MANUAL DO IBAMA - PARTE D

AVALIAO DA TOXICIDADE DE AGENTES QUMICOS PARA MICRORGANISMOS, MICROCRUSTCEOS, PEIXES, ALGAS, ORGANISMOS DO SOLO, AVES ANIMAIS SILVESTRES E PLANTAS

D.2. AVALIAO DA TOXICIDADE PARA MICROCRUSTCEO

D.2.1. Avaliao da toxicidade aguda para Daphnia similis (Cladocera, Crustacea) D.2.2. Avaliao da toxicidade crnica para Daphnia similis (Cladocera, Crustacea) D.2.3. Avaliao da toxicidade crnica para Ceriodaphnia dubia (Cladocera, Crustacea)

D.2.1. Avaliao

da

toxicidade

aguda

para

Daphnia

similis

(Cladocera, Crustacea)
Data da reviso: 09/87 1. Objetivo Avaliar a toxicidade aguda de agentes qumicos para Daphnia similis. 2. Fundamento Este mtodo consiste na exposio de indivduos jovens de Daphnia similis a vrias concentraes do agente qumico, por um perodo de 48 horas, nas condies prescritas. Tal procedimento permite determinar a concentrao efetiva inicial mdia CE50, 48 h, da substncia-teste.

3. Definio 3.1. Concentrao efetiva inicial mdia - CE50, 48 h Concentrao nominal do agente qumico no incio do teste, que causa efeito agudo (imobilidade) a 50% dos organismos em 48 horas de exposio, nas condies de teste. 4. Material necessrio 4.1. Aparelhos e equipamentos Todo material que entrar em contato com a substncia-teste dever ser quimicamente inerte, preferencialmente de vidro. Como recipientes para teste podem ser utilizados tubos de ensaio aferidos para 10 ml, cuidadosamente lavados e enxaguados. 4.1.1. Medidor de pH. 4.1.2. Medidor de oxignio dissolvido na gua. 4.1.3. Agitador de tubos de ensaio. 4.1.4. Cmara incubadora com temperatura controlada para 20C. 4.1.5. Titulador para determinao da dureza total da gua. 4.2. Solues e reagentes 4.2.1. gua de diluio Para o preparo de gua reconstituda deve-se utilizar reagentes de grau analtico. A gua usada para o preparo do meio sinttico deve ser originria de um destilador de vidro ou gua deionizada de pureza equivalente, com condutividade igual ou menor que 10uS/cm. A gua de diluio reconstituda gua mole (APHA, 1980), devendo possuir pH = 7,4 0,2, dureza total de 40 a 48 mg/L em CaCO3 e condutividade em torno de 160uS/cm. Para o preparo da gua de diluio so utilizadas duas solues, abaixo especificadas, nas seguintes propores:

Soluo 1........................................................ 20 ml Soluo 2........................................................ 10 ml gua deionizada ou destilada....................... 970 ml As solues 1 e 2 so preparadas da seguinte maneira: Soluo 1 Sulfato de clcio (CaSO4 . 2H2O).................. 1,50 g gua deionizada ou destilada....................... 1000 ml Soluo 2 Cloreto de potssio (KCl).............................. 0,2 g Bicarbonato de sdio (NaHCO3)................... 4,80 g Sulfato de magnsio (MgSO4 . 7H2O............ 6,10 g gua deionizada ou destilada....................... 4,80 g Aps o preparo da gua mole, introduz-se aerao durante pelo menos 24 horas, para homogeneizao e para que seja atingida saturao mxima de oxignio. Se o pH estiver abaixo de 7,2 ou acima de 7,6 dever ser ajustado com o acrscimo de cido clordrico (HCl) 1N ou hidrxido de sdio (NaOH) 1N. A gua no deve ser aerada aps o ajuste de pH. 4.2.2. Solues-estoque As solues-estoque devem ser preparadas no momento da realizao do teste, dissolvendo-se uma quantidade conhecida do agente qumico, a ser testado, em um volume definido de gua de diluio. Substncias de baixa solubilidade podem ser dissolvidas ou dispersadas por intermdio de solventes que apresentam baixa toxicidade a Daphnia, desde que a concentrao final destes no ultrapasse 0,1 ml/L ou 0,1 g/L na soluo-teste. No caso de emprego de solventes dever ser preparado, por ocasio do bioensaio, alm de um controle com gua de diluio, um outro com a concentrao mxima de solvente utilizada.

Quando da utilizao de solventes torna-se importante a anlise qumica da soluo-estoque. 4.2.3. Solues-teste Estas solues devem ser preparadas atravs de misturas da soluo-estoque em gua de diluio, em diferentes propores relativas. Nas solues-teste so colocados os organismos a serem estudados. 4.3. Organismos-teste Para a realizao do teste devem ser utilizados organismos com 06 a 24 horas de idade, obtidos de culturas mantidas em condies controladas (Anexo I). Para obteno dos mesmos pode-se adotar o seguinte procedimento: a) Um dia antes de iniciar o teste, um lote de fmeas ovgeras separado das culturas, utilizando-se para isso uma pipeta Pasteur com ponta arredondada, de dimetro adequado. As fmeas separadas so colocadas em um recipiente de vidro limpo, contendo 2 litros de gua de diluio. Anota-se ento o horrio de incio desta nova cultura e alimenta-se com um volume tal de suspenso algcea que cada organismo disponha de 5 x 106 clulas (Anexo II). O recipiente deve ser coberto com uma tampa de vidro para evitar possveis contaminaes pelo ar. No dia seguinte (menos de 24 horas aps o incio desta cultura), as fmeas adultas so retiradas com pipeta Pasteur e recolocadas nas culturas originais. As jovens ali eclodidas podero, ento, ser utilizadas no teste. b) Outro modo para separar as jovens com o uso de peneiras. No caso de ensaios com Daphnia similis pode-se utilizar jovens que atravessam uma rede com malha de 500 m e que ficam retidas em uma rede de malha de 360 m. No caso de testes com outras espcies de Daphnia o uso desta tcnica fica condicionado a um estudo prvio sobre as dimenses adequadas das malhas das redes (ISSO, 1976).

