement le plan que nous avions recommandé. Dans la plupart des cas un compte
rendu (une feuille réponse) vous sera distribué au début de chaque séance.
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TP 1
MITOSE ET MÉIOSE
I- INTRODUCTION
Les cellules somatiques d'un organisme pluricellulaire dérivant par divisions successives ou mitose
d'une même cellule ou zygote.
La mitose est caractérisée par la réplication du matériel génétique ou chromosomes, et sa répartition entre
deux noyaux fils identiques. Elle est suivie de la cytokinèse ou la division du cytoplasme qui en résulte deux
cellules somatiques filles.
Dans une cellule diploïde (2n chromosomes), la taille et la forme d'un couple de chromosomes
homologues sont bien déterminées. Chacun de ces homologues porte deux allèles de même position.
Au cours de la formation du zygote, deux lots de n chromosomes, l'un d'origine maternelle, l'autre d'origine
paternelle ; sont réunis dans un même noyau par l'union des gamètes ou fécondation.
Les gamètes sont le résultat de la méiose au cours de laquelle le niveau de ploïdie des cellules
germinales est réduit de 2n à n chromosomes.
La fécondation, la mitose et la méiose sont les étapes du cycle biologique au cours duquel, il y a
perpétuation de l'espèce.
Au cours des divisions cellulaires les chromosomes sont visibles. Les différentes étapes sont
caractérisées par la disposition des chromosomes et leur condensation plus ou moins forte. On distingue
après coloration au carmin :
- L'interphase : noyau granuleux présentant de nombreux points colorés correspondant à la substance
chromatique hydrolysée.
- La prophase : noyau volumineux teinté de rose. Filaments rouges denses et confus (début) aux
chromosomes individualisés (fin).
- La métaphase : chromosomes dispersés dans le plan médian de la cellule. En vue polaire on peut les
dénombrer.
- L'anaphase : deux groupes identiques de chromosomes sont séparés l'un de l'autre.
- La télophase : deux lots de chromosomes sont groupés aux pôles de la cellule (début). Parfois, il apparaît
une membrane entre les deux cellules filles (fin).
Une explication détaillée, des différents stades mitotiques et méiotique, est fournie par les
planches du cours.
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- chauffer très légèrement pendant quelques minutes pour renforcer le contraste (Ne pas faire
bouillir).
- recouvrir avec une lamelle
- placer lame et lamelle entre les deux feuilles d'un buvard plié en deux et écraser légèrement du
doigt.
Chez Lilium regale des inflorescences mâles (étamines) sont recueillies et fixées 5 à 10 jours avant la
floraison en vue d'observer les phases de la méiose dans les anthères.
Les fleurs les plus basses sur l'inflorescence sont les plus intéressantes. Elles se présentent en paires
dont l'une est pédicellée et l'autre sessile, celle-ci étant la plus âgée.
- Prélever une fleur et la placer sur une lame.
- Retirer les anthères avec des aiguilles en évitant les pressions trop fortes.
- Les couper en deux avec la lame de rasoir dans une goutte de carmin acétique, tapoter légèrement avec
l'aiguille pour forcer les sporocytes à l'extérieur par la partie ouverte. Eviter de les briser.
- Piquer les anthères avec l'aiguille pour les enlever. Eviter les pousser de côté.
- recouvrir avec une lamelle.
- Chauffer légèrement pendant quelques minutes pour éclairer le cytoplasme et colorer les chromosomes.
Eviter l'ébullition.
- placer lame et lamelle entre les deux feuilles d'un buvard plié en deux et écraser légèrement du doigt.
- Repérer les différents stades au grossissement x 10.
- Passer au grossissement x40 pour une meilleure observation.
Ce protocole expérimental vous est fourni à titre indicatif. L’étude des figures de méiose s’effectuera
sur des préparations microscopiques (lames) ainsi que des planches.
