OBJETIVO: Identificar las especies patgenas de las vas gastrointestinales a travs del coprocultivo y de sus reacciones bioqumicas INTODUCCION

La alta incidencia de procesos infecciosos entricos en la poblacin en general, en pases desarrollados y en vas de desarrollo, y sus elevados ndices de morbimortalidad entre determinadas subpoblaciones (nios y ancianos), hacen que este tipo de patologa siga cobrando gran inters desde el punto de vista clnico y microbiolgico. En pases en vas de desarrollo suele ser la causa ms frecuente de muerte y desnutricin en pacientes en edad peditrica. En pases desarrollados, debido al aumento de la calidad de vida, hay una disminucin de la frecuencia y mortalidad, siendo la mayora de los procesos autolimitados y resueltos con tratamiento adecuado. FINALIDAD DEL COPROCULTIVO La finalidad del coprocultivo es determinar el pronostico del o los agentes causantes de las infecciones intestinales y toxiinfeccin alimentaria estas por lo general estn producidas por m. O. Pertenecientes a la familia de las entero bacterias no por ello se descarta a otros m. O. Como stafilococcus productores de entero toxinas Estreptococos , Clostridios , etc. As como tambin virus , hongos y parsitos . La bsqueda del agente causal no se descarta despus de procesado una sola muestra ,la eliminacin del posible agente patgeno se hace muchas beses en forma intermitente obligando al microbilogo repetir el anlisis por lo comn despus de una semana . INDICACIONES DEL COPROCULTIVO Generalmente suele indicarse en un cuadro entrico infeccioso persistente de ms de 2 3 das, se aconseja la toma de muestras para exmenes de laboratorio. Se recomienda la evaluacin del cuadro: su duracin, su gravedad (grado de deshidratacin, fiebre, sangre en heces, prdida de peso, etc.); y la evaluacin de los antecedentes clnicos del paciente: uso reciente de antibiticos (diarreas asociadas a uso de antibiticos), edad del paciente (los rota virus son la primera causa de gastroenteritis deshidratante en nios), ingestin de mariscos poco cocidos (orienta hacia la infeccin por vibriones o virus smil Norwalk), viajes a zonas tropicales (aumentaran las infecciones por parsitos, virus, y E. coli entero hemorrgico O157), en huspedes inmuncomprometidos se tendran que considerar un amplio espectro de agentes etiolgicos (bacterianos, parasitarios, vricos y micolgicos), en brotes epidmicos se debe orientar hacia la presencia de S. aureus, Cl. perfringens, Salmonella, Vibriones, Shigella, Campylobacter, E. coli, B. Creus. Algunos de ellos escapan a la rutina diagnstica (S. aureus, B. Creus, etc.) porque lo que suele interesar es el estudio de su poder toxignico. Finalmente en cuadros gastroentricos que persisten durante ms de 10 das, se recomiendan los exmenes parasicolgicos. ETIOLOGA El nmero de microorganismos responsables de cuadros entricos se ha ido ampliando debido al mejor conocimiento de los mismos y al desarrollo de mtodos diagnsticos cada vez ms sensibles.

Diversos microorganismos afectan directamente o a travs de sus toxinas al tubo digestivo provocando cuadros diarreicos, dolor abdominal, vmitos, fiebre, etc. Las infecciones gastrointestinales pueden tener una etiologa bacteriana y/o toxiinfeccin alimentara, vrica y parasitaria. BACTERIANA : Entre las que incluiremos Salmonella, Campylobacter, Helicobacter, Shigella, Yersinia entero colitica ,E. Coli entero patgeno , Psedomonas , Aeromonas , hidrfila , Pleciomonas , B. Creus , Clostridium difficile, Staphylococcus aureus, vibrios, y otras menos frecuentes como Mycobacterium tuberculosis . VIRICA : Los virus productores de gastroenteritis son Rotavirus, Adenovirus, virus Norwalk, entre otros. PARASITARIA : Los agentes etiolgicos parasitarios pueden representar un amplio grupo de los que slo mencionaremos algunos como Giardia lambia , Cryptosporidium, Entamoeba histoltica, Ciclos porra, Blastocystis, etc. MICOTICA : levaduras como cndida albicans . Al igual que en el caso de otras muestras humanas, sera conveniente que el clnico orientase al laboratorio sobre el proceso de infeccin y la etiologa sospechosa. Todo ello repercutir en beneficio del paciente, permitiendo ganar tiempo en la obtencin del diagnstico y disminuyendo el coste del precio del anlisis. Esta orientacin es de gran importancia, y en caso de no recibirla, sin ningn tipo de reparos debe ser el microbilogo quien la solicite al mdico para que le d informes sobre detalles epidemiolgicos, perodo de incubacin, as como si el paciente cursa o no con fiebre. Es preciso recordar que las intoxicaciones alimentarias, es decir, las debidas a toxinas producidas fuera del hospedador y despus ingeridas, generalmente no cursan con fiebre y tienen un perodo de incubacin muy corto; en cambio, las producidas directamente por microorganismos cursan habitualmente con fiebre y tardan ms en aparecer. En la tabla 1 se justifica, en parte, lo expuesto. RELACION ENTRE ALGUNOS TIPOS DE GASTROENTERITIS Y LA FIEBRE (1) Patologa causada por Perodo de incubacin (3) Sntomas comunes (4) (2) Nuseas, vmitos, calambres abdominales, Staphylococcus aureus. Toxina (termoestable). 26 horas. diarrea (30 %), sin fiebre o muy poca. Diarrea, dolor abdominal, Salmonella. Infeccin 1236 horas. por lo comn fiebre. Diarrea lquida con mucus; Shigella Infeccin 2472 horas. la fiebre es habitual Toxina (moderadamente Diarrea, calambres, sin Clostridium perfringens. 612 horas. termoestable) fiebre o muy poca. Gastroenteritis inicial Clostridium botulinum. Toxina (termoestable) Variable (de horas a das) seguida por efectos de tipo curare. Microorganismos

(1) La tabla describe algunos microorganismos productores de gastroenteritis. (2) Patologa causada por la produccin de toxinas o por enteroinvasividad. (3) El efecto patolgico se manifiesta generalmente antes si el microorganismo produce toxinas. (4) Entre los sntomas de gastroenteritis figura siempre la diarrea y slo en los casos de infeccin es habitual la fiebre. OBTENCIN DE LA MUESTRA Se utilizaran heces recientes en un recipiente limpio de boca ancha y cierre hermtico con un volumen mnimo de 2 a 4 g en heces pastosas y 5 a 10 ml en heces lquidas. En general debe desaconsejarse el uso de hisopos rectales y restringirlo a casos excepcionales como en neonatos. En muestras digestivas se puede utilizar aspirado gstrico o duodenal. Las biopsias y muestras obtenidas por endoscopia son fundamentales para la bsqueda de Helicobacter pylori (biopsia gstrica y duodenal). La biopsia rectal es empleada para la deteccin de Entamoeba histoltica. El meconio se suele utilizar para estudio perifrico en neonatos con riesgo de sepsis. En muestras para estudio parasicolgico se envan con frecuencia estas en frascos cerrados con lquido conservador. La obtencin de la muestra se har depositando directamente la misma en un recipiente estril, para lo cual puede servir una placa de Petri o un frasco de boca ancha. En caso de no ser posible esta toma directa, se recoger con una cuchara estril alguna porcin del material fecal recin emitido, que no haya entrado en contacto con el frasco receptor (orinal), y se verter en un contenedor estril. Se recomienda procesar las muestras en el menor tiempo posible puesto que un numero de m. O. No sobreviven a lo cambios en el PH lo cual ocurre cuando baja la temperatura , esto es especialmente importante cuando se trata de Shigella y un numero apreciable de salmonellas , si se desea preservar las muestras se deben de someter a la accin de un preservante como el buffer fosfato 0.033 M mezclado con igual volumen de glicerina se estar frente a un PH de 7.0 . las muestras se obtienen por evacuacin natural o mediante frotis rectal de una evacuacin natural tomar las porciones que presenten mucosidad y sangre , cuando se obtiene la muestra por frotis rectal se debe de utilizar una torunda de 6 y sembrar inmediatamente en los medios apropiados o en su efecto colocar en un medio de transporte . este mtodo de toma de muestra es por lo general utilizado en lactantes . El producto as recogido se debe sembrar inmediatamente, incluso en la misma habitacin del paciente si ello es posible, pues algunos patgenos intestinales, concretamente Shigella y algunas especies de Salmonella, sobreviven muy poco tiempo a los cambios de pH que sufren las heces en contacto con el ambiente. En caso de no poder sembrar la muestra in situ, y ante la necesidad de mandarla a un laboratorio, aunque est relativamente cercano, es conveniente enviar parte de ella, incluida en algn medio de transporte que mantenga el pH cercano a la neutralidad. Entre estos medios de transporte se pueden citar: a) Buffer fosfato 0,033 M, mezclado en partes iguales con glicerina. b) Medio tamponado con indicador (Sachs, 1939). Es parecido al anterior, con la innovacin de incluir un indicador, que seala que el medio slo se puede utilizar en condiciones de coloracin rosa y que se debe desechar cuando adquiere tonalidad amarilla. 3

c) Medio de Hajna. Es un excelente medio para el transporte de heces que contienen Salmonella o Shigella.. Puede adquirirse comercializado en forma deshidratada y aadirle, una vez rehidratado, glicerina al 30 por 100. d) Caldo GN. Debido tambin a Hajna. e) Medio de transporte de CaryBlair. Es quiz el ms aceptado universalmente. Permite incluso la recuperacin de anaerobios. NMERO DE MUESTRAS Si con la primera muestra no se detecta la presencia de entero patgenos, es necesario enviar dos tomas ms en diferentes das. MUESTRAS INADECUADAS No se consideran adecuadas las heces emitidas no procesadas antes de 2 horas y no refrigeradas y el envo de tres muestras de heces el mismo da. OBSERVACIONES Las muestras debern tomarse antes de la administracin de antibiticos y se debe indicar siempre en el volante de peticin el juicio diagnstico de presuncin, la edad y explcitamente algunas investigaciones especiales como toxina de C. difficile. PROCESAMIENTO Y VALORACIN

OBSERVACIN DE LA MUESTRA Se puede realizar un examen microscpico para detectar polimorfo nucleares (sugiere infeccin por un patgeno invasivo) y flora predominante. Al recibir la muestra en el laboratorio se observarn detenidamente sus caractersticas, tales como el olor, color, consistencia, o la presencia de mucosidades, sangre, o restos de alimentos sin digerir. Estos detalles pueden orientar algo el diagnstico; as, por ejemplo, unas heces lquidas con grumos en forma de agua de arroz, harn pensar en el clera, o la sangre y mucosidades indicarn una sintomatologa inflamatoria del intestino, que puede ser debida a una disentera. Hay autores que completan esta apreciacin microscpica, mezclando en un porta una pequea porcin de heces con una gota de azul de metileno, tapndolo con un cubre y observando la preparacin con objetivo de inmersin, intentando descubrir leucocitos. Su presencia denotar que hay inflamacin en el intestino, la cual suele estar producida por agentes infecciosos invasores como Salmonella, Shigella o E. coli enteroinvasivo; en cambio, ante un proceso gastroentertico, con heces exentas de glbulos blancos, se sospecha una etiologa virsica, o una bacteriana capaz de producir toxina, como vibrio cholerae, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum o E. coli entero txico. Incluso hay investigadores que afinan ms, y con una tcnica de coloracin como la de Wright, llegan a establecer las distinciones etiolgicas expuestas en la tabla 2. ENFERMEDADES GASTROINTESTINALES ASOCIADAS CON LEUCOCITOS FECALES Enfermedad Tipo de leucocito predominante (2) 4

Porcentaje de pacientes con leucocitosis fecal (1) Shigelosis Salmonelosis (no por S. typhi) Fiebre tifoidea E. coli (invasor) Colitis ulcerosa (activa) 100 82 100 100 100 Leucocitos polimorfo nucleares (media 84 %). Leucocitos polimorfo nucleares (media 75 %). Leucocitos mononucleares (media 95 %) Leucocitos polimorfonucleares (media 85 %). Leucocitos polimorfonucleares (media 88%) (eosinfilos, media 8 %). Por lo general mononucleares, salvo infeccin bacteriana secundaria

Disentera amebiana (activa) Variable Controles sanos, diarrea virsica, clera. 010

La leucocitosis fecal se puede apreciar, simplemente, por observacin entre porta y cubre. El tipo de leucocitos se observa despus de una coloracin de Gram. EXAMEN DIRECTO CON SOLUCION DE LUGOL Y SOLUCION SALINA Es un mtodo muy fcil de realizar , valido para la bsqueda de huevecillos, trofozoitos, larvas y quistes de helmintos y protozoarios. TCNICA: Se toma un fragmento de materia fecal de aproximadamente 1mm de dimetro con el aplicador. Se lleva a un porta, el cual contendr una gota de solucin salina o yodo lugol. Se emulsiona perfectamente, se protege con un cubre y se observa al microscopio. Si la muestra tiene moco con sangre se realiza una toma igual del sitio. EXAMEN RUTINARIO Consiste fundamentalmente en la inoculacin de la muestra diluida en solucin fisiolgica en diversos medios de cultivo, alguno de ellos general como el Agar sangre para evaluacin general de la flora. Otros medios moderadamente selectivos para aislamiento de entero bacterias patgenas como MacConkey, SalmonellaShigella, XLD (xilosalisinadesoxicolato), CIN (cefsulodinairgasannovobiocina) que permiten el crecimiento de Salmonella, Shigella, Yersinia. Sabouraud cloranfenicol para cndida cuando se presenta en disbacteriosis. Medios lquidos de enriquecimiento, para la recuperacin de algunos microorganismos, como el medio de Selenito Medios para Campylobacter como el medio de Skirrow, en ambiente microaeroflico. Tambin en este mismo ambiente, diversos medios como el Agar sangre, se pueden emplear para Helicobacter. Deteccin de rotavirus y adenovirus en nios, especialmente en meses invernales y de temperatura templada. CULTIVOS O PRUEBAS ESPECIALES

Se debe hacer constar en el volante de peticin esa circunstancia. Por ejemplo para deteccin de Vibrio sp. con medios como agua de peptona y TCBS. En toxina de Clostridium difficile, especial atencin a enfermos que hayan usado recientemente antibiticos durante algunos das. Deteccin de toxina de E. coli entero patgeno O157H7 en heces hemorrgicas. En los casos poco frecuentes de bsqueda de cepa Salmonella lactosa positiva, aadir a los medios habituales Agar sulfito bismuto o verde brillante. Aeromonas mesfilas con temperatura de incubacin de 25 a 30 C. Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens y Bacillus cereus relacionados con brotes de toxiinfeccin alimentaria, slo en laboratorios que realicen anlisis de alimentos. Ensayos para virus causantes de esta patologa, como rotavirus, adenovirus , etc. AISLAMIENTO Y CULTIVO MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPO Muestra de materia fecal en frasco con tapa. Placas estriles de: agar soya tripticasena, agar EMB, agar endo, agar SS, agar verde brillante. , Mac Conkey , XLD . Tubo de 16 x 150 con 5 ml de caldo tetrationato. Tubo de 16 x 150 con 5 ml de caldo nutritivo estril. Tubo de 16 x 150 con 5 ml de caldo selenito Mechero, asa, incubadora. Al da siguiente: Placas con coprocultivo. Equipo de coloracin de Gram Serie de tubos de cultivo para pruebas bioqumicas tales como TSI , SIM , LIA , CITRATO DE SIMONS , UREA , etc. Mechero, asa, tina, puente, piseta. Lmpara de alcohol. SIEMBRA DE MUESTRAS PARA BACTERIOLOGA BIOSEGURIDAD Tmense precauciones de asepsia al manipular los especimenes. al inocular en los tubos es indispensable el uso de mascarillas y gorra. trabajar siempre frente a la flama del mechero

Para hacer el coprocultivo, es decir, la siembra de las muestras fecales, se recogern aquellas partes del contenido intestinal que llamen ms la atencin por su aspecto sanguinolento o mucoso, pues es all donde abundan los microorganismos patgenos. La inoculacin se efectuar sobre medios de cultivo propios y selectivos de los principales patgenos intestinales, incluyendo, dada su importancia, un medio de enriquecimiento para Salmonella (Selenito o tetrationato). Las cepas de Salmonella aisladas se identificarn por pruebas bioqumicas y se confirmar su identidad mediante un polivalente serolgico. No es necesario que los pequeos laboratorios dispongan de todo el amplio material perecedero para serotipificar a Salmonella. La presencia de Shigella tambin se confirmar serolgicamente Es discutible la inclusin rutinaria de mtodos y medios para el diagnstico de Vibrio cholerae y Campylobacter. El primero porque es poco frecuente y adems porque las caractersticas clnicas del paciente y las de la muestra ya orientaran hacia ello en caso necesario. El segundo porque, aunque actualmente ocupa el primer puesto en incidencia patolgica intestinal, su metodologa de cultivo e incubacin resulta cara para una prctica sistemtica de todas y cada una de las solicitudes. En este caso se valorar individualmente cada muestra, concediendo especial importancia a la edad del paciente y a la consistencia del producto. Todo lo tratado demuestra que la Microbiologa es una ciencia viva, en constante desarrollo, y que su investigador, aunque tenga establecidos unos esquemas tericos a seguir, deber en ocasiones hacer uso de improvisaciones prcticas, vinculadas a su experiencia cientfica. las muestras obtenidas segn los mtodos sealados estas deben ser procesadas en el menor tiempo posible utilizando para ello una torunda o una ansa de kolle sembrar mas o menos 1 g de muestra en los medios de enriquecimiento escogiendo de preferencia las porciones que presentan mucosidad y sangre paralelamente se deben sembrar en placas con agar Salmonella Shigella , agar verde brillante , xld agar y agar mac conkey este ultimo con la finalidad de aislar E. Coli entero patgeno (EPI) muy comn en las diarreas infantiles , los medios sembrados deben dejarse en incubacin por 24 48 horas a 37C . ESQUEMA A SEGUIR EN EL PROCEDIMIENTO PARA LA SIEMBRA DEL COPROCULTIVO PROCEDIMIENTO 1) Sembrar una asada de materia fecal sospechosa en el tubo de caldo de tetrationato. Inocular con asa por emulsin. 2) De la misma manera sembrar otra asada de la misma muestra en el tubo de caldo nutritivo. 3) Etiquetar con los datos escolares 4) Levar a la incubadora a 37C durante 24 horas. Colocar los tubos en gradilla de rejilla, de tal manera que se mantengan en posicin vertical para evitar que el lquido se derrame. RESIEMBRA. BIOSEGURIDAD Al inocular las placas, es indispensable el uso de mascarillas as y gorra. Trabajar frente a la flama. 1) Retirar los tubos de la incubadora. 2) Disponer sobre la mesa una serie de medios selectivos (agar EMB, agar SS, agar verde brillante y agar soya tripticaseina) para resembrar el cultivo en caldo de tetrationato. 7

3) Disponer sobre la mesa una serie de los mismos medios selectivos para resembrar el cultivo en caldo nutritivo. 4) Resembrar en cada una de las placas el inculo correspondiente por la tcnica de estrias cruzadas sectoriales. Usar solo una asada para cada placa. 5) Sellar las placas. Etiquetar con los datos escolares 6) Llevar las placas a la incubadora. Colocarlas en posicin invertida. Mantenerlas durante 24 horas. Al da siguiente: 1) Retirar las placas de la incubadora. 2) Efectuar anlisis macroscpico de cada una para valoracin de la prueba presuntiva respecto a la fermentacin de la lactosa, de acuerdo a la siguiente: GUIA DE IDENTIFICACION PRESUNTIVA La prueba de identificacin presuntiva para diferenciacin de los bacilos entricos Gram. negativos se basa en la valoracin de la fermentacin de la lactosa sobre medios de cultivo adicionados con este carbohidrato, como el agar endo o el agar EMB: a) Enterobacilos que producen fermentacin rpida de la lactosa: Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae. b) Enterobacilos que producen fermentacin lenta de la lactosa: Edwarsiella, Serratia, Citrabacter, Arizona, Providencia, Erwinia. c) Enterobacilos que no producen fermentacin de la lactosa: Shigella, Salmonella, Proteus, Pseudomonas. La manera de cmo metabolizan este azcar en los diferentes medios de cultivo selectivos se manifiestan por cambios en el color del medio con respecto al que originalmente tena o bien por la coloracin de las colonias, la cual es tpica en algunos de elos, al respecto, se sugiere utilizar la siguiente tabla: BACTERIAS MEDIOS EMB DE MAC CONKEY CULTIVO SSA Opacas parte central negra , periferie transparente HK XLD

SALMONELLA

translucidas incoloras

incoloras transparentes

PROTEUS E. COOL OTRAS COLIFORMES

Translucidas o incoloras Centro oscuro conbrillometalico

centro negro , Translucidas o periferie incoloras transparente Rojas, rosadas Rojas o rosadas rodeadas por poco coloreadas una zona de con centro rosado

Negras si producen Colonias SH2 y rojas verdes si no azuladas producen SH2 Opacas , amarillas (Mirabilis y Vulgaris) Salmn Opacas anaranjado amarillas

SHIGUELLA

translucidas incoloras translucidas incoloras

bilis precipitada incoloras transparentes translucidas incoloras

PSEUDOMONAS

opacas transparentes Principalmente inhibidas o translucidas incoloras Rojas rosadas , incoloras con el centro rosado

Verde azulado

Rojas A veces colonias rojas Opacas amarillas Colonias opacas y amarillas Colonias rojas con la parte central negra

KLEBSIELLA

Mucosas mas grandes que E. Coli Rosadas y tienden a unirse , mucosas siempre convexas

ENTEROBACTER , SERRATIA

Blancas o Brillo metlico mas Rojas rosadas cremosas opacas grandes que E.coli y mucosas translucidas incoloras Transparentes con brillo verde metlico Incoloras transparentes rojas las LF. Parte central negra y bordes transparentes

ARIZONA

CITROBACTER

LEYENDA EMB : Eosin methilene blue agar SSA : salmonella shiguella agar XLD : xilose lycine desoxicolato agar Mc C : agar Mac Conkey VB : agar verde brillante HK : agar enterico de hektone 3) Efectuar anlisis microscpico por el mtodo de Gram de cada una de las placas para confirmacin de la morfologa de los bacilos entricos gram negativos en los medios selectivos y para bsqueda e identificacin de Entero cocos en los medios de uso general como el agar soya tripticaseina. 4) Seleccionar en los medios selectivos una variedad de colonias consideradas como sospechosas de pertenecer a algn gnero patgeno (segundo grupo en la tabla anterior) y resembrarlas en los medios diferenciales para conocer sus REACCIONES BIOQUMICAS como se indica a continuacin. CONTROL E INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS al termino de la incubacion se seleccionan las colonias sospechosas en las placas de agar SS , VB ,y agar Mac conkey de los caldos senbrados se repican en los mismos medios sealados . se ara enfasis en la busqueda de colonias pequeas no fermentadoras de lactosa con excepcion de E. coli EPI que si fermenta la lactosa y presenta las mismas caracteristicas morfologicas de una E.coli componente normal de la flora intestinal , la 9

unica forma de identificar este m.o . es por serologia , las colonias seleccionadas se suspenden en una gota de suero OB polivalente colocada en un porta obgeto , se homogenisa y se ajita por vaiven ,observar si presenta aglutinacion o no sobre un fondo oscuro . otras colonias sospechosas son seleccionadas para su identificacion bioquimica en los medios de TSI , LIA, citrato de simons , urea ,SIM entre otros . al termino de 24 horas de incuvacion a 37c se efectuan las lecturas utilizando la tabladeidentificacion de enterobacterias . Es indudable que la Salmonella y shiguella son los m.o.que frecuentemente producen cuadros de toxiinfecion , tanto en elhombre como en los animales pudiendo encontrarlos con mayor fasilidad durante los tres primeros dias del cuadro diarreico . para el aislamiento de Salmonella y sgiguella los autores Tailor y Eschelhart Rollender y Coll recomiendan el uso de medio de cultivo XLD , la siembra debe ser directa y lo mas fina posible a fin de obtener colonias aisladas , encanbio cuando se trata de medios altamente selectivos la sienbra por estrias es abundante . El cresimiento de Salmonellas en medio XLD se presenta como colonias rojas, muchas veses con el centro de la misma de color negro . Cuando sequiere aislar Estafilococos patogenos se hace uso demedios furtemente inhibidores de laflora intestinal grm negativa. tal es el caso del medio manitol salado y el agar Baird Parker en elprimero sedesarrollan colonias doradas rodeadas de un alo amarillo por fermentacion del azucar y en el segundo las colonias son pequeas , negras y rodeadas de un alo transparente devido a la ovolisis . La inbestigacion de cocos patogenos no deve ser descartado en la rutina entos se an encontrado en el orden de 15 20 % segun Ginton y Col. Asi mismo de manera obcional se puede investigar Candida albicans ,Mycobacterium tuberculosis y V.cholerae esto inplica disponer de mayor tienpo y los costos aumentan considerablemente , su inbestigacion esta superitado deacuerdo a la nesesidad del clinico tratante . Por lo tanto un examen de materia fecal nos lleva a determinar la existencia de trastornos de la digestion , alteraciones en las paredes gastrointestinales y la existencia de parasitos y m. o.patogenos . prebiamente es nesesario efectuar un examen macroscopico , suspendiendo la muestra en solucion ficiologica y en una placa petri , inclinando esta se podra aprecia si hay moco , restos alimenticios ,pus restos o parasitos adultos ,etc. posteriormente efectuaruna obserbacion microscopica de un preparado en una lamina portaobgeto con nsolucion de lugol y salina , la existencia de polimorfonucleares y piocitos indica una inflamacion o infeccion , encanbio si las heces son ndiarreicas pero que en el examen no seobserban muchos polimorfonucleares ni piocitos ,puede que eltrastorno sea de origen alimenticio y no nesesariamente de origen bacteriano ,esto no libera al microbiologo de prosesar la muestra para su inbestigacion rutinaria . REACCIONES BIOQUMICAS 1) Disponer a la temperatura ambiente en gradilla una serie doble de tubos de cultivo para reacciones bioqumicas. 2) Resembrar del medio de cultivo que contiene las colonias de bacilos Gram. negativos seleccionados como sospechosas a los medios para bioqumicas dejando uno de uno sin sembrar para emplearlo como control negativo. a) En los medios inclinados sembrar por estras. b) En los medios verticales sembrar por picadura. asa c) En los medios lquidos sembrar por emulsin. 3) Etiquetar con los datos escolares. Llevar a la incubadora por 24 horas.

