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Revisión Bibliográfica

Revista Dental de Chile

2002; 93 (2): 25-28

A u t o r e s :

Actualización de la Técnica de Obtención y Uso del Plasma Rico en Factores de Crecimiento (P.R.G.F.)

Dr. Mario Reyes M. * Dra. Sandra Montero R.* Dr. Julio Cifuentes F.* Dr. Emilio Zarzar C.*

Extraction Technique and Surgical Use of the Plasma Rich in Growth Factors (P.R.G.F.) Update

Resumen

Resumen

*Servicio de Cirugía y Traumatología Máxilo Facial. Clínica Alemana. Santiago Dirección Postal: Vitacura 5951. Vitacura. Santiago.

El uso del plasma rico en factores de crecimiento (PRGF), en cirugía, tiene beneficios técnicos importantes y puede incrementar la regene- ración ósea, al utilizarse junto con injertos de hueso autólogo. Sus predecesores fueron el adhesivo de fibrina, utilizado como hemostático y adhesivo quirúrgico, el fibrinógeno autólogo, con el que se preparaba el gel de fibrina autóloga y, posteriormente, el plasma rico en plaquetas o PRP, el cual se mezcla con cloruro cálcico y trombina bovina para producir la agregación y desgranulación plaquetaria, obteniéndose factores de crecimiento. El PRP requiere grandes volúme- nes de sangre, un ambiente intrahospitalario, implementación sofisticada, plantea dos ciclos de centrifugación a altas revoluciones y utiliza trombina bovina para su activación. Siguiendo los mismos principios del PRP, surge la técnica de obtención del PRGF, que requiere menores volúmenes de sangre, un equipamiento simple que permite su uso en la consulta, no utiliza trombina bovina y plantea una sola centrifugación con menos revoluciones, preservan- do la integridad de la membrana plaquetaria, permitiendo así obtener una mayor concentración de factores de crecimiento; siendo un procedimiento económico, enormemente eficiente y 100% autólogo.

Summary

económico, enormemente eficiente y 100% autólogo. Summary The use of PRGF in oral and maxillofacial surgery
económico, enormemente eficiente y 100% autólogo. Summary The use of PRGF in oral and maxillofacial surgery

The use of PRGF in oral and maxillofacial surgery procedures has technical benefits and may enhance bone regeneration when used in

conjuction with autologous bone grafts. The fibrin adhesive was used as a haemostatic agent and surgical adhesive, before PRGF appeared. Autologous fibrinogen was widely used to produce the autologous fibrin gel, until platelet rich plasma (PRP) became the best option to obtain growth factors, after mixing this plasma with calcium chloride and bovine trombine, which causes platelet addition and exocytosis of these factors. However, PRP requires large volume of blood, hospitalary environment, sophisticated equipment, two high-speed spinning cycles and utilizes bovine trombine for its activation. Following the same principle, PRGF appears as an alternative which requires: minimum volume of blood, a plain equipment that allows its performance at the ambulatory office, a single low-speed spinning cycle -which contributes to obtain a higher concentration of growth factors- and does not utilize bovine trombine. Therefore, PRGF is an economic, highly efficient and 100% autologous technique.

Introducción

Introducción

El uso del gel de plasma rico en plaquetas (PRP) para la colocación de injertos óseos en cirugía oral y maxilofacial, fue origi- nalmente propuesto por Marx en 1986 y, en los últimos años, se ha masificado su uso con excelentes resultados, debido fun- damentalmente, a la capacidad que tiene de incrementar la regeneración ósea al ser utilizado junto con injertos de hueso autólogo y a que es un procedimiento re- lativamente simple.

Desarrollo

Desarrollo

El desarrollo del PRGF parte en los años 80 con el adhesivo de fibrina, el cual apa- rece en el ámbito de la investigación en respuesta a la necesidad de mejorar los agentes hemostáticos y los adhesivos qui-

Ha despertado el interés también en otras áreas como ortopedia, otorrinolaringolo- gía, cirugía plástica, neurocirugía y periodoncia. La técnica de obtención y utilización del PRP ha sufrido algunas variaciones, dado que se ha seguido investigando al respec- to y en la actualidad el procedimiento se ha simplificado y optimizado a la vez, tanto

rúrgicos, sobre todo en aquellos órganos en los que resulta muy difícil controlar el sangrado como hígado, riñones, cerebro, en tejidos infectados, quemados o sopor- tes de injertos (1) .

así, que hoy se prefiere hablar de plasma rico en factores de crecimiento (plasma rich in growth factors o PRGF). La presente revisión pretende actualizar los conceptos referentes a este importante re- curso y mostrar cómo se realiza hoy, tanto la técnica de obtención del PRGF, como su uso clínico.