Étude de la planche II
a- Donner le nom de chaque stade méiotique figurant sur cette planche.
b- Quel est le niveau de ploïdie des cellules figurant sur cette planche.
c- les stades méiotiques sont caractérisés par la présence des bivalents (les chromosomes se groupent par
deux).
1/ Quelles est le nombre de bivalent des stades c, d et e?
2/Quel est le nombre de chromosomes de l’espèce étudiée ?
d- En supposant qu’on a une cellule germinale hétérozygote pour deux gènes indépendants avec deux allèles
chacun (A/a et B/b). Indiquer les combinaisons possibles de leurs allèles, au cours des différents stades
méiotiques (cas de brassage interchromosomique).
e- Si les deux gènes sont portés par le même chromosome en position trans schématiser le devenir de ces
deux gènes au cours des différents stades de la méiose (avec absence ou présence de C.O. cas de
brassage intrachromosomique).
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V- ANALYSES CHROMOSOMIQUES : UNE INTRODUCTION Á LA
CYTOGÉNÉTIQUE :
A- Diagnostic prénatal
Tous les parents espèrent la naissance d’un enfant en bonne santé, et la majorité des bébés ne présente pas
de problème particulier à la naissance; cependant, environ un enfant sur 170 présente une anomalie
chromosomique qui va peser plus ou moins lourdement sur son développement, et un enfant sur 100 présente
une maladie génique due a un changement dans un gène6.
Certaines de ces situations peuvent être prévenues par un diagnostic prénatal.
25 mg dans tube contenant du milieu de culture frais, mis à disposition la veille du prélèvement. Délai de
résultat: 3 à 6 jours.
3- Analyses Fish
Sur liquide amniotique, hybridation fluorescente in situ en interphase, sans culture.
Prélèvement de 5 ml supplémentaires de liquide amniotique.
Le liquide ne doit pas être rouge ou brun car il pourrait dans ces conditions, contenir du sang maternel.
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C- Amniocentèse: du prélèvement au résultat
Les principales étapes sont :
1. Le prélèvement
2. Début de la culture
3. La culture cellulaire
4. La récolte et la coloration
5. L’analyse des cellules
6. Les résultats
1- Le prélèvement
Le prélèvement est réalisé sous contrôle échographique, chez le médecin traitant. Il est ensuite acheminé au
laboratoire où il sera enregistré et étiqueté.
2- Début de la culture
Les cellules du liquide amniotique sont récupérées par centrifugation puis ensemencées dans des boites de
culture qui seront placées dans un incubateur à 37°.
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3- La culture cellulaire
Les cellules en croissance nécessitent l’apport d’éléments nutritifs qui sont apportés par le milieu de culture.
Ces opérations s’effectuent stérilement.
4- La récolte et la coloration
Lorsqu’il y a suffisamment de colonies, la culture est arrêtée par la colchicine. Les chromosomes sont libérés par
choc hypotonique puis colorés par la trypsine puis le Giemsa.
Les cellules en division des colonies cellulaires sont photographiées. Les chromosomes d’une quinzaine de
mitoses sont comptés, découpés et classés.
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6-Les résultats
Caryotype normal masculin 46,XY Caryotype 46,XY,del(18), délétion partielle Caryotype 45,XX,der(13;14)translocation
du 18
D- Partie pratique :
Elle consiste en l’analyse de documents et de fiches techniques fournis dans un support informatique
portant sur les applications de la cytogénétique.
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TP 2
GÉNÉTIQUE DE LA DROSOPHILE
L'étude de la génétique d'une espèce donnée, nécessite une bonne connaissance de l'organisme
considéré autant que par sa morphologie, que sa physiologie, ainsi que par son cycle biologique.
La mouche du vinaigre Drosophila melanogaster (2n = 8) a été largement étudiée du fait qu'elle présente les
avantages suivants :
- Le temps d'une génération est court (10 jours à 25°C, voir cycle de reproduction en Fig.1).
- Son corps de petite taille permet qu’un grand nombre d'individus puisse être contenu dans un espace réduit.
L'insecte reste cependant assez grand pour que la reconnaissance des différents caractères soit aisée.