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AL DIA SIGUIENTE: 4) Retirar las series de tubos con las reacciones bioqumicas. 5) Interpretar las reacciones bioqumicas en cada uno de los tubos, de la siguiente manera. AGAR HIERRO DE KLIGLER Es una prueba diferencial y adems se trata de una multiprueba. Se compone de dos hidratos de carbono (Lactosa en un 1% y Glucosa en un 0,1%). La Glucosa se encuentra en menor cantidad para que se consuma antes de las 24 horas de incubacin y necesariamente las bacterias tengan que consumir las peptonas, con lo que se produce amonaco y se alcaliniza el medio. 1. hay 3 formas bsicas de fermentacin en este medio de cultivo: Que solamente se fermente la Glucosa: por principio, todas las enterobacterias fermentan la glucosa. Cuando la glucosa se acaba y la bacteria no es capaz de utilizar la lactosa, se alimentar de las peptonas del medio. Mtodo: la siembra se hace en profundidad (condiciones anaerobias) y en superficie (condiciones aerobias). La muestra debe proceder de un medio de cultivo puro, se tomar una colonia con un hilo de siembra y se har la inoculacin del medio de cultivo primero en profundidad, y segundo, segn sacamos el asa, en superficie. La lectura se realizar tras un tiempo de incubacin de 24 horas (que se ha de cumplir a rajatabla) a 3537C. Resultados: Si se fermenta la Glucosa, se producen unos compuestos que acidifican el medio y, por lo tanto, el medio virar a amarillo. Si adems de la Glucosa utiliza las peptonas, que producen amoniaco, el medio se alcaliniza y en lugar de virar a amarillo virar a rojo intenso. Esto ltimo solo ocurre en la siembra que se ha hecho en la superficie, es decir, que veremos la superficie roja y el fondo amarillo. Esto es as porque los productos metablicos son diferentes si la transformacin es aerbica o anaerbica. Que fermente tanto la Glucosa como la Lactosa: Se observar el medio totalmente amarillo, debido al pH cido. Que no fermente ninguna: se alimenta desde el principio de las peptonas, por lo tanto podremos afirmar que no se trata de una Enterobacteria. Se originarn una serie de productos alcalinos que virarn el medio a rojo tanto en el fondo como en la superficie, siempre y cuando la bacteria sea capaz de consumir las peptonas tanto en medio aerobio como anaerobio. Si la bacteria solo fuera capaz de utilizar las peptonas de forma aerobia, la superficie aparecera roja, mientras que el fondo permanecera sin cambios. 2 Observacin de la produccin de gas (CO2 y H2): Si en el medio se forma alguno de estos gases, se observarn algunos cambios en el medio de cultivo: Aparicin de burbujas. Fracturas en el agar. 1. Desplazamiento del medio de cultivo hacia la boca del mismo debido a una produccin intensa de gas. Observacin de la produccin de Sulfhdrico (SH2). Para que se produzca el SH2 Las condiciones han de ser cidas

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 Se necesita una fuente que suministre el azufre (Tiosulfato de Sodio) Se necesita un indicador que nos permita visualizarlo (Sal de hierro Citrato Frrico Amoniacal). Este indicador hace que el SH2 precipite en forma de un precipitado negro. Si la cantidad precipitada es pequea, el precipitado se observar en la superficie del medio de cultivo. Si, por el contrario, la produccin de SH2 es muy intensa, toda la parte profunda del tubo se ver negra. Ahora bien, si todo el fondo se ve negro cmo sabremos el viraje del medio?. Pues bien, como para que se pueda producir el Sulfhdrico es necesario que se den unas condiciones cidas, deberemos suponer que el medio de cultivo habr virado a amarillo en el fondo. En la superficie si podremos diferencias entre el rojo y el amarillo sin ningn problema. PRUEBA DE LA CATALASA Definicin: Es una enzima que se encuentra en la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas (a excepcin del Estreptococcus, por eso es una prueba que nos permite diferenciar entre Estafilococos y Estreptococos). Funcin: Descompone el perxido de hidrgeno (H2O2 o agua oxigenada) que se forma como producto terminal oxidativo de la descomposicin aerbica de los azcares: 2 H2O2 2 H2O + O2 (gas) Catalasa Tcnica: Consiste en recoger con el asa de siembra una colonia procedente de un cultivo puro, reciente y colocarla sobre un portaobjetos. A continuacin agregamos 1 gota de perxido de hidrgeno al 30%(comercial) sobre el microorganismo con una pipeta Pasteur (no es necesario homogeneizar). Resultados: 1 Si la prueba es POSITIVA: se formarn inmediatamente burbujas bien visibles. 2 Si la prueba es NEGATIVA: no se observar burbujeo. Precauciones: es importante que la muestra no tenga su origen en un medio que contenga sangre, ya que podramos obtener falsos positivos. PRUEBA DE LA OXIDASA O CITOCROMOOXIDASA Principio: se basa en determinar la presencia de las enzimas oxidasas, las cuales catalizan la transferencia de electrones desde el sustrato, que es generalmente orgnico, hasta el oxgeno. Tcnica: Se realizar segn las instrucciones de la casa que nos proporcione el producto. Generalmente, en las oxidasas positivas, se produce una reaccin entre la enzima y un sustrato que est en la tira reactiva dando lugar a un producto coloreado que suele ser el azul de indofenol. El reactivo puede variar de una casa comercial a otra, as una prueba oxidasa+ se observar de un color que oscila entre el prpura y el negro. Precauciones: No tomar la muestra de medios coloreados. PRUEBA DEL INDOL Principio: se basa en determinar la capacidad de un microorganismo para desdoblar el indol de la molcula de triptfano, que es un aminocido, que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar metabolitos 12

indlicos. A este grupo de enzimas, capaces de desdoblar el triptfano se les denomina triptofanasas. Tcnica: Se utiliza un caldo de triptona o de peptona (a veces tambin se utiliza un medio semislido: medio de S.I.M = Sulfhdrico; Indol; Movilidad). Se disponen 5 mL del medio en cada uno de los tubos que vayamos a utilizar para la prueba, esterilizamos, inoculamos e incubamos (3537C / 24h). Por ltimo, para saber si se ha producido el Indol aadimos 5 gotas del reactivo de Kovacs indol. Resultados: 1 Si la prueba es POSITIVA: aparece un anillo rojo en la superficie del medio. 2 Si la prueba es NEGATIVA: permanece un color amarillo, que es el color del reactivo (el reactivo es un aldehdo) PRUEBA DEL CITRATO Principio: consiste en determinar si una bacteria es capaz de utilizar el citrato como nica fuente de carbono alcalinizando el medio de cultivo. El medio de cultivo utilizado para observar la fermentacin de citrato contiene tambin sales de amonio inorgnicas. Un organismo que es capaz de utilizar el citrato como nica fuente de carbono, utiliza tambin las sales de amonio como nica fuente de nitrgeno. Estas sales de amonio se van a desdoblar en amoniaco produciendo la consiguiente alcalinidad. El medio utilizado es el Agar Citrato de Simmons que lleva como indicador el azul de bromotimol (cuando el pH es alcalino vira a azul intenso, mientras que el medio sin inocular tiene un color verde). Tcnica: Se utiliza un tubo inclinado. Hacemos la estra en superficie con un inculo poco denso y lo llevamos a incubar (3537C / 24h) Resultados: 1. Si la prueba es POSITIVA: En la superficie del medio de cultivo se observa un viraje del verde a azul intenso. 2.Si la prueba es NEGATIVA: no se produce viraje, se queda verde. PRUEBA DEL ROJO METILOVOGES PROSKAUER (RMVP) INTRODUCCIN: Para el metabolismo de los Hidratos de Carbono se pueden dar varios procesos: Gluclisis: proceso de hidrlisis por el cual se transforma la glucosa en cido pirvico. Vas alternativas Pentosas fosfato: se puede usar al mismo tiempo que la Gluclisis o de forma independiente. Entner Douduroff: la utilizan algunas Enterobacterias sin necesidad de utilizar la Gluclisis y la va de las pentosas fosfato. El cido pirvico puede usarse mediante: Va aerbica: Respiracin. El aceptor final de electrones es una molcula inorgnica (O2).

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 Como productos obtenemos CO2 y H2O Empoacetilo + CoA ciclo de Krebs + cadena transportadora de e Va anaerobia: Fermentacin. El aceptor final de electrones es una molcula orgnica. Es de menor rendimiento energtico que la Gluclisis. Puede ser de tres tipos: Lctica Alcohlica cido mixta o del Grupo Califorme: tiene como productos: cidos mixtos: frmico, actico, succnico, etlico... (RM+) Butilenglicol Butanediol Acetona (RM) ROJO DE METILO (RM) Principio: Es una prueba que mide de forma cualitativa los productos cidos que se originan por el metabolismo de la Glucosa de forma que, cuando estos cidos se producen en cantidad elevada, consiguen superar el sistema amortiguador llevando el pH del medio hasta 4 4,5. Tcnica: Se siembra 1 tubo para la prueba RM y otro para la de VP para cada muestra. Se incuba a 3037C durante 48 horas a 4 das incluso 6 das, y finalizado el perodo de incubacin le aadimos al tubo del RM 0,10,2 mL del reactivo Rojo de Metilo. Resultados: Si la prueba es POSITIVA aparece coloracin roja en la superficie de contacto del reactivo y del medio de cultivo. Si la prueba es NEGATIVA se queda el color del medio (amarillo) Precauciones: Es importante incubar como mnimo 48 horas. Si se observa un color anaranjado hay que continuar con la incubacin hasta 4 das. Si hacemos la lectura antes de las 48 horas todas las enterobacterias darn la prueba positiva, ya que todas fermentan la glucosa. Las enterobacterias que van a ser Rojo de Metilo positivas producen como consecuencia del metabolismo de la glucosa unos productos cidos en gran cantidad y estables. Trascurridas las 48 horas se aade el indicador. En este caso, los cidos habrn superado el sistema amortiguador del tampn (pH = 4 4,5), por el contrario, las enterobacterias que van a ser Rojo de Metilo negativas tambin producen cidos pero se producen en menor cantidad, son menos estables, se produce mayor cantidad de CO2 y, adems, se producen productos como consecuencia de la degradacin de las peptonas, con lo que el pH tiende a la neutralidad, es decir que 14

tiende a alcalinizarse. VOGESPROSKAUER Principio: Es una prueba que pone de manifiesto un producto final neutro que es la Acetona. Tcnica: Se inocula y se incuba durante 24 48 horas. Para poner de manifiesto la acetona se utilizan 0,6 mL de naftol al 5% (intensifica el color) y 0,2 mL de KOH NaOH al 40% (oxida la acetona en diacetilo, que es el producto coloreado junto con el alcali y las peptonas). Es importante que se aadan en este orden y tienen que ser medidas exactas. Resultados: Se realiza la lectura a los 1015 min de la adicin de los reactivos: 1. Si la prueba es POSITIVA se observa un color rojo rosado en la superficie del medio. 2. Si la prueba es NEGATIVA se observa un color amarillo en la superficie del medio Precauciones: Despus de la incubacin del reactivo es importante dejar destapado el tubo con el fin de que el O2 se ponga en contacto con los productos formados, de tal forma que se acelere la reaccin. En la mayora de los casos, las enterobacterias que son RM+ son PV y viceversa. O.N.P.G ORTONITROFENOL DGALACTOPIRANSIDO Principio: Es una prueba que pone de manifiesto la capacidad de un m.o de fermentar la Lactosa, demostrando la presencia ausencia de la enzima galactosidasa cuando se emplea un compuesto orgnico que es el ONPG. Si en la clula bacteriana se encuentran enzimas para metabolizar la lactosa, el reactivo ONPG es hidrolizado, liberando un compuesto amarillo (ortonitrofenol). Estas enzimas son inducidas y estn controladas genticamente. Pueden disminuir o desaparecer despus de varias generaciones si el sustrato no est presente. NOTA: las enzimas inducidas son aquellas que la bacteria produce exclusivamente cuando se encuentra el sustrato sobre el que se va a ejercer su accin. Las enzimas constitutivas son aquellas que son producidas por la bacteria independientemente de que el sustrato se encuentre o no en el medio de cultivo. Para que se produzca la fermentacin de la Lactosa, un microorganismo necesita 2 enzimas: galactosidasa permeasa: Se encuentra en la membrana celular. Transporta la Lactosa al interior celular. D galactosidasa: Hidroliza la Lactosa en el interior celular. En funcin de que la bacteria tenga una, las dos o ninguna de las enzimas, podemos clasificarlas en: Activas: Poseen las dos enzimas. Retardadas: Carecen de la galactosidasa permeasa y poseen la Dgalactosidasa. Tardan ms tiempo en degradas la Lactosa porque tienen que producir la permeasa.

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 No fermentadores: No poseen ninguna de las enzimas. Tcnica: Es necesario partir de un cultivo puro, reciente, preferiblemente obtenido a partir de un medio de cultivo de Kligler. Tomaremos una cantidad espesa de inculo para demostrar rpidamente la presencia de la enzima. A partir del cultivo preparamos una suspensin del microorganismo en un tubo de hemlisis con 0,5 mL de agua destilada. Ponemos un disco de ONPG en el tubo y lo incubamos a 37C. Resultados: Si la prueba es POSITIVA: en los 1530 minutos posteriores a la adicin del disco, el medio se habr vuelto amarillo. Si la prueba es NEGATIVA: habr que esperar entre 2,3 o incluso 24 horas para una buena confirmacin. El medio no cambiar de color. PRUEBA DE LAS DESCARBOXILASAS Principio: Con esta prueba ponemos de manifiesto la capacidad que tiene un microorganismo, mediante la enzima correspondiente, para decarboxilar un aminocido (Lisina, Arginina, Ornitina). Son enzimas inducidas y, generalmente, estas reacciones se producen en condiciones anaerobias. Son capaces de actuar sobre distintos aminocidos, la enzima ataca al grupo carboxilo (COOH) y da lugar a una amina y a CO2. Nosotros slo realizaremos la prueba de la Lisina Carboxilasa. Si esta enzima se encuentra presente se formar Cadaverina y CO2 (alcaliniza). Dependiendo del medio de cultivo que se utilice, una vez inoculado, es necesario sellarlo para obtener las condiciones anaerobias. En este caso del caldo de Lisina no es necesario sellarlo, basta un tapn metlico, preferiblemente de rosca. Tcnica: Inoculamos el medio de cultivo (caldo) con un inculo escaso y lo incubamos durante 24 horas a 37C. En algunos casos es necesario incubar hasta 4 das. Resultados: El medio sin inocular es de color prpura y suele contener glucosa y el aminocido que queremos estudiar. Si la prueba es POSITIVA: el medio tomar un color prpura amarillento o prpura turbio. Primero habr pasado por el color amarillo y luego habr revirado al prpura. Si la prueba es NEGATIVA: el medio tomara un color amarillo brillante. Solo se consume la glucosa. Precauciones: Es conveniente guardar un tubo sin inocular con el fin de comprobar los resultados. Prueba de la Ureasa Principio: Con esta prueba ponemos de manifiesto la capacidad orgnica de algunas bacterias de desdoblar la urea en dos molculas de amonaco, mediante la accin de la enzima Ureasa, que es una enzima constitutiva. Tcnica: Se pueden utilizar distintos medios de cultivo: Agar base de urea: tiene el inconveniente que hay que prepararlo, esterilizarlo y, antes de que se 16

enfre, hay que aadirle la urea. Se usa de forma inclinada. Caldo de urea: ya lleva incorporada la urea. Directamente se siembra el microorganismo y se incuba. Resultados: Se observa a las 24 o incluso a las 48 horas. Si la prueba es POSITIVA: el medio se observar de un color rosado Si la prueba es NEGATIVA: no se producir ningn cambio de color. Se mantendr el color amarilloanaranjado del medio inicial. Prueba de la Fenilalanina Desaminasa Principio: La prueba pone de manifiesto la capacidad enzimtica de un microorganismo para desaminar la fenilalanina, originndose el cido fenilpirvico. Tcnica: Se utiliza el medio fenilalanina en tubo inclinado. Se siembra un inculo denso, reciente, puro y se incuba durante 24 horas. Resultados: Para poner de manifiesto el producto coloreado se aade Cloruro Frrico al 10% : c. Fenilpirvico + Cloruro Frrico COLOR Dejamos resbalar por la superficie del agar inclinado 56 gotas del reactivo y se mueve el tubo suavemente para extenderlo. 1. Si la prueba es POSITIVA: aparece un color verde sobre la superficie. 2. Si la prueba es NEGATIVA: se queda del color del Cloruro Frrico, es decir, amarillo. CARACTERISTICAS DE BACTERIAS PATOGENAS A continuacin se precisan algunas caractersticas clnicas y de cultivo de las bacterias reconocidas como entero patgenas y se discuten las de alguna cuya etiologa es dudosa. Salmonella : Las ltimas tendencias en taxonoma aceptan el establecimiento de una sola especie de Salmonella. Le Minor, en la ltima edicin de EI Manual de Bergey (1984), propone como nica especie a Salmonella Choleraesuis subdividida en seis subespecies. En el XIV Congreso Internacional de Microbiologa celebrado en Manchester (1986), el Comit Internacional de Sistemtica Bacteriana a travs del Subcomit Internacional de Enterobacteriaceae , ha decidido modificar el nombre de Salmonella Choleraesuis , propuesto por Le Minor, por el de Salmonella enterica , quedando los grmenes conocidos tradicionalmente como S. Enteritidis , S. typhimurium, S. dublin, etc., en la categora de serotipo, biotipo o bioserotipo dentro de su correspondiente subespecie (datos facilitados por el doctor Usera. Majadahonda). De forma general se podra decir que la Salmonella produce dos cuadros clnicos muy diferenciados, y que en ambos casos puede hacerse el diagnstico a partir del coprocultivo.

Estos dos cuadros son la fiebre tifoidea y la salmonelosis gastrointestinal. El primero est producido por Salmonella Typhi y con menos frecuencia por Salmonella Paratyphi A y Salmonella Paratyphi B. El segundo est causado por otros serotipos como Salmonella Typhimurium, Salmonella Enteritidis, Salmonella Cholerae 17

suis, etc. En contra de esta clara diferenciacin, aceptada por todos, hay autores que sealan que pierde valor cuando se trata de nios, y que en ellos cualquier Salmonella puede producir los dos sndromes. El diagnstico de la fiebre tifoidea puede hacerse por mtodos directos y por mtodos indirectos. Los primeros son aquellos que permiten aislar el microorganismo, como son: el hemocultivo y el coprocultivo. A veces, aunque es raro, se puede aislar tambin el germen de la orina. Los mtodos indirectos son aquellos que ponen de manifiesto la accin del germen sobre el organismo, es decir, demuestran la presencia de anticuerpos especficos contra el agente etiolgico. En este punto se podra cuestionar qu mtodos son mejores? cules ayudan ms a hacer el diagnstico? La respuesta sera que todo depende del momento en que se halle la infeccin, del tiempo transcurrido desde el comienzo de la enfermedad. El hemocultivo presenta un mximo de positividad durante la primera semana. El coprocultivo permite aislar con un 3050 por 100 de posibilidad Salmonella durante todo el transcurso de la enfermedad, siempre y cuando el paciente no est bajo tratamiento, aunque el mximo de positividad se obtiene durante la segunda semana de evolucin. Las tcnicas indirectas, es decir, las serolgicas, y, concretando ms, las de aglutinacin, tienen un mximo de efectividad a partir de las dostres semanas de evolucin. Para aislar Salmonella, las siembras de las heces se efectuarn sobre medios de enriquecimiento (Selenito de Leifson, tetrationato de Kauffman, GN de Hajna, etctera), y al mismo tiempo sobre medios selectivos (SS, Wilson Blair, desoxicolato citrato, Hektoen, etc.), resembrando a las docediecisis horas de incubacin un asa de las primeras en una placa de estos ltimos. Con las colonias sospechosas se realizarn pruebas de identificacin. En el otro sndrome clnico, es decir, la infeccin gastrointestinal, el coprocultivo es a menudo el nico mtodo que permite demostrar la etiologa. El hemocultivo es slo efectivo en algunas ocasiones. Shigella : Existen cuatro grupos de Shigella, representados respectivamente por Sh. dysenteriae, Sh. sonnei, Sh. flexneri, y Sh. boydii. Hoy en da se est intentando una tipificacin por colicinotipia, es decir, por la susceptibilidad a las colicinas. La Shigella es un germen muy lbil y que resiste muy poco tiempo en las heces del organismo humano, a esto se debe la necesidad de sembrar lo antes posible las muestras sospechosas de contener Shigella. Incluso hay autores que recomiendan hacerlo en la misma habitacin del paciente. El medio de cultivo ms utilizado es el selectivo llamado SS, o SalmonellaShigella, que se siembra con n inculo abundante. La Shigella es productora de la disentera bacteriana, y de muchas colitis en verano. A pesar de ser la responsable de las citadas enfermedades, en la actualidad la tendencia es no tratar las infecciones debidas a este microorganismo. En Espaa no es frecuente la Sh. dysenteriae, siendo la ms comn Sh. sonnei. Muchos autores estn de acuerdo en considerar que la Shigella causante de gastroenteritis bacteriana es eliminada por el efecto de arrastre de la diarrea, y por otro lado, su condicin lbil les hace sensibles al resto de la flora bacteriana intestinal. Estos motivos justifican segn los citados autores, la no utilizacin de antibiticos, que actuaran sobre la mayora de grmenes intestinales, eliminando la competencia, favoreciendo la aparicin de resistencias y alargando el perodo de convalecencia. Esto transformara al paciente en portador crnico. Precisamente fue en una Shigella, donde Watanabe, un investigador japons, descubri el fenmeno de la 18