5. Procedimento Em tubos de ensaio aferidos para 10 ml, colocam-se conhecidos de soluesestoque e completa-se o volume para 8 ml com gua de diluio para obter as concentraes-teste desejadas. O contedo do tubo homogeneizado em agitador. Adiciona-se a cada tubo 2 ml de gua de diluio contendo 5 organismos, completando-se, com isso, o volume final para 10 ml. Para cada teste prepara-se um controle somente com gua de diluio e com o mesmo nmero de organismos durante o perodo de teste, de 48 horas. Os tubos so mantidos em estantes temperatura de 20 2C, em ambiente escuro. Ao trmino do teste verificam-se quantos organismos mveis restam em cada tubo e quantos se encontram imveis. Aqueles que no so capazes de nadar por um intervalo de 15 segundos, aps agitao suave do tubo, so considerados imveis. Qualquer modificao no comportamento dos organismos-teste deve ser registrada. 5.1. Teste preliminar Este teste permite determinar a faixa de concentraes a ser utilizada no teste definitivo. Para este propsito utilizam-se 2 rplicas com 5 organismos em cada, preparando-se diferentes concentraes a partir das solues-estoque. Para o preparo das solues-teste deve-se utilizar intervalos de concentraes em escala logartmica como, por exemplo, 32,0; 10,0; 3,2; 1,0; 0,32; e 0,10 mg/L, alm de um controle. Se houver dados insuficientes para estabelecer a faixa de concentraes necessrias para o teste definitivo, repete-se o teste preliminar, com incluso de concentraes intermedirias ou ampliando a faixa de concentraes. 5.2. Teste definitivo Atravs da faixa estabelecida no teste preliminar prepara-se uma srie de concentraes intermedirias, cada qual com 4 rplicas, em progresso geomtrica de razo 1,3, por exemplo. Assim ter-se-, para cada concentrao, um total de 20

organismos, distribudos em nmero de 5 em cada uma de 4 rplicas contendo 10 ml de soluo-teste. O teste incubado a 20 2C, em ambiente escuro, por um perodo de 48 horas e no trmino desse perodo registra-se o nmero de organismos mveis e imveis em cada tubo. Aps a observao e registro do nmero de organismos mveis, faz-se a leitura do pH, oxignio dissolvido e se possvel a anlise qumica das solues-teste. Todos os dados fsico-qumicos e biolgicos devem ser anotados em uma ficha controle (Anexo III). Com os dados de imobilidade obtidos no teste definitivo determina-se a CE(I)50 - 48 horas e seu intervalo de confiana, atravs do mtodo estatstico de LITCHFIELD & WILCOXON (1949) ou outros mtodos similares citados na literatura. 6. Apresentao dos resultados 6.1. Expresso dos resultados O resultado da CE(I)50 deve ser acompanhado do intervalo de confiana determinado estatisticamente. Os dados devem ser expressos em mg/L. No caso da realizao de anlises qumicas durante o perodo de teste, devese observar se o desvio padro dos resultados obtidos em relao concentrao prevista no maior do que 20%. Se esta situao ocorrer, a concentrao efetiva pode ser calculada em funo dos resultados qumicos e ser expressa com CE50 24 horas. 6.2. Relatrio Devem constar do relatrio final os seguintes itens: a) Mtodo utilizado; b) Identificao da substncia-teste; c) Mtodo de preparo da soluo-estoque e soluo-teste; d) Dados biolgicos incluindo idade e condies de cultura de Daphnia similis, e dados fsico-qumicos referentes ao teste;

e) Resultados de CE(I)50 ou CE50, 48 horas, com intervalo de confiana, anlises qumicas e mtodo empregado nestas anlises; f) A concentrao mnima que imobiliza 100% dos organismos e a mxima que no causa imobilidade; g) Qualquer comportamento anormal dos organismos nas condies de teste; h) Devem constar as modificaes introduzidas e eventuais ocorrncias durante a realizao do teste que podem influenciar os resultados. 7. Controle de qualidade Consideram-se vlidos os resultados que, no trmino do perodo de teste, atenderem os seguintes requisitos: a) A porcentagem de organismos imveis no controle no deve exceder 10%; b) O teor de O2 dissolvido deve ser 2 mg/L; c) No caso de Daphnia similis a CE50 24 horas de K2Cr2O7 deve estar entre 0,04 e 0,17 mg/L. Para outras espcies a faixa aceitvel deve ser estabelecida; d) A temperatura deve ser mantida a 20 2C; e) Organismos flutuantes no controle so considerados mortos, lembrando-se que no devem ocorrer mais de 10% de imobilidade. 8. Literatura bsica APHA. AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. Standard methods for the examination of water and wastewater. 15 Ed. New York, 1980. CETESB. gua e Teste de Toxicidade Aguda com Daphnia similis Claus, 1876 (Cladocera, Crustacea). Norma tcnica LR.018. CETESB, So Paulo. 1986. 27p. ISSO. INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Determina-tion de l'inhibition de la mobilit de Daphnia magna Straus (Crustacs, Cladocre). Projeto de norma ISSO/IC 147 - QUALIT DES EAUX. Paris, 1976. LITCHFIELD, J.T. & WILCOXON, F.A. A simplified method for evaluating dose effect experiments. J. Pharm. Exp. Ther., 96:99-113, 1949.

