MICROSCOPIA

Microscpio ptico (M.O.) - Partes

Mecnica 1. p 2. brao 3. tubo ou canho 4. revlver 5. platina 6. charriot 7. parafusos para ajuste macro e/ou micromtrico do foco

ptica Sistema de aumento: - oculares - objetivas Sistema de iluminao: - espelho - condensador - diafragma - filtro

Observaes: 1. A imagem proporcionada pelo M.O. aumentada, virtual e invertida em relao ao objeto examinado. 2. Calcula-se o aumento da imagem obtida ao M.O. multiplicando-se o valor do aumento da ocular pelo valor do aumento da objetiva. 3. Campo microscpico a rea da preparao que se est observando ao M.O. Quanto maior o aumento da imagem, menor a abrangncia do campo. 4. Em virtude do ltimo item, sempre se inicia a observao ao M.O. com uma combinao de lentes que proporcione o menor aumento, a fim de se ter uma viso panormica da regio que se quer observar com maior aumento.

MANEJO DO MICROSCPIO

1. Acender a lmpada do sistema de iluminao. 2. Abrir totalmente o diafragma e colocar o sistema condensador diafragma na posio mais elevada, pois aquela que permite melhor iluminao. 3. Movimentar o revlver, colocando em posio a objetiva de menor aumento (4X). 4. Tomar a lmina com a lamnula para cima e coloc-la na platina, prendendo-a com os grampos. 5. Movimentar o charriot, fazendo com que o preparado fique em baixo da objetiva. 6. Com o parafuso macromtrico, elevar a platina ao mximo, observando que a objetiva no toque na lamnula, pois poder quebr-la. 7. Focalizar a preparao para a obteno de uma imagem ntida, movimentando o parafuso macromtrico e abaixando a platina at que se possa visualizar a imagem. 8. Aperfeioar o foco com o parafuso micromtrico. 9. Colocar a regio do preparado que se quer ver com maior aumento bem no centro do campo visual da lente. 10. Movimentar o revlver, colocando em posio a objetiva de 10X (aumento mdio). 11. Repetir o procedimento do item 6. 12. Para focalizar a nova imagem, repetir o procedimento do item 7. 13. Repetir o item 8. 14. Repetir o item 9. 15. Colocar a objetiva de 40X (maior aumento) em posio e repetir os itens 6, 7 e 8. 16. A objetiva de 100X chamada de imerso e seu uso ser explicado posteriormente.

OBSERVAES: 1. A maior parte de nossos microscpios possuem lentes parafocais. Isto significa que, uma vez obtido o foco com a objetiva de menor aumento, basta girar o revlver, colocar a objetiva 10X em posio e acertar o foco apenas com o parafuso micromtrico. 2. Age-se da mesma forma, ao focalizar a objetiva 40X, desde que a imagem esteja em foco com a objetiva 10X.

3. A objetiva de 100X chamada de imerso e seu uso ser explicado oportunamente. 4. O aluno dever repetir vrias vezes as operaes descritas no manejo do microscpio, a fim de atingir maior desenvoltura no manuseio do microscpio ptico.

TCNICA PARA OBTENO DE LMINAS (preparados histolgicos permanentes)

Sob este ttulo, estudaremos os passos para a obteno de um preparado histolgico permanente, denominado lmina, que sero descritos a seguir: 1. Colheita do material - a obteno da pea, por bipsia ou necropsia. 2. Fixao - o tratamento assim denominado visa impedir a destruio das clulas por suas prprias enzimas (autlise), ou bactrias. Este tratamento feito imediatamente aps a retirada do material (bipsia), ou at antes (fixao por perfuso do animal). A fixao visa ainda endurecer os tecidos, tornando-os mais resistentes e favorveis s etapas subsequentes da tcnica histolgica. Resumindo, pode-se dizer que a fixao o tratamento da pea histolgica a fim de que possamos observar ao microscpio os componentes teciduais, com a morfologia e a composio qumica semelhantes s existentes no ser vivo. A fixao pode ser feita por processos fsicos ou qumicos. A fixao qumica, mais usada em Histologia, feita por fixadores que podem ser simples ou compostos. Como exemplo de fixador simples temos o formol e, de composto, citamos o lquido de Bouin (uma mistura de formol, cido pcrico e cido actico). 3. Desidratao - visa retirar a gua dos tecidos, a fim de permitir a impregnao da pea com parafina. Para isto, a pea submetida a banhos sucessivos em lcoois de teor crescente (ex.: lcool a 70%, 80%, 90% e 100%). 4. Diafanizao - visa impregnar a pea com um solvente de parafina. O mais usado o xilol. 5. Impregnao pela parafina fundida - tem a finalidade de permitir a obteno de cortes suficientemente finos para serem observados ao microscpio. Para isso os tecidos devem ser submetidos a banhos de parafina a 60C, no interior da estufa. Em estado lquido, a parafina penetra nos tecidos, dando-lhes, depois de solidificada, certa dureza. 6. Incluso - a passagem da pea que estava na estufa para um recipiente retangular (forma) contendo parafina fundida que, depois de solidificada temperatura ambiente, d origem ao chamado bloco de parafina. A

incluso pode tambm ser feita com celoidina, gelatina ou resorcina epxi, sendo estas ltimas usadas para microscopia eletrnica. 7. Microtomia - a etapa em que se obtm delgadas fatias de peas includas na parafina, atravs de um aparelho chamado micrtomo, que possui navalha de ao. A espessura dos cortes geralmente varia de 5 a 10 um (micrmetros). (1 um = 0,001 mm) 8. Extenso - os cortes provenientes da microtomia so enrugados. Para desfazer estas rugas, so esticados num banho de gua e gelatina a 58C, e pescados com uma lmina. Leva-se ento, estufa a 37C, por 2 horas, para que se d a colagem do corte lmina, pela coagulao da gelatina contida na gua quente. 9. Colorao - tem a finalidade de dar contraste aos componentes dos tecidos, tornando-os visveis e destacados uns dos outros. Para realiz-la, so observados 3 itens:

a) Eliminao da parafina - por meio de banhos sucessivos em xilol