Clonagem Clonagem de genes: consiste em acrescentar a um organismo, genes de outro organismo que capaz de fazer algo que o organismo

o receptor no capaz de fazer. Como funciona: Um fragmento de ADN que contem o gene a ser clonado, inserido num elemento, geralmente um vrus ou um plasmdeo, chamado de vector, de modo a produzir uma "molcula de ADN recombinante".

Esta molcula introduzida numa clula hospedeira onde permanece em estado epissomal (no integrado no Genoma do hospedeiro);

A clula hospedeira vai dividindo, e o vector recombinante tambm, sendo transmitidos s clulasfilhas, formando-se um clone de clulas iguais.

Conceitos importantes: DNA recombinante: DNA que composto por genes de diferentes origens. Vector: funciona como um veculo que transporta o gene para o interior da clula hospedeira, que normalmente uma bactria. (plasmdeo e vrus bacterifagos (vrus que infecta apenas bactrias)). Caractersticas dos vectores: a)Contm uma origem de replicao que lhes permitem dividirem-se no hospedeiro.

b)Tm locais onde cortam enzimas de restrio e possvel introduzir fragmentos de DNA.

c)Possuem marcas de seleco (como um gene que codifica resistncia a um antibitico que permite seleccionar hospedeiros que contm o vector.

Plasmdeos: Os Plasmdeos so molculas circulares de DNA que esto separadas do DNA cromossmico. Os Plasmdeos contm geralmente um ou dois genes e podem replicar-se independentemente do DNA cromossmico.

Enzimas importantes na clonagem T4 DNA Ligase: essencial para a formao de DNA recombinante, pois constri ligaes covalente de fragmentos de DNA (ligaes fosfodiester entre os grupos fosfato 5 e hidroxilo 3). dependente de ATP. DNAse I : faz aleatoriamente cortes nas molculas de DNA, e pode ser utilizada para a sua degradao. DNA Polimerase I: sintetiza DNA, na presena de nucletidos copia uma molcula j existente a partir de um primer;

Klenow: resulta da clivagem da DNA polimerase I elimina a actividade de exonuclease na direco 5-3; Mantm a actividade de exonuclease 3-5 inibida na presena de um excesso de nucletidos; Mantm a actividade de polimerase necessita de um primer ligado cadeia molde de DNA.

RNA polimerases: utilizadas para sintetizar RNA complementar a cadeias molde de DNA; Transcritase Reversa: Utiliza como molde uma cadeia de RNA ; Requer a presena de um primer; Sintetiza DNA origina molculas hbridas de DNA/RNA. Exonuclease III: Degrada progressivamente uma das cadeias da dupla hlice de DNA; Actua em extremidades 3. Nuclease S1: Obtida a partir de um fungo; Degrada DNA em cadeia simples. Fosfatase Alcalina: Remove os grupos fosfato das extremidades 5 do DNA; Gera grupos hidrxilo. Cinase de Polinucletidos: Presena de ATP; Fosforila os grupos hidroxilo 5 da desoxirribose.

Enzimas de Restrio (tesouras de DNA)

Foram obtidas a partir de microorganismos, tm um papel de defesa contra a invaso de DNA estranho, e quando esta invaso acontece, as enzimas de restrio cortam a poro de DNA de forma especfica, inactivando-o, mas no danificando a molcula original.

So especificas e reconhecem sequncias especficas de DNA em cadeia dupla (tipicamente sequncias de 4 ou 6 nucletidos). Um corte num fragmento de DNA gera dois fragmentos, sendo as extremidades coesivas (assimtricas). As Mais relevantes so as que cortam o DNA na sequncia de reconhecimento. Fragmenta o DNA a copiar, e o plasmideo que ir receber o fragmento segmentado.