9. Anexos 9.1. Anexo I Mtodo de cultura de Daphnia Em cristalizadores de 4 litros colocam-se 3 litros de gua mole, 40 organismos adultos e 40 de idade heterognea. Em cada cristalizador devem ser colocados, tambm, 2 gastrpodos das espcies Limnea spp., Helissoma spp., Physa spp. ou Biomphalaria spp. A sala de manuteno da cultura de Daphnia deve ser limpa, isenta de substncias ou vapores txicos e as culturas devem ser mantidas em temperatura de 20 2C, fotoperodo de 16 horas de luz e 8 (oito) horas de escuro, com intensidade luminosa de aproximadamente 1000 lux. As culturas so alimentadas diariamente com uma suspenso de Chlorella vulgaris, de tal forma que o nmero de clulas de alga por Daphnia por dia seja de 5x106 (Anexo II). Outras espcies de algas podem ser utilizadas como alimento a Daphnia. Duas vezes por semana o volume de gua de cada cultura reduzido metade por sifonamento, retirando-se, dessa maneira, os detritos depositados no fundo da cuba e o excesso de animais, mantendo-se assim a populao em torno de 80 organismos de idade variada. Completa-se volume para 3 litros com gua mole reconstituda. Uma vez por semana as culturas so transferidas para cristalizadores limpos. Os frascos de cultura devem ser lavados com gua da torneira, passando-se gaze para a remoo de materiais aderidos nas paredes internas dos recipientes, enxaguando-se posteriormente com gua destilada. Sabe-se que em condies ambientais desfavorveis podem surgir machos na cultura de Daphnia, a qual visualmente composta apenas por fmeas que se reproduzem partenogeneticamente. Com o aparecimento de machos ocorre reproduo sexuada, resultando em efpios, que so ovos resistentes de colorao escura, visveis na cmara de ovos das

fmeas adultas. Se dois ou mais efpios surgirem em uma cultura, a mesma deve ser descartada e nova cultura deve ser iniciada. 9.2. Anexo II Manuteno de culturas de Chlorella vulgaris Uma das maneiras de se cultivar algas em laboratrios como fonte de alimento para Daphnia atravs da produo contnua de culturas unialgceas em fermentadores (Figura 1). Para tanto, o seguinte procedimento pode ser seguido: a) Preparo do meio de cultura Utiliza-se o meio LC-Oligo preparado como segue: Soluo 1 Ca(NO3) . 4H2O ........................................... 4 g gua bidesionizada ..................................... 100 ml Soluo 2 KNO3............................................................ 10 g gua bidesionizada ..................................... 100 ml Soluo 3 MgSO4 . 7H2O.............................................. 3 g gua bidesionizada ..................................... 100 ml Soluo 4 K2HPO4 ........................................................ 4 g gua bidesionizada ..................................... 100 ml Soluo 5 CuSO4 . 5H2O .............................................. 30 mg (NH4)6Mo7O24 . 4H2O ................................... 60 mg ZnSO4 . 7H2O .............................................. 60 mg

CoCl2 . 6H2O................................................ 60 mg Mn(NO3)2 . 4H2O.......................................... 60 mg C6H8O2 . H2O ............................................... 60 mg H3BO3 .......................................................... 60 mg gua bidesionizada ..................................... 1000 ml Soluo 6 C6H5FeO7 . 5H2O ......................................... 1,625 g FeSO4 . 7H2O .............................................. 0,625g FeCl3 . 6H2O ................................................ 0,625 g gua bidesionizada ..................................... 1000 ml Soluo 7 NaHCO3 ....................................................... 15 g gua bidesionizada ..................................... 1000 ml Em 994 ml de gua bideionizada adicionar: Soluo 1..................................................... 1 ml Soluo 2..................................................... 1 ml Soluo 3..................................................... 1 ml Soluo 4..................................................... 1 ml Soluo 5..................................................... 0,5 ml Soluo 6..................................................... 0,5 ml Soluo 7..................................................... 1 ml Ajustar o pH desse meio com HCl ou NaOH para 7,1 0,1, se necessrio, e autoclavar a 121C por 15 min/litro. b) Preparo do inculo Em condies asspticas (cmara de fluxo laminar) inocula-se clulas de Chlorella vulgaris, mantidas em meio de agar, em frascos erlenmeyer de 500 ml contendo 100 ml de meio L.C. Oligo esterilizado. Essa cultura deve

ser incubada por 5 a 7 dias a 24 2C, em agitao contnua de 145 rpm e iluminao contnua de intensidade 5000 lux. Aps esse perodo, a suspenso algcea dever atingir de 6,0 a 20,0 x 106 clulas/ml. Utiliza-se esta cultura como inculo para o fermentador. O fermentador inoculado conectado ao suprimento de ar, devendo ser mantido em banho-maria a 20C sob iluminao constante de 2000 ou 3000 lux (Figura 1). c) Preparo de alimento para Daphnia spp. Aps cerca de 4 a 5 dias verifica-se se a cultura algcea est em fase exponencial de crescimento. Nessas condies, retira-se o volume necessrio do fermentador e centrifuga-se a 4000 rpm por 5 minutos, temperatura de 15 a 20C, descartando-se o sobrenadante e ressuspendendo-se as algas em gua mole. Estima-se o nmero de clulas por ml de suspenso algcea, por meio de contagem ao microscpio ptico ou por leitura no espectrofotmetro. A partir desse dado, calcula-se o volume a ser adicionado cada cultura de Daphnia spp., de tal forma que sejam fornecidas 5 x 106 clulas por Daphnia por dia. Detalhes dos procedimentos descritos nesse anexo encontram-se no Procedimento Operacional Padronizado n 009-CE-TESB.