Matras describió este adhesivo como una sustancia con propiedades selladoras y hemostáticas que promovía la reparación del tejido y el cierre de la herida y que fue co- mercializado con el nombre de Tisucol® (3) .

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Como consecuencia del veto a su utilización porlaFoodandDrugAdministration(FDA), se ha desarrollado otra modalidad: la obten- ción del fibrinógeno autólogo, que evita los riesgos de infección y rechazo. La técnica sugiere la obtención de sangre del paciente días antes de la cirugía para aislar el fibrinógeno en el laboratorio con el que se prepara el gel o cola de fibrina autóloga. El mecanismo de acción de la cola de fibrina mimetiza la última etapa de la coagulación en la cual el fibrinógeno se convierte en fibrina por acción de la trombina, la que en presencia de calcio, rompe los fibrinopéptidos A y B de la molécula de fibrinógeno, originando así los monómeros de fibrina; además, la trombina activa el fac- tor XIII que favorece el entrecruzamiento de estos monómeros, formando el coágulo. Debidoalaacciónproteolíticadelatrombina sobre el fibrinógeno, que es soluble, al con- vertirlo en fibrina, que es insoluble, se gene- ra esta sustancia viscosa que constituye el adhesivo de fibrina (1,2) . La alternativa a la preparación del gel de fibrinaautólogo,querequeríacitaralpaciente días antes de la intervención, ha sido la ob- tencióndeunplasmaricoenplaquetas(PRP) mediante plasmaféresis, minutos antes de la intervención.

Elmétodoconsisteenobtener500mldesan-

gre del paciente a través de un catéter a una

velocidad de 50 ml/min la que es recepcionada en tubos citratados. Posterior- mente se centrifuga la sangre a 5.600 rpm,

obteniéndose 3 fracciones, de menor a ma- yor densidad: plasma pobre en plaquetas (PPP), plasma rico en plaquetas (PRP) y cé- lulas rojas. El PPP y PRP se aspira y se lleva a otro recipiente para ser centrifugado nue- vamente a 2.400 rpm obteniéndose 2 frac- ciones: PPP y PRP. Este último, se conserva hasta que se requiera su uso en la cirugía, momento en el cual se mezcla con cloruro cálcicoytrombinabovina,produciéndoseen un intervalo de 5 a 30 segundos la coagula- ción del PRP. Este cambio produce agrega- ción y desgranulación plaquetaria, liberán- dose las proteínas contenidas en su interior,

entreellaslosfactoresdecrecimiento;lapre-

paración tarda en total 45 minutos (4) . El éxito del gel de fibrina ha llevado a desa- rrollar una técnica con la misma filosofía, con menores volúmenes de sangre, que pue- da ser utilizada en forma rutinaria incluso en laconsultaambulatoria.Laestrategiasebasa en la utilización de las plaquetas por las si- guientes razones: Por un lado, funcionan como vehículo portador de factores de cre- cimiento y de otras proteínas que desempe- ñan un papel importante en la biología ósea,

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como son la fibronectina y otras proteínas adhesivas. Por otro lado, se controla la libe- ración de estas proteínas contenidas en los gránulos alfa de las plaquetas, sustancias que serán concentradas y depositadas en el lugar

delaherida,exponiendoyorientandouncon-

centrado fisiológico de proteínas que va a intervenir, acelerando y favoreciendo el pro- ceso de reparación y regeneración. Entre

otras encontramos las siguientes proteínas:

- PDGF: factor de crecimiento derivado de las plaquetas.

- VEGF: factor de crecimiento endotelial

vascular.

- TGF beta: factor de crecimiento transfor-

mado tipo beta.

- EGF: factores de crecimiento epidérmico.

- IGF-I: factores de crecimiento insulínico tipo I.