- La drosophile se reproduit au laboratoire en nombre suffisamment élevé, ce qui rend les analyses
statistiques précises.
- Enfin, il existe actuellement un grand nombre de lignées (plus de 1500) très bien caractérisées et
répertoriées, rendant ainsi possible toute étude génétique.
Le type sauvage est le type le plus fréquent dans la nature. C'est la référence pour déterminer les
nombreuses mutations morphologiques et autres, d'où la nécessité de sa bonne connaissance.
1- Le sexe
L'abdomen de la femelle se courbe postérieurement jusqu'à un point. Il présente des bandes noires séparées
le long de la face dorsale jusqu'au bout terminal.
Le mâle est généralement plus petit. Son abdomen a une terminaison ronde où les bandes sombres
fusionnent. Le premier tarsomère de la première paire de pattes présente une structure sombre sous forme de
peigne appelé le peigne sexuel (voir Figures 2 et 3).
3- Les antennes
Noter la forme et les embranchements.
4- Les soies
Sont des organes sensoriels hérités selon un mode constant.
Noter la différence de taille entre les soies courtes nombreuses et les soies longues. Localiser les différents
types.
5- L'aile
- Observer la forme, la longueur, la position au repos et la couleur.
- Observer la position des veines longitudinales et les veines transversales. (Fig. 4).
- Noter la couleur et la forme des balanciers.
6- Le corps
- Observer la forme, la taille et la couleur.
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II- PARTIE EXPÉRIMENTALE
a. Yeux
w (white) : Blanc (ocelles incolores)
v (vermillon) : Rouge orangé vif (ocelles incolores)
bw (brown) : Marron
st (scarlett ): Rouge vif
bw / st (Brown-rouge vif) : Blanc
se. (sepia) : Rouge brunâtre à violet foncé (ocelles : couleur sauvage).
b. Ailes
vg. (vestigial) : Dimension très réduite
cy. (curly) : Extrémité postérieure courbée vers le haut et l'avant.
c. Couleur du corps
y. (yellow) : Jaune (soies brunes à extrémité jaune).
d. Soies
sn (singed) : soies frisées ou courbées.
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- Mettre les femelles vierges d'une lignée (1) en présence des mâles d'une lignée (2) à raison de 3 femelles et
de 3 à 4 mâles dans un tube vide ou réanimation. Quand ils montreront des signes de réveil, les transférer
dans un tube de culture (Croisement A).
- Le croisement réciproque met en présence des femelles de la lignée (2) en présence de mâles de la lignée
(1) (Croisement B).
- Marquer sur une étiquette collée au tube : la nature du croisement, la date de réalisation du croisement et le
N° du groupe et de binôme ou de la personne ayant réalisé le croisement.
- Au bout de 7 jours à 23°C on peut observer les larves à la surface du milieu et sur les bords du tube.
Eliminer les parents et continuer à conserver le tube dans l'étuve à 23°C.
Au bout de 3 semaines de la date de fécondation, on est en mesure d'examiner environ 200 drosophiles
issues du croisement.
3- Comptages :
- Ethériser pendant 1 min au maximum les mouches par petits groupes pour ne pas être pris de court par des
mouches qui se réveillent.
- Pour l'examen, séparer d'abord les phénotypes ensuite les sexes d'un croisement.
- Compter le nombre de mouches par sexe et par phénotype.
N.B. Par manque de temps (nombre de séances de TP insuffisants), cette partie ne sera pas réalisée
par les étudiants.
IV- INTERPRÉTATION
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Figure 1 : Cycle de vie de D. melanogaster.
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Figure 3 : Détail des pattes avant chez le mâle et la femelle.
Notez la présence du peigne sexuel au niveau du premier tarse chez le mâle.
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TP 3
LA RECOMBINAISON GÉNÉTIQUE CHEZ Sordaria
macrospora
I- INTRODUCTION
Les gènes mutants sont des marqueurs chromosomiques qui permettent de réaliser la carte génétique
d'un organisme. Il est donc important de les distinguer du type sauvage.