Figura 1 - Esquema para construo do fermentador para cultivo de alga.

D.2.2. Avaliao da toxicidade crnica para Daphnia similis (Cladocera, Crustacea) Data da reviso: 09/87 1. Objetivo Avaliar a toxicidade crnica de agentes qumicos, durante a exposio de uma gerao de Daphnia similis a diferentes concentraes da substncia-teste. 2. Fundamento Este mtodo consiste na exposio de organismos jovens de Daphnia similis a vrias concentraes do agente qumico, por um perodo de 21 dias de exposio. Durante esse tempo avalia-se os efeitos da substncia-teste sobre a sobrevivncia, crescimento e reproduo dos organismos-teste. 3. Definies 3.1. Concentrao de efeito no observado (CENO) A maior concentrao nominal do agente txico que no causa efeito deletrio estatisticamente significativo na sobrevivncia e reproduo dos organismos, em sete dias de exposio, nas condies de teste. 3.2. Concentrao de efeito observado (CEO) A menor concentrao nominal do agente txico que causa efeito deletrio, estatisticamente significativo, na sobrevivncia e reproduo dos organismos em sete dias de exposio, nas condies de teste.

3.3. Valor crnico (VC) Mdia geomtrica dos valor de CENO e CEO. 3.4. CE50 Concentrao do agente qumico que causa um determinado efeito a 50% dos organismos-teste, em um tempo de exposio definido. 3.5. Nmero de jovens Nmero total de jovens produzidos por fmea adulta no perodo de 21 dias. 3.6. Comprimento do organismo Comprimento total do organismo vivo, obtido atravs da medida entre o pice e a base do espinho abdominal e expresso em mm. 3.7. Efpio Ovos resistentes, de colorao escura, visveis na cmara de ovos de fmeas adultas, resultantes da reproduo sexuada. 4. Material necessrio 4.1. Aparelhos e equipamentos 4.1.1. Medidor de oxignio dissolvido 4.1.2. Medidor de pH 4.1.3. Condutivmetro Os materiais que entrarem em contato com as solues-teste devem ser inertes e estar isentos de contaminantes. 4.2. Solues e reagentes

4.2.1. gua de diluio A gua natural ou reconstituda deve ser adequada manuteno dos organismos e no deve afetar, durante o perodo do teste, o crescimento, reproduo e sobrevivncia dos mesmos. A gua deve ser aerada antes do seu uso e, quando necessrio, filtrada para remoo de materiais em suspenso. Deve-se proceder periodicamente as medidas de pH, dureza, alcalinidade, carbono orgnico total, pesticidas, metais e outra anlises para caracterizao e controle de qualidade da gua. 4.2.2. Solues-estoque As solues-estoque devem ser preparadas no momento da realizao do teste, dissolvendo-se uma quantidade conhecida do agente qumico em um volume definido de gua de diluio. Substncias de baixa solubilidade podem ser dissolvidas ou dispersadas por intermdio de solventes que apresentem baixa toxicidade a Daphnia, desde que a concentrao final destes no ultrapasse 0,1 ml/L ou 0,1 g/L na soluo-teste. No caso do emprego de solventes dever ser preparado, por ocasio do teste, alm de um controle com gua de diluio, um outro com a concentrao mxima de solvente utilizada. Quando da utilizao de solventes torna-se importante a anlise qumica da soluo-estoque. 4.2.3. Solues-teste As solues-teste podem ser obtidas a partir de solues-estoque, que por sua vez so preparadas dissolvendo-se uma quantidade conhecida do agente qumico num volume de gua de diluio. As concentraes devem ser preparadas tomando-se como base os resultados dos testes a curto prazo, 48 horas (CETESB, 1986). A concentrao mais alta a ser utilizada no teste deve ser a concentrao mais baixa do teste a curto prazo, que produz efeito adverso nos organismos. As solues-teste devem ser preparadas no mesmo dia do incio do teste. Se a concentrao do agente txico decrescer mais que 10% num perodo de 72 horas, o que pode ser atribudo adsoro da substncia s paredes do

recipiente-teste, necessrio saturar os frascos com as solues-teste antes do incio do ensaio. Se a concentrao do agente txico na soluo-teste decrescer mais que 30% em 72 horas, deve-se usar o procedimento com renovao contnua da soluo (teste de fluxo contnuo). 5. Procedimento 5.1. Descrio das condies do teste 5.1.1. Os organismos devem ser manipulados com cuidado, para no terem seu comportamento e sensibilidade alterados e no sofrerem choques de temperatura. A temperatura no deve variar mais que 3C num perodo de 12 horas. 5.1.2. A concentrao de oxignio dissolvido na gua deve estar entre 60 a 100% de saturao e a concentrao de amnia no ionizada deve ser inferior a 20 g/L. 5.1.3. Uma variedade de alimentos tem sido adequada para manuteno de Daphnia, incluindo algas (Chlorella, Ankistrodesmus, Selenastrun, Chlamydomonas), leveduras e alimentos sintticos de origem vegetal e animal. Quanto qualidade e quantidade de alimento recomenda-se consultar o estudo realizado por GOULDEN & HENRY (1982). A concentrao de alimento nas soluesteste deve ser suficiente para manter o crescimento, reproduo e sobrevivncia dos organismos e tambm no interferir na biodisponibilidade da substncia-teste. 5.1.4. O alimento adicionado nas solues-teste trs vezes por semana, quando cada soluo renovada. 5.1.5. Cultura e aclimatao de Daphnia As culturas devem ser mantidas, pelo menos 21 dias antes do incio do experimento, nas mesmas condies de teste, com renovao da gua de manuteno trs vezes por semana. Este procedimento se faz necessrio a fim de que seja comprovada a adequao das condies abiticas.