La acción e interacciones de estos factores de crecimiento varían dependiendo del tipo de célula y de su grado de madurez (1,10) . El TGF beta 1 promueve la síntesis de ma-

triz extracelular e induce la expresión de re- ceptores tipo beta para el PDGF. Junto a este último, estimula la síntesis de colágeno tipo

I, fibronectina y osteonectina así como la

sedimentación de la matriz extracelular y la quimiotaxis. También disminuye la síntesis de metaloproteínas (que degradan la matriz

extracelular) y del factor activador de plasminógeno, todo lo cual tiene como con- secuencia una disminución en la destrucción delamatrizdetejidoconjuntivo.El TGFbeta 1, al parecer, inhibe la formación de osteoclastos, pero por otro lado, promueve

la resorción de hueso por un mecanismo de-

pendiente de las prostaglandinas. Su acción es muy compleja, pero parece que es uno de los factores de conexión entre la reabsorción

y formación ósea (5,12) .

Los niveles plasmáticos de EGF no son detectables, pero las plaquetas contienen

cantidades importantes de este factor de crecimiento epidérmico. Tras la coagula- ción, la concentración de EGF en el suero es aproximadamente de 130 pmol/L, can- tidad suficiente para inducir la mitosis y

la migración celular. Este hecho sugiere la

participación de EGF en las primeras fa- ses de la reparación, estimulando la mi- gración y división celular y aumentando la síntesis de proteínas como la fibronectina (13) . El plasma contiene cantidades importan- tes de IGF-I, el que es sintetizado princi- palmente en el hígado. También se encuen- tran cantidades importantes de este factor en las plaquetas. Una vez liberado por las plaquetas, el IGF-I es un potente agente

quimiotáctico para las células vasculares endoteliales, provocando un aumento en la neovascularización de la herida. El IGF- I también estimula la proliferación y dife- renciación de osteoblastos y tiene mayor efecto combinado con otros factores de crecimiento. VEGF estimula la proliferación celular en aquellos vasos sanguíneos que han sido da- ñados. De este modo se utilizan las plaquetas como fuente exógena de factores de creci- miento que, en algunos casos, refuerzan las concentraciones ya existentes en el hueso, y en otros actúan en concierto con éstos, estimulando la actividad de las cé- lulas óseas y células epiteliales. El coágulo de PRGF o coágulo blanco, funciona como vehículo natural de los fac- tores de crecimiento y presenta muchas ventajas sobre otros diseños más sofisticados. Como las plaquetas carecen de núcleo, sus posibilidades de sintetizar proteínas son prácticamente inexistentes. Sin embargo,

poseen proteínas, entre ellas el fibrinógeno, que captan del plasma por un mecanismo de endocitosis. Este fenómeno utiliza un sistema canalicular conectado a la super- ficie e interrelaciona el medio plasmático externo con los gránulos. Esta es la razón por la que las plaquetas contienen proteí-

nas plasmáticas (1) .

Con técnicas de microscopía electrónica se ha estudiado la cinética de la agrega- ción plaquetaria en el PRGF activado con cloruro cálcico, pudiéndose observar cómo, cuando se activa el PRGF, las plaquetas cambian su forma y se van agre- gando desplazándose dentro del coágulo hasta agruparse por completo a los 30 mi- nutos. Se ha visto que ocurren cambios no sólo en la forma de las plaquetas, sino también en su contenido. A los 3 minutos se apre- cian aisladas, esparcidas por el coágulo, pero ya se observa la formación de pseudopodos y la centralización de los grá- nulos. Entre los 3 y los 10 minutos las plaquetas continúan su activación y se agregan. A los 30 minutos la morfología del coágulo es completamente diferente. Las plaquetas se han agregado y permane- cen fuertemente unidas, rodeadas de fibras de fibrina, se ha liberado el contenido de todossusgránulos,observándoselasplaquetas vacías y fibras gruesas de fibrina. Al cabo de unahoralaestructuraymorfologíadelcoágulo es muy regular y estable.Ala hora y media las

plaquetas están vacías e incluso se puede ob- servar la rotura de muchas de ellas (6) .