Il existe trois types de mutants :
- Morphologiques : affectant les organes végétatifs et reproducteurs.
- Biochimiques : affectant les besoins en un élément nutritif particulier pour se développer.
- De coloration : sont largement étudiés chez les ascomycètes dont Neurospora crassa ou Sordaria
macrospora en vue de comprendre le mécanisme de l'échange génétique.
Pour la plupart des champignons, c'est la phase haploïde qui domine le cycle biologique. La phase
diploïde se réduit à une période très courte (Fig. 1, voir cycles de Sordaria sp et de Neurospora crassa). Cette
situation présente des avantages par rapport aux organismes diploïdes :
- Les résultats de la ségrégation étant haploïde, le génotype est directement exprimé par le phénotype.
- Les quatre produits de la méiose peuvent être isolés ou groupés en tétrade.
- La descendance est très nombreuse.
Comme Neurospora crassa, Sordaria macrospora présente le cas le plus favorable pour l'analyse des
tétrades : l'orientation spatiale des résultats de la méiose (tétrades) dans les asques ce qui permet d'orienter
les deux divisions de la méiose du sommet de l'asque vers sa base.
1- LE PERITHECE
Sordaria macrospora est un ascomycète de la classe des pyronomycètes. Il se caractérise par une
fructification en forme de ballon (Fig. 2) ou périthèce. Celui-ci s'ouvre à maturité par un canal ou ostiole pour
libérer les asques.
Le périthèce de Sordaria macrospora (ordre des sphaerialés, famille des sordaréacés) est de couleur
sombre. Il se développe en un minimum de 9 jours. Une coupe transversale montre à la base du périthèce la
juxtaposition de plusieurs asques à différents stades de maturité. Les asques se développent à tour de rôle,
un seul à la fois occupe l'ostiole.
2- LES ASQUES
Les asques sont des structures cylindriques. Leurs parois sont fines et se terminent par un anneau
apical plus épais. Les ascospores de type sauvage sont de couleur très sombre, les mutants sont blancs ou
de couleur claire.
3- LE TYPE D'UNION
Sordaria macrospora est homothalique : la fécondation chez un mycélium de même origine. En même
temps, il a la capacité de s'hybrider ce qui permet les recombinaisons génétiques.
Quand on inocule deux souches différentes sur un milieu de culture une proportion des périthèces peut
résulter de mycélium hétérothalique hybride. On peut alors observer dans les asques une combinaison de
couleur, de la base au sommet de l'asque, montrant si la ségrégation a eu lieu en méiose I ou en méiose II
(Fig. 3).
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III- L'ANALYSE DES TETRADES
Une hybridation entre un mutant aux spores sombres (n) et un mutant aux spores claires (c) a été effectuée
(voir Fig. 3).
Dans le périthèce hybride, la plupart des asques présentent quatre ascospores blancs et quatre ascospores
sombres. Les arrangements possibles figurent au tableau 1.
Distance gène - gène = ½ TT + DNP X 100 (DP> DNP donc gènes liés)
TOT des asques
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3- L’observation de l’appareil reproducteur :
- Prélever à l'aide d'une pince fine flambée à proximité d’une flamme quelques périthèces et les placer
entre lame et lamelle dans une goutte d'eau distillée et ensuite on écrase délicatement entre deux
feuilles de papier absorbant.
- Observer au microscope au grossissement (x10) puis au (x40).
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Figure 1.a : Appareil de fructification d'un ascomycète Sordaria sp.
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Figure 2 : Appareil de fructification d'un ascomycète Sordaria sp.
a) Schéma d’un périthèce avec un asque en cours de maturation ;
b) bouquets d'asques d’un périthèce mûr éclaté.
Pré-Réduction Post-Réduction
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Nom : ………………………. Date :………...
Prénom : ……………………
Section : …………………….