O teor de oxignio dissolvido, temperatura, dureza da gua, e outras condies devem ser as mesmas estabelecidas para o teste. Dez e doze dias antes do incio do ensaio de ciclo de vida separam-se fmeas adultas ovgeras da cultura e inicia-se uma nova cultura. Jovens de menos de 24 horas de idade so obtidas dessa nova cultura e utilizadas no incio do teste. Para uma boa manuteno de Daphnia a cultura no deve conter mais de um organismo por 50 ml de gua. 5.1.6. A temperatura mdia de gua durante o perodo-teste, de 21 dias, deve permanecer entre 19 a 21C. 5.2. Execuo So utilizados 10 bqueres de 250 ml para cada concentrao, contendo 200 ml de soluo-teste. As solues-teste so preparadas a partir de solues-estoque em diferentes propores com a gua de diluio. Nestas solues adicionado o alimento para Daphnia. As solues devem ser preparadas no mximo at quatro horas antes do incio do teste e so distribudas nos bqueres. Posteriormente, os organismos so cuidadosamente adicionados ao acaso nos frascos teste. Para cada concentrao so colocados em sete bqueres, com um organismo por bquer para obteno dos dados de sobrevivncia, crescimento e reproduo. Os trs bqueres restantes contero cinco organismos em cada, para registro dos dados de sobrevivncia. Para cada teste preparado o controle com gua de diluio utilizando 10 rplicas. Se for necessrio o uso de solvente para diluir a substncia-teste, deve ser preparada, alm do controle, uma srie de 10 rplicas com a maior concentrao de solvente utilizada no experimento. Todos os bqueres so colocados ao acaso na incubadora e cobertos com uma placa de vidro. So preparadas pelo menos cinco concentraes-teste em srie geomtrica, com fator de 0,5. Quando possvel, um nmero maior de concentraes podem ser utilizadas para assegurar a deteco das concentraes de efeito e de no-efeito.

A seleo das concentraes se baseia nos resultados obtidos no teste da toxicidade aguda (concentrao mais baixa da substncia-teste que causou um efeito). Se este dado no for disponvel utiliza-se, em geral, a concentrao equivalente a 1/10 de CE50 como concentrao mediana para a preparao das concentraes-teste. O teste se inicia quando a Daphnia com menos de 24 horas de vida adicionada na soluo teste e termina no final do 21 dia de teste. 5.2.1. Renovao das solues teste e registro dos dados biolgicos Se o teste se inicia numa 2 feira as solues devem ser renovadas nas prximas quartas, sextas e segundas-feiras. Nos dias de renovao das solues so registrados os nmeros de organismos vivos e mortos de cada frasco. Os organismos vivos so transferidos para frascos com solues novas, com as mesmas concentraes-teste. conveniente registrar o nmero de jovens nascidos dos sete bqueres aps a transferncia dos adultos. Os bqueres com as solues velhas so esvaziados, lavados adequadamente e enxaguados com gua de diluio. Nos 7 e 21 dias de teste os organismos dos sete bqueres, so contados e, com o auxlio de um retculo micromtrico ao microscpio, medido o comprimento total de cada indivduo. Devem ser ainda anotados o dia da primeira reproduo, o nmero de natimortos e a incidncia de desenvolvimento ou comportamento anormal dos organismos. 5.2.2. Registro das condies abiticas Para cada teste deve-se realizar o controle de qualidade da gua de diluio: dureza, alcalinidade, pH, OD e condutividade so mensurados no comeo e final do teste e uma vez por semana durante a renovao das solues. Se a concentrao de OD nas solues-teste cair para menos que 50% de saturao recomenda-se utilizar o sistema de fluxo contnuo. Durante o perodo de 21 dias deve-se registrar a temperatura vrias vezes ao longo de cada dia ou as temperaturas mxima e mnima. O teste deve ser realizado a

20 1C. A temperatura mdia deve estar entre 19 a 21C e a temperatura instantnea registrada a qualquer momento no deve sair da faixa de 17 a 23C. A concentrao nominal das solues-estoque deve ser verificada analiticamente. As concentraes do agente qumico em estudo nas solues-teste devem ser determinadas analiticamente pelo menos uma vez por semana, em amostras s quais j foi adicionado o alimento. A diferena entre a concentrao nominal e aquela determinada experimentalmente no deve ser superior a 30%. Se isto ocorrer a causa deve ser identificada. 6. Apresentao dos resultados Vrios mtodos estatsticos so utilizados na interpretao dos dados obtidos no teste. Recomenda-se consultar o documento elaborado pela ASTM (1983) sobre o assunto. Em geral, para determinar a menor concentrao que afeta significativamente a sobrevivncia, o crescimento ou a reproduo de Daphnia, necessrio que uma concentrao-teste e todas as mais elevadas a esta tenham exercido um efeito nas trs variveis acima mencionadas quando comparadas ao controle. Os resultados devem ser expressos em valor crnico (VC), o qual ser a mdia geomtrica entre a maior concentrao na qual no se observa efeito adverso (CENO) e a menor concentrao que causa o efeito observado (CEO). 6.1. Relatrio Um relatrio final dos resultados do teste deve conter informaes quanto ao procedimento utilizado, identificando a metodologia empregada e qualificando os resultados obtidos. O relatrio deve conter: Nome do teste e pesquisador, nome e local do laboratrio e data de incio e trmino do teste;