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Técnica de Obtención del PRGF

Hasta 1995, todos los protocolos de obten- ción de concentrados plaquetarios partían de cantidades muy elevadas de sangre y se rea- lizaban en ambientes hospitalarios con equi- pos sofisticados de autotransfusión. Además, existía una gran controversia, en Europa sobre todo, con el uso de trombina bovina,yaquesehabíadetectadoanticuerpos anti trombina en pacientes tratados con los métodos antes descritos (1) . Se pensó en la obtención de un coágulo rico en factores de crecimiento mediante un mé- todo sencillo y de fácil utilización incluso en la consulta ambulatoria. Se inicia entonces la optimización de un pro-

tocolo que permitiera utilizar esta fuente fisiológica de factores de crecimiento que, además del beneficio de la liberación de és- tos, constituyera un elemento mecánico que permitiera consolidar los materiales de in- jerto y facilitara el cierre de la herida favore- ciendo el postoperatorio (7) . Se eligió como anticoagulante idóneo para la extracción de sangre el citrato sódico. Esta sal capta los iones calcio que se encuentran en la sangre y los neutraliza formando un compuesto químico llamado quelato, impi- diendo de esta forma, la coagulación de la sangre. Además, el citrato sódico no altera los receptores de membrana de las plaquetas

y permite la reversibilidad del proceso al

añadir calcio en forma de cloruro de calcio. La separación del plasma se logra mediante centrifugación suave, la cual permite con- centrar las plaquetas que se encuentran más próximas a los hematíes. Las fracciones con mayor contenido de plaquetas son las que se encuentran inme- diatamente por encima de la serie roja (0,1 cc. por encima de los hematíes). Esta frac- ción contiene un plasma 8 veces más con- centrado en plaquetas que la sangre periférica. La siguiente fracción contiene un plasma 4 veces más concentrado (1) .

Procedimiento de Obtención del PRGF

Se realiza la extracción de la sangre al pa- ciente unos minutos antes de comenzar la cirugía. La cantidad dependerá del defec- to a tratar. Por ejemplo, para una exodoncia, entre 20 y 30 cc. serán suficien- tes, mientras que para una elevación de seno, bastarán 30 cc. La sangre se recepciona en tubos estériles con citrato sódico al 3,8% como anticoagulante. A pesar que el EDTA tiene un rendimiento mayor que el citrato, se ha visto por microscopía de luz, a las plaquetas rasgadas, rodeadas de abundan- tes restos celulares cuando se ha usado EDTA como anticoagulante. Se prefiere por tanto el Fosfato de Dextrosa Citratado (CDP), debido a que éste preserva la inte- gridad de la membrana plaquetaria, hecho de vital importancia, ya que los factores de crecimiento son exocitados activamen- te. Durante este proceso ocurre la forma- ción de la molécula proteica y la forma- ción de su estructura terciaria, de cuya in- tegridad depende su actividad y efectivi- dad. En este mismo contexto, es importante considerar también, la velocidad de centrifugación que va en relación directa con la fuerza de gravedad (G), ya que se ha visto que una G excesiva, reduce dra- máticamente la cantidad de factores de cre- cimiento (11) . Se centrifuga el plasma en una centrífuga digital que permita controlar los parámetros de tiempo y velocidad. El tiem- po de centrifugación será de 8 minutos a 1.800 rpm (280 G), a temperatura ambiente. El plasma luego es separado mediante pipeteado muy meticuloso para no crear

turbulencias en las fracciones obtenidas. Los primeros 500 microlitros (0,5 cc.) (fracción 1) es un plasma pobre en plaquetas y por lo tanto pobre en factores de crecimiento. Los siguientes 500 microlitros (fracción 2) corresponderán a un plasma con un número de plaquetas si- milar al que tiene la sangre periférica. La fracción de plasma más rico en plaquetas y factores de crecimiento (PRGF) son los 500 microlitros que se en- cuentran encima de la serie blanca (frac- ción 3). Con una pipeta de 500 microlitros se aspi- ra la fracción 1 y se traslada a un tubo estéril, previamente etiquetado, donde se reunirá todo el PPGF, repitiéndose el proceso con todos los tubos procedentes de la centrifugación. Con la misma pipeta (diferente punta estéril), se aspira la frac- ción 2 de todos los tubos y al igual que con la fracción 1, se lleva a otro tubo esté- ril etiquetado, que contendrá entonces, un plasma con una concentración de plaquetas similar a la de la sangre periférica (PGF). Para la fracción 3 se realiza un pipeteado más cuidadoso, con una pipeta de 100 microlitros, para evitar las eventuales tur- bulencias que se puedan producir, y de este modo no aspirar los hematíes ni la serie blanca. Se repite este proceso 5 veces, colectándose lo obtenido en un ter- cer tubo estéril y etiquetado, el cual contendrá el PRGF. El volumen de plasma que se obtiene tras la centrifugación varía ligeramente de un individuo a otro, obteniéndose volúmenes diferentes de cada fracción. Por lo tanto,

se debe contar siempre desde la serie blan-

ca hacia arriba, y de obtenerse más plas- ma, éste será PPGF, cuyo volumen puede

variar entre 1 y 2 cc. Así, si tenemos 4,5

cc de sangre, 1 cc. será PRGF, 1 cc. de PGF

y el resto PPGF. Lo importante es el con-

cepto de que se comienza a pipetear desde

arriba, pero la fracción más importante es

la última.