conjugacin bacteriana, al comprobar la transmisin de trozos de DNA llamados plsmidos, de una bacteria a otra, a travs de un canal protoplasmtico que les conecta. Si en este trozo de cromosoma est codificada la resistencia a un antibitico, o a un determinado grupo de antibiticos, la bacteria receptora se volver, al igual que la donadora, insensible a los citados frmacos. De todas maneras, la cuestin de no establecer tratamiento es difcil para aquellos clnicos que estn en contacto con los pacientes, sobre todo si stos son nios. Segn la misma idea antes aportada, tampoco sera correcto dar antidiarreicos, porque ello evita la expulsin de los grmenes patgenos, los cuales, al quedar retenidos al abrigo intestinal aumentarn cuantitativamente, incrementando su agresividad sobre el tracto intestinal. En este punto es tambin necesario evaluar la necesidad de anteponer al citado efecto infeccioso, el hecho de evitar una deshidratacin en el nio pequeo. Vibrio : Hay varias especies del gnero Vibrio que son responsables de distorsiones intestinales. La ms importante, Vibrio cholerae, produce su efecto gracias a una toxina muy semejante a la del E. coli entero patgeno. En los casos tpicos, las heces presentan un aspecto conocido como agua de arroz, debido a su color blanco y consistencia lquida, con grumos que contienen gran cantidad de pequeos bacilos Gram. negativos ligeramente curvados. El aislamiento de las heces se hace utilizando medios selectivos, como el agua de peptona alcalina (pH 8,4), o el de Nakanishi modificado o TCBS, a base de tiosulfato, citrato, bilis y sacarosa. Otros vibrios semejantes al Vibrio cholerae, como su biotipo El Tor, y los vibrios NAG o no aglutinables, fabrican de igual forma la citada entero toxina, poseyendo estos ltimos tambin un cierto efecto invasor del tejido intestinal. Si los vibrios NAG se encuentran principalmente en aguas dulces, el Vibrio parahaemolyticus vive en el agua del mar, dndose cada vez con mayor frecuencia cuadros de gastroenteritis transmitidos a partir de los llamados frutos del mar (mariscos y pescados poco cocidos). Yersinia : Es otro miembro de la familia Enterobacteriaceae que suele producir trastornos intestinales. De sus tres especies, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudo tuberculosis y Yersinia pestis, slo las dos primeras estn implicadas en los citados procesos, especialmente la inicial. La Yersinia pseudo tuberculosis se incluye, pues ha sido asociada ltimamente en Rusia con cuadros entricos, cuadros que ellos califican como fiebre escarlatinosa del Lejano Oriente. La Yersinia enterocolitica produce gastroenteritis aguda, caracterizada por fiebre, cefaleas, dolores abdominales agudos y diarrea lquida. Tambin se ha implicado con otras afecciones abdominales con dolor, que se localiza en la fosa iliaca derecha, y que hace pensar en una apendicitis. Se trata de la linfoadenitis mesentrica aguda benigna, que no acostumbra a evolucionar con diarrea, y la nica forma de hacer el diagnstico es a partir de los ganglios. La Yersinia enterocolitica crece bien en medios ordinarios como el agar SS o el agar desoxicolato. Aunque las colonias aparecen a las cuarenta y ochosetenta y dos horas, su pequeez y poca proporcin en ocasiones les hace pasar desapercibidas. Para facilitar su aislamiento se utilizan medios selectivo como el Drigalski Norwegian medium, el Oxalate Y mdium, o el Wauters, y como enriquecimiento se usa el enfriamiento a 4 C durante tres semanas en Selenito o BHI. Lgicamente, los diagnsticos hechos con estos procesos de enriquecimiento no son vlidos para implantar un tratamiento clnico, pero s para estudios epidemiolgicos. Hasta ahora no se han comercializado sueros antiYersinia que permitan confirmar la identificacin bioqumica. Los laboratorios que quieran efectuar esta comprobacin, pueden mandar las cepas a laboratorios de referencia. Indirectamente puede hacerse el diagnstico enfrentando suero del paciente con una mezcla polivalente, o, 19

cuando menos, que contenga los serotipos 3 y 9. Ttulos iguales o superiores a 1/160 son significativos. Escherichia coli : Gracias a los trabajos empezados por Kauffmann, y sobre la base de 157 antgenos somticos (0), 93 capsulares (K) y 52 flagelares (H) de los que hay tres variedades (L, A y B), es posible identificar serolgicamente a E. coli. Esta determinacin serolgica, en la prctica diaria de los laboratorios de microbiologa, slo se realiza para la investigacin de una serie de Escherichia coli denominados entero patgenos, y cuya patologa parece reducirse a gastroenteritis infantiles en nios menores de dos aos y medio. Ahora bien, en la actualidad se duda de su verdadera intervencin, pues es posible aislarlos de muchas heces infantiles que no tienen sntomas de gastroenteritis. Nuestra opinin es que slo es valorable en caso de epidemias en las que se asle un solo serotipo. En casos aislados slo podremos imputarle con seguridad la etiologa del proceso si comprobamos su capacidad entero patognica. E. coli entero patgeno puede efectuar de dos maneras su accin intestinal, una produciendo entero toxinas, de las cuales se conocen dos (ST o estable al calor y LT o lbil al calor, que es parecida antignicamente a la entero toxina de V. cholerae ) y otra por la invasin de las clulas epiteliales del intestino, produciendo un cuadro disenteriforme, denominndose respectivamente E. coli enterotoxignico y E. coli enteroinvasivo. La capacidad entero txica por produccin de LT se investiga inoculando extracto bruto del cultivo sobre clulas Vero y observando cambios celulares debidos a alteraciones del contenido en AMP cclico. La capacidad entero txica por ST se demuestra inoculando extracto bruto de su cultivo en ratones lactantes de uno a tres das. La propiedad enteroinvasiva se pone de manifiesto por el test de Anton, inoculando 10 e8 clulas bacterianas en el saco conjuntival de cobayas, y observando, en caso positivo a las veinticuatrocuarenta y ocho horas, la produccin de una inflamacin corneoconjuntival. Como se comprender, estas tcnicas generalmente no estn al alcance de laboratorios pluridisciplinarios, por lo que es aconsejable mandar la cepa a laboratorios especializados para que hagan su estudio, hecho que, por otro lado, no solucionar el problema, ya que cuando se consiga el resultado, el paciente probablemente estar ya curado. Por otro lado es difcil establecer una relacin entre enteropatogenicidad y serotipo de E. Coli, ya que los factores entero patognicos conocidos hasta ahora: capacidad de producir entero toxinas (ST y LT) e invadir la mucosa intestinal, dependen de plsmidos independientes del material gentico que codifica su estructura antignica. En consecuencia, sera necesario estudiar, por un lado, la capacidad entero patognica, por otro lado, el serotipo y, finalmente, la presencia del plsmido ent. Anaerobios esporulados : Los anaerobios esporulados no suelen producir infecciones gastrointestinales, y en la literatura slo se cita con escasa frecuencia la presencia de Clostridium perfringens causante de intoxicaciones alimentarias. Tambin se han mencionado casos de colitis pseudo membranosa debidos a Clostridium difficile. Otros microorganismos que con menor frecuencia se consideran responsables de gastroenteritis son los siguientes: Cndida : sobre todo Cndida albicans, que es aislada mayoritariamente de heces patolgicas de nios pequeos. En ocasiones es posible su hallazgo en el contenido fecal de adultos con trastornos intestinales recin llegados de patses del Medio y Lejano Oriente (Egipto, India, etctera). Pseudomonas : Frecuente en personas tratadas largo tiempo con antibiticos de amplio espectro.

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Staphylococcus aureus : Su presencia es favorecida tambin por terapia con antibiticos de amplio espectro. Adems de este efecto por sobrecrecimiento, son muy frecuentes las intoxicaciones alimentarias por la entero toxina, producida por el microorganismo. Campylobacter : Desde hace algn tiempo se reconoce a Campylobacter jejuni como el patgeno intestinal con mayor morbilidad. Generalmente afecta a nios pequeos, a los que produce diarrea, dolores abdominales, fiebre, nuseas y a veces vmitos. La fuente de infeccin suele ser el agua, o, ms frecuentemente, los alimentos de origen animal. Tambin se encuentra en abundancia en las heces de animales domsticos. El desarrollo de su patologa no est bien definido, ya que mientras que, por un lado, produce manifestaciones enteroinvasivas (con produccin de sangre y leucocitos), por otro, hay constancia de que libera una entero toxina similar a la de Vibrio cholerae y E. coli enterotoxignico. Para el diagnstico microbiolgico, la siembra de las heces debe hacerse muy rpidamente, preferiblemente antes de dos horas. En caso de no ser posible, se incluir la muestra en un medio de transporte adecuado (el mejor es el de CaryBlair). Para el cultivo de Campylobacter se precisan unas condiciones especiales, que son: disponer de un medio selectivo, temperatura de incubacin de 4243 C y atmsfera microaeroflica (reducida de oxgeno) con C02. Hay varios medios de cultivo selectivos apropiados, la mayora de ellos comercializados, como el Skirrow, el Butzler o el Campy BAP, no siendo necesario utilizar ningn medio de enriquecimiento previo. La incubacin a 4243 C se realiza por espacio de cuarenta y ochosetenta y dos horas en una atmsfera que contiene un 5 por 100 de 02, 10 por 100 de C02 y 85 por 100 de N2. Hay casas comerciales que preparan sobres generadores de este tipo de atmsfera. Las placas pueden incluirse dentro de jarras de anaerobiosis, donde se incorporan tambin estos sobres. Con las colonias sospechosas crecidas en los medios antes mencionados, se efecta una identificacin presuntiva, observando su morfologa vacilar Gram. negativa en espiral (es mejor usar como colorante de contraste fucsina fenicada al 0,3 por 100), su movilidad caracterstica y la capacidad de dar positiva la prueba de la oxidasa. Se puede completar la determinacin con una batera de pruebas bioqumicas, de las cuales destacamos la catalasa, la reduccin de nitratos, la produccin de SH2 y la hidrlisis del hipurato. Aeromonas : Aeromonas hydrophila se asla con relativa frecuencia de heces diarreicas, habindose comprobado su capacidad entero txica y enteroinvasiva. Hay autores que tambin implican en estos procesos a Pleciomonas shigelloides. Otros entero patgenos son Edwarsiella, Streptococcus faecalis variedad liquefaciens, que produce toxiinfeccin, y Bacillus cereus, que da lugar a intoxicaciones.

ESTUDIO DELOS DIFERENTES AGENTES PATOGENOS INTESTINALES GENERO : CAMPYLOBACTER Son pequeos bacilos Gram que tienen forma de coma, forma espiral y, en ocasiones, tambin se les puede 21

observar en forma de S. Son microaeroflicos, mviles por un nico flagelo polar y no esporulados. No fermentan carbohidratos y dan positiva la prueba de la Oxidasa y la Catalasa. Campylobacter suele encontrarse en el tracto gastrointestinal de un gran nmero de animales y en el hombre producen infecciones gastrointestinales. Tambin se les asocia, aunque en menor grado a infecciones extraintestinales, sobre todo en pacientes con SIDA. ESPECIES CLNICAS Las ms importantes para el hombre, y que son agentes etiolgicos de la diarrea son: Campylobacter jejuni Campylobacter coli Campylobacter laridis El Campylobacter fetus subespecie fetus produce cuadros de septicemia en pacientes con un sistema inmunitario deficiente. Aislamiento a partir de muestras clnicas Cuando se trata de un aislamiento a partir de heces es recomendable hacer el anlisis lo ms pronto posible. Si se va a retrasar, es necesario usar un medio de transporte: Cary Blair CampyThio, en los cuales se mantiene de 1 a 2 semanas a 4C. Las condiciones bajo las cuales deben realizarse los cultivos son: Utilizar medios de cultivo selectivos para estos microorganismos. Temperatura de incubacin de 41C (porque los ms importantes son termoflicos). Condiciones reducidas de Oxgeno (microaeroflicos). Medios Selectivos Skirrow CampyBAP Butzler Generalmente no se suelen usar medios de enriquecimiento cuando la muestra procede de heces. S es til en aquellos casos en que est disminuido el nmero de bacterias por haber permanecido las heces durante un tiempo a temperatura ambiente. Tambin es importante usar un medio de enriquecimiento cuando la muestra procede de personas que estn en tratamiento o en portadores. Incubacin Se deben incubar a 42C durante unas 72 horas, en el caso de Campylobacter jejuni y C.coli. De esta forma eliminamos la flora acompaante. Para otras especies de Campylobacter: 22

 Utilizar medios selectivos sin cefaloesporinas Incubacin a 37C durante 7 das en atmsfera microaeroflica. Mtodos alternativos para el aislamiento de Campylobacter en heces Filtrar las heces (eliminamos coliformes y flora contaminante), diluir y se siembra en un medio NO selectivo. Se incuba a 42C en ambiente microaeroflico. Colocar directamente el filtro sobre la superficie del agar. Echar 1 o 2 gotas de las heces sobre el filtro. Hacer una primera incubacin, retirar el filtro y volver a reincubar. Aislamiento de Campylobacter a partir de muestras de sangre Se aslan en sangre: C. fetus, C. jejuni, C. laridis y otros que generalmente pueden aislarse en sangre como agentes etiolgicos de sepsis en pacientes con el sistema inmunitario deprimido o en enfermos de SIDA. Aunque la mayora crecen bien en medios con sangre, tienen el inconveniente de que tardan hasta 2 semanas en desarrollarse en estos medios. Es preferible realizar un cultivo en medios lquidos y, a partir de estos, realizar subcultivos en medios slidos, en ambiente microaeroflico y a una temperatura de 37C. IDENTIFICACIN La identificacin cuando se sospecha la presencia del Campylobacter consiste en una TINCIN DE GRAM, en la cual se observan como bacilos Gram que pueden adoptar una forma de S, aunque cuando la tincin de Gram se realiza a partir de cultivos viejos pueden perder esta morfologa. Tambin se puede hacer un MONTAJE EN FRESCO para observar la movilidad; las pruebas de la OXIDASA y la CATALASA darn positivas y, para la diferenciacin entre especies se pueden realizar las siguientes pruebas: Crecimiento a distintas temperaturas Sensibilidad que presentan al cido nalidixico y cefalotina Produccin de SH2 en Agar Hierro de Kliger Reduccin de Nitratos Adems de estas pruebas tambin se puede realizar la SEROTIPIFICACIN mediante tcnicas de Hemaglutinacin Indirecta y Tcnicas de Aglutinacin en portaobjetos. PATOGENIA. PATOLOGA El que tiene mayor importancia desde el punto de vista clnico es el C. jejuni: Campylobacter jejuni da lugar a gastroenteritis que se manifiesta con un cuadro diarreico y, en ocasiones puede observarse la presencia de sangre en heces. Este m.o se adquiere generalmente por va oral como consecuencia de la ingesta de alimentos o bebidas contaminadas. Tambin se puede producir por contacto con animales infectados. C. jejuni es un m.o muy sensible al pH cido del estmago por lo que debe ingerirse un elevado nmero de m.o para que se produzca la infeccin.

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Se multiplica en el intestino delgado, invade el epitelio y produce inflamacin. En ocasiones tambin puede pasar al torrente circulatorio y desarrollar un cuadro de fiebre entrica. La diarrea que produce suele acompaarse de dolor abdominal, cefalea y fiebre. Campylobacter coli y Campylobacter laridis producen una infeccin gastrointestinal similar a la producida por C. jejuni. Campylobacter fetus y C. upsaliensis producen cuadros diarreicos en individuos normales y pueden ocasionar bacteriemia en pacientes con el sistema inmunitario deprimido. HELICOBACTER PYLORI Se asla en el estmago de pacientes con lesiones gstricas y lcera gstrica. Es un bacilo Gram con forma espiral y con una gran actividad ureasa. Es un m.o mvil y el inters en l reside en que se le considera como un importante factor de lesiones gstricas. DETECCIN Se pueden realizar MTODOS DIRECTOS dado que este m.o se localiza preferentemente en los pliegues de la mucosa del estmago. Las pruebas ms idneas para el aislamiento del mismo sern las biopsias de las zonas lesionadas (IMP: Las muestras deben proceder de Biopsias, NO de aspirados gstricos). Cuanto mayor sea el nmero de biopsias que se realicen, mas posibilidades habr de conseguir el aislamiento de este m.o. Las muestras procedentes de biopsias deben enviarse directamente al laboratorio para proceder a su cultivo y, si esto no fuese posible, es necesario utilizar un medio de transporte: Solucin glucosada al 20%; Solucin Salina o Caldo Tioglicolato. En estos medios de transporte, el microorganismo se mantiene viable durante aproximadamente 5 horas si la temperatura de conservacin es de 4C. De las biopsias, una parte se utiliza para la realizacin de un frotis (TINCIN DE GRAM GIEMSA). En la tincin de Gram se observan bacilos Gram con forma de espiral o una forma caracterstica denominada forma de U o de Arns de bueyes. El resto de la muestra de la biopsia se trocea o machaca en un mortero estril y posteriormente se siembra. Adems de las tinciones tambin se pueden realizar PRUEBAS BIOQUMICAS como la prueba de Reduccin de Nitratos y la prueba de la Ureasa: Prueba Rpida: se realiza a partir de la muestra de la biopsia que se inocula en un medio para la determinacin de urea, como por ejemplo, Caldo de Urea o Cristensen. Evidencia, cuando es positiva, que puede tratarse de H. Pylori. Prueba de la Urea Respiratoria: el paciente ingiere una urea marcada y tras un perodo determinado de tiempo se mide el nivel de CO2 espirado. Adems de estos mtodos tambin se utilizan los MTODOS SEROLGICOS que utilizan tcnicas de ELISA con las que pueden ponerse de manifiesto la presencia de IgG e IgA. MEDIOS DE CULTIVO Los medios de cultivo utilizados para el aislamiento de Campylobacter procedente de estas biopsias son: Agar MuellerHinton con 5% de sangre de carnero 24

 Agar Brucella con 1% de almidn soluble Agar sangrechocolateSkirrowThayer Martn, siempre que estn suplementados o bien con suero o bien con almidn. Adems de estos medios se pueden usar medios SELECTIVOS que incorporan antibiticos con el fin de inhibir la flora acompaante: Medio selectivo para Helicobacter pylori Medio Belo Horizonte La temperatura ptima de crecimiento es de 37C, en ambiente microaeroflico, y la incubacin debe mantenerse al menos durante 7 das cuando se trata de aislamiento primario. FACTORES DE PATOGENICIDAD Produccin de Ureasa Crea un ambiente alcalino (CO2 y NH3) que le protege de la acidez gstrica. Proteasas Modifica el pH gstrico de la mucosa. Hemaglutininas Se adhieren a las clulas epiteliales. Citotoxinas (no tienen un papel determinado). PATOLOGA Gastritis aguda lceras ppticas: H. Pylori se ha aislado en el 100% de los enfermos que padecen lcera duodenal y en un 80% de los enfermos que padecen una lcera gstrica. PSEUDOMONAS Las especies de este gnero son bacilos Gram, aerobios estrictos, Oxidasa+ y mviles por un flagelo polar. No fermentan ningn tipo de carbohidrato pero pueden utilizar los azcares por metabolismo oxidativo. Pseudomona aeruginosa Es un m.o que crece bien en la mayor parte de los medio habituales de laboratorio, entre ellos MacConkey y Levine. No fermenta ningn carbohidrato y es capaz de crecer a temperaturas de 42C. En Agar Sangre da lugar a colonias de morfologa variable, en ocasiones hemolticas y con un olor caracterstico a fruta. Elabora pigmentos hidrosolubles que colorean el agar como la piocianina de color azul, pioverdina de color verde y piorrubina de color rojo. Es la nica especie que produce piocianina, caracterstica que se puede utilizar para su identificacin. La produccin de pigmentos se puede potenciar recurriendo a medios especiales como, por ejemplo, el King A y el King B. Adems existen medios selectivos para el aislamiento de P.aeruginosa a partir de muestras contaminadas como heces y esputo como son el Agar Cetrimida y el Agar Irgarsen. IDENTIFICACIN DE LA P.AERUGINOSA Las caractersticas que ayudan a la identificacin de P.aeruginosa son:

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 Crecimiento en la mayor parte de los medios de cultivo En Agar Sangre dan colonias azulverdosas con olor afrutado Catalasa y Oxidasa+ Reduccin de Nitratos Crecimiento a 42C En Agar de Kligler produce un crecimiento en superficie sin viraje del medio Oxidacin de Glucosa en un medio de OxidacinFermentacin. Hidrlisis de Arginina No decarboxilan ni Lisina ni Ornitina Tolerancia a la Cetrimida PATOGENICIDAD Y PATOLOGA DE LA P.AERUGINOSA La P.aeruginosa posee un gran nmero de factores de virulencia que se encuentran implicados en los mecanismos de patogenicidad del m.o, entre ellos fimbrias, que permiten su adherencia a clulas epiteliales; cpsula polisacrida, que le protege de la fagocitosis; enzimas extracelulares, como proteasas, hemolisinas y coagulasas; y endo y exotoxinas. Posee adems, la capacidad de sobrevivir en medios con bajo contenido en nutrientes, especialmente en ambientes hmedos, de forma que se ha llegado a aislar en agua destilada y soluciones desinfectantes. P.aeruginosa se haya implicada en un gran nmero de procesos infecciosos aunque siempre como patgeno oportunista y en pacientes con algn tipo de alteracin en su inmunidad. Es causante de infecciones nosocomiales. Puede producir tambin infecciones oculares asociadas al uso de lentes de contacto, otitis media en nadadores y, en ocasiones, puede producir septicemias. Pseudomona mallei y Pseudomona pseudomallei Son las nicas especies del grupo consideradas como verdaderos patgenos. P.mallei es el agente etiolgico del Muermo, enfermedad que se transmite al hombre a travs del ganado equino. A deferencia del resto de las especies del gnero, no habita ni en el agua ni en el suelo, sino que se encuentra perfectamente adaptada al hombre y animales a quien parasita. P.pseudomallei es de vida libre y se encuentra en el agua y en el suelo. Es el agente etiolgico de la Meliovidosis, una infeccin rara en nuestro medio y que se manifiesta de diversas formas, como infeccin pulmonar, abscesos, septicemia, etc. En el laboratorio crece en agar sangre dando colonias umbilicadas, de crecimiento lento y con una zona de hemlisis alrededor. Puede crecer en Agar MacConkey y a temperaturas de 42C. Otras Pseudomonas P.cepaia: produce fibrosis qustica 26

 P.fluorescens, P.ptida, P.putrefaciens y P.alcaligenes: se suelen aislar como agentes infecciosos en pacientes cuyas defensas se encuentran comprometidas. GENERO : ACINETOBACTER Este gnero engloba m.o que se encuentran habitualmente en el suelo y en el agua. Se puede hallar presentes en ambientes hospitalarios, donde producen infecciones en pacientes con las defensas disminuidas. Dos especies son las que se aslan con ms frecuencia: A.calcoaceticussubespecie anitratus A.calcoaceticussubespecie Iwoffi Estos m.o se han aislado en pacientes con neumona, infeccin urinaria y sepsis. En el laboratorio crecen en Agar MacConkey y en Agar Sangre donde dan colonias grises rodeadas de una zona de hemlisis. Se diferencian de las Pseudomonas porque dan negativa la prueba de la Oxidasa, son Catalasa+ y no reducen los Nitratos. Al microscopio se observan como bacilos Gram que, en ocasiones, pueden confundirse con las Neisserias. ENERO :BRUCELLA Son CocoBacilos, Gram, inmviles, no esporulados y aerobios estrictos. Algunas especies de Brucellas pueden presentar cpsula. Al microscopio se observan agrupados en parejas o formando cadenas cortas. La temperatura ptima de crecimiento es de 3537C. Son Catalasa+. La mayor parte de las Brucellas dan positiva la prueba de la Oxidasa y reducen los Nitratos a Nitritos. Las especies de Brucellas son parsitos obligados de animales y, algunos de ellos, producen infeccin en el hombre. DIAGNSTICO A PARTIR DE MUESTRAS CLNICAS 1 Examen Directo: El examen de la muestra, previa tincin de Gram, ofrece pocos resultados, debido al escaso numero de m.o que puede contener. La tcnica del Ac fluorescente directo, que emplea Ac antiBrucella marcados con fluorescena, proporciona mejores resultados que la tincin de Gram. Las tinciones ofrecen un diagnstico de presuncin que no es definitivo por lo que siempre hay que realizar el cultivo de las muestras. 2 Aislamiento de la Brucella. Medios de cultivo: realizamos el aislamiento cuando no se puede realizar la identificacin directamente de la muestra clnica. Las Brucellas son m.o intracelulares, por lo que necesitan requerimientos nutricionales complejos. El cultivo se realizar, por lo tanto, en medios enriquecidos, aunque hay Brucellas que se pueden desarrollar en medios generales como Agar Sangre y Agar Chocolate: 27

 Medios de cultivo Lquidos: Caldo Brucella. Medios de cultivo Slidos: Agar Brucella complementado con suero o glicerina. Medios de cultivo Selectivos: Medio de Farell; Medio modificado de ThayerMartin. A todos los enfermos sospechosos de infeccin por Brucellas se les debe realizar un hemocultivo. 3 Identificacin de Brucellas Basada en la Morfologa de las colonias: Lisas y transparentes: estn relacionadas con la presencia de cepas virulentas. Presenta tanto la parte lipdica A como la parte polisacrida O. Rugosas: estn relacionadas con cepas avirulentas. Slo poseen la parte lipdica A, y si poseen la parte polisacrida, sta es defectuosa, por lo que no se consideran virulentas otra forma de diferenciar las formas virulentas de las avirulentas es sembrar en un medio Agar Glucosa Glicerol. Una vez incubada la placa inundamos la superficie de la placa con una solucin de cristal violeta y observamos con una luz oblicua. Las colonias lisas se observarn de un azul verdoso, mientras que las colonias rugosas se observarn de un azul rojizo o violeta rojizo. Tincin de Gram: Las Brucellas aparecen como cocobacilos Gram que se tien dbilmente con el colorante de contraste, por lo que es necesario mantener la accin del colorante de contraste (Safranina) por lo menos durante 3 minutos. Es conveniente, antes de hacer la tincin de Gram, que si se sospecha la presencia de Brucellas, hagamos una suspensin de una colonia en una solucin salina fenicada al 1%, para evitar riesgos. Pruebas Bioqumicas: Son Catalasa+, la mayora dan positiva la prueba de la Oxidasa, son Ureasa+, reducen los Nitratos a Nitritos y no fermentan la Glucosa ni la Lactosa. DIAGNSTICO SEROLGICO: (diagnstico indirecto) Prueba de la Rosa de Bengala Aglutinacin en tubo Prueba de antiglobulina para Brucella (Coombs indirecto) La Prueba de la Rosa de Bengala y la aglutinacin en tubo se realizan de la misma forma. Son pruebas de aglutinacin que se realizan con una suspensin de Brucellas a pH = 3,6. Para la prueba se preparan una serie de diluciones: Dilucin 1/2 :100L de suero problema + 100L solucin salina Dilucin 1/4 : 100L dilucin anterior + 100L solucin salina Dilucin 1/8: 100L dilucin anterior + 100L solucin salina

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.etc. Una vez hechas las diluciones, colocamos 50L de las mismas en un porta y le aadimos 1 gota de la suspensin de Brucellas. Primero se detecta la presencia de la Brucella y despus se realiza la cuantificacin de la misma. Para que la prueba se positivice, el paciente debe tener una concentracin de Ac en suero de 25 UI/mL o superior. Para conocer este dato calculamos el ttulo: TTULO = 25 UI/mL x Inversa de la Dilucin Las pruebas se deben repetir a los 15 das despus de la seroconversin: Siempre que aumenta el ttulo de Ac de una fase a otra significa que se encuentra en una fase aguda. Si el ttulo se mantiene, pueden darse dos situaciones: Que se trate de Ac residuales Que se trate de una infeccin crnica La Prueba de la antiglobulina para Brucella Coombs indirecto sirve para detectar Ac bloqueantes (IgA, que se encuentran en las mucosas) Enfrentamos el suero de paciente con la solucin de brucellas e incubamos. El Ac bloqueante se une al Ag, pero no produce la aglutinacin. Para saber si realmente existe el Ac bloqueante o simplemente es que no existe, aadimos la antiglobulina humana o suero de Coombs. Si se produce la aglutinacin significar que en el suero del paciente exista el Ac bloqueante, ya que la antiglobulina humana se ha unido a este Ac y ha aglutinado. Si no se produce la aglutinacin significa que no exista Ac en el suero del paciente. EPIDEMIOLOGA DE LAS BRUCELLAS Las principales especies de Brucella con importancia patolgica son: B. melitensis: produce la mayor parte de los casos de Brucelosis que se producen en Espaa. B. abortus: producen una infeccin ms leve que la melitensis. A veces cursa de forma asintomtica y es la causante de muchos de los abortos espontneos que se dan en los animales. B. suis: suele afectar al ganado porcino pero tiene menos importancia desde el punto de vista clnico. La Brucelosis es una antropozoonosis, es decir, que afecta a los animales de forma primaria y pueden transmitirse al hombre. La infeccin puede producirse tanto por: Contagio Directo: se puede producir como consecuencia de un contacto con animales infectados o bien por inhalacin de aerosoles, o por contacto de productos infectados con las mucosas. Contagio Indirecto: se produce como consecuencia de ingestin de leche y sus derivados que no han sido pasteurizado.

