Mara Isabel Navarrete Ortiz IS05111176 Ingeniera Bioqumica Produccin, extraccin y purificacin industrial de enzimas Introduccin La produccin de enzimas

para uso industrial tuvo sus orgenes en Dinamarca y Japn, a finales del siglo XIX, cuando se produjeron las primeras preparaciones de renina a partir del estmago de terneros y de amilasa de origen fngico. Las enzimas son productos de las clulas y por lo tanto pueden obtenerse a partir de tejidos animales, tejidos vegetales o mediante procesos de fermentacin empleando microorganismos seleccionados. Las plantas han sido la fuente tradicional de ciertas enzimas. A partir del ltex producido por la papaya, algunas proteasa aisladas desde la higuera y la pia. La cebada malteada tambin ha sido fuente importante de enzimas vegetales. La industria cervecera ha empleado tradicionalmente este material crudo por su actividad protesica y amilsica. En cuanto a las enzimas de origen animal, se han obtenido pocas, por ejemplo lipasa pancretica y tripsina, debido principalmente a la disponibilidad limitada de material adecuado y a la posibilidad de reemplazarlas por enzimas similares derivadas de microorganismos. Debido a que las aplicaciones industriales de las enzimas requieren que estas sean producidas a gran escala y bajo costo, el empleo de algunas enzimas de origen vegetal y animal ha ido decayendo, a favor de las enzimas de origen microbiano. Produccin industrial de enzimas Durante siglos las enzimas fueron utilizadas, formando parte de clulas o extractos crudos de materiales vegetales, animales y microbianos. As sucedi en forma totalmente emprica, sin conocerse su modo de accin, ni el porqu de su actividad cataltica en la industria de la fermentacin como en la cerveza, vino, pan y queso. An suele emplearse una enzima til producida por una bacteria, una levadura o un trozo de tejido, sin siquiera extraerla de las clulas. Por ejemplo, el Acetobacter aceti puede servir para oxidar el alcohol y convertirlo en cido actico sin purificar antes la oxidasa del alcohol. La levadura fermenta el azcar y lo convierte en alcohol sin que se efecte la extraccin del complejo cimasa; las muchas otras enzimas que contiene la levadura no estorban la reaccin, a causa de que tienen otras actividades especficas. El desarrollo de fuentes para producir enzimas de uso en la industria alimentaria, de mtodos de aislamiento y purificacin y el diseo de reactores enzimticos, que permiten su aplicacin en diversos procesos, ha evolucionado en forma considerable y ha dado origen a un rea interdisciplinaria conocida hoy da como "ingeniera enzimtica", como nuevo enfoque de la biotecnologa. Las principales fuentes de enzimas usadas en la industria de alimentos son de diferente origen: a) Vegetal: Lipasas y pectinoesterasa se elaboran a partir de soya, ricino y frutas ctricas; del germen de trigo se extrae la alfa-amilasa. Las proteasas se obtienen de la papaya, del higo, de la pia y la peroxidasa, del rbano picante; b) Animal: La renina, pepsina, tripsina, quimotripsina, catalasa y lipasa pancretica son de origen animal; c) Microbiano: Las enzimas de los hongos: Aspergillus flavus, orycae y niger y del Bacillus subtilis han demostrado ser de gran uso en la industria alimentaria.

Elaboracin de enzimas a. Elaboracin de enzimas de origen animal o vegetal. Si se trata de enzimas de origen animal la simple trituracin de algunos tejidos especializados, como el pncreas o el hgado, permite formar una papilla, la cual se extrae a continuacin con un solvente adecuado como agua, acetona fra (-20C ), glicerina o una solucin salina. En forma parecida se procede con los tejidos vegetales, previamente sometidos a trituracin o disrupcin (rotura). Tambin puede partirse de los jugos de expresin de los respectivos tejidos, cuya estructura celular se destruye por autolisis, plasmolisis (18) o por congelacin, la cual revienta las paredes celulares. b. Elaboracin de enzimas de origen microbiano Actualmente la tendencia industrial es el reemplazo de muchas enzimas provenientes de tejidos por aquellas que resultan de la aplicacin de cultivos de microorganismos seleccionados, que generan la enzima especfica. La produccin de enzimas por microorganismos tiene la ventaja de su costo, generalmente menor, y por realizarse en un periodo relativamente breve: Por ejemplo, 1 a 5 das en el caso de una fermentacin discontinua por lotes ("batch"). Adems, se puede incrementar el rendimiento de una enzima especifica por un determinado organismo, recurriendo a modificar sus condiciones ambientales, o bien, a formar por va gentica cepas mutantes, en las cuales la produccin de la enzima puede ser varias veces superior que en la cepa original. De este modo procesos de seleccin, adaptacin y mutacin han mejorado considerablemente la produccin de enzimas a partir de microorganismos. Las enzimas elaboradas industrialmente son por lo general del tipo degradativo y extracelular, es decir, que son excretadas al medio por el microorganismo que las genera; pues entonces no precisan de la ruptura de las clulas microbianas para su extraccin como es necesario en las enzimas intracelulares de biosntesis. La elaboracin de enzimas de origen microbiano comprende diferentes etapas: a. Seleccin de microorganismos: Se empieza generalmente por un cultivo de enriquecimiento de la cepa seleccionada. Cultivos originales pueden obtenerse de la firma American Tipe Culture Collection (ATCC), del Northern Utilization Research Branch o de otro organismo o instituto reconocido. b. Cultivo: Las materias primas que sean de costo adecuado y que puedan utilizarse como medio de cultivo varan naturalmente segn la enzima por elaborar y pueden ser de los siguientes orgenes .

i. ii. iii. iv.