Descrio detalhada do material testado, incluindo sua fonte, nmero do lote, composio, propriedades fsico-qumicas, identificao das concentraes, etc.;

Descrio de como a gua de diluio foi obtida ou preparada, suas caractersticas, registros e outras informaes; Informaes detalhadas sobre o organismo testado, nome cientfico, fonte, idade e cultura utilizada; Descrio do teste, recipientes, solues, condies, luz, nmero de organismos, etc.; Descrio detalhada quanto ao alimento (qualidade, quantidade); Preparo das solues-teste; Temperatura teste: mdia e tambm faixa de temperatura durante o teste; Mtodos utilizados nas anlises qumicas; Dados de sobrevivncia, crescimento e reproduo dos organismos de controle e das demais solues-teste; Mtodos estatsticos utilizados e resultados da aplicao dos mesmos; Resumo dos efeitos gerais ou sinais observados nos organismos durante o perodo teste; Resultados dos testes de toxicidade aguda; Quaisquer modificaes introduzidas no procedimento descrito neste mtodo.

7. Controle de qualidade 7.1. Aceitabilidade do teste Um teste deve ser desprezado se ocorrer qualquer uma das seguintes situaes: Mais que 20% de mortalidade no controle; Se no final de 21 dias, em cada controle, no houver produo, em mdia, de pelo menos 40 jovens; Produo de efpios no controle;

Se a temperatura mdia no estiver entre 19 e 21C ou se for detectada, a qualquer momento, temperatura abaixo de 17C ou acima de 23C; Se a concentrao de OD, em mdia, for menor que 50% de saturao ou se, a qualquer momento, for detectada menos que 40% de saturao; Se os resultados das anlises qumicas revelarem um desvio de concentrao maior que 30% da concentrao nominal.

7.2. No aceitvel para teste a cultura que: a) Produzir efpio; b) No produziu jovens at o 12 dia; c) Apresentar mais que 20% de mortalidade dos jovens durante uma semana antes do teste; d) No produzir, em mdia, pelo menos trs jovens por adulto por dia, num perodo de sete dias antes do teste. 8. Literatura bsica ASTM - Comittee E 47. Draft n 4. Proposed Standard Practice for conducting Renewal life-cycle toxicity Tests with Daphnia magna (Strauss). 1983. CETESB. gua. Teste de toxicidade aguda com Daphnia similis. Norma Tcnica L 5018. CETESB, So Paulo, 1986. 27p. GOULDEN, C.E. & HENRY, L.L. Nutrition of Daphnia used in Bioassay Studies. Final report of subcontract n T 6418 (7197) - 032 Contract n 68-01.5043. Office of Pesticides and Toxic Substance. U.S. Environmental Protection Agency. May, 1982.

D.2.3. Avaliao da toxicidade crnica para Ceriodaphnia dubia (Cladocera, Crustacea) Data da reviso: 09/87 1. Objetivo Avaliar a toxicidade crnica de agentes qumicos Ceriodaphnia dubia. 2. Fundamento Fmeas de Ceriodaphnia dubia so expostas a vrias concentraes da substncia em estudo, por sete dias, em condies definidas de teste. Ao final desse perodo determina-se o nmero mdio de jovens produzidos partenogeneticamente, por fmea, e o nmero de fmeas adultas sobreviventes. Os resultados incluem os efeitos sinrgicos, antagnicos e aditivos de todos os componentes fsicos, qumicos e biolgicos que afetam adversamente as funes fisiolgicas e bioqumicas dos organismos-teste. 3. Definies 3.1. Concentrao de efeito no observado (CENO) A maior concentrao nominal do agente txico que no causa efeito deletrio estatisticamente significativo na sobrevivncia e reproduo dos organismos em 7 dias de exposio, nas condies de teste.

3.2. Concentrao de efeito observado (CEO) A menor concentrao nominal do agente txico que causa efeito deletrio estatisticamente significativo na sobrevivncia e reproduo dos organismos em 7 dias de exposio, nas condies de teste.

3.3. Valor crnico (VC) Mdia geomtrica dos valores de CENO e CEO. 4. Material necessrio 4.1. Aparelhos e equipamentos 4.1.1. Medidor do oxignio dissolvido (OD) 4.1.2. Medidor de pH 4.1.3. Condutivmetro 4.1.4. Aparelhagem para medir dureza da gua 4.1.5. Cmaras de temperatura controlada 4.2. Solues e reagentes 4.2.1. gua de diluio A gua natural ou reconstituda deve ser adequada manuteno dos organismos e no deve afetar, durante o perodo-teste, o crescimento, a reproduo e a sobrevivncia dos mesmos. A gua deve ser aerada antes de seu uso e, quando necessrio, filtrada para remoo de materiais em suspenso. Deve-se proceder periodicamente s medidas de pH, dureza, alcalinidade, carbono orgnico total, pesticidas, metais e outras anlises para caracterizao e controle de qualidade da gua. 4.2.2. Substncia de referncia Cloreto de cdmio ou dodecil sulfato de sdio, de grau analtico. 4.2.3. Soluo-estoque Esta soluo deve ser preparada dissolvendo-se uma quantidade conhecida do agente qumico num volume definido de gua de diluio. As solues-estoque devem ser preparadas diariamente, com exceo dos casos em que o agente qumico seja comprovadamente estvel, sendo que em tais casos recomendvel o preparo a cada dois dias.