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Es importante destacar el peligro que supone para el personal sanitario la manipulacin de muestras sospechosas de Brucelosis ya que es fcil que pueda producirse el contagio por contacto con piel y mucosas, por inhalacin de aerosoles y por accidentes como consecuencia de la manipulacin de agujas contaminadas en la realizacin de los hemocultivos. PATOGENIA Generalmente, las Brucellas tienen un perodo de incubacin que puede oscilar entre 16 semanas. Durante este perodo, las Brucellas se multiplican en el interior de las clulas del retculo endotelial y, de esta forma, elude la respuesta inmune del husped. Pueden pasar a la sangre y diseminarse en los tejidos. Es frecuente que la infeccin se localice en algn rgano, generalmente hgado y mdula sea. ENTEROBACTERIAS. Son bacilos Gram; Catalasa+; Oxidasa; anaerobios facultativos... Fermentan la glucosa con produccin de cido, con sin gas. La mayor parte reduce los nitratos a nitritos, pueden ser mviles o inmviles. Cuando son mviles, la mayora presenta flagelos pertricos. Estn ampliamente distribuidas en la naturaleza, habitan tanto a plantas como animales y suelo, y en el hombre se encuentran como flora comensal en el intestino. Son responsables de un gran nmero de infecciones, siendo particularmente frecuente su aislamiento a partir de determinadas muestras clnicas. Son responsables del 50% de los casos de septicemia; de 6070% de los casos de enteritis bacteriana aguda y ms del 70% de los casos de infecciones del tracto urinario. ESTRUCTURA ANTIGNICA Ag somtico O: se encuentra en la pared celular y tiene naturaleza polisacrida. Ag capsular K: polisacrido o protena. Ag flagelar H: naturaleza proteica. Endotoxinas. Exotoxinas. Colicitinas: Son bacteriocinas,. Son toxinas contra otras cepas de la misma o distinta especie. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN Todas aquellas muestras clnicas en las que se sospecha la presencia de Enterobacterias, generalmente procedentes de heridas, lquidos y exudados orgnicos, orina y hemocultivos, deben sembrarse en un medio general (Agar sangre o chocolate) en un medio selectivo. Si la muestra procede de heces o hisopos rectales, se utilizarn medios selectivos diferenciales caldos de enriquecimiento.

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 MEDIOS DE CULTIVO En funcin del origen de la muestra, podemos utilizar distintos medios de cultivo. Los que se utilizan ms frecuentemente son: Medios de cultivo poco selectivos: Agar Mc Conkey Agar EMB Levine Caldo de crecimiento: SelenitoSalmonella TetrationatoSalmonellaShigella (Toxoinfecciones alimentarias) Medios de cultivo de Selectividad mediaalta: Agar enterico Hecktren Agar salmonellaShigella Agar verde brillante (para todo tipo de Salmonellas, excepto la S. typhi) Agar bismuto sulfito (selectivo para S. typhi) PROCEDIMIENTOS PARA LA IDENTIFICACIN DE ENTEROBACTERIACEAS Pruebas Bioqumicas. Sistemas comerciales de identificacin. Identificacin serolgica: permite la identificacin a nivel de gnero y especie. Diagnstico inmunolgico. PRUEBAS BIOQUMICAS AGAR HIERRO DE KLIGLER Es una prueba diferencial y adems se trata de una multiprueba. Se compone de dos hidratos de carbono (Lactosa en un 1% y Glucosa en un 0,1%). La Glucosa se encuentra en menor cantidad para que se consuma antes de las 24 horas de incubacin y necesariamente las bacterias tengan que consumir las peptonas, con lo que se produce amonaco y se alcaliniza el medio. 1. hay 3 formas bsicas de fermentacin en este medio de cultivo: Que solamente se fermente la Glucosa: por principio, todas las enterobacterias fermentan la glucosa. Cuando la glucosa se acaba y la bacteria no es capaz de utilizar la lactosa, se alimentar de las peptonas del medio.

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Mtodo: la siembra se hace en profundidad (condiciones anaerobias) y en superficie (condiciones aerobias). La muestra debe proceder de un medio de cultivo puro, se tomar una colonia con un hilo de siembra y se har la inoculacin del medio de cultivo primero en profundidad, y segundo, segn sacamos el asa, en superficie. La lectura se realizar tras un tiempo de incubacin de 24 horas (que se ha de cumplir a rajatabla) a 3537C. Resultados: Si se fermenta la Glucosa, se producen unos compuestos que acidifican el medio y, por lo tanto, el medio virar a amarillo. Si adems de la Glucosa utiliza las peptonas, que producen amoniaco, el medio se alcaliniza y en lugar de virar a amarillo virar a rojo intenso. Esto ltimo solo ocurre en la siembra que se ha hecho en la superficie, es decir, que veremos la superficie roja y el fondo amarillo. Esto es as porque los productos metablicos son diferentes si la transformacin es aerbica o anaerbica. Que fermente tanto la Glucosa como la Lactosa: Se observar el medio totalmente amarillo, debido al pH cido. Que no fermente ninguna: se alimenta desde el principio de las peptonas, por lo tanto podremos afirmar que no se trata de una Enterobacteria. Se originarn una serie de productos alcalinos que virarn el medio a rojo tanto en el fondo como en la superficie, siempre y cuando la bacteria sea capaz de consumir las peptonas tanto en medio aerobio como anaerobio. Si la bacteria solo fuera capaz de utilizar las peptonas de forma aerobia, la superficie aparecera roja, mientras que el fondo permanecera sin cambios. 2 Observacin de la produccin de gas (CO2 y H2): Si en el medio se forma alguno de estos gases, se observarn algunos cambios en el medio de cultivo: Aparicin de burbujas. Fracturas en el agar. 1. Desplazamiento del medio de cultivo hacia la boca del mismo debido a una produccin intensa de gas. Observacin de la produccin de Sulfhdrico (SH2). Para que se produzca el SH2 Las condiciones han de ser cidas Se necesita una fuente que suministre el azufre (Tiosulfato de Sodio) Se necesita un indicador que nos permita visualizarlo (Sal de hierro Citrato Frrico Amoniacal). Este indicador hace que el SH2 precipite en forma de un precipitado negro. Si la cantidad precipitada es pequea, el precipitado se observar en la superficie del medio de cultivo. Si, por el contrario, la produccin de SH2 es muy intensa, toda la parte profunda del tubo se ver negra. Ahora bien, si todo el fondo se ve negro cmo sabremos el viraje del medio?. Pues bien, como para que se pueda producir el Sulfhdrico es necesario que se den unas condiciones cidas, deberemos suponer que el medio de cultivo habr virado a amarillo en el fondo. En la superficie si podremos diferencias entre el rojo y el amarillo sin ningn problema. PRUEBA DE LA CATALASA Definicin: Es una enzima que se encuentra en la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas (a excepcin del Estreptococcus, por eso es una prueba que nos permite diferenciar entre Estafilococos y Estreptococos). Funcin: Descompone el perxido de hidrgeno (H2O2 o agua oxigenada) que se forma como producto terminal oxidativo de la descomposicin aerbica de los azcares:

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2 H2O2 2 H2O + O2 (gas) Catalasa Tcnica: Consiste en recoger con el asa de siembra una colonia procedente de un cultivo puro, reciente y colocarla sobre un portaobjetos. A continuacin agregamos 1 gota de perxido de hidrgeno al 30%(comercial) sobre el microorganismo con una pipeta Pasteur (no es necesario homogeneizar). Resultados: 1 Si la prueba es POSITIVA: se formarn inmediatamente burbujas bien visibles. 2 Si la prueba es NEGATIVA: no se observar burbujeo. Precauciones: es importante que la muestra no tenga su origen en un medio que contenga sangre, ya que podramos obtener falsos positivos. PRUEBA DE LA OXIDASA O CITOCROMOOXIDASA Principio: se basa en determinar la presencia de las enzimas oxidasas, las cuales catalizan la transferencia de electrones desde el sustrato, que es generalmente orgnico, hasta el oxgeno. Tcnica: Se realizar segn las instrucciones de la casa que nos proporcione el producto. Generalmente, en las oxidasas positivas, se produce una reaccin entre la enzima y un sustrato que est en la tira reactiva dando lugar a un producto coloreado que suele ser el azul de indofenol. El reactivo puede variar de una casa comercial a otra, as una prueba oxidasa+ se observar de un color que oscila entre el prpura y el negro. Precauciones: No tomar la muestra de medios coloreados. PRUEBA DEL INDOL Principio: se basa en determinar la capacidad de un microorganismo para desdoblar el indol de la molcula de triptfano, que es un aminocido, que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar metabolitos indlicos. A este grupo de enzimas, capaces de desdoblar el triptfano se les denomina triptofanasas. Tcnica: Se utiliza un caldo de triptona o de peptona (a veces tambin se utiliza un medio semislido: medio de S.I.M = Sulfhdrico; Indol; Movilidad). Se disponen 5 mL del medio en cada uno de los tubos que vayamos a utilizar para la prueba, esterilizamos, inoculamos e incubamos (3537C / 24h). Por ltimo, para saber si se ha producido el Indol aadimos 5 gotas del reactivo de Kovacs indol. Resultados: 1 Si la prueba es POSITIVA: aparece un anillo rojo en la superficie del medio. 2 Si la prueba es NEGATIVA: permanece un color amarillo, que es el color del reactivo (el reactivo es un aldehdo) PRUEBA DEL CITRATO Principio: consiste en determinar si una bacteria es capaz de utilizar el citrato como nica fuente de carbono alcalinizando el medio de cultivo. El medio de cultivo utilizado para observar la fermentacin de citrato contiene tambin sales de amonio inorgnicas. Un organismo que es capaz de utilizar el citrato como nica 33

fuente de carbono, utiliza tambin las sales de amonio como nica fuente de nitrgeno. Estas sales de amonio se van a desdoblar en amoniaco produciendo la consiguiente alcalinidad. El medio utilizado es el Agar Citrato de Simmons que lleva como indicador el azul de bromotimol (cuando el pH es alcalino vira a azul intenso, mientras que el medio sin inocular tiene un color verde). Tcnica: Se utiliza un tubo inclinado. Hacemos la estra en superficie con un inculo poco denso y lo llevamos a incubar (3537C / 24h) Resultados: 1. Si la prueba es POSITIVA: En la superficie del medio de cultivo se observa un viraje del verde a azul intenso. 2.Si la prueba es NEGATIVA: no se produce viraje, se queda verde. PRUEBA DEL ROJO METILOVOGES PROSKAUER (RMVP) INTRODUCCIN: Para el metabolismo de los Hidratos de Carbono se pueden dar varios procesos: Gluclisis: proceso de hidrlisis por el cual se transforma la glucosa en cido pirvico. Vas alternativas Pentosas fosfato: se puede usar al mismo tiempo que la Gluclisis o de forma independiente. Entner Douduroff: la utilizan algunas Enterobacterias sin necesidad de utilizar la Gluclisis y la va de las pentosas fosfato. El cido pirvico puede usarse mediante: Va aerbica: Respiracin. El aceptor final de electrones es una molcula inorgnica (O2). Como productos obtenemos CO2 y H2O Empoacetilo + CoA ciclo de Krebs + cadena transportadora de e Va anaerobia: Fermentacin. El aceptor final de electrones es una molcula orgnica. Es de menor rendimiento energtico que la Gluclisis. Puede ser de tres tipos: Lctica Alcohlica cido mixta o del Grupo Califorme: tiene como productos: cidos mixtos: frmico, actico, succnico, etlico... (RM+) 34

 Butilenglicol Butanediol Acetona (RM) ROJO DE METILO (RM) Principio: Es una prueba que mide de forma cualitativa los productos cidos que se originan por el metabolismo de la Glucosa de forma que, cuando estos cidos se producen en cantidad elevada, consiguen superar el sistema amortiguador llevando el pH del medio hasta 4 4,5. Tcnica: Se siembra 1 tubo para la prueba RM y otro para la de VP para cada muestra. Se incuba a 3037C durante 48 horas a 4 das incluso 6 das, y finalizado el perodo de incubacin le aadimos al tubo del RM 0,10,2 mL del reactivo Rojo de Metilo. Resultados: Si la prueba es POSITIVA aparece coloracin roja en la superficie de contacto del reactivo y del medio de cultivo. Si la prueba es NEGATIVA se queda el color del medio (amarillo) Precauciones: Es importante incubar como mnimo 48 horas. Si se observa un color anaranjado hay que continuar con la incubacin hasta 4 das. Si hacemos la lectura antes de las 48 horas todas las enterobacterias darn la prueba positiva, ya que todas fermentan la glucosa. Las enterobacterias que van a ser Rojo de Metilo positivas producen como consecuencia del metabolismo de la glucosa unos productos cidos en gran cantidad y estables. Trascurridas las 48 horas se aade el indicador. En este caso, los cidos habrn superado el sistema amortiguador del tampn (pH = 4 4,5), por el contrario, las enterobacterias que van a ser Rojo de Metilo negativas tambin producen cidos pero se producen en menor cantidad, son menos estables, se produce mayor cantidad de CO2 y, adems, se producen productos como consecuencia de la degradacin de las peptonas, con lo que el pH tiende a la neutralidad, es decir que tiende a alcalinizarse. VOGESPROSKAUER Principio: Es una prueba que pone de manifiesto un producto final neutro que es la Acetona. Tcnica: Se inocula y se incuba durante 24 48 horas. Para poner de manifiesto la acetona se utilizan 0,6 mL de naftol al 5% (intensifica el color) y 0,2 mL de KOH NaOH al 40% (oxida la acetona en diacetilo, que es el producto coloreado junto con el alcali y las peptonas). Es importante que se aadan en este orden y tienen que ser medidas exactas. Resultados: Se realiza la lectura a los 1015 min de la adicin de los reactivos: 1. Si la prueba es POSITIVA se observa un color rojo rosado en la superficie del medio. 2. Si la prueba es NEGATIVA se observa un color amarillo en la superficie del medio Precauciones: Despus de la incubacin del reactivo es importante dejar destapado el tubo con el fin de que el O2 se ponga 35

en contacto con los productos formados, de tal forma que se acelere la reaccin. En la mayora de los casos, las enterobacterias que son RM+ son PV y viceversa. O.N.P.G ORTONITROFENOL DGALACTOPIRANSIDO Principio: Es una prueba que pone de manifiesto la capacidad de un m.o de fermentar la Lactosa, demostrando la presencia ausencia de la enzima galactosidasa cuando se emplea un compuesto orgnico que es el ONPG. Si en la clula bacteriana se encuentran enzimas para metabolizar la lactosa, el reactivo ONPG es hidrolizado, liberando un compuesto amarillo (ortonitrofenol). Estas enzimas son inducidas y estn controladas genticamente. Pueden disminuir o desaparecer despus de varias generaciones si el sustrato no est presente. NOTA: las enzimas inducidas son aquellas que la bacteria produce exclusivamente cuando se encuentra el sustrato sobre el que se va a ejercer su accin. Las enzimas constitutivas son aquellas que son producidas por la bacteria independientemente de que el sustrato se encuentre o no en el medio de cultivo. Para que se produzca la fermentacin de la Lactosa, un microorganismo necesita 2 enzimas: galactosidasa permeasa: Se encuentra en la membrana celular. Transporta la Lactosa al interior celular. D galactosidasa: Hidroliza la Lactosa en el interior celular. En funcin de que la bacteria tenga una, las dos o ninguna de las enzimas, podemos clasificarlas en: Activas: Poseen las dos enzimas. Retardadas: Carecen de la galactosidasa permeasa y poseen la Dgalactosidasa. Tardan ms tiempo en degradas la Lactosa porque tienen que producir la permeasa. No fermentadores: No poseen ninguna de las enzimas. Tcnica: Es necesario partir de un cultivo puro, reciente, preferiblemente obtenido a partir de un medio de cultivo de Kligler. Tomaremos una cantidad espesa de inculo para demostrar rpidamente la presencia de la enzima. A partir del cultivo preparamos una suspensin del microorganismo en un tubo de hemlisis con 0,5 mL de agua destilada. Ponemos un disco de ONPG en el tubo y lo incubamos a 37C. Resultados: Si la prueba es POSITIVA: en los 1530 minutos posteriores a la adicin del disco, el medio se habr vuelto amarillo. Si la prueba es NEGATIVA: habr que esperar entre 2,3 o incluso 24 horas para una buena confirmacin. El medio no cambiar de color. PRUEBA DE LAS DESCARBOXILASAS Principio: Con esta prueba ponemos de manifiesto la capacidad que tiene un microorganismo, mediante la 36

enzima correspondiente, para decarboxilar un aminocido (Lisina, Arginina, Ornitina). Son enzimas inducidas y, generalmente, estas reacciones se producen en condiciones anaerobias. Son capaces de actuar sobre distintos aminocidos, la enzima ataca al grupo carboxilo (COOH) y da lugar a una amina y a CO2. Nosotros slo realizaremos la prueba de la Lisina Carboxilasa. Si esta enzima se encuentra presente se formar Cadaverina y CO2 (alcaliniza). Dependiendo del medio de cultivo que se utilice, una vez inoculado, es necesario sellarlo para obtener las condiciones anaerobias. En este caso del caldo de Lisina no es necesario sellarlo, basta un tapn metlico, preferiblemente de rosca. Tcnica: Inoculamos el medio de cultivo (caldo) con un inculo escaso y lo incubamos durante 24 horas a 37C. En algunos casos es necesario incubar hasta 4 das. Resultados: El medio sin inocular es de color prpura y suele contener glucosa y el aminocido que queremos estudiar. Si la prueba es POSITIVA: el medio tomar un color prpura amarillento o prpura turbio. Primero habr pasado por el color amarillo y luego habr revirado al prpura. Si la prueba es NEGATIVA: el medio tomara un color amarillo brillante. Solo se consume la glucosa. Precauciones: Es conveniente guardar un tubo sin inocular con el fin de comprobar los resultados. Prueba de la Ureasa Principio: Con esta prueba ponemos de manifiesto la capacidad orgnica de algunas bacterias de desdoblar la urea en dos molculas de amonaco, mediante la accin de la enzima Ureasa, que es una enzima constitutiva. Tcnica: Se pueden utilizar distintos medios de cultivo: Agar base de urea: tiene el inconveniente que hay que prepararlo, esterilizarlo y, antes de que se enfre, hay que aadirle la urea. Se usa de forma inclinada. Caldo de urea: ya lleva incorporada la urea. Directamente se siembra el microorganismo y se incuba. Resultados: Se observa a las 24 o incluso a las 48 horas. Si la prueba es POSITIVA: el medio se observar de un color rosado Si la prueba es NEGATIVA: no se producir ningn cambio de color. Se mantendr el color amarilloanaranjado del medio inicial. Prueba de la Fenilalanina Desaminasa Principio: La prueba pone de manifiesto la capacidad enzimtica de un microorganismo para desaminar la fenilalanina, originndose el cido fenilpirvico. Tcnica: Se utiliza el medio fenilalanina en tubo inclinado. Se siembra un inculo denso, reciente, puro y se incuba durante 24 horas. Resultados: Para poner de manifiesto el producto coloreado se aade Cloruro Frrico al 10% : c. 37

Fenilpirvico + Cloruro Frrico COLOR Dejamos resbalar por la superficie del agar inclinado 56 gotas del reactivo y se mueve el tubo suavemente para extenderlo. 1. Si la prueba es POSITIVA: aparece un color verde sobre la superficie. 2. Si la prueba es NEGATIVA: se queda del color del Cloruro Frrico, es decir, amarillo. SISTEMAS COMERCIALES DE IDENTIFICACIN API 10 S: La galera API 10 S consta de 10 microtbulos que contienen sustratos deshidratados. Estos test se inoculan con una suspensin bacteriana que reconstituye los medios. Durante la incubacin, se producen cambios de color espontneos o revelados por adicin de reactivos. Despus de la incubacin de 1824 horas a 3537C, la lectura de reacciones se realiza visualmente con la Tabla de Lectura y la identificacin se alcanza consultando la lista de perfiles de la ficha tcnica o con un software de identificacin. Tcnica: Preparacin de la galera: Repartir aproximadamente 3 mL de agua destilada en los alveolos del fondo de la cmara de incubacin con el fin de crear una atmsfera hmeda. Inscribir la referencia de la cepa en la lengeta lateral de la cmara Preparacin del Inculo: Preparar una suspensin de una colonia del m.o con 5mL de solucin fisiolgica al 0,85%. 3. Inoculacin de la galera: Llenar el tubo y la cpula del test CITcon la suspensin bacteriana. Llenar solo los tubos (y no las cpulas) de los otros test. Crear una anaerobiosis en los test LDC, ODC, H2S, URE, llenando su cpula con aceite de parafina. Cerrar la cmara de incubacin Incubar a 3537C durante 1824 horas. 4. Lectura de la galera: se utiliza la Tabla de Lectura. Anotar las reacciones espontneas en la hoja de resultados y luego leer los test que requieren aadir reactivos: TDA: aadir 1 gota de cloruro Frrico. Una coloracin marrnrojiza indica una reaccin positiva. IND: aadir 1 gota de reactivo de Kovacs. Si la reaccin es positiva aparecer una coloracin rosa. NO2: aadir 1 gota de reactivos NIT1 y NIT2 en el tubo GLU. Esperar de 2 a 5 minutos. Una coloracin roja indica una reaccin positiva. se realiza mediante un perfil numrico. En la hoja de resultados, los test estn separados en grupos de tres y un valor 1, 2 4 se indica para cada uno. Dado que la galera API 10 S consta de 1 test, al sumar los valores dentro de cada grupo que corresponden a las reacciones positivas, se obtienen 4 cifras que corresponden al perfil numrico.

