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WESTERN BLOT
El mtodo para protenas ms potente es el denominado Western blot en el que las protenas son separadas en primer lugar mediante electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (s, el viejo y conocido SDS-PAGE) y posteriormente se transfieren a una membrana, mediante la aplicacin de un campo elctrico perpendicular al gel (electroblotting). Una vez completada esta operacin la protenas de inters son reveladas por el agregado de un anticuerpo especfico.

El primer paso de todo Western Blot es la separacin de las macromolculas mediante geles de electroforesis.

El electroblotting es el mtodo donde las protenas son transferidas desde el gel a la membrana electroforticamente. La ventaja de este proceso es su corta duracin (de 30 minutos a pocas horas), lo que reduce notablemente el efecto de difusin de las bandas. Las protenas del gel se desplazan hacia el polo positivo y quedan atrapadas por la membrana. Tras la transferencia, se suele proceder a la tincin del gel con Coomassie Brilliant Blue (un colorante de protenas) para comprobar que en efecto una parte importante del material proteico ha pasado a la membrana. La electroforesis se realiza a 8-10 V/cm (de separacin entre electrodos), que suele corresponder a 0,3 a 2 Ampere de 1 a 4 horas. La velocidad de transferencia es inversamente proporcional al tamao de la protena. El proceso provoca un fuerte calentamiento de la solucin por lo que se recomienda refrigerar el sistema y recircular el buffer.

Las macromolculas ya separadas en funcin de su diferente peso molecular se transfieren a una segunda matriz.

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El ms sencillo es aplicarlas directamente en forma de una pequea gota de una solucin concentrada sobre la membrana. La absorcin de la gota provoca la adhesin de la protena a la membrana, quedando en forma de una mancha. Existen dispositivos que facilitan la aplicacin de las protenas directamente a la membrana, aplicando una succin que facilita la penetracin de la solucin, y reciben los nombres de dot blot o slot blot en funcin de que la protena quede aplicada en forma de una gota circular o de una lnea.

Membranas Trabajar con las protenas fijadas sobre una membrana tiene ventajas sobre el emplearlas dentro del gel: Las membranas pueden incubarse fcilmente con anticuerpos para la deteccin de protenas especficas Son ms rpidas de teir y desteir Se detectan cantidades menores de protenas, ya que se concentran en la superficie y no se diluyen en todo el espesor del gel Las membranas son mucho ms fciles de manipular que el gel. Una membrana que se emplea frecuentemente es la nitrocelulosa, aunque cuando se requieren soportes ms robustos, por ejemplo cuando la membrana ha de ser reutilizada diversas veces se recurre al Nylon. Sin embargo las membranas de Nylon se bloquean con ms dificultad que las de nitrocelulosa y suelen presentar mayor background (marca inespecfica). Las membranas de PVDF tienen gran capacidad de unin a protenas y gran resistencia mecnica y en general son las ms utilizadas actuamente. En general las membranas son hidrofbicas y requieren un tratamiento previo con metanol antes de sumergirlas en soluciones acuosas. Lavado de la membrana Estos lavados son necesarios para eliminar los excesos de reactivos no unidos y para reducir el ruido de fondo, ayudando a incrementar la relacin seal:ruido. Un lavado insuficiente de la membrana ocasionara un elevado ruido de fondo, mientras que un exceso del mismo puede ocasionar una disminucin de la sensibilidad debido al lavado del antgeno y/o anticuerpo de la membrana. Para realizar estos lavados, se pueden utilizar una gran variedad de amortiguadores fisiolgicos como el TBS o el PBS. Bloqueo de la membrana Una etapa comn a todos los procedimientos de inmunodeteccin es el bloqueo, para prevenir la unin no especfica del sistema de deteccin a la membrana. El paso de bloqueo evita que los anticuerpos y otras protenas involucradas en la deteccin se peguen inespecficamente a la membrana, con el riesgo asociado de tener un elevado falsos positivos. El bloqueo implica la saturacin del sistema con protenas no especficas. Las dos soluciones de bloqueo que son compatibles con casi cualquier sistema de deteccin son las soluciones de leche descremada y las soluciones de albmina srica bovina (BSA).

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Leche en polvo 5% de leche descremada en PBS /TBS. Muy econmico. Con poco 'background'. Se deteriora con rapidez. Es posible que tape algunos antgenos. Leche / Tween-20 Econmico. 5% de leche desnatada en PBS/TBS - 01% Tween-20. Con poco 'background'. Se deteriora con rapidez. Es posible que tape algunos antgenos. Tween-20 0.1% Tween-20, 0.02% azida sdica en PBS/TBS. Econmico. Permite la tincin despus de la inmunodeteccin. Puede quedar un 'background' residual. BSA 3% BSA, 0,02% azida sdica en PBS. Bueno. Relativamente econmico. Suero de caballo 10% suero de caballo, 0,02% azida sdica en PBS. Sin 'background'. Moderadamente caro. Incompatible con algunos anticuerpos antiinmunoglobulinas.

Deteccin especfica de protenas sobre la membrana Comnmente el sistema de inmunodeteccin indirecta. se emplea un anticuerpo para localizar la protena de inters (anticuerpo primario) y un segundo anticuerpo que detecta el anticuerpo primario (anticuerpo secundario). Este anticuerpo es el que posee alguna una marca capaz de producir una seal detectable. Eleccin del sistema de revelado Asociados a enzimas, que catalizan una reaccin en la que se forma un precipitado coloreado, o en la que se emite luz. Las dos enzimas ms empleados para marcar los anticuerpos son la peroxidasa de rbano y la fosfatasa alcalina. Prueba para el VHI El fundamento de la principal prueba confirmatoria de la actualidad, o Western blot (WB), es una discriminacin de los antgenos del VIH frente a los que se dirigen los anticuerpos presentes en la muestra. Por lo general cada uno de los diferentes equipos comerciales que existen para la realizacin de la prueba contienen instrucciones precisas de cmo interpretar los resultados obtenidos con unos criterios de positividad ms o menos restrictivos y sus tiras pueden contener un nmero variable de bandas; las principales bandas del WB se recogen en la tabla:

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De un modo muy esquemtico se puede decir que el WB puede ofrecer tres tipos de resultados diferentes: Positivo: Cuando cumple los criterios de positividad adoptados por la tcnica que se est empleando (presencia de ciertas bandas). Negativo: Cuando ninguna de las bandas presenta reaccin. Indeterminado: Cuando no es positivo o negativo Las principales causas de WB indeterminado suelen obedecer a:

Reactividad inespecfica (ver falsos positivos) Infeccin por VIH-2 u otros retrovirus humanos Seroconversin al VIH-1 Estado avanzado de infeccin VIH-1 Hijo de madre seropositiva Divergencias genticas de la cepa del VIH-1 (africanos)

Es importante notar que ninguna de las protenas usadas en las pruebas de anticuerpos VIH son especificas al VIH, y que ninguno de los antigenos que se dice son especficos al VIH se encuentran solamente en personas que resultan ser VIH positivos. Bibliografa: http://www.protocolmonkey.com/protocols/view_protocol.php?id=1 Chapter 3, Anlisis de protenas, Humana Press. 2009. pp. 9-22.