Substncias de baixa solubilidade podem ser dissolvidas ou dispersadas por intermdio de solventes com baixa toxicidade Ceriodaphia spp. desde que a concentrao final deste no ultrapasse 0,1 ml?l ou 0,1 g/L na soluo-teste de concentrao mais elevada no teste. No caso do emprego de solventes deve ser preparado, alm do recipiente com gua de diluio (controle), um outro recipiente (controle) com a concentrao mxima do solvente utilizado no teste. Quando da utilizao de solventes torna-se importante a anlise qumica da soluo-estoque. 4.2.4. Soluo-teste Estas solues sero preparadas atravs de misturas da soluo-estoque em gua de diluio de diferentes propores relativas. Nas solues-teste sero colocados os organismos a serem estudados. 4.3. Organismo-teste Ceriodaphnia dubia (Cladocera, Crustacea) de no mximo 8 (oito) horas de idade, obtidas por partenognese e mantidas em condies controladas (Anexo I). 5. Procedimento 5.1. Condies do teste A qualidade e intensidade luminosas devem ser mantidas a nveis do ambiente, de aproximadamente 50 a 100 velas p ou 10 a 100 lmens, com um fotoperodo de 16 horas de luz, 8 horas de escuro. essencial que a temperatura das solues de teste seja mantida a 25 1C para obter trs crias em sete dias. O ambiente deve ser isento de vapores e poeiras txicas.

5.1.1. Oxignio dissolvido (OD) O OD das solues-teste deve ser mantido acima de 5 mg/L, no sendo recomendada aerao durante o teste. Assim deve-se utilizar gua saturada de oxignio para o preparo das solues. 5.1.2. Alimentao Os organismos nos frascos-teste so alimentados com uma dieta composta por bactrias, leveduras e extratos vegetais (Anexo I) na proporo de 0,1 ml para 15 ml de soluo-teste, desde que a quantidade de slidos totais em suspenso no alimento preparado seja 14 mg/L. 5.1.3. Renovao da soluo-teste A cada 2 dias e, se necessrio, diariamente, usando uma pipeta de vidro com ponta arredondada, transfere-se cada organismo para 15 ml de soluo-teste recmpreparada j contendo o alimento. Os animais devem ser liberados abaixo da superfcie da gua para que no entre ar sob a sua carapaa. 5.1.4. Determinaes fsico-qumicas rotineiras Pelo menos a temperatura, OD, pH, condutividade e dureza devem ser medidas, a cada troca de solues, no controle e no tratamento contendo a maior concentrao do material em teste. 5.2. Execuo do teste 5.2.1. Teste preliminar A seleo das concentraes para teste dever ser definida atravs de ensaios preliminares exploratrios. Utilizando-se a soluo-estoque, deve-se preparar 5 solues-teste com gua de diluio. No preparo das solues-teste utilizar intervalos de concentrao em escala logartmica, por exemplo, 1000,0; 320,0; 100,0; 32,0 e 10,0 mg/L.

Alm dessas solues deve-se utilizar controle com gua de diluio e no caso do uso de solventes um controle adicional. O teste preliminar deve ter durao de 48 horas. Se houver dados insuficientes para estabelecer a faixa de concentraes necessrias para o teste definitivo, repetir o teste preliminar com a incluso de concentraes intermedirias ou ampliando a faixa de concentraes. 5.2.2. Teste definitivo Com base no teste preliminar, so selecionadas 6 solues-teste do agente txico, utilizando-se, tambm, neste caso, intervalos de concentrao em escala logartmica, porm incluindo-se solues intermedirias que reduziro a amplitude da faixa de concentraes. Prepara-se uma quantidade de soluo-teste para cada concentrao do agente qumico (e tambm do controle contendo o solvente, se for o caso) que seja suficiente para colocar 15 ml em cada uma das 10 rplicas e restem 400 ml para anlise qumica. a) Obteno de neonatos para teste: O teste requer neonatos com idade de, no mximo, 8 (oito) horas. Para obtlos, fmeas adultas so colocadas em bqueres de 30 ml contendo 15 ml de gua mole, 4 a 5 dias antes do incio do teste. Cerca de 8 (oito) horas antes do incio do teste so removidos todos os jovens dos bqueres. Desta forma, quando o teste comear todos os jovens encontrados nos bqueres tero a idade de, no mximo, 8 (oito) horas. b) Incio do teste: Imediatamente antes do incio do teste a temperatura da amostra deve ser ajustada para 25 1C e a amostra diluda em gua de diluio mesma temperatura, para preparo das diferentes concentraes. Inicia-se o teste colocando um neonato, aleatoriamente, em cada bquer contendo 15 ml da soluo a ser testada, fazendo-se 10 rplicas em cada concentrao. Os bqueres devem ser aleatoriamente dispostos em uma bandeja e sua posio deve ser mudada diariamente.