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ENTEROTUBE: Se utiliza para la identificacin de Enterobacteriaceae. Tcnica: Quitar los capuchones de proteccin roscados. Bajo el capuchn blanco se encuentra la punta de la aguja de inoculacin. Con la punta de la aguja sin flamear se pica ahora cuidadosamente una colonia bien aislada, sin atravesar el agar. Extraer la aguja por todos los compartimentos, hacindola girar ligeramente. Seguidamente se introduce de nuevo la aguja hasta que la muesca de la aguja alcance la abertura del tubo. La punta de la aguja debe llegar hasta el compartimento de citrato. Romper la aguja, doblndola hacia un lado, por la muesca. Con el extremo restante de la aguja rota se perfora ahora la pelcula plstica que recubre los orificios de aireacin de los ltimos 8 compartimentos para as permitir en estos un crecimiento en aerobiosis. A continuacin, enroscar de nuevo los capuchones. Incubar en posicin vertical, con el compartimiento de glucosa hacia arriba, o bien en posicin horizontal, con la pelcula de plstico hacia abajo a un temperatura de entre 3537C durante 2024 horas. Despus de la incubacin se registran, en una ficha de interpretacin, las reacciones positivas, a excepcin de los compartimentos del Indol y VP, ya que necesitan la adicin de reactivos. Para la prueba del Indol aadir con una jeringa 3 4 gotas de reactivo de Kovacs, atravesando la superficie de plstico por arriba del compartimiento de H2S / Indol. Ser positivo si el reactivo agregado adquiere un color rojo en pocos segundos. Para la prueba de VP inyectar 3 gotas de solucin naftol y 2 gotas de KOH por el orificio de aireacin lateral en el compartimiento de VP con el Enterotube en posicin horizontal. Ser positivo si el reactivo agregado adquiere un color rojo dentro de los 10 minutos siguientes. IDENTIFICACIN SERLOGICA Se utiliza fundamentalmente para la identificacin del gnero Salmonella, Shigella y E.coli. Se basa en la utilizacin de pruebas de aglutinacin mediante la identificacin de al menos tres antgenos. Estos antgenos son: 1. Ag somtico 0: Lo suelen poseer cepas como: E.coli 0112: es una cepa enteroinvasiva que produce un cuadro de diarrea similar a la originada por Shigella. E.coli 0157: produce una neurotoxina que da lugar a una colitis hemorrgica y al sndrome urmico hemoltico. Shigella: permite clasificar en cuatro grupos diferentes la identificacin de este Ag somtico 0. 2 . Ag capsular K: Est constituido por polisacridos de la cpsula. Es termolbil. Suele estar presente en los gneros Klebsiella, Salmonella (algunas cepas pueden presentar un Ag Vi que est relacionado con la mayor virulencia de las mismas) y E.coli. 3 Ag flagelar H: Est formado por protena. Son termolbiles. DIAGNSTICO INMUNOLGICO PATOLOGAS ENTEROBACTERIAS ASOCIADAS CON INFECCIONES GASTROINTESTINALES Y FIEBRE ENTRICA 39

ESCHERICHIA COLI : Es una bacteria que se asocia con 4 tipos distintos de infeccin entrica: E.coli enterotoxignica (ETEC) Esta es la que se asocia en mayor grado con las diarreas infantiles en los pases subdesarrollados y es causante tambin de la diarrea del viajero. Generalmente, este tipo de diarreas se produce como consecuencia de la ingestin de agua y alimentos contaminados. Para que se produzca el cuadro diarreico es necesario que se ingiera una elevada cantidad de m.o ya que estos no suelen resistir la accin de pH cido del estmago. El m.o coloniza el intestino delgado favoreciendo la adhesin mediante las fimbrias que posee, adems produce 2 tipos de toxinas: una termolbil y otra termoestable. Estas toxinas inducen una secrecin activa de metabolitos a la luz intestinal y el cuadro clnico se manifiesta como diarrea acuosa, nauseas, dolor abdominal y fiebre. E.coli enteroinvasiva (EIEC) Estas cepas de E.coli dan lugar a un cuadro similar a la Shigellosis. Son capaces de invadir y multiplicarse en las clulas epiteliales de la mucosa intestinal, produce fiebre, dolor abdominal y diarrea acuosa con eliminacin de sangre y moco. En ocasiones puede producir un cuadro de toxemia. E.coli enteropatgena (EPC) Estas cepas de E.coli pueden daar la mucosa intestinal originando descamacin de la misma. Algunas cepas producen toxinas que tienen una accin citotxica. El cuadro clnico se presenta con diarrea, eliminacin de moco y apenas presencia de sangre. Suelen afectar con mayor frecuencia a los lactantes y a nios de corta edad. E.coli 0157: H7 Suele producir dos cuadros clnicos: Colitis hemorrgica. Es una forma grave de diarrea. Sndrome urmico hemoltico.. Se produce una insuficiencia renal, anemia hemoltica y trombocitopenia. SALMONELLA : Produce gastroenteritis transmitidas generalmente por el consumo de alimentos contaminados por el m.o. Es mvil. El reservorio de la Salmonella suele ser los animales, excepto la Salmonella typhi cuyo reservorio es el hombre. Los puentes de las infecciones por Salmonella suelen ser las aves y sus productos, y con menor frecuencia, leche y sus derivados. Para que se produzcan los cuadros de gastroenteritis es necesaria la ingestin de un gran nmero de m.o ya que la acidez gstrica disminuye el nmero de m.o viables. Aquellos que sobreviven a la acidez gstrica pasan al intestino delgado donde se multiplican. Esta proliferacin del m.o en el intestino puede cursar sin sintomatologa clnica o de forma sintomtica. En ste ltimo caso, se puede manifestar como enterocolitis, bacteriemia o fiebre entrica: 40

 Fiebre Entrica: El cuadro de esta fiebre suele estar producido por S. typhi o por S. paratuphi. Da lugar a lo que se conoce como fiebres tifoideas o paratifoideas. Una vez que se produce la ingestin de estas salmonellas y llegan al intestino delgado, pueden atravesar el sistema linftico y alcanzar el torrente circulatorio producindose la diseminacin a otros rganos. Bacteriemia: Suele estar producida por S.cholerae, S.suis y otros tipos de Salmonella. Enterocolitis: Suelen estar causadas por S. typhimurium que es la forma ms comn de manifestarse las infecciones por Salmonella. Este tipo de infecciones producidas por S. typhimurium, despus de transcurridas de 8 a 48 horas de la ingestin de alimentos contaminados se produce un cuadro de nauseas, vmitos y diarrea. La que ms importancia tiene en el cuadro clnico de las Salmonellas es la Enterocolitis, porque se produce por la ingestin de alimentos. No citan tratamiento antibitico. SHIGELLA : Son una de las causas ms frecuentes de diarrea bacteriana. La diarrea producida por Shigella tambin se conoce como disentera bacilar. La va de transmisin de este microorganismo es la va fecaloral y tambin a travs de los alimentos contaminados con heces. Resiste la acidez gstrica, por lo que es suficiente un pequeo nmero de m.o para producir la infeccin. Se multiplica en la mucosa intestinal aunque sin llegar a atravesarla, por este motivo, los hemocultivos sern negativos. SHIGELLA DYSENTERIDE TIPO I Elabora una toxina termolbil que es neurotxica y citotxica. Produce una diarrea similar a la enterotoxina termolbil de E.coli. El carcter neurotxico de la toxina determina que, en ocasiones, se puedan producir cuadros de meningitis y coma. Generalmente, los nios de corta edad son los ms afectados por este tipo de infeccin. YERSINIA : Dentro de este gnero, la Yersinia enterocoltica, da lugar a cuadros de gastroenteritis por ingestin de agua o alimentos contaminados. Con menor frecuencia, tambin se produce la infeccin por contacto directo con animales infectados. Este m.o es capaz de crecer a temperaturas de refrigeracin, por lo que es un m.o a tener en cuenta en la industria alimentaria. Para que se produzca la infeccin es necesario que el sujeto ingiera gran cantidad de inculo. Con menor frecuencia se aslan tambin Yersinia pseudotuberculosis y Yersinia intermedia, que tambin originan cuadros de gastroenteritis. ENTEROBACTERIAS ASOCIADAS CON INFECCIONES EXTRAINTESTINALES YERSINIA PESTIS : Es el agente etiolgico de la peste bubnica. Se transmite por la picadura de la pulga o por manipulacin de animales infectados. El principal reservorio lo constituyen las ratas. Una vez que el m.o penetra a travs de la piel, como consecuencia de la picadura, es fagocitado por macrfagos y leucocitos en cuyo interior se multiplican. Durante esta fase intercelular el m.o sintetiza dos Ag, uno proteico y otro lipoproteico, que permiten que el m.o no sea destruido por las clulas inmunitarias una vez que se produce la lisis de la clula que parasita. Las infecciones por Yersinia pestis se pueden manifestar como peste bubnica, peste sistmica o peste neumnica. 41

En la peste bubnica hay una infeccin de los ganglios linfticos con inflamacin, pudiendo producirse cuadros de neumona por diseminacin hematgena. La peste sistmica se caracteriza por fiebre y bacteriemia. La peste neumnica es muy contagiosa por va area. E.coli : Es la principal causa de infecciones del tracto urinario. Pueden dar lugar a cuadros de cistitis, uretritis, pielonefritis y sepsis. Las cepas implicadas en este tipo de infecciones son las denominadas Urohepatognicas, debido a que poseen elementos de adherencia entre otros factores de patogenicidad. El E.coli tambin produce infecciones de tipo nosocomial, entre las que se encuentran neumonas e infecciones de heridas quirrgicas. Adems puede producir meningitis neonatal, que est producida por una cepa con Ag capsular denominada K1. Klebsiella Enterobacter Serratia : Este grupo de enterobacterias da lugar a infecciones de origen nosocomial. Klebsiella pneumoniae. Es el agente etiolgico de aproximadamente el 3% de las neumonas de origen bacteriano. Suele afectar a individuos con diabetes, alcoholismo o infecciones pulmonares. (inmvil) El gnero Enterobacter engloba patgenos oportunistas que producen principalmente infecciones de heridas, quemaduras e infecciones de tracto respiratorio y urinario. Serratia es un gnero formado por especies habitualmente saprofitas del suelo que pueden producir infecciones nosocomiales, principalmente del tracto respiratorio y urinario. ProteusMorganellaProvidencia: Estos gneros se suelen relacionar con infecciones del tracto urinario. La capacidad que tienen para hidrolizar la orina produce la liberacin de amonaco, lo que determina una alcalinizacin de la misma que induce a la formacin de clculos. Por otro lado, la movilidad del gnero Proteus favorece la invasividad del tracto urinario por parte de esta enterobacteria. El gnero Providencia se ha asociado a bacteriemias en pacientes con catteres venosos. Citrobacter: Esta bacteria se engloba dentro del gnero de patgenos oportunistas. Se asocia con infecciones urinarias y respiratorias en pacientes hospitalizados. (mvil). El Citrobacter diversus se asocia en casos de meningitis en neonatos. GNERO I: VIBRIO Son bacilos Gram, anaerobios facultativos, mviles (flagelo polar), Oxidasa+, reducen los nitratos a nitritos, todos los miembros de este gnero son capaces de crecer en medios que contienen sal (haloflicos). El gnero Vibrio est ampliamente distribuido en la naturaleza. Son bacterias acuticas. Ciertas especies de Vibrios producen infecciones localizadas y otras especies pueden dar lugar tambin a infecciones sistmicas. ESTRUCTURA ANTIGNICA Poseen el antgeno flagelar H, que es termolbil y el antgeno somtico O, que es termoestable, de naturaleza polisacrida, especficos y que se utilizan para la serotipificacin.

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Vibrio cholerae 01 Son los que producen las epidemias de clera. Estas cepas epidmicas de V.cholerae se pueden separar segn factores especficos en los serotipos: Ogawa ; Inaba y Hikojima. Adems de estos serotipos, se conocen tambin dos biotipos de V.cholerae 01 que son el Clsico y El Tor. TOXINAS El V.cholerae produce una potente enterotoxina que provoca un aumento de la secrecin de agua y electrolitos a la luz intestinal. El biotipo El Tor de V.cholerae produce hemolisinas que son termolbiles y tienen una actividad citotxica. Otras especies de Vibrios producen toxinas extracelulares con actividad citoltica y citotxica. AISLAMIENTO Transporte de las muestras: Para aquellas muestras que son extraintestinales, el procesamiento de las mismas se realiza de igual manera que para el aislamiento de otras bacterias. Cuando la muestra son heces, y no se van a procesar inmediatamente despus de su recogida, es necesario utilizar un medio de transporte (Ej. CaryBlair) con el fin de evitar la exposicin al aire de la muestra, ya que los Vibrios son muy sensibles a la desecacin. Medios de cultivo: Los Vibrios se desarrollan bien en: Agar sangre: los Vibrios desarrollan colonias con o sin hemlisis, Oxidasa+. Agar MacConkey: dan lugar a colonias incoloras, Lactosa. Cuando se sospecha una infeccin entrica por V.cholerae es necesario incluir una placa de un medio selectivo : Agar TCBS (Triptosa, Citrato, Bilis, Sacarosa). En este medio, los Vibrios que son fermentadores de sacarosa producen colonias amarillas, mientras que los no fermentadores dan lugar a colonias verde azuladas. Cuando es necesario utilizar caldos de enriquecimiento para el aislamiento, a partir de las heces, es conveniente utilizar Agua de Peptona alcalina con un 1% de Cloruro Sdico. IDENTIFICACIN Tincin de Gram: son bacilos Gram, cortos, rectos o curvados. Pruebas bioqumicas: se utilizan los medios habituales para la identificacin de enterobacterias, siempre y cuando estn enriquecidos con Cloruro Sdico. PATOLOGA Vibrio cholerae 01: Es el agente etiolgico del Clera. Tiene 2 biotipos el Clsico y El Tor. El biotipo El Tor causa infecciones menos graves que el biotipo Clsico. La infeccin se adquiere por va oral, 43

se necesita una dosis de m.o alta y, una vez que han superado la mucosa gstrica, los Vibrios se fijan en las clulas epiteliales del intestino delgado donde elaboran la enterotoxina. Los sntomas clnicos son nauseas, vmitos, dolor abdominal y diarrea acuosa. Las deposiciones son continuas, lo que conduce a una prdida masiva de agua y electrolitos. El tratamiento es fundamentalmente sintomtico y consiste en la reposicin de lquidos y electrolitos. Vibrio cholerae NO 01: Tambin producen cuadros de gastroenteritis, aunque ms leves que el clera y, en ocasiones tambin se aslan en infecciones extraintestinales: Vibrio vulnificus: es el ms patognico. Vibrio parahaemolyticus: es junto con el V.cholerae el m.o que con ms frecuencia se asla en clnica. Se asocia con infecciones gastrointestinales por consumo de pescado crudo. EPIDEMIOLOGA Y CONTROL Los factores de riesgo para la adquisicin de infecciones por especies de Vibrios no colricos son el consumo de pescado y mariscos crudos o poco cocinados y el contacto con heridas y mucosas con aguas contaminadas. Por lo que respecta al Clera, la diseminacin del mismo se produce por contacto de persona a persona y por el consumo de alimentos y aguas contaminadas. El control de las infecciones producidas por los Vibrios consiste en la educacin sanitaria y en la mejora de las condiciones higinicosanitarias. GENERO: AEROMONAS Son bacilos Gram, anaerobios facultativos, Oxidasa+, fermentan la Glucosa con o sin produccin de gas, son mviles (flagelo polar), capaces de crecer en un amplio intervalo de temperaturas. Se diferencian de los Vibrios porque no crecen en concentraciones al 6,5% de Cloruro Sdico. Habitan aguas dulces y saladas, sonde infectan a los peces y, en el hombre, se asocian a infecciones gastrointestinales. PATOLOGA Consiste en diarrea aguda (infeccin ms frecuente producida por este tipo de microorganismo que se asocia a la diarrea del viajero). Con menos frecuencia puede dar lugar a celulitis e infecciones de heridas por contacto con agua o tierra contaminada. GNERO : PLESIOMONAS Este gnero comprende una nica especie, P.shigelloides, que produce Catalasa y Oxidasa, fermenta la Glucosa sin produccin de gas, es capaz de crecer en un amplio margen de temperaturas siendo la ptima 37C. Generalmente habita en el intestino de peces de agua dulce y animales. Se asocia con infecciones intestinales en reas tropicales y subtropicales. MEDIOS DE CULTIVO. AISLAMIENTO

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Se desarrollan en agar sangre y tambin en Agar SalmonellaShigella. Se distingue de las Enterobacterias por la prueba de la Oxidasa. Se distingue de las Aeromonas por la prueba de la Dnasa (Aeromonas son +) Se distingue de los Vibrios en que no toleran la sal (Vibrios s). GNERO : ESTAFILOCOCOS Son Cocos Gram+, aerobios y anaerobios facultativos, inmviles, Catalasa +, no esporulados, generalmente no capsulados y se agrupan en racimos u otras formas (parejas, tetradas,...). Resisten a la accin del calor, sales biliares, cloruro sdico 9,5% y a la optoquina. El gnero Sataphylococcus se compone de 27 especies, la mayor parte de las cuales son flora habitual del hombre y se localizan preferentemente en la piel y en las mucosas. De entre las especies de Staphylococcus, las que se asocian con ms frecuencia a infecciones son S. aureus (Coagulasa+), S, epidrmidis (Coagulasa) y S. saprophyticus (Coagulasa). Crecen bien en los medios habituales de laboratorio. Las muestras clnicas en las que se sospecha que pueden contener Staphylococcus se siembran en un medio general como el Agar Sangre y en un medio lquido como el Caldo de Tioglicolato o el Caldo de Infusin de CerebroCorazn. S. aureus Colonias de color amarillo anaranjadas S. epidermidis Colonias blanco grisceas S. saprophyticus Colonias grandes, de aspecto brillante y opacas AISLAMIENTO DE STAPHYLOCOCCUS DE MUESTRAS MUY CONTAMINADAS Como muestras contaminadas se refiere por ejemplo a heces. Se utilizan medios selectivos: Agar Sal y Manitol: S. aureus y saprophyticus acidifican el medio Agar Sal lipasamanitol: S. aureus zona amarilla alrededor de la colonia y una zona opaca por la precipitacin de los lpidos. Agar Columbia Agar AlcoholFeniletlico IDENTIFICACIN Resiste a la Bacitracina: permite diferenciar entre Staphylococcus y Micrococos. Prueba de la Catalasa: permite diferenciar Staphylococcus de Streptococcus. Morfologa de la colonia Fermentacin de Carbohidratos Coagulasa 45

 Hemlisis Resistencia a la Novobiocina Actividad Fosfatasa Desoxirribonucleasa Ureasa Prueba de la Coagulasa S. aureus es capaz de producir una protena llamada Coagulasa que es capaz de aglutinar el plasma en presencia de un factor contenido en el suero. Esta factor reacciona con la coagulasa, activa el fibringeno y produce un cogulo de fibrina. Esta coagulasa se puede encontrar de forma ligada o en forma libre. El estudio de esta actividad coagulasa se puede llevar a cabo en tubo o en portaobjetos: En Portaobjetos: Poner una gota estril de agua destilada o solucin salina fisiolgica sobre el porta. Emulsionar suavemente con una suspensin espesa de Staphylococcus o una colonia tomada con un asa. Mezclar suavemente la suspensin de Staphylococcus con el plasma que podamos tomar con un asa. Observar la inmediata formacin de un precipitado macroscpico. Prueba Positiva Prueba Negativa Acentuada aglutinacin 520 sg No se observan cambios, la Retardada 20 sg1min suspensin permanece homognea Dudosa > 1min En el caso de que la aglutinacin sea dudosa, ser necesario repetirla o realizar la prueba en tubo. En tubo: Poner en un tubo estril de hemlisis 0,5 mL de plasma de conejo y 0,5 mL de un cultivo en caldo o placa. En este ltimo caso se tomar un nmero suficiente de colonias. Incubar en un bao a 37C durante 4 horas. Observar cada 30 min. Prueba Positiva Prueba Negativa Se forma un cogulo o filamentos de fibrina definidas Sin cambios Completa: cogulo en todo el tubo Parcial

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Prueba de la Hemlisis S. aureus halo translcido S. saprophyticus y S. epidermidis No tienen capacidad hemoltica Resistencia a la Novobiocina Solamente S. saprophyticus es resistente. Se utilizan discos Actividad Fosfatasa Algunas especies de S. aureus y S. epidermidis producen la Fosfata Alcalina. Esta enzima acta sobre el Difosfato de Fenolftaleina y los transforma en Fenolftaleina libre. Esta Fenolftaleina libre, al reaccionar con un lcali da lugar a un color rojo rosado brillante. Reactivos: Sal Sdica Difosfato de Fenolftaleina al 0,5% en agua destilada. Debe estar esterilizado por filtro de membrana (0,22 m como dimetro del poro) Medios: Caldo Nutritivo: 3 mL de caldo por tubo. Esterilizar y antes de enfriar aadir una gota de reactivo. Agar Nutritivo Mtodo utilizando el caldo nutritivo: Se inocularn 2 tubos rotulados como A y B con un inculo denso de un cultivo puro y reciente (1824 horas). Incubar a 35C durante 6 horas. Transcurrido este tiempo aadir 1 gota de NaOH 10N al 40% al tubo A. Si no hay viraje, lo desechamos y continuamos la incubacin con el tubo B hasta 24 horas. Mtodo utilizando el agar nutritivo: Esterilizamos el medio, lo dejamos enfriar y le aadimos 2 mL de fenolftaleina al 5% por cada 98 mL de medio. Lo mezclamos y plaqueamos. Sembramos por estra con un inculo poco denso, procedente de un cultivo puro y reciente e incubamos a 37C durante 24 horas. Para proceder con la lectura es necesario exponer las colonias al vapor de amoniaco. Esto se puede hacer de dos formas: Tras la incubacin mantenemos las colonias sobre un frasco abierto Agregar 1 mL de amoniaco a la tapa de la placa de petri donde hemos realizado la siembra e invertimos el cultivo sobre ella.

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Se considerar resultado positivo si aparece un color rojo rosado brillante Se considerar resultado negativo si no se observan cambios. Colonias claras o blancas. Prueba de la Desoxirribonucleasa (DNAasa) Se utiliza el Agar DNAasa. Sembramos con una estra nica de aproximadamente 2 cm de longitud y se incuba a 37C durante 24 horas. Despus de incubar aadimos, inundando la placa, ClH 0,1 N que reacciona con el DNA presente apareciendo una zona turbia. A los 5 minutos realizamos la lectura de los resultados: Se considera prueba positiva si aparece una zona clara alrededor de la lnea de siembra. Se considera prueba negativa si aparece turbidez en toda la superficie del medio de cultivo. En ocasiones este medio lleva indicadores que nos indican si el m.o posee la DNAasa sin necesidad de aadir el HCl. Estos indicadores pueden ser: Verde de Metilo: prueba positiva halo claro / prueba negativa verde intenso Azul de Toluidina: prueba positiva halo rosa / prueba negativa halo azul (se puede aadir sobre el propio crecimiento) Prueba de la Ureasa Pruebas que ponen de manifiesto la produccin de cido por fermentacin de carbohidratos Utilizacin de Sistemas Comerciales de identificacin: basados en pruebas bioqumicas, enzimticas...(Ej. API) ESTRUCTURA ANTIGNICA Puesto que Staphylococcus es una bacteria Gram+ tiene una estructura antignica compleja y muy variada: Peptidoglucano: es un polisacrido constituido por Nacetil murmico y Nacetil glucosamina. El peptidoglucano induce a la produccin de Interleuquina I (*) y de Ac opsonizantes (*), adems proporciona una actividad endotxica. cidos Teitoicos Protena A: se une a la regin Fc (*) de la IgG y activa el complemento (*) Factor de aglutinacin: coagulasa unida (fijada) fija fibringeno Polisacrido: S. aureus cpsula polisacrida que inhibe la fagocitosis S. epidermidis exopolisacrido (Slime) que permite la adherencia a superficies plsticas, adems de contribuir a la resistencia a la fagocitosis por los polimorfonucleares.