Materias azucaradas o amilceas, como melaza, jarabe de glucosa, almidones y afrechos de trigo, arroz o maz; Materias proteicas, como hidrolizados proteicos, harina de pescado, casena, gelatina y afrechos de extraccin de semillas oleaginosas; Componentes nitrogenados, como sales de amonio, nitratos, urea; Sustancias favorecedoras del crecimiento microbiano; como, extractos y autolizados de levadura, sales minerales con inclusin de elementos trazas y eventualmente vitaminas.

Fuera de la composicin del medio constituyen parmetros importantes que deben controlarse en el cultivo, las condiciones ptimas del caso, en cuanto a temperatura, pH, aereacin (para suministrar el oxgeno necesario y evitar exceso de calor de reaccin), y velocidad de agitacin. En lo que se refiere a los reactores para realizar la fermentacin se distingue entre los cultivos en superficie de medios lquidos o semislidos, usndose ya sea sartenes o tambores rotatorios, y cultivos en profundidad, actualmente ms usados, mediante tanques agitados, de lecho fijo o de lecho fluidizado (partculas suspendidas y agitadas, lo que facilita su mezcla y circulacin) Terminada la incubacin del proceso fermentativo se separa la biomasa junto con el resto de las clulas y los componentes slidos del medio de cultivo por filtracin o centrifugacin. El liquido resultante, generalmente an bastante heterogneo, puede utilizarse directamente como preparado enzimtico; Pero, generalmente, se somete a una purificacin y/o aislamiento posteriores, que comprenden diferentes fases y que pueden aplicarse igualmente en las enzimas de origen vegetal o animal. PURIFICACIN Y AISLAMIENTO DE ENZIMAS. Un preparado enzimtico puede consistir en el mismo extracto o caldo fermentado que slo se somete a una clarificacin y concentracin (preparado liquido) o desecacin (preparado slido) se recurre tambin a mtodos de aislamiento y purificacin de enzimas en gran escala, lo cual se logra principalmente por los siguientes procesos: Adsorcin selectiva con hidrxidos de hierro o aluminio coloidales, a cierto pH, pues no todas las protenas son adsorbidas en iguales condiciones. Una vez adsorbida se lava con agua o solucin salina y luego s eluye a pH diferente, generalmente alcalino mediante otra solucin salina, por ejemplo, de fosfato. Por precipitacin, en que las enzimas son fraccionadas al reducirse su solubilidad hasta el punto en que precipitan. Esto se logra por adicin de sales a cierto pH y a elevada concentracin inica o por solventes orgnicos (alcohol, acetona, isopropanol) a baja temperatura. La sal ms usada es el sulfato de amonio por su alta solubilidad, bajo costo, alta atoxicidad para la enzima y por no afectar mayormente la viscosidad de la solucin. Dilisis por gradientes de concentracin a travs de membranas semipermeables. Ultrafiltracin por aspiracin o presin a travs de membranas de porosidad fina como tamiz molecular. Presenta una alternativa interesante para separar enzimas, pues no hay cambio de fases, ni altos gradientes de temperatura (15). Electroforesis sobre soportes de papel, gel de almidn, agar o dextrano. Fraccionamiento cromatografico Pico de tipo preparativo, tanto en cada fina, como en columna con intercambiadores inicos, geles o tamices moleculares. Combinando estos procedimientos con otros a base de electroforesis de alta tensin, cataforesis y electrodilisis se logran actualmente separaciones de mezclas complejas de enzimas.

El control de todas estas etapas en su forma ms rigurosa, es necesario para asegurar el mximo de rendimiento y reproducibilidad, seguridad y calidad de los productos enzimticos obtenidos. Enzimas inmovilizadas El enorme nmero de reacciones catalizadas por enzimas y la especificidad de las enzimas individuales significa que stas son potencialmente de gran valor industrial. Sin embargo, su costo se agudiza al aplicarlas como reactivos en forma soluble, pues se produce su prdida, una vez utilizadas. Aunque la enzima por regenerarse en el proceso podra usarse muchas veces, su separacin a partir de la mezcla de reaccin no es econmicamente factible. De all que ha significado un avance importante la posibilidad de inmovilizar las enzimas sobre soportes inertes, reteniendo as gran parte de su actividad cataltica original. Como las reacciones enzimticas se desarrollan en medio acuoso, la matriz del soporte debe ser insoluble en agua, pero tan hidrfila que garantice un buen contacto con el medio de la reaccin. Su aplicacin se basa en sus interesantes propiedades: a) Son trmicamente ms estables que las enzimas nativas y ms resistentes a la autolisis; b) Al final de una reaccin catalizada enzimticamente, la enzima enlazada puede separarse por simple centrifugacin o filtracin, sin necesidad de agregar un reactivo de inactivacin o precipitacin; c) Una vez recuperada, la enzima enlazada puede volver a usarse las veces que se desea, sin prdida sustancial de actividad despus de un simple lavado con soluciones tampones acuosas y permitiendo realizar as procesos enzimticos continuos. Por lo tanto, se usan tambin para aislar y purificar enzimas, al separarlas de inhibidores especficos.