exceo

da

dureza,

os

demais

parmetros

devem

ser

medidos

imediatamente antes e aps a troca das solues-teste, se possvel na concentrao mais elevada, em uma intermediria, na menor e no controle. Se ocorrer uma mortalidade das fmeas maior que 30%, medem-se os parmetros fsico-qumicos citados em 5.1.1 e 5.1.4 nas concentraes em que isto ocorrer, para auxiliar na avaliao da causa da mortalidade. c) Observao durante o teste: Trs crias so usualmente obtidas em um teste de 7 (sete) dias conduzido a 25C. A cada troca das solues-teste conta-se e anota-se a sobrevivncia do adulto e o nmero de jovens nascidos. Uma maneira fcil de contar as jovens acrescentar 2 a 4 gotas de HCl 1N ao frasco contendo as jovens aps a remoo das adultas. Assim as jovens so mortas rapidamente e vo ao fundo. Quaisquer organismos j mortos no bquer devem ser contados antes do acrscimo do cido. Para a contagem usa-se um microscpio estereoscpico. As jovens so descartadas aps a contagem. Se forem encontradas jovens em um bquer contendo uma adulta morta, assume-se que a morte ocorreu imediatamente antes da contagem. Os jovens vivos so computados na anlise e a adulta considerada viva na anlise de sobrevivncia. Os resultados do teste so aceitos quando a letalidade no controle no exceder a 20% das fmeas adultas. d) Trmino do teste: O teste deve findar exatamente 7 dias aps o seu incio, devido rpida taxa de desenvolvimento de Ceriodaphnia. Um acrscimo de apenas algumas horas no perodo de teste englobaria uma parte importante do ciclo reprodutivo dos animais e poderia resultar em crias adicionais. 6. Apresentao dos resultados Os dados so reunidos e tabelados. Anota-se o nmero de fmeas sobreviventes e calcula-se o nmero de jovens produzidos por fmea adulta. A esses dados aplica-se o teste de Fisher e o teste de Dunnett, que inclui uma anlise de

varincia (ANOVA) seguida de uma comparao da mdia do efeito observado em cada concentrao do produto-teste com a mdia do controle. So utilizados os dados combinados de reproduo e sobrevivncia de Ceriodaphnia, que so expressos atravs da mdia do nmero de jovens produzidos por adulta para cada concentrao da soluo txica. No entanto, qualquer anlise estatstica dever ser usada com o conhecimento das premissas ou suposies das quais o teste depende. Recomenda-se consultar HORMING & WEBER (1985). Os resultados devem ser expressos em valor crnico (VC), o qual ser a mdia geomtrica entre a maior concentrao na qual no se observa efeito adverso (CENO) e a menor concentrao que causa o efeito observado (CEO). 6.1. Relatrio do teste Devem constar no relatrio do teste as seguintes informaes: a) Mtodo utilizado; b) Identificao do agente txico; c) Procedimento de preparo de amostras, solues-estoque e solues-teste; d) Data da realizao do teste (incio e trmino); e) Dados biolgicos e fsico-qumicos referentes ao teste; f) Resultado expresso em CENO, CEO ou VC e mtodos estatsticos utilizados; g) Qualquer comportamento anormal dos organismos nas condies teste; h) Qualquer alterao dos procedimentos prescritos neste mtodo. 7. Controle de qualidade Periodicamente devem ser realizados testes com substncias de referncia, como o cloreto de cdmio ou dodecil sulfato de sdio, para avaliar a sensibilidade do lote de Ceriodaphnia jovens.

8. Literatura bsica CETESB. gua. Teste de toxicidade crnica com Ceriodaphnia dubia Richard, 1894 (Cladocera, Crustacea). Norma Tcnica L5. 022. CETESB, So Paulo. DUNNETT, C.W. Multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50:1096-1121, 1955. HORNING II, W.B. & C.I.WEBER. Short-term methods for estimating the chronic toxicity of effluents and receiving waters to freshwater organisms. Environmental Monitoring and Support Laboratory. Cincinnati. U.S. EPA/600/485/014. 1985.

ANEXO I Mtodo de cultura As culturas so mantidas nas mesmas condies controladas indicadas para o teste, sendo alimentadas diariamente com uma rao adequada, que pode ser preparada como segue: a) Rao de truta fermentada: colocar 5 g de rao de truta em 1,0 L de gua destilada, com aerao por baixo, de forma que a rao fique em suspenso, movendo-se constantemente na gua. Manter assim por uma semana e a seguir filtrar em rede de plncton com poros de 45 m de dimetro. A soluo assim obtida pode ser congelada, em pequenas pores, para armazenamento e uso posterior. b) c) Fermento: colocar 0,5 g de fermento biolgico seco em 100 ml de gua Extratos vegetais: uma composio de folhas de cereais ou gramneas destilada, agitando at que dissolva. desidratadas e trituradas, formando um p fino, pode ser utilizada como fonte de fibras no alimento de Ceriodaphnia. Acrescenta-se 0,5 g de p em 100 ml de gua destilada e agita-se por 24 horas. Aps esse perodo, filtra-se essa soluo em rede de plncton com poros de 45 m de dimetro.

Nota: Pode-se substituir esse componente do alimento por cultura de algas (Selenastrum, Ankistrodesmus) em fase exponencial de crescimento, devendo-se conservar a proporo de algas de alimento como um todo, considerando o peso seco das referidas algas. Para preparo do alimento misturam-se partes iguais das trs solues obtidas da forma descrita acima. Mantm-se uma Ceriodaphnia por bquer contendo 15 ml de gua mole e alimenta-se diariamente com 0,1 ml do alimento preparado. A cada dois dias (segundas, quartas e sextas-feiras) troca-se a gua dos bqueres, descartando-se as jovens. A cada duas semanas iniciada nova cultura com espcimes jovens. O OD da gua de manuteno deve ser medido semanalmente e os frascos de cultura devem ser cobertos, porm no tampadas hermeticamente, para permitir fornecimento de O2 s culturas. Mudanas de pH no devem ultrapassar 0,5 unidade. Os organismos para teste devem ser manuseados cuidadosamente e o mnimo possvel, para que no sejam desnecessariamente estressados. A transferncia de um frasco a outro deve ser feita com pipetas de ponta arredondada, cuidando-se para liberar os animais abaixo da superfcie da gua. Organismos machucados no manuseio devem ser descartados. A sobrevivncia dos organismos em manuteno dever ser observada, e os mesmos no devem ser usados em bioensaios se a sobrevivncia entre duas trocas de gua for menor que 80%.