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ENZIMAS Coagulasa, Hialuronidasa, Lactamasas, Nucleasas, Lipasas TOXINAS Alfa toxina: acta sobre la membrana de los eritrocitos Beta toxinas: degrada enfingomielina (*) Gamma toxina: lisa eritrocitos Delta toxina: ejerce una accin detergente sobre membranas biolgicas Toxina esfoliativa: produce daos dermatolgicos (Sndrome piel escaldada) Toxinas implicadas en el Sndrome del Shock Sptico Enterotoxinas: termoestable, resiste la accin de las enzimas del tubo digestivo. Se producen cuando los Staphylococcus crecen en alimentos ricos en carbohidratos y protenas. PATOGENIA S. aureus: 240% son portadores nasales y un 10% son mujeres (vagina) Infecciones de la piel: fornculos, ntrax, celulitis, imptigo... Bacteriemias, endocarditis, meningitis, neumona, osteomielitis... Sndrome del Shock Txico (fiebre, hipotensin, afectacin multisistmica) Intoxicaciones alimentarias S. coagulasa negativos: S. epidermidis: bacteriemia, endocarditis infecciosa, peritonitis, osteomielitis, infeccin del tracto urinario, infeccin de catteres y prtesis... S. saprophyticus: infecciones del tracto urinario S. haemolyticus; S. lugdunensis; S. schleiferi oportunistas (*)Complemento: es un conjunto de 20 protenas que dan lugar a un sistema enzimtico en cascada en el plasma. Sus funciones son las siguientes: Opsonizacin Quimiotaxis Aumento del flujo sanguneo y permeabilidad capilar en infeccin (inflamacin) Lisis celular, bacterias y hongos El complemento se puede activar por dos vas: Va Clsica: activada por la unin del Ag al Ac. Esta unin activa los siguientes escalones C1, C2...hasta 49

llegar al C3. Va Alternativa: activada por los polisacridos cuando la infeccin es producida por bacterias Gram+. Igual que la anterior finaliza en el C3. A partir de la Fraccin C3 se produce la activacin de la C3a y C3b. C3a va activando consecutivamente otras fracciones dando lugar a la inflamacin. Por su parte, C3b da lugar a la opsonizacin, relacionada con la quimiotaxis. (*) Estructura de las Ig: (*) Opsonizacin: Es el proceso por el cual las bacterias se hacen atractivas a los fagocitos. El germen se une a la IgG y C3b (protenas plasmticas) y de esta forma el microorganismo se hace ms fcilmente reconocible por los fagocitos (se modifica la estructura fisiolgica de la bacteria). (*) Linfoquinas: son protenas liberadas por los linfocitos TD. Factor quimiotctico Factor inhibidor de la migracin de los macrfagos Factor activador de macrfagos Interleuquina I: promueve la activacin y multiplicacin de los linfocitos B y T. El Ag estimula a la clula presentadora de Ag y sta secreta Interleuquina I que activa los linfocitos T (fabrican la Interleuquina II) Interleuquina II Interferol (*) Esfingomielina: La esfingomielina est constituida por esfingosina (forma parte de los cerebrsidos), cido fosfrico, cidos grasos, colina (transporte de grasas) y se localiza en grandes cantidades en el cerebro y en el tejido nervioso. Es degradada por las toxinas de los Estafilococos. GNERO : STREPTOCOCCUS Los Estreptococos son cocos Gram+ (en cultivos viejos pueden perder su carcter Gram+), inmviles, Oxidasa y Catalasa que se observan al microscopio en parejas o en cadenas de diferente longitud. Las clulas aisladas tienen forma esfrica u ovoide. Cuando se presentan en parejas pueden tener aspecto de bacilo. Son m.o anaerobios facultativos, aunque hay cepas que crecen mejor en condiciones microaeroflicas. Las pruebas de la Catalasa y de la Oxidasa les diferencian de los cocos Gram de gnero Neisseria que son positivos para estas pruebas. Los Estreptococos son m.o que estn ampliamente distribuidos en la naturaleza, algunos de ellos son flora habitual del hombre y otros se asocian a infecciones bien por accin directa o por fenmenos de sensibilizacin. La clasificacin de los Estreptococos resulta compleja por lo cual se recurre a una combinacin de factores morfolgicos, bioqumicos y serolgicos. ESTRUCTURA ANTIGNICA Ag de la pared: es especfico de grupo y se denomina carbohidrato C. Est localizado en la pared 50

celular lo que permite clasificarlos serolgicamente en los llamados grupos de Lancefield. Protena M: se trata de un Ag proteico que se encuentra en la pared celular y constituye el principal factor de virulencia del Strept. pyogenes que es un Estreptococo perteneciente al grupo A. Esta protena se encuentra en unas proyecciones similares a las fimbrias que sobresalen de la pared celular. Su presencia o ausencia condiciona la virulencia de la cepa. En el caso de que en el husped no existan Ac frente a esta protena, las cepas de S. pyogenes con dicha protena son capaces de resistir la accin fagoctica de los leucocitos. Adems, esta protena tambin est implicada en los procesos de adherencia a clulas epiteliales. Otros Ag: Protena T y R: se encuentran en la pared celular. Nucleoprotenas Cpsula polisacrida (S. pneumoniae) TOXINAS Y ENZIMAS Streptocinasa o Fibrinolisina: la poseen los Strept. hemolticos del grupo A Streptodornasa o Desoxirribonucleasa Estreptococica. Hialuronidasa Toxina eritrognica: produce lesiones cutneas propias de la escarlatina. Hemolisina: hemlisiscompleta / hemlisisincompleta Estreptolisina (S. pyogenes): tipo 0 / Tipo S AISLAMIENTO Medios Generales que contengan sangre o derivados: Agar Columbia Agar Tripticasa Soja con un 5% de sangre de carnero Agar Chocolate Medios de Enriquecimiento Caldo Tripticasa Soja Caldo ToddHewit Medios Selectivos Agar Columbia suplementado con ColistinaNalidxico Agar feniletlico Medios Selectivos de Enriquecimiento 1 Medio de ToddHewit modificado. Posee Azida Sdica (inhibe la presencia de Gram) y Cristal Violeta 51

(inhibe los posibles Stafilococcus de la muestra). IDENTIFICACIN: Pruebas Bioqumicas Sensibilidad a la bacitrocina (Streptococcus del grupo A) VP Hidrlisis del Hipurato: pone de manifiesto si el Estreptococo tiene una enzima que acta sobre el Hipurato que es la hipurinasa. Se revela con un reactivo. Esta prueba sirve para Strep. del grupo B, cepas del grupo D y algunos hemolticos. Tolerancia a la sal: diferenciamos a los Enterococos de los hemolticos A, C, F, G y del S. viridans porque los Enterococos toleran la sal (alto contenido salino: 6,5). Prueba de la Bilis Esculina: los Strept. del grupo D hidrolizan la esculina en presencia de bilis dando como productos esculetina y glucosa. El medio que se usa es el Medio Bilis Esculina que es slido y se deja enfriar inclinado. La siembra se realiza a partir de un caldo, depositando dos gotas con una pipeta o un asa. La incubacin se hace a 3537C durante 4872 horas. Si la prueba resulta positiva se observa un color negro en la mitad o ms de la superficie. Si la prueba resulta negativa no hay ennegrecimiento o aparece en menos de la mitad del medio. Solubilidad en Bilis: esta prueba se usa para diferenciar neumococos de otros Strept. del grupo viridans. La bilis lisa las clulas de S. pneumoniae y, por el contrario, no es capaz de solubilizar las clulas de otros Strept. de ese grupo viridans. Sensibilidad a la Optoquina: esta prueba nos permite diferenciar entre neumococos, que son sensibles a la optoquina, y Strept. hemolticos, que son resistentes. Se realiza de forma similar a la de la bacitrocina. Utilizacin de Carbohidratos. Prueba de CAMP: sembramos en una placa de Agar Sangre estreptococos de forma perpendicular y sin tocarse a una siembra de S. aureus. Si el m.o se trata de un Strept. del grupo B se producir una sustancia llamada CAMP que en presencia de los Estafilococos producen una zona de lisis en forma de punta, agrandando la zona de hemlisis. Ejercicio: Hacemos un urocultivo. Sembramos un agar sangre y un agar MacConkey. Las posibles opciones son las siguientes: No hay colonias Agar sangre Crecen colonias iguales Crecen colonias distintas Agar MacConkey Crecimiento No crecimiento 52

PATOLOGA Ag especfico de grupo (c): nos permite la clasificacin de los Estreptococos hemolticos. Es un carbohidrato. Protena M: la posee el S. pyogenes el grupo A Hemolticos (S. pyogenes del grupo A) Las infecciones producidas por S. pyogenes se pueden clasificar en tres grandes grupos: Enfermedades por invasin de tejidos: Erisipela: inflamacin aguda de la piel con afectacin de los vasos linfticos cutneos que cursa con fiebre elevada y escalofros. El rea afectada suele ser la cara y, en ocasiones, el tronco y las extremidades. Fiebre puerperal y sepsis: comienza como una infeccin del tero como consecuencia de un parto o de un aborto y puede evolucionar desde la infeccin uterina hasta una peritonitis produciendo en algunos casos cuadros de septicemia. Enfermedades por infeccin localizada producida por S. pyogenes y sus productos: Faringitis: aparece inflamacin, fiebre, afectacin de los ganglios linfticos del cuello. Se da un elevado porcentaje de portadores asintomticos. El tratamiento es importante para prevenir posibles complicaciones como la fiebre reumtica y la glomerulonefritis. Fiebre Escarlatina: se produce en aquellos casos en los que las cepas de S. pyogenes producen una toxina eritrognica que afecta a pacientes que no estn inmunizados. Se caracteriza por inflamacin de tejidos que pueden llegar a formar abscesos localizados generalmente en las anginas y que pueden llegar a bloquear el paso del aire. Se observa tambin un exantema de color rosado que se acompaa de fiebre. Pioderma (imptigo): vesculas rellenas de un lquido purulento son estafilococos en su interior. Los Estreptococos tambin pueden producir un imptigo similar al producido por Estafilococo. Endocarditis; Meningitis; Otitis y Neumonas. 3 . Enfermedades por hipersensibilidad tras infeccin estreptoccica no supurativas: Fiebre reumtica: es una complicacin de tipo autoinmune que generalmente se expresa en forma de artritis, aunque tambin puede producir afectacin cardiaca originando lesiones en las vlvulas del corazn. El elemento desencadenante suele ser una faringitis estreptoccica donde los sntomas aparecen de 1 a 5 semanas despus de que la infeccin original haya desaparecido. Los mecanismos por los cuales se produce esta fiebre reumtica son: Los Ag bacterianos que se depositan en las articulaciones y el corazn y cuando el organismo produce Ac contra ellos se originan complejos que podran ser el origen de la lesin. Los Ag estreptoccicos dan una reaccin cruzada con componentes del msculo cardiaco que induce a la produccin de Ac que posteriormente lesionarn el corazn. Glomerulonefritis: est originada por cepas de Estreptococos que tienen especial afinidad por el rin. NOTA: En las enfermedades postestreptoccicas no supurativas el Estreptococo no se encuentra en la lesin sino que sta se origina por unos complejos como consecuencia de la interaccin AgAc (reacciones de 53

hipersensibilidad). Streptococcus agalactiae B ( hemoltico) Es el agente etiolgico ms frecuente de sepsis y meningitis neonatal. Tambin puede producir osteomielitis, infeccin del tracto urinario, endocarditis y neumonas. Streptococcus de los grupos C y G Son habituales en la garganta, tracto gastrointestinal y vagina. Pueden producir faringitis y bacteriemia. Streptococcus bovis del grupo D: Produce endocarditis y bacteriemias Streptococcus anginosus: produce abscesos y otras infecciones purulentas Streptococcus pneumoniae; forma parte de la flora normal de la nasoorofaringe y produce neumona bacteriana extrahospitalaria; otitis, sinusitis y peritonitis y es el segundo agente etiolgico productor de la meningitis bacteriana. Streptococcus del grupo viridans: forma parte del tracto gastrointestinal y respiratorio. Da lugar a infecciones como m.o oportunista. De este grupo los ms importantes son S. mutans y S. sanguis I y II GENERO : ENTEROCOCOS Son flora normal fecal del hombre y animales. Tambin pueden localizarse en la cavidad oral y en la vagina. Las especies que se aslan con ms frecuencia son: E. faecalis y E. faecium. GENERO : BACILLUS CEREUS Es un m.o capaz de producir toxoinfecciones alimentarias que estn motivadas por la produccin de una enterotoxina. El diagnstico se suele hacer mediante el aislamiento del germen a partir de los alimentos sospechosos de estar contaminados o bien a partir de las heces de los pacientes. En ocasiones, B. cereus, puede comportarse como un patgeno oportunista en pacientes inmunodeprimidos. BACILOS GRAM+ ESPORULADOS. CLOSTRIDIUM Generalmente se suelen encontrar tanto en el suelo como en el intestino del hombre y los animales. Aunque se les define como Gram+, en los cultivos de ms de 48 horas pueden aparecer como Gram. Una de las caractersticas que presenta este gnero es la formacin de esporas, aunque se producen de manera diferente dependiendo de la especie de Clostridium. Patogenicidad Depende de la liberacin de exotoxinas y de la produccin de enzimas con un alto poder destructivo. Clostridium puede dar lugar a diferentes cuadros clnicos: Intoxicacin alimentaria: Producida por Clostridium perfringens. Es el cuadro clnico ms frecuente. Consiste en la aparicin de diarrea y dolor abdominal tras la ingesta de alimentos contaminados, generalmente carne. Las enterotoxinas que produce este tipo de Clostridium son las responsables de la infeccin. Estas toxinas se liberan a partir de las esporas del m.o cuando el alimento permanece a 54

temperatura ambiente despus de haber sido conocido. La unin de la enterotoxina a las clulas epiteliales del intestino altera el equilibrio osmtico y provoca la diarrea. El diagnstico de laboratorio se realiza mediante la deteccin de C. perfringens en el alimento o bien en las heces de los pacientes. Tambin se puede hacer la deteccin directa de la toxina en las muestras fecales. Enteriditis necrotizante: Es otro de los cuadros producido por C. perfringens, en este caso del tipo C. Este Clostridium produce una toxina necrotizante que da lugar a una necrosis del tejido intestinal y a una diarrea sanguinolenta que se acompaa de vmitos y dolor abdominal. El diagnstico es fundamentalmente clnico ya que, el hecho de aislar o cultivar el m.o, no indica necesariamente que haya infeccin. Gangrena gaseosa: El agente causal que se asla con ms frecuencia es Clostridium perfringens y la infeccin se produce a partir de heridas traumticas o quirrgicas contaminadas por el m.o. Consiste en una necrosis muscular y signos de toxicidad sistmica debido a la produccin de toxinas citotxicas. El diagnstico se realiza basndose en las manifestaciones clnicas y por la observacin en la tincin de Gram de bacilos Gram+ de gran tamao y con los extremos cuadrados, a partir de muestras obtenidas de los tejidos afectados. Botulismo: Producido por Clostridium botulinum.. Este Clostridium es capaz de producir una serie de neurotoxinas que son las responsables de la enfermedad. Se reconocen 4 formas clnicas producidas por C. botulinum: Intoxicacin alimentaria: es la forma ms frecuente. Se produce tras la ingestin de alimentos contaminados, generalmente conservas vegetales. La gravedad de la enfermedad va a depender de la cantidad de toxina ingerida. Se manifiesta por una serie de sntomas neurolgicos que afectan a la visin, hay afona, ... Botulismo de las heridas Botulismo del lactante Forma indeterminada: se manifiesta generalmente en nios menores de un ao y en ellos no se encuentra la fuente de infeccin. El diagnstico del botulismo es fundamentalmente clnico, aunque se puede demostrar la presencia de la toxina en sangre y del m.o en heridas, tejidos afectados, alimentos, etc. tanos: Se produce por la potente accin de una neurotoxina elaborada por Clostridium tetani. La enfermedad consiste en una parlisis generalizada debido al bloqueo por la toxina de las uniones musculares de las neuronas motoras. El diagnstico es fundamentalmente clnico. Colitis pseudomembranosa: Producida por las toxinas de tipo A y B que produce el Clostridium difficile. Esta colitis se trata de un cuadro de diarrea tras un tratamiento con antibiticos de amplio espectro que altera la flora intestinal y permiten la multiplicacin del m.o. En el laboratorio el mtodo ms especfico es la deteccin directa de la toxina en las heces del paciente. ANTIBIOGRAMA PRUEVA DE SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA POR EL MTODO DE DISCO DIFUSIN 55

GENERALIDADES OBJETIVO Describir los procedimientos para la determinacin de la susceptibilidad antimicrobiana mediante el Mtodo de disco difusin (KiMb Bauer) CAMPO DE APLICACIN Comprende la determinacin de la susceptibilidad antibitica mediante el mtodo de disco difusin (Kim Bauer) e interpretacin de los resultados, de las bacterias que a continuacin se sealan 1. Staphylococcus spp 2. Enterococcus spp 3. Pseudomonas aeruginosa 4. Acinetobacter spp 5. Enterobacterias 6. Streptococcus pneumoniae 7. Streptococcus spp 8. Haemophilus spp 9. Vibrio cholerae

Equipos 1. Potenciometro pH metros 2. Incubadoras 3. Refrigeradores 4. Autoclave 5. Cabinas de bioseguridad 6.Bao mara 7.Espectrofotmetro o Fotocolormetro 8 Vortex (digitador para tubos

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Materiales 1. Vernier o Regla 2. Termmetros 3. Pinza punta plana 4. Placas petri 5. Erlenmeyer 6. Hisopos de Algodn 7. Tubos con Tapa Rosca 8. Pipetas

MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS Medios de cultivo y reactivos necesarios para la prueba

1. Agar Mueller Hinton 2. Caldo Mueller Hinton 3. Agar Mueller Hinton con 5% de sangre de carnero 5. Discos de sensibilidad antibitica 6. Cloruro de sodio al 0.85% 7. cido Sulfrico (H2SO4)

Haemophilus test medium (HTM) PREPARACIN DEL AGAR MUELLER HINTON 1. Preparar el medio a partir de la base deshidratada de acuerdo a las indicaciones del fabricante. 2. Autoclavar y dejar enfriar en bao de agua hasta que alcance los 45C 50C. 3. Una vez esterilizado y solidificado, medir el pH del agar . El valor del mismo debe encontrarse entre 7,2 y 57

7,4 a temperatura ambiente. Esta medicin puede realizarse: a. Utilizando un electrodo de superficie b. Macerando el medio en agua destilada y utilizando un electrodo de inmersin c. Solidificando el agar con el electrodo del potenciometro 4. Repartir el medio en placas petri (60 ml 70 ml o 25 ml 30 ml, para placas de 150 mm o 100 mm de dimetro interno respectivamente), de manera que el grosor del agar en la placa sea de 4 mm. 5. Realizar las pruebas de esterilidad para cada lote de Mueller Hinton, incubando una o dos placas de cada lote a 30C 35C durante 24 horas o ms. Estas placas utilizadas deben ser, luego, descartadas. PREPARACION DEL INOCULO Mtodo directo de inoculacin a partir de colonias aisladas a. De una placa de cultivo con agar no selectivo e incubada por 18 24 h, seleccionar colonias aisladas en numero de 4 a 5 colonias similares b. transferir estas colonias (obtenidas con una asa de kolle por contacto por la parte convexa o superior de las colonias ) colocarlas en un tubo conteniendo cerca de 5 ml de solucin salina caldo adecuado c. La suspensin debe ser inmediatamente ajustada a la escala 0,5 de Mc. Farland. INOCULACIN DE LAS PLACAS 1. Dentro de los 15 minutos siguientes al ajuste de la turbidez del inculo, sumergir un hisopo estril en la suspensin, rotar el hisopo varias veces presionando firmemente sobre la pared interior del tubo por encima del nivel del lquido para remover el exceso de inculo. 2. Inocular la superficie seca de la placa de Mueller Hinton, estriando con el hisopo en tres direcciones para asegurar una distribucin uniforme del inculo (Figura 1). Antes de colocar los discos dejar Secar la placa a temperatura ambiente durante 3 a 5 minutos para que cualquier exceso de humedad superficial sea absorbido. APLICACIN DE LOS DISCOS 1. Colocar los discos individuales o multidiscos sobre la superficie del agar con la ayuda de una pinza estril o la punta de una aguja presionando suavemente sobre cada disco para asegurar un contacto completo con la superficie del agar. 2. Distribuir los discos uniformemente, de modo que estn a una distancia mnima de 25 mm uno del otro (el dimetro de los discos segn las normas de la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) debe ser de 6 mm). No deben colocarse ms de 12 discos en una placa de 150 mm, ni ms de 6 en una placa de 100 mm de dimetro interno, para evitar la superposicin de las zonas de inhibicin. Un disco no debe ser removido una vez que tom contacto con la superficie del agar debido a que algunos antibiticos se difunden rpidamente. INCUBACIN 1. Incubar lar placas en posicin invertida a 35C dentro de los 15 minutos posteriores a la aplicacin de los discos. 58

2. Las placas de Haemophilus spp y Streptococcus spp, deben ser incubadas en atmsfera del 5% de CO2. 3. Despus del tiempo recomendado de incubacin (18524 horas a 37c ) examinar cada placa y medir los dimetro de los halos de inhibicin alrededor de cada disco. En los casos de Staphylococcus spp y Enterococcus spp el tiempo de incubacin debe prolongarse por 24 horas para una mejor deteccin de la resistencia a Oxacilina y Vancomicina, respectivamente. LECTURA DE LAS PLACAS E INTERPRETACIN DE LOS RESULTADO 1. Medir los dimetros de las zonas de inhibicin completa (incluyendo el dimetro del disco), usando una regla o calibrador. Se debe mantener iluminada la parte posterior de la placa petri con una luz reflejada localizada a unos cuantos centmetros sobre un fondo negro. Tener la precaucin de observarla placa siguiendo una vertical directa para evitar una lectura errnea de las marcas de la regla por efecto de paralelismo. En los medios suplementados con sangre, las zonas son medidas en la parte superior de la superficie del agar y retirando la tapa. Tener cuidado de no medir la zona de la hemlisis sino la de inhibicin del crecimiento. 2. Para Staphylococcus spp o Enterococcus spp, usar luz transmitida, manteniendo la placa arriba de la luz para examinar un posible ligero crecimiento de cepas resistentes a Oxacilina/ Meticilina o Vancomicina dentro de los halos aparentes de inhibicin. Cualquier desarrollo dentro de la zona de inhibicin es indicativo de resistencia a Meticilina (Oxacilina) o Vancomicina. 3. El punto final debe tomarse como el rea que no muestra un crecimiento obvio, visible, que puede ser detectado mediante observacin visual, no incluyendo velo de crecimiento o colonias muy pequeas que puedan ser detectadas solo con mucha dificultad en el borde de la zona. Sin embargo las colonias mayores creciendo dentro de la zona clara debern ser subcultivadas, reidentificadas y reensayadas. Algunos Proteus spp, debido a su gran movilidad, pueden presentar un velo de invasino swarming dentro de las zonas de inhibicin de algunos antibiticos. En estos casos el velo del swarming debe ser ignorado al momento de medir los halos de inhibicin. 4. Cuando se prueban discos de Cotrimoxazol puede arrastrarse sustancias antagnicas que producen un crecimiento con aspecto de niebla dentro de la zona del halo de inhibicin, en estos casos no considerar en la lectura un crecimiento del 20% o menos del desarrollo total. 5. Los dimetros de inhibicin son interpretados basndose en las Tablas N 1 al 9. La sensibilidad de la cepa bacteriana ser reportada como sensible (S), intermedio (I), o resistente (R). INTERPRETACION DEL ANTIBIOGRAMA PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO 2. MEDIOS DE TRANSPORTE INTRODUCCION La correcta recoleccin de una muestra para su cultivo es posiblemente la etapa mas importante en el aislamiento de microorganismos responsables de enfermedades infecciosas : sin embargo, los especimenes bacteriolgicos recolectados en hospitales u obtenidos en condiciones ordinarias estn sujetos con frecuencia a considerables demoras antes de que puedan ser inoculados en los medios de cultivo adecuados. En un medio hospitalario se recomienda un lmite de 2 horas entre la recoleccin de las muestras y su procesamiento en el laboratorio bacteriolgico. 59

En otras circunstancias el tiempo es mayor y el espcimen puede Acercarse causando la muerte de los microorganismos patgenos o puede permitir que organismos contaminantes como ndice de reproduccin mas rpido, cubran el desarrollo de los microorganismos cuando se produce una demora importante entre la recoleccin y el cultivo definido. Los medios de transporte mas frecuentemente utilizados son: Cary y blair Stuart Base de glicerina solucin fisiolgica amortiguada Ames Principios y usos a) MEDIOS DE TRANSPORTE SEGN CARY Y BLAIR Presentado por cary S.G y blair E.B Contiene fosfato disodico como estabilizador de ph, tioglicolato de sodio como agente reductor para mejorar la recuperacin de bacterias anaerobias la pequea cantidad de agar y el cloruro de calcio proveen una consistencia semislida para impedir la oxigenacion y derramamiento durante el transporte. Usado para recuperar salmonellas, sguelas, hasta 22 das y yersinia hasta ms de 1 mes de muestras fecales. Nota: una vez depositada la muestra no guardar en la incubadora o refrigeradora, mantener a temperatura ambiente. b) MEDIOS DE TRANSPORTE SEGN STUART Stuart R.D.torach S.R y patrulla T.M. propusieron un medio que resulta eficaz en la preservacin de la viabilidad de agentes patgenos de materiales clnicos impidiendo la deshidratacin de secreciones como la oxidacin y autodestruccin enzimatica de los grmenes presentes. La formula del medio consta de una solucin buffer con exclusin de hidratos de carbono, peptona y otros nutrientes. El tioglicolato de sodio de aade como agente reductor y el agar con el cloruro de calcio provee la consistencia slido. c) MEDIOS DE TRANSPORTE BASE GLICERINA SOLUCION FISIOLOGICA AMORTIGUADA Descrita por taegue y clurman y modificada por sachs. Contiene sustancias estabilizadoras de ph, sin wmbargo el glicerofosfato permite la multiplicacin de microorganismos que pueden producir cierta acidez . toxico para los grmenes patgenos que se evidencia prontamente gracias al viraje del indicador rojo de fenol que lleva el medio en su composicin. Usado para el transporte de especimenes fecales, aislamiento de microorganismos entericos. Nota: las muestras deben ser enviadas directamente al laboratorio bacteriolgico. Composicin y preparacin Medios De Transporte De Cary Y Blair 60

Composicin Fosfato Disodico 1.1g. Cloruro De Sodio . 5.0g Tioglicolato De Sodio 1.5g. Agar 5.0g. Agua Destilada 991.0 Ml. Cloruro De Calcio (1%) 9.0 Ml. Solucin Acuosa pH 8.4 Preparacin agregar los componentes excepto el cloruro de calcio a un frasco qumicamente llimpio. calentra agitando frecuentemente hasta que la solucin se muestre limpia (clarifique) dejar enfriar hasta 50C. Agregar 9 ml. De solucin acuosa de cloruro de calcio al 1% ajustar el pH a 8.4 Distribuir 7 ml. En tubos de 13 x 100 mm. Previamente enjuagados y esterilizados. Calentar a vapor fluente 100C por 15 minutos. El medio de transporte a un pH 8.4 es usado para el aislamiento de vidrio cholerae a partir de muestras de heces (hisopado rectal) Si se debe usar para entero bacterias llevar a ph 7.0 = 0.2 B) Medio De Transporte Segn Stuart Composicin Cloruro de sodio 3.0g. Cloruro de potasio 0.2g. Hidrofosfato Disodico Anhidro 1.15g. Fosfato Sodico Y Dihidrogeno Anhidro. 0.2g. Thioglicolato De Sodio 1.0g. Agar 4.0g. Agua Destilada Csp . 1000 Ml. Cloruro De Calcio (1%) . 10 Ml. Solucin Acuosa Recin Preparada Cloruro De Magnesio (1%) Solucin Acuosa Recin Preparada 10 Ml. Carbn Neutro . 10.0g. pH 7.3 Preparacin Agregar el agar con el agua destilada y calentar hasta su competa disolucin. Agregar el resto de los componentes slidos excepto el carbn neutro 61

 retirar del calor Aada el cloruro de calcio y el cloruro de magnesio medir el ph. Agregar el carbn neutro. Distribuir en tubos con tapa rosca de 13 x 100 mm. En volmenes de 5 a 6 ml. Agitando frecuentemente para mantener la suspensin del carbon. Esterilizar a 121 C por 20 minutos Antes de que se solidifique, invertir los tubos para distribuir el carbon de manera uniforme. Guardar en refrigerador. C) Medio De Transporte Base Glicerina Solucin Fisiolgica Amortiguada Composicin Cloruro de sodio .. 4.2g. Bihidrofosfato potasico anhidro 1.0g Fosfato de potasio y dihidrogeno anhidro 3.1g Rojo de fenol . 0.003g. Agua destilada .. 700.0 ml. Glicerol .. 300.0 ml. pH 7.2 Preparacin Calentar todos los ingredientes excepto el rojo de fenol y el glicerol Agregar el indicador rojo de fenol y homogenizar uniformemente Agregar el glicerol medir el ph 7.2 Distribuir 7 ml. En tubos rosca de 13 x 100 mm. Y esterilizar a 116C por 10 minutos. Si el medio se encuentra amarillo antes de su uso es por que esta contaminado. MEDIOS DE CULTIVO DE ENRIQUECIMIENTO Y TRANSPORTE 1. CALDOS DE ENRIQUECIMIENTO INTRODUCCION Los caldos de enriquecimiento se usan para acrecentar el desarrollo de ciertas especies bacterianas . Inhibiendo o retardando el crecimiento de los microorganismos superfluos. Son utilizados con frecuencia para el aislamiento de salmonella, siguella, vibrio cholerae de muestras fecales y tambin de otros materiales contaminados como aguas residuales. Los caldos de enriquecimiento actan sobre la base del principio de que la flora enterica normal es mantenida en la fase de retardo del desarrollo , mientras que las especies de shiguella y salmmonella son desinhibidas y entran en una fase logartmica normal de crecimiento . 62

As en materiales fecales de portadores de salmonella donde la echerichia coli se encuentra 109/g. se puede recatar salmonellas cuyo numero de microorganismos pueden ser tan solo 200/gramo de heces. Toda muestra recolectada deber ser procesada dentro de un periodo limite de 2 horas, en los casos que las muestras no puedan ser sembradas o remitidas al laboratorio en este tiempo se requiere de un medio de transporte. PRINCIPIOS Y USOS A) Caldo Selenito El selenito de sodio retarda el desarrollo de echerichia coli y de otros coniformes, incluyendo muchas cepas de shiguella. Se recomienda para el aislamiento de salmonella de muestras de heces, orina o aguas residuales con abundantes concentracin de bacterias mixtas. Incubacin aproximada hasta 24 horas a 37C resiembra en medios de cultivo selectivo. B) Caldo Tetraionato El tetraionto es sintetizado a partir de tiosulfato en el momento que se aade el yodo. El ttetraionato junto con el tiosulfato excedente inhibe a coniformes y otras bacterias acompaantes. En cambio todas las bacterias reductoras de tetraionato como salmonella y proteus pueden multiplicarse mas o menos sin obstculo . el cido proveniente de la reduccin del tetraionato es neutralizado por el carbonato calcico. Las sales biliares inhiben a todos los microorganismos que no necesariamente viven en el intestino. La adicin de verde brillante (0.01 0/00) sirve para inhibir la flora gram positiva. Incubacin aproximada de 18 24 horas a 37C Resiembra en medio de cultivo selectivo. C) Caldo Gram Negativo (Gn) La triptosa sirve como base nutritiva ,el citrato y el desoxicolato actan inhibiendo el crecimiento de microorganismos gram positivos, el manitol favorece el crecimiento de salmonella y shiguella. El caldo GN es menos inhibidor del desarrollo de cepas mas exigente de shiguella . Incubacin aproximada entre 6 horas a temperatura ambiente. Resembrar. D) Agua Peptonada Alcalina (Apw) La peptona de carne sirve de fuente nutritiva y el ph alcalino inhibe o retarda el desarrollo de enterobacterias . Se recomienda para el aislamiento de especies de vibrio de muestras fecales de aguas residuales u otros alimentos con abundancia en concentracin de bacterias mixtas. Incubacin aproximada de 4 6 horas a 37C resiembra de la superficie del medio en agar TCBS. 63

E) Caldo De Enriquecimiento Para Estreptococos Es utilizado para el enriquecimiento selectivo de estreptococos a partir de diversos materiales objeto de investigacin . La azida y el sulfito inhiben la flora gram negativa acompaante, los grmenes grampositivos ya son considerablemente inhibidos por la pequea concentracin de cristal violeta , en tanto que los estreptococos no resultan aun perjudicados por este motivo. Composicin y Preparacin a) Caldo selenito composicin Peptona . 5.0 g Lactosa . 4.0 g. selenito de sodio . 4.0 g. fosfato de sodio . 10.0 g. agua destilada CSP. 1000.0g. ph 7.0 = 0.1 Preparacin Pesar 33g.para 1000 ml. De agua destilada Disolver al calor suave a 60C. Repartir en tubos estriles aproximadamente 10 15 ml. No se esteriliza en autoclave , el caldo preparado es claro y ligeramente amarillo o rojizo , si se presenta un sedimento de color rojo ladrillo de selenio precipitado , el medio de cultivo no es utilizable. Si se quiere almacenar debe de esterilizarse por filtracin, conservar en el refrigerador cubierto y no expuesto a la luz. B) Caldo Tetraionato composicin Proteosa peptona . 5.0g. Sales biliares . 1.0g. Carbonato de calcio . 10.0 g. Tiosulfato de sodio . 30.0g. Agua destilada . 1000.0 ml. Ph 7.0 = 0.1 Procedimiento 64

 Pesar 46g.para 1000 ml. De agua destilada esteril.no calentar el medio. Repartir en tubos estriles 10 ml. Aproximadamente y dejar en reposo unos das antes de su uso. No esterilizar en autoclave Antes de su empleo agregar 0.2 ml. De solucin yodada (6g. de cristales de yodo) mas 5g. de yoduro de potasio en 20 ml. De agua destilada) en cada tubo. El caldo as preparado debe ser usado el mismo dia. C).Caldo Gram. Negativo (GN) Composicin Triptosa 20.0g. Glucosa 1.0 g. Manitol 2.0g Fosfato dipotasico . 1.5g. Cloruro sodico . 5.0g. Citrato sodico . 5.0g. Desoxicolato sodico . 0.5 Agua destilada .1000.0ml. ph 7.0 = 0.2 preparacin Pesar 39 g. para 1000 ml. De agua destilada Disolver al calor Distribuya aproximadamente 10 ml. En cada tubo a 60C. El caldo distribuido es claro y amarillento. Autoclavar a 116C x 15 minutos. D) Agua Peptona Alcalina (APW) Composicin Peptona de carne 10.0g. Cloruro de sodio 10.0g. Agua destilada csp 980 ml. Ph 8.8 = 0.1 Preparacin Disolver los componentes en agua destilada a 60C. Distribuir en tubos aproximadamente 57ml. autoclavar A 121C X15 minutos el APW eees liogeramente amarillo. Para muestras de aguas residuales preparar APW 10 veces concentrado.

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E) Caldo De Enriquecimiento De Estreptococos Composicin Peptona De Caseina . 14.4g. Peptona De Harina De Soja . 5.0g. Clna 4.0g. Glucosa 5.0g Citratop De Sodico 1.0g. Cisterna 0.2g. Sulfito Sodicpo 0.2g. Azida Sindica . 0.2g. Violeta Cristal 0.0002g. Preparacin Disolver los ingredientes a 1000 ml. De agua destilada, distribuir en tubos y esterilizar a 121C x 15 minutos. Es utilizado para el enriquecimiento selectivo de estreptococos apartir de diversos materiales, objeto de investigacin. PREPARACIN DE MEDIOS SELECTIVOS Y DIFERENCIALES I. Medios Selectivos Los medios selectivos son aquellos que poseen como parte de sus componentes una variedad de inhibidores en concentraciones adecuadas que impide el crecimiento de bacterias superfluas. Por ejemplo. Se emplean para el aislamiento de enterobacterias de importancia mdica (Salmonella, Shigella y otras) a partir de muestras con una flora acompaante diversa. Adicionalmente los medios selectivos llevan indicadores que evidencian el metabolismo bacteriano facilitando la identificacin preliminar del microorganismo. 1. Agar Mac Conkey (Gramos / litro) Peptona de casena 17.0 Peptona de carne 3.0 Lactosa 10.0 Sales biliares 1.5 Cloruro de Sodio 5.0 Rojo Neutro 0.03 Cristal violeta . 0.01 Agar Agar . 13.5 66

Ph 7.1= 0.1 Este medio se emplea para el aislamiento de Salmonella, Shigella y bacterias coniformes a partir de muestras clnicas y aguas residuales. Las sales biliares y el cristal violeta actan como agentes inhibidores de bacterias Gram. Positivas y de algunos entericos exigentes. El rojo neutro es el indicador de Ph, que permite determinar los cidos producidos de la degradacin de la lactosa. Preparacin: 1. Pesar 50gr del producto deshidratado. 2. Disolver en un litro de agua destilada. Remojar durante 15 minutos. 3. Hervir la solucin hasta su completa disolucin. 4. Autoclavar a 121C por 15 minutos 5. Enfriar a 50C 6. Repartir en placas estriles. Aproximadamente 20ml. 2. Agar Salmonella Shigella (s.s.) (Gramos / litro) Extracto de carne 5.0 Peptona especial 5.0 Lactosa 10.0 Bilis de buey, disecado . .. 8.5 Citrato de Sodio .... 10.0 Tiosulfato de Sodio 8.5 Hierro (III) citrato 1.0 Verde brillante .... 0.003 Rojo neutro . 0.025 Agar Agar 12.0 ph 7.2 = 0.1 Preparacin: 1. Pesar 60gr del producto deshidratado 67

2. Disolver en un litro de agua destilada. 3. Dejar remojar por quince minutos. 4. Someter al calor, agitando frecuentemente hasta ebullicin y disolucin total. 5. Enfriar a 50C 6. Repartir en placas petri estriles aproximadamente 20 ml. 7. El medio no necesita ser autoclavado. 3. Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (Xld) (Gramos/ litro) Xilosa 3.5 Lisina 5.0 Lactosa 7.5 Sacarosa 5.0 Cloruro de sodio 5.0 Extracto de levadura . 3.0 Desoxicolato de sodio 2.5 Tiosulfato de sodio 6.8 Amonio y hierro (III) 0.8 Rojo de fenol . 0.08 Agar Agra . 13.5 ph.7.4 Este medio de utiliza principalmente para el aislamiento y diferenciacin de bacterias enterpatgenos, especialmente salmonella, shigella, y arizona. El agar XLD permite las siguientes reacciones de diferenciacin: Degradacin de la xilosa, lactosa y sacarosa a cido (viraje amarillo del indicador de ph rojo de fenol). La descarboxilacion de la lisina a cadaverina(color rojo prpura alrededor de la colonia). El tiosulfato sirve como indicador de la formacin de sulfuro de hidrogeno(colonias con precipitado negro) El viraje puede variar desde el amarillo hasta el rojo durante el curso de una incubacin prolongada. 68

Preparacin: 1. Pesar 55gr del producto deshidratado. 2. Disolver en un litro de agua destilada. 3. Dejar remojar por 15 minutos. 4. Calentar rpidamente hasta ebullicin por unos segundos. 5. Enfriar rpidamente en agua fra a unos 50C. 6. Repartir en placas petri estriles aproximadamente 20 ml. El medio en estado slido tiene un color rojizo. 4. Agar Emb (Eosina Azul De Metileno) (Gramos/ litro) Peptona 10.0 Hidrogeno fosfato dipotasico 2.0 Lactosa 5.0 Sacarosa 5.0 Eosina amarillenta 0.4 Azul de metileno 0.07 Agar 13.5 ph7.1 = 0.1 Los grmenes Gram positivos son inhibidos en su crecimiento gracias a la presencia de los colorantes: Eosina y azul de Metileno. El contenido en lactosa y sacarosa hacen posible la distincin de Salmonella, shigella lactosa negativa y sacarosa negativa, frente a otra flora acompaante lactosa negativa pero sacarosa positiva como citrobacter. Proteus vulgaris, Aeromonas hydrophila. La E. coli se observara con un brillo metlico positivo sobre un crecimiento de colonias de color violeta. Salmonella y Shigella no presentaran brillo metlico y sus colonias se observara transparentes. Preparacin: 1. Pesar 36gr 2. Disolver en un litro de agua destilada. Dejar remojar por 15 minutos.

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3. Hervir hasta su completa disolucin. 4. Autoclavar a 121C por 15 minutos. 5. Enfriar a 50C 6. Repartir en placas petri estriles aproximadamente 20 ml. 5. TCBS (Agar Tiosulfato Citrato Sales Biliares Sacarosa) (gramos/ litros) Peptona de casena .. 5.0 Peptona de caren .. 5.0 Extracto de levadura .. 5.0 Citrato de sodio .. 10.0 Tiosulfato de sodio .. 10.0 Bilis de buey, disecada . 5.0 Colato de sodio . 3.0 Sacarosa . 20.0 Citrato de hierro (III) . 1.0 Agar . 14.0 Azul de timol .. 0.04 Azul de bromotimol .. 0.04 ph 8.8 = 0.1 Este medio se emplea preferentemente para el aislamiento de Vibrio Cholerae. Las elevadas concentraciones de tiosulfaro y citrato, asi como el medio fuertemente alcalino. Inhiben notablemente a als enterobacterias. Solo algunas cepas sacarosa positivas pueden desarrollar entre ellos proteus y yersinia. La bilis de buey y el colato inhiben sobre todo a los enterococos. El indicador mixto azul de timol azul de bromotimol presentan viraje al amarillo por la formacin de cido. Las colonias de V. cholerae sacarosa positiva se observaran de color amarillo. Mientras que para el V. parahaemolyticus sacarosa negativas sern verdes azulado. Preparacin:

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1. Pesar 88gr del producto deshidratado. 2. Disolver en un litro de agua destilada, remojar durante 15 minutos. 3. Hervir hasta su completa disolucin. 4. No esterilizar en autoclave 5. Enfriar hasta 50C . 6. Repartir en placas petri estriles, aproximadamente 20 ml. 6. Agar Hipertonico Segn Chapman (Gramos/litro) Peptona 10.0 Extracto de carne 1.0 Cloruro de sodio 75.0 D() manitol 103.0 Agar 12.0 Rojo de fenol 0.025 ph 7.4 = 0.1 Debido a la concentracin extremadamente alta de sal, permite solamente el crecimiento de microorganismo tolerantes a ella, entre los que se encuentra el genero Staphylacoccus. La degradacin del manitol con formacin de cido esta notablemente correlacionada con la patogenicidad del germen. El metabolismo del manitol se evidenciara por la viracion a amarillo del indicador rojo de fenol. Preparacin: 1. Pesar 108gr por litro del producto deshidratado. 2. Disolver en un litro de agua destilada, remojar durante 15 minutos. 3. Hervir hasta su completa disolucin. 4. Esterilizar en autoclave a 121C por 15 minutos. 5. Enfriar a 50C . 6. Repartir en placas petri estriles aproximadamente 20 ml.

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7. AGAR DCLS(Agar desoxicolato citrato lactosa sacarosa) (Gramos / litro) Peptona de carne . 5.5 Extracto de carne 5.0 Lactosa .10.5 Sacarosa 10.5 Citrato de sodio 2 hidratado 6.0 Tiosulfato de sodica . 4.0 Desoxicolato de sodio .. 3.0 Citrato de amoniio y hierro III. 1.0 Rojo neutro . 0.02 Agar 13.0 Ph 7.5 = 0.1 Agar selectivo para el aislamiento y diferenciacin de enterobacterias patgenas. La presencia de desoxicolato y citrato inhiben a la flora gram positiva, la degradacin de la lactosa y sacarosa se manifiesta por el viraje del indicador rojo neutro al rojo. Las colonias de salmonella y shiguela se conservaran incoloras con le centro negruzco. Preparacin: 1. Pesar 57gr. Por litro de producto deshidratado 2. Disolver en un litro de agua destilada , remojar durante 15 minutos . 3. Hervir hasta su completa disolucin 4. No esterilizar en autoclave 5. Enfriar a 50C. 6. Repartir en placas petri estriles. Aproximadamente 20 ml. 8. Agar Enterico De Hektoen Composicin : Peptona Proteosa .. 12g. Sales Biliares .. 9g. Extracto de Levadura 3g. Lactosa 12g. Salicina 2g. Sacarosa . 12g. Cl Na 5g. Tiosulfato de sodio 5g. Citrato ferrico de amonio .. 1.5g. Agar .. 14 g. 72

 Fuccina acida .. 0.1g. Azul de bromotinol .. 0.065g. Agua destilada . 1000 ml. Preparacin: Preparar una suspensin con 70 g. de medio deshidratado, si se usa el producto comercial en 1000 ml. De agua destilada, calentar hasta el punto de ebullicin y continuar hasta que el medio se disuelva, no poner en autoclave. Enfriar hasta 50C. y volcar en placas petri. Este medio resulta til para el aislamiento y diferenciacin de bacterias patgenas entericas gram negativas. Las coliformes generalmente aparecen de color salmon o anaranjado , mientras que salmonella y siguella muestran un color verde azulado. 9. Agar Selectivo Para Campylobacter Composicion: Peptona proteica 21g. Electrolitos 5g. Almidn soluble 1g. Agar 13g. Agua destilada 1000 ml. Ph 7.3 0.1 Preparacin: Disolver y autoclavar a 121C por 15 min. Dejar enfriar a 40 C 50 C. incorporar de 50 70 ml. De sangre desfibrinada y un frasco de suplemento selectivo por cada 200ml. De medio de cultivo, verter en placas estriles. Suplemento : vancomicina . 2.0 mg. polimixina . 500mg. trimethoprim ....... 1.0 mg. Disolver el liofilizado en 2 ml. De agua destilada estril, este medio es usado para el aislamiento de campylobactter a partir de material clnico as como el procedente de alimentos contaminados. Es un medio rico en nutrientes y los antibiticos aadidos como suplemento selectivo inhiben considerablemente la flora acompaante. II. MEDIOS DIFERENCIALES Todas las bacterias requieren despus de su aislamiento primario ka identificacin de especie ,para ello es necesario determinar caractersticas metablicas adicionales, empleando medios diferenciales , con los cuales 73

poseen dentro de sus ingredientes carbohidratos ,aminocidos y otros sustratos que van a ser utilizados por el microorganismo ,siendo interpretados posteriormente por el profesional calificado correspondiente del laboratorio de microbiologa. Existen muchos tipos de medios diferenciales, en la practica se preparan algunos de estos. 1. Agar Hierro Tres Azucares (Tsi = Triple Sugar Iron) (Gramos/ litro) Extracto de carne 3.0 Extracto de levadura . 3.0 Peptona de caseina .. 15.0 Peptona de carne 5.0 Lactosa 10.0 Sacarosa 10.0 Glucosa 1.0 Citrato ammoniio ferrico.... 0.5 Cloruro de sodio 5.0 Tiosulfato de sodio . 0.5 Rojo de fenol 0.024 Agar agar . 12.0 ph 7.4 = 0.1 Este medio de diferenciacin bioqumica, se utiliza para identificar alas bacterias gran negativas por gneros y especies. La degradacin del carbohidrato con formacin de cido se comprueba por el viraje del indicador rojo de fenol a amarillo y una alcalinizacin por un viraje hacia rojo oscuro . La degradacin de la glucosa a cido produce cambio de color solo en la zona columnar del medio , pues debido a su baja concentracin con la escasa cantidad de cido producido en la superficie inclinada del agar se evapora rpidamente . Si , en cambio son degradadas la lactosa y sacarosa , que se encuentren en mayor proporcin . se observa un viraje de color amarillo en todo el tubo . El Tiosulfato de sodio se reduce por accin de algunas bacterias a sulfuro de hidrogeno. el cual reacciona con la sal ferrica produciendo H2S , un precipitado negro . La formacin de grietas o cavidades en el medio , indican la formacin de gas (Co2) por la degradacin del azcar . 74

Preparacin : 1. Suspender 65 gr del producto deshidratado en un litro de agua destilada o desmineralizada . 2. Remojar durante 15 minutos 3. Hervir hasta la completa disolucin 4. Distribuir en tubos 13*100 aproximadamente de 3 a4 ml . 5. Esterilizar al autoclave a 121C por 15 minutos. 6. Despus de la esterilizacin. Colocar los tubos en posicin inclinada, procurando que la zona columnar y la superficie (pico flauta) tengan la misma longitud. Aproximadamente 3 cm El color del medio de diferenciacin es rojo naranja. 2. Agar Citrato Segn Simmons (Gramos/litro) Amonio dihidrogefosfato 1.0 Hidrogenofosfato dipotasico ... 1.0 Citrato de sodio 2.0 Cloruro de sodio 5.0 Sulfato de magnesio 0.2 Azul de bromotimol 0.08 Agar agar . 12.0 PH 6.9 = 0.1 El medio se emplea para la diferenciacin bioqumica de bacterias . la degradacin del citrato produce una alcalizacin del medio que se reconoce por el viraje de color verde a azul oscuro del indicador de pH del azl de bromotimol . Preparacin: Suspender 65gr del producto deshidratado en un litro de agua destilada o desmineralizada. Remojar durante 15 minutos . Calentar hasta la ebullicin , agitando con frecuencia hasta la completa disolucin . Esterilizar al autoclave a 121C por 15 minutos . Distribuir en tubos de 13 x 100 aproximadamente de 3 a 4 ml. 3. AGAR UREA Segn CHRISTENSEN ( Basal) (Gramos /litro) Peptona especial 1.0 Glucosa .1.0 Cloruro de sodio ... 5.0 Dihidrogenofosfato potasico.. 2.0 Rojo de fenol .0.012 Agar agar .12.0 75

pH 6.8 = 0.1 Solucin de Urea Urea 40.0 Agua destilada1 litro Esta solucin se esteriliza por filtracin. Este medio se utiliza para la diferenciacin de microorganismos es hidrolizada a dixido de carbono y amoniaco. El amoniaco produce alcalinizacin del medio, lo cual se demuestra por el viraje del rojo del fenol de amarillo a rosado intenso . Preparacin: Disolver 21 gr del producto deshidratado en 950 ml de agua destilada o desmineralizada . Remojar durante 15 minutos . Hervir hasta la disolucin total . Autoclave a 121C por 15 minutos . Antes de su uso aadir 50 ml de la solucin de urea al 40% al medio del cultivo fundido y enfriado hasta uno 55C bajo condiciones estriles . mezclando homogneamente . Distribuir en tubos de 13 x 100 aproximadamente de 3 a4 ml solidificando en plano inclinado. Caldo Peptonado (Prueba De Indol) (Gramos/litro) Peptona 20.0 Cloruro de sodio .10.0 Agua destilada 1000.0 ml El medio es empleado para la diferenciacin de muchas especies de bacterias que degradan el triptofano por accin de la enzima triptofanasa . El producto metablico detectado al agregar el reactivo de kovac o de Ehrlich es el Indol. Preparacin: Disolver los ingredientes por calentamiento. hasta la clasificacin del medio . Enfriar a 50C Autoclavar a 15 lb de presin por 15 minutos. Repartir el medio en tubos estriles de 13 x 100 aproximadamente de 3 a 4 ml. Para la interpretacin del producto metablico producido por el microorganismo se requiere del siguiente reactivo : Reactivo de Kovac Alcohol amilico .150.0 ml p dimetil aminobenzaldehido ..10.0 g. cido clorhdrico 50.0 ml.

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 CALDO MR VP(rojo de metilo voges proskauer) Composicin : Peptona especial 7.0 Glucosa .5.0 Fosfato dipotasico.5.0 ph 6.9= 0.1 Con este medio se realizan dos tipos de pruebas bioqumicas : rojo de metilo y voges proskauer ; dichas pruebas sirven para poder identificar a diversos microorganismos. Preparacin: Disolver 17g. del producto deshidratado en un litro de agua destilada. Disolver por ligero calentamiento. Distribuir en tubos de 13 x 100 aproximadamente 5ml. Esterilizar al autoclave a 121C X 15 minutos. Reactivo Rojo de Metilo Rojo de metilo 0.1g. Alcohol etilico 300.0ml. la prueba de rojo de metilo sirve para identificar la formacin de acidos fuertes a partir de glucosa. Reactivo de Voges Proskauer Alfa naftol . 5.0g. Alcohol etilico absoluto 100.0ml. Hidroxido de potasio . 40.0g. Agua destilada . 100.0ml. la prueba de Voges Proskaeur sirve para identificar la formacin de acetoina a partir de glucosa. Agar Lisina Hierro (Gramos / litro) Peptona de gelatina . 20.0 Extrcto de levadura .. 10.0 Glucosa 1.0 L lisina 10.0 Citrato ferrico de amonio . 0.5 Tiosulfato de sodio . 0.04 Purpura de bromocresol . 0.02 Agar Agar . 13.5 Ph 6.7= 0.1 77

Este medio se emplea para la diferenciacin bioqumica de los bacilos entericos y microorganismos afines en el cual Podemos observar la decarboxilacion de la lisina,la diseminacin y produccin de hidrogeno sulfurado. El Agar lisina hierro tiene incorporado el indicador de ph purpura de bromocresol.oscilando el rango de ph entre 5.2 (amarillo) y 6.8 (purpura). Las bacterias que decarboxilan la lisina , elevan el ph del medio debido a la produccin de amina tornndose el medio de color purpura el en fondo del tubo es color amarillo producto de la acidez de la glucosa. En la diseminacin de la Lisina , la accin sobre el aminocido producir un complejo desconocido que alcanzara el medio formndose un complejo anaranjado que al combinarse con el indicador da un color rojo en el tubo. La produccin del hidrogeno sulfurado se detecta debido al tiosulfato de sodio y mediante el indicador que es el citrato ferrico de amonio, se produce un precipitado negro insoluble (H2S). Preparacin: 1. Disolver 33 g del producto deshidratado en un litro de agua destilada. 2. Dejar embeber por 15 minutos. 3. Disolver por calentamiento agitando con frecuencia. 4. Distribuir en tubos de 13 por 100 y autoclavaza a 15 Ib de presin por 15 minutos. 5. Enfriar en plano inclinado. 7. Agar Esculina (Gramos/litros) Esculina .. 1g Citrato ferrico .. 0.5g Agua peptonada 1000 ml. Agar 20 g Disolver la esculina,la sal de fierro y el agar en el agua peptonada. Esterilizar a 115C por 10 minutos. 8. Leche Tornasolada Leche desnatada en polvo 100g Tornasol 5g Agua destilada 1000ml colocar en autoclave durante 10 minutos a 10 Ibs. El color rosado del tornasol indica una reaccin cida provocada por la fermentacin de la lactosa.un color 78

purpura o azul (alcalina) indica que no hay fermentacin de la lactosa. El color blanco (reduccin) resulta cuando el tornasol sirve como aceptor electrnico y es reducido a su leucobase. La coagulacin es causada por la precipitacin de la caseina por el cido producido a partir de la lactosa. Tambin puede provocar la coagulacin por la conversin de la caseina en paracaseina por la enzima renina. La peptonizacion (disolucin del coagulo) indica la digestin del cuajo o proteinas de la leche por las enzimas proteoliticas. 9. Medio De Gelatina Diluido Composicin: Gelatina .. 4g Agua destilada .. 1000ml Distribuir en tubos, colocar en autoclave a 121C durante 5 minutos. 10. Medios De Gelatina Composicin: Gelatina .. 12g Caldo BHI .. 1000ml calentar en bao mara hasta disolver completamente la gelatina. Ajustar al ph a 7.0 Colocar en tubos y autoclavar a 121C por 15 minutos. ANEXOS ANEXO A : METABOLISMO BACTERIANO SIEMBRA, LECTURA E INTERPRETACION DE PRUEBAS DIFERENCIALES Introduccin La identificacin bacteriana inicial puede realizarse mediante la determinacin de las caractersticas de las colonias y morfologa con tincin gram u otras coloraciones. Sin embargo la caracterizacin final de un aislamiento bacteriano desconocido. Para identificarlo a nivel de genero y especie habitualmente se lleva a cabo estudiando ciertos sistemas enzimticos que son nicos para cada especie y sirvan como marcadores de identificacin. En el laboratorio estos sistemas enzimticos se detectan inoculando un apequea porcin de la colonia bacteriana aislada en una serie de medios de cultivo que contienen substratos especficos e indicadores qumicos que permiten detectar cambios del ph o la presencia de subproductos especficos. La identificacin de muchas bacterias fermentadoras y no fermentadoras se ha visto facilitada por el uso de sistemas instrumentales autorizados ,por medio de las cuales los microorganismos se identifique con los 79

cdigos numricos computarizados. Estos sistemas permiten tener resultados en el menor tiempo posible y son de menor costo. Entre estos se conocen API. Enterotube oxi/ferm.micro Id, mintek, etc. Existe tambin otros sistemas de identificacin como Microscan, Sceptor, autobac IDX, Automicrobic ( AMS), etc. ACCIN SOBRE LOS HIDRATOS DE CARBONO Por definicin la fermentacin es un proceso metablico de oxido reduccin que ocurre en un medio ambiente anaerbico, y en lugar de oxigeno un substrato orgnico sirve como aceptor final de hidrogeno ( electrones. Este termino de fermentacin es utilizado comnmente para referirse a la utilizacin de hidratos de carbono por las bacterias. Esta pueden utilizar desde polisacridos como el almidn, la celulosa hasta monosacridos como la glucosa los cuales les servirn como fuente de energa y carbono. Las bacterias de diferencias por los hidratos de carbono que utilizan los tipos y cantidades de cidos mixtos producidos, dando como resultado la acidificacin del medio, el cual es visible por el cambio de color en el medio de cultivo de fermentacin, la presencia de burbujas o rotura del medio slido. Materiales: Mtodo de cultivo semislido con lactosa e indicador de PH ( rojo fenol) Medio de cultivo semislido con glucosa indicador de PH ( rojo de fenol) Procedimiento: Seleccionar en la placa con medio slido una colonia totalmente aislada, la cual ha desarrollado a 37 C por 1824horas. Con ayuda del asa d siembra en punta tomar una pequea porcin de la colonia seleccionada y transferir a cada uno de los tubos por el mtodo de siembra por puntura. Rotula los tubos con el numero de la cepa bacteriana y la fecha. Incubar el material en la estufa a 37 C 1824 horas. Nota: No olvidar de esterizar el asa de siembra antes y despus de casa siembra. Interpretacin Cuando la bacteria a degradado el hidrato de carbono se produce un cambio de color en el medio de cultivo, inicialmente anaranjado amarillo y luego a amarillo debido a la presencia de productos metabolicos y los cuales se detectan por la inclusin del indicador de PH rojo fenol, cuyo rango de viraje esta entre 6.8 ( amarillo) y 8.4 ( rojo). Si el microorganismo tiene la capacidad de desdoblar un subproducto metablico a CO2 e H+ ( ejemplo el cido formico) se observara la presencia de gas,en forma de burbujas. Si se utilizan medios lquidos deber colocarse dentro del tubo, tubos de durharn invertidos. Temiendo estos la ventaja de detectar cantidades muy pequeas de gas. PRODUCCIN DE ACIDOS Y ACETIL CARBINOL Prueba De Rojo De Metilo (RM) La prueba de rojo de metilo es una prueba cuantitativa que proporciona una caracterstica valiosa para identificar especies bacterianas que producen cidos fuertes ( lcticos, actico, formico) a partir de glucosa. Estas bacterias que primariamente siguen la vida de fermentacin de cidos mixtos frecuentemente produce suficiente cido despus de una incubacin prolongada como para mantener el PH por debajo de 4.4 ( el punto 80

cido limite del indicador de rojo de metilo) superando el sistema amortiguador del ph del medio. Prueba De Voges Proskauer ( VP) El cido peruvico un compuesto fundamental formado en la degradacin fermentativa de la glucosa es metabolizado por algunos microorganismos produciendo el acetilmeticarbonil (acetona) un subproducto neutro de la via 2.3 butilenglicol. La prueba se basa en la conversin del acetilmetilcarbonil en diacetil a travs de la accin de KOH y oxigeno atmosfrico. El diacetilo es convertido en un concepto rojo bajo accin cataltica de alfa naftol y Cratina. Materiales: Cepa bacteriana control MR positivo y negativo Cepa bacteriana control positivo y negativo Reactivo de rojo de metilo Reactivo de vogesporskauer. Procedimiento: Por la tcnica de inoculacin sembrar independientemente la cepa control MR positivos y negativos en el medio rotular los tubos e incubar durante 48 72 horas 37 C Proceder del mismo modo con las capas VP controles incubar 1824 horas. Interpretacin Para la prueba el rojo de metilo.aadir al cultivo unas gotas del reactivo del mismo nombre cuyo rano de virajes esta entre PH 4.4 ( rojo) y 6.0 ( amarillo), la prueba positiva se manifiesta de color rojo estable y la negativa de color amarillo naranja, Para la prueba de Voges ProsKauer, agregar al cultivo 0. 6 ml (12gotas) de alfa naftol y 0.2ml (4gotas) de KOH. Agitar el tubo por 1minuto y dejarlo en reposo durante 15 minutos. Es importante aadir los reactivos. Una prueba positiva color rojo localizado en la mitad superior o en todo tubo es observada dentro de los primeros 15 minutos. Si la lectura se realiza despus de una hora los cultivos pueden presentar un color cobrizo, siendo esta una interpretacin falsa positiva. En la perte negativa no cambia el color inicial del medio de cultivo. PRINCIPIOS BIOQUIMICOS DE LAS REACCIONES EN TSI (triple sugar iron) Este medio fue diseado para la diferenciacin de bacilos de Gram. negativos, basndose en la capacidad potencial de estas bacterias para fermentar carbohidratos y producir sulfuro de hidrogeno (H2S). el medio contiene tres azucares: glucosa,lactosa y sacarosa en proporciones de 1:10:10 respectivamente. Para detectar los productos cidos generados se emplea un indicador de Ph que es el rojo fenol cuyo rango de viraje esta entre Ph 8.4(rojo) y ph6.8(amarillo). Los patrones de comportamiento de los bacilos gram negativos ante los carbohidratos presentes en este medio pueden ser fundamentalmente tres:

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1. Fermentacin de glucosa nicamente 2. Fermentacin de glucosa + galactosa + sacarosa o glucosa + ambos. 3. No fermentacin de carbohidratos. Como producto de la fermentacin de los diferentes carbohidratos se puede formar gas, que se detecta como pequeas burbujas o grietas en el medio o por desplazamiento del mismo hacia arriba del tubo. El medio tiene incorporado tiosulfato de sodio como fuente de azufre para generar H2S, y sales de hierro que al reaccionar con el gas forman un precipitado negro insoluble de sulfato ferroso (FeS) Material Tubo con medio TSI en plano inclinado. Procedimiento 1. Con el asa de siembra inocule una porcin pequea de la colonia en el centro del tubo y estire la superficie del pico de flauta. 2.Rotular e incubar a 37C por 18 24 horas. Interpretacin Es indispensable que la lectura se haga en el tiempo de incubacin indicada. 1. Producto de h2s ennegrecimiento en el fondo del tubo. 2. Fermentacin de la glucosa nicamente(rojo/ amarillo). Esto se debe a la glucosa(que se encuentra en baja concentracin con respecto a los otros azucares), ha sido utilizada y la cantidad de cido producido no es suficiente para neutralizar los productos alcalinos generados por la utilizacin de la peptonas: adems los cidos pueden se utilizados. Estos procesos, que son oxidativos, ocurren en la superficie del medio, mientras que en el fondo, por no esta en contacto con el oxigeno, solo hay fermentacin y en medio permanece cido 3. fermentacin doble o triple de carbohidratos: (amarillo/ amarillo). La fermentacin de la glucosa y alguno (o ambos) de los otros 2 azucares produce gran cantidad de acidos; por lo que el tubo permanece amarillo. 4. no fermentacin de carbohidratos: (rojo/ anaranjado). Se presenta nicamente utilizacin oxidativa de peptonas, por lo que solo la superficie del tubo se alcaliniza. 5. produccin de gas: formacin de burbujas (CO2 e H +) GRIETAS O desplazamiento del medio. PRUEBAS DE OXIDACION FERMENTACION (OF segn Hugh y Lefson) El termino de no fermentacion se refiere aun grupo de bacterias gram negativas aerobias, no esporuladas; que son incapaces de utilizar hidratos de carbono como fuente de energa que los degradan por la va oxidativa de la glucosa son sumamente dbiles y para su deteccin se requiere de un medio mas sensible, como el de Hugh y Heifson (medio QF9).

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Principio El medio QF se Hugh y Lefson difiere de los medios convencionales de fermentacin de carbohidratos en que la concentracin de : 1. Las protenas han sido disminuidas del 1% al 0.2 %. 2. Los hidratos de carbono esta aumentada del 0.5% al 1%. 3. el agar esta disminuido 1.5% a 0.2 % por lo cual su consistencia es semislida. La menor concentracin de protenas reduce la formacin de aminas alcalinas que pueden neutralizar las pequeas cantidades de cidos dbiles derivados del metabolismo oxidativo. La mayor concentracin de carbohidratos sirve para aumentar potencialmente la produccin de cido. La consistencia semislida permite que los cidos formados en la superficie difundan por todo el medio facilitando la observacin del viraje del indicador de pH. Este medio tambin permite determinar la movilidad de las bacterias. Materiales Cepa control OF positiva y negativa. Tubos con medio OF. Parafina liquida estril. Procedimiento Se requieren dos tubos para la prueba OF. 1. Inocular con el asa de siembra en punta. Hasta llegar casi al fondo del tubo. 2. Cubrir un tubo de cada par con una capa de 1cm con la parafina liquida estril, dejando el otro tubo abierto al aire. 3. Rotular los tubos e incubar ambos tubos a 37C durante 48 horas o ms. Interpretacin La produccin de cido se detecta en el medio por la aparicin de color amarillo. En el caso de organismos oxidativos la produccin de color se puede notar primero cerca de la superficie del medio. Para las especies de desarrollo muy lento puede requerirse de una incubacin de tres das o mas para detectar reacciones positivas, como por ejemplo Moraxella spp. ACCION SOBRE LAS PROTEINAS

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Produccin de sulfato de hidrogeno (H2S) Esta es una prueba bioqumica importante para la identificacin bacteriana. Algunas bacterias poseen sistemas enzimticos productos de sulfato de hidrogeno. La produccin de H2S puede detectarse en medios aptos que aseguren el crecimiento de la bacteria en estudio y que tengan: Una fuente de azufre, como los aminocidos cisterna y metionina o el tiosulfato de sodio. Un indicador incluido en el medio o tiras de papel embebidas con este. El citrato ferrico, e sulfato ferroso, el citrato de hierro o amonio, hierro peatonizado y el acetato de plomo son los mas comnmente usados. Materiales Cepa control H2S positivo y negativo. Tubo con agar y peptona en plano inclinado, contenido el indicador subacetato de plomo. Procedimientos 1. Por la tcnica de puntura y estra sembrar separadamente en el medio la cepa control H2S positiva y negativa. 2. Rotular el tubo e incubar a 37C por 18 24 horas. Interpretacin La secuencia que lleva a la produccin de H2S es la siguiente : 1. Liberacin del sulfato de cisterna o tiosulfato por accin enzimatica bacteriana. 2. Acople del sulfuro (S2) con un ron hidrogenado (H+) para formar H2S. 3. Deteccin de H2S por hierro o plomo para producir sulfuros con metales pesados insolubles que se observan como un precipicio negro insoluble. Si se usa Tiras de papel este precipitado aparecer en el extremo del mismo. El ennegrecimiento se ve primero en medios, donde la formacin de cidos es mxima, es decir, a lo largo de la lnea de inoculacin en la profundidad del agar inclinado o en el centro de colonias que creen en superficies de agar. PRODUCCION DE INDOL Las bacterias que posen la enzima triftofanasa son capaces de actuar sobre el aminocido triptofano, produciendo indol, un benzil, pirrol, cido piruvico y amoniaco (NH3). El indol puede detectarse en un medio rico en triftofano, observando la aparicin de un color rojo(en forma de anillo o impregnado en la tira de papel),luego de agregar una solucin que contiene demitilaminobezaldehido. En la practica puede emplearse medios combinados como el SIM (sulfato indolmotilidad) NIO(motilidad indol ornitina)indolnitrato o medio solo para detectar el indol. 84

Materiales Cepa control indol positivo y negativo Medio liquido peptonado Reactivo de Kovac (alcohol amilico + HCL concentrado + p dimetillaminbezaldehido). Procedimiento 1. Sembrar las cepas control indol + y por la tcnica de inoculacin en el medio de caldo peptonado. 2. Rotular los tubos e incubar a 37C por 18 24 horas. 3. Agregar unas gotas del reactivo de K ovac. Dejando resbalar por la pared. Interpretacin La aparicin de un color rojo fucsia brillante en la interfase del reactivo y el caldo, pocos segundos despus de haber agregado el reactivo es indicativo de la presencia de indol y construye una prueba positiva. Las bacterias que a pesar de desarrollar en el medio, pero que no producen indol, al agregar el reactivo este aparecer sin cambio alguno siendo esa una prueba negativa. UTILIZACION DEL CITRATO Esta prueba se utiliza principalmente para identificar varias especies de la familia Enterobacteriaceae, las cuales pueden obtener energa por va distinta de la fermentacin de los carbohidratos utilizando el citrato de sodio como nica fuente de carbono para su metabolismo y desarrollo; por lo tanto, cualquier medio que se emplee para determinar esta caracterstica no debe contener protenas ni carbohidratos. El citrato de sodio es una sal de acido citrico compuesto orgnico simple que construye unos de los metabolismos del ciclo de Krebs. Principio La utilizacin del citrato por una bacteria se detecta por su crecimiento en un medio con citrato con formacin de subproductos de alcalinos. El medio(citrato de simmos) incluye citrato de sodio, un anion como nica fuente de carbono y fosfato de amonio como nica fuente de nitrogeno. Las bacterias que pueden utilizar citrato tambin pueden extraer nitrgeno de la sal de amonio, con produccin de amoniaco(NH3), alcalinizando el medio por conversin del NH3 en hidrxido de amonio (NH4OH), detectndolo con el indicador de ph incorporando el azul de bromotidol cuyo rango de viraje esta entre Ph 6.9(verde) y pH 7.8(azul). Materiales Cepa el control citrato negativo y positivo. Medio de citrato de Simmos en plano inclinado.

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Procedimiento 1. Con el asa de siembra bien esterilizada, sembrar por la tcnica de estra en cada tubo la cepa citrato + y . 2. Rotular los tubos e incubar a 37C por 18 24 horas. Interpretacin Prueba Positiva: color azul en 24 a 48 horas y crecimiento en la superficie del medio inclinado. Prueba Negativa: no hay cambio de color ni crecimiento. La prueba es tambin positiva si existe un desarrollo visible de colonias a lo largo de la estra de la siembra, esto es posible debido a que para que el desarrollo del organismo sea visible debe encontrarse en fase logartmica, lo cual es posible solo si el carbono y nitrgeno han sido asimilados. Para la confirmacin de la prueba el cultivo deber incubarse 24 horas mas en que aparecer el color azul. La aparicin del color amarillo en al zona de la siembra se interpreta como negativo y es producto en un medio inoculo denso. PRODUCCION DE UREASA. Una prueba importante usada para la identificacin de especies. Muchas especies de bacterias producen la enzima ureasa que hidroliza la urea segn la siguiente reaccin bioqumica: o NH2 CNH2 + 2HOH CO2 + H2O + 2NH . (NH4)2CO2 UREASA El amoniaco reacciona en solucin para dar carbonato de amonio produciendo una alcalinizacin y un aumento de ph del medio. Materiales Cepa patrn ureasa negativa y positiva Medio de urea segn Christensen. Procedimiento 1. Por la tcnica de estra, sembrar la cepa positiva y negativa, no inocular el fondo. 2. Rotular e incubar durante 18 24 horas a 37C . Interpretacin Prueba Positiva: color rosado en la superficie o en todo el tubo.

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Prueba Negativa: el medio permanece del color original. Los microorganismos que hidrolizan urea rpidamente pueden producir reacciones positivas en 1 o 2 horas: las especies menos activas pueden requerir 3 o mas das. PRUBA DE CATALASA La catalasa es un tipo de enzima que poseen las bacterias aerobias y facultativa anaerobias. El peroxido de hidrogeno (H2O2) es uno de los productos finales del metabolismo oxidativo de los carbohidratos y si se acumula es letal para el microorganismo. La catalasa convierte el peroxido de hidrogeno en agua y oxigeno de acuerdo a la siguiente reaccin: 2H2O2 . 2H2O + O2 la prueba es de vital importancia en la diferenciacin de los estreptococos (catalasa negativo) de los estafilococos (catalasa positiva). Medios Y Reactivos Peroxido de hidrogeno (H2O) al 3%: se prepara a partir del H2O2 al 30% diluyendo con agua destilada . este reactivo es muy inestable que cuando se expone a la luz se descompone fcilmente debe almacenarse en refrigeracin y en botella mbar y chequearse justo antes de su uso con los controles positivos. Medios de cultivo: cualquier medio slido no inhibitorio y sin sangre ya que los eritrocitos poseen actividad de catalasa , por lo que su presencia puede dar resultados falsos positivos. Prueba en Lmina a) Con el agua asa bacteriolgica en punta o un aplicador estril, picar el centro de una colonia bien aislada y transferir el inoculo a un porta objeto limpio. b) Aadir 1 a 2 gotas de H2O2 al 3% c) Observar si se forman burbujas o no inmediatamente despus que se aade el reactivo. d) Descartar la lamina en un recipiente con desinfectante. Prueba en Placa o Tubo con Agar a) Aadir unas gotas del reactivo al 3% directamente sobre las superficie donde hay crecimiento. b) Observar si se forma burbujas de inmediato. Precauciones El orden de la prueba en lamina no debe invertirse cuando se use asa de platino. Ya que puede resultar falso positivo. El alambre de Nichrone no interfiere en el resultado de la prueba. La prueba debe realizarse en cultivos de 18 24 horas: cultivos mas viejos pueden perder su actividad de catalasa dando una reaccin falsa negativa. El H2O es extremadamente custico por lo que se debe evitar que toque la piel, en caso que ocurra inundar el rea afectada con el alcohol de 70% para neutralizar la accin. NO DEBE USARSE AGUA. 87

Interpretacin Prueba Cualitativa: la aparicin rpida y prolongada de burbujas de gas o efervescencia son indicativas de catalasa + algunas bacterias poseen enzimas diferentes a la catalasa que descomponen el H2O2 , dando pocas burbujas diminutas durante 20 30, esta son catalasas positivas. CITOCROMO OXIDASA Los citocromos son hemoproteinas que contienen hierro y actan como el ultimo eslabn de la cadena respiratoria aerobia, transfiriendo electrones (H) al oxigeno. Conformacin de agua, el sistema citcromo se encuentra en los organismos aerobios o anaerobios facultativos permitiendo identificar a organismos que carecen de la enzima o son anaerobios obligados. Principio En bacteriologa se puede terminar su presencia , al hacer reaccionar una poblacin bacteriana con un sustrato oxidable como el dimetil o tetrametil p fenillendiamina o discos o tiras de oxidasa y el resultado observado es la aparicin de color que va de rosado al prpura. Material Cepa control, citocromo oxidasa positiva y negativa, sembrada en placa de agar nutritivo. Reactivo de oxidasa. Procedimiento La prueba se lleva a cabo por dos mtodos: Tcnica Directa En placas, en las cuales se aade directamente 2 o 3 gotas del reactivo a las colonias bacterianas aisladas. Tcnica Indirecta En discos o tiras de papel embebidos con el reactivo y se extiende un asada de la colonia sospechosa. Interpretacin Las colonias bacteriana son actividad citoicromo oxidasa desarrolla en segundos un intenso color azul en el sitio de inoculacin. La reaccin debe observarse UNICAMENTE en la colonia y no alrededor de esta. ANEXO B: Muestra de Heces frescas Agar verde brillante

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Cary Blair (mx por hisopado rectal) caldo Selenito tetrationato o tioglicolato Xld Agar MAC Conkey Salmonella Shigella pruebas bioqumicas Antibiograma

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