Groupe : ……………………
TP 1
MITOSE - MÉIOSE
I/ Mitose :
a- Question :
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
b- Préparation au microscope :
1- Les cellules d'Alium sp possèdent normalement 64 chromosomes. Précisez le nombre de chromosomes
présents à chacun des stades de la mitose. Dans vos réponses, comptez les chromatides comme des
chromosomes.
Stades Mitotiques
Prophase Métaphase Anaphase/ Télophase/
pôle noyau
Nombre de
chromosomes
2- Si une mitose se produit dans une cellule de génotype AABbCc, où toutes les paires de gènes sont sur
des paires chromosomiques différentes :
• Schématiser les phases mitotiques avec les chromosomes et leur gènes correspondants.
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..
• Quels seront le ou les génotypes des cellules résultantes?
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………..
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………..
3- Etude de la Planche I :
a- Donner le nom de chaque stade mitotique présenté sur la planche I ?
Photos a b c d e f
Nom du Stade
b- Quel est le nombre de chromosomes de l'espèce étudiée, et à quel stade on peut le déterminer?
2n =……………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………..
20
II/ Méiose :
1- Etude de la planche II
a- Donner le nom de chaque stade méiotique présenté sur la planche II, ainsi que le nombre de
bivalents des stades c, d et e.
Photos Stade Méiotique Nb. de Lames Stade Méiotique
bivalents
………………………….. …………………………..
………………………….. …………………………..
a ………………………….. 1 …………………………..
………………………….. …………………………..
………………………….. …………………………..
b ………………………….. 2 …………………………..
………………………….. …………………………..
………………………….. …………………………..
c ………………………….. 3 …………………………..
………………………….. …………………………..
………………………….. …………………………..
d ………………………….. 4 …………………………..
………………………….. …………………………..
………………………….. …………………………..
e ………………………….. 5 …………………………..
2-
a- En supposant qu'on a une cellule germinale hétérozygote pour deux gènes (2 loci) avec 2 allèles
chacun (N/n et R/r), portés sur deux chromosomes différents. Schématiser la ségrégation des
allèles au cours des différents stades méiotiques?
N R
b- Si les deux gènes sont portés sur le même chromosome en position cis schématiser
le devenir de ces deux gènes au cours des différents stades n r
de la méiose :
b.1. Absence de C.O. (ou) b.2. Présence de C.O.
21
Nom : ………………………. Date :………...
Prénom : ……………………
Section : …………………….
Groupe : ……………………
TP 2
GÉNÉTIQUE DE LA DROSOPHILE
ANALYSE DE LA F1 et de la F2
1- Question :
………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………
2- Donner les résultats obtenus en F1 sous forme de tableau, par sexe et par phénotype :
4- Que peut-on conclure en comparant les phénotypes des individus mâles et les phénotypes des
individus femelles ?
5- Quelle information nouvelle est apportée par la comparaison des deux croisements réciproques ?
22
7- Donner les résultats obtenus en F2 sous forme de tableau, par sexe et par phénotype :
Mâles
Parents
Femelles
Mâles
F1
Femelles
Mâles
F2
Femelles
23
Nom : …………………………………………………………………………………….……….
Prénom : ………………………………………………….………………………………………….
Date :……….…..
Section : …………………….
Groupe : ……………………
TP 3
RECOMBINAISON GÉNÉTIQUE
CHEZ Sordaria macrosposra
2- Question :
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
3- Préparation au microscope :
4- Analyse du croisement C :
¾ Compléter le tableau des résultats de ce croisement (Indiquer le phénotype et le génotype des
spores).
Types
d'Asques DP DNP TT
Paire des I II III IV I II III IV I II III IV V VI VII VIII IX X
Spores
Nombre
d’asques
Total
Types
d'Asques TT (suite)
Paire des I II III IV V VI VII VIII IX X
Spores
Nombre
d’asques
Total
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¾ Résumer les génotypes des différents phénotypes.
¾ Les gènes sont-ils liés? Si oui calculer les différentes distances (Gène-Gène et Gène-
Centromère).
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
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……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
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……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
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……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
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……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
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……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
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