Metodo Maxam-Gilbert Maxam-Gilbert que ordena con este mtodo de DNA que ordena en vez de sintetizar la DNA in vitro

y de parar las reacciones de la sntesis con los adaptadores de cadena, este mtodo comienza con integral, termina la DNA etiquetada y la hiende con los reactivo especficos bajos. Tan cmo este mtodo trabaja con las bases de la guanina, solamente el mismo principio se aplica a las cuatro bases; Primero fin-etiquetamos un fragmento de la DNA que queremos ordenar. ste puede ser 5 ' - o 3 ' - termina el etiquetado. Despus, modificamos una clase de base. Aqu utilizamos el sulfato dimethyl (DMS) para desnaturalizar las guaninas. (Realmente, este reactivo tambin desnaturaliza adenines, pero no de una manera se lleva a la hendidura del hilo de la DNA.) Como en el mtodo de cadena del fin, no queremos afectar a cada guanina, o produciremos solamente los fragmentos minsculos que no permitirn que determinemos la secuencia de la DNA. Por lo tanto, hacemos la metilacin bajo condiciones suaves que lleven a un promedio de solamente una guanina desnaturalizada por hilo de la DNA. Despus, utilizamos un reactivo (piperidina) que haga dos cosas: causa la prdida de la base desnaturalizada, despus rompe la espina dorsal de la DNA en el sitio de la base perdida (el sitio apurinic). En este caso, el G en el medio de la secuencia fue desnaturalizado, as que la rotura del hilo ocurri all, produciendo un trmero etiquetado.. En otra molcula de la DNA, el primer G no se podra desnaturalizar, dando lugar a un fosfato etiquetado (la base y el azcar seran perdidos en las hendiduras qumicas). Finalmente, electrophorese los productos y las detectamos por autoradiografa, apenas como en el mtodo del encadenamiento-fin. Por supuesto, necesitamos ejecutar tres otras reacciones que hiendan en las otras tres bases. Hay varias maneras de hacer esto. Por ejemplo, podemos debilitar los enlaces del glucsido a la adenina y a la guanina con el cido; entonces la piperidina causar la despurinacin y la rotura del hilo despus de ambos como y del Gs. Si electrophorese esto reaccin de A + de G al lado de la reaccin de G solamente, nosotros podemos obtener como por la comparacin. Semejantemente, la hidracina abre los anillos del thymine y de la citosina, y la piperidina puede despus quitar estas bases y romper el hilo de la DNA en los sitios resultantes del apyrumidine. En presencia del NaCl del 1M, la hidracina es especfica para la citosina solamente, as que podemos ejecutar esta reaccin al lado de la reaccin de C+T y obtener los Ts por la comparacin.

Conocido en ocasiones como "secuenciacin qumica", este mtodo se origin en el estudio de las interacciones entre ADN y protenas (huella gentica), estructura de los cidos nucleicos y modificaciones epigenticas del ADN, y es en estos campos donde an tiene aplicaciones importantes. Mtodo enzimtico de terminacin de cadena o mtodo didesoxi de Sanger Para obtener la secuencia de bases nitrogenadas de un segmento de ADN por el mtodo enzimtico de terminacin de cadena, se necesitan los siguientes compuestos: El ADN molde o segmento de ADN que se desea secuenciar. Para poder secuenciar un segmento de ADN, previamente se necesita tener gran cantidad de ese fragmento, y por tanto, hay que clonarlo en un vector apropiado. Adems, debe estar en estado de hlice sencilla. Un enzima que replique el ADN, normalmente la ADN Polimerasa I del bacteriofago T4. La ADN Polimersa I del fago T4 emplea como molde ADN de hlice sencilla y siguiendo las reglas de complementaridad de las bases nitrogenadas va aadiendo nucletidos a partir de un cebador o "primer". Un cebador o "primer" que suele ser un oligonucletido corto de alrededor de 20 bases de longitud necesario para que la ADN polimerasa I comience a aadir nucletidos por el extremo 3' OH. Este cebador debe poseer una secuencia de bases complementaria a la del fragmento de ADN que se desea secuenciar. Debido a que la secuencia de nucletidos del segmento que se quiere secuenciar es desconocida, se emplea un "primer" con secuencia complementaria al vector empleado para clonar el fragmento de ADN, adems, este cebador procede de una regin del vector muy cercana al punto de insercin del ADN problema cuya secuencia se conoce. El "primer" utilizado suele marcarse radiactivamente. Los cuatro nucletidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP). A veces en vez de marcar radiactivamente el cebador, se marca radiactivamente uno de los cuatro nucletidos trifosfato en cada reaccin. Por ltimo, se necesitan nucletidos didesoxi (ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP). Los nucletidos didesoxi son nucletidos modificados que han perdido el grupo hidroxilo de la posicin 3' de la desoxirribosa. Estos nucletidos pueden incorporarse a la cadena de ADN naciente, pero no es posible que se una a ellos ningn otro nucletido por el extremo 3'. Por tanto, una vez incorporado un nucletido didesoxi se termina la sntesis de la cadena de ADN.

Breve descripcin del mtodo enzimtico de terminacin de cadena En primer lugar, deben realizarse en cuatro tubos diferentes, cuatro mezclas de reaccin. Cada mezcla de reaccin contiene los cuatro nucletidos trifosfato (dATP, dCTP, de dTTP y dGTP), ADN polimerasa I, un cebador marcado radiactivamente y un nucletido didesoxi, por ejemplo ddATP, a una concentracin baja. El nucletido didesoxi utilizado (ddATP en este ejemplo) competir con su homlogo (dATP) por incorporarse a la cadena de ADN que se est sintetizando, produciendo la terminacin de la sntesis en el momento y lugar donde se incorpora. Por este sistema, en cada mezcla de reaccin se producen una serie de molculas de ADN de nueva sntesis de diferente longitud que terminan todas en el mismo nucletido y marcadas todas radiactivamente por el extremo 5' (todas contienen en el extremo 5' el cebador utilizado).

Los fragmentos de ADN de nueva sntesis obtenidos en cada mezcla de reaccin se separan por tamaos mediante electroforesis en geles verticales de acrilamida muy finos (0,5 mm de espesor) y de gran longitud (cerca de 50 cm) que permiten distinguir fragmentos de ADN que se diferencian en un solo nucletido.Los productos de cada una de las cuatro mezclas de reaccin se insertan en cuatro calles o carriles diferentes del gel. Una vez terminada la electroforesis, el gel se pone en contacto con una pelcula fotogrfica de autorradiografa. La aparicin de una banda en una posicin concreta de la autorradiografa en una de las cuatro calles nos indica que en ese punto de la secuencia del ADN de nueva sntesis (complementario al ADN molde) est la base correspondiente al nucletido didesoxi utilizado en la mezcla de reaccin correspondiente.

Teniendo en cuenta que el ADN de nueva sntesis crece en la direccin 5' 3', si comenzamos a leer el gel por los fragmentos de menor tamao (extremo 5') y avanzamos aumentando el tamao de los fragmentos (hacia 3'), obtendremos la secuencia del ADN de nueva sntesis en la direccin 5' 3'.