Otro detalle importante es que si después de centrifugar se observara un tubo con plasma turbio, por la presencia de hematíes, éste debe ser descartado, ya que esta pequeña hemólisis se debe a una falla en el momento de extraer la sangre del paciente, por una mayor lesión de la pared vascular. Esta lesión ha provocado la libe- ración de una gran cantidad de tromboplastina tisular, comenzando la for- mación del coágulo.

F i g u r a

cantidad de tromboplastina tisular, comenzando la for- mación del coágulo. F i g u r a

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Activación y Agregación Plaquetaria

Una vez obtenido el PRGF, para provocar la formación del coágulo se pueden em- plear los siguientes protocolos:

- Añadir 50 microlitros de cloruro cálcico

al 10% por cada cc. de PRGF. Luego de 5 a 8 minutos se obtendrá el coágulo, tiem- po que variará en relación inversa al nú- mero de plaquetas. Para acelerar el proce- so se puede elevar la temperatura del plas-

ma a 37º C, antes de activarlo, disminu- yendo de 2 a 3 minutos el tiempo de for- mación del coágulo.

- Si se va a mezclar el plasma con algún

material de injerto, primero se añade el cloruro cálcico y luego el injerto. Después de 2 a 5 minutos se obtendrá un agregado que contendrá el injerto, con una consis-

tencia gomosa fácil de manipular. También

se puede disminuir el tiempo de formación aumentando a 37º C la temperatura (8) .

- Si se desea obtener un efecto “barrera”,

se pueden mezclar 2 cc. de sulfato cálcico con 1 cc. de PRGF para, luego de 5 minu-

tos, obtener un material gomoso de fácil manipulación. Este material además posee propiedades osteoconductoras (1) .

Obtención de Fibrina Autóloga

Al mezclar el PRGF con cloruro cálcico se activa la trombina endógena y se trans- forma el fibrinógeno en fibrina. En un prin- cipio, se forma la malla de fibrina y se ac- tivan las plaquetas, las que inicialmente dispersas, poco a poco se van agregando uniéndose entre sí, provocando cambios en su citoplasma para luego liberar el conte- nido de sus gránulos alfa. El coágulo recién formado es una verda- dera esponja empapada en factores de cre- cimiento y otras citoquinas.

Aplicaciones Clínicas

El uso clínico del PRGF es muy variado y, cada vez, surgen nuevas e insospechadas aplicaciones en las cuales este recurso autólogo y económico, soluciona proble- mas otrora imposibles de enfrentar con éxito. Dentro de todas las aplicaciones clínicas,

se mencionarán las utilizadas en el campo de la cirugía oral y maxilofacial, a saber:

- Reconstrucción de rebordes alveolares atróficos.

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Este coágulo, englobando o no un injerto, sigue experimentando cambios para final- mente retraerse. Este, ha eliminado parte de su contenido en factores de crecimien- to, y ya presenta fibras gruesas de fibrina, bien organizadas. Esta última fase se puede catalizar manteniendo el coágulo a 37º C. El tapón de fibrina así obtenido puede servir como cierre en una exodoncia para proteger el coágulo de PRGF de ser aspirado o movi- lizado por la lengua. También se puede obtener fibrina en for-

- Elevación de seno maxilar.

- Relleno de cavidades quísticas post

quistectomía.

- En exodoncias múltiples, para conservar la altura del reborde alveolar.

- En defectos óseos generados por la

desinclusión de caninos o terceros molares.

- En defectos óseos periapicales, luego de una apicectomía, por ejemplo.

- Regeneración ósea alrededor de implan-

tes osteointegrados, rellenando el defecto

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inmediatamente luego de haber colocado el o los implantes.

- En injertos óseos en bloque, para relle-

nar la zona donante, estimulando su rege- neración y para cubrir y ayudar a remodelar el bloque a utilizar, compactándose las zo- nas limítrofes del injerto, evitando así los escalones óseos (8) .

- Reconstrucción de grandes defectos óseos post cirugía oncológica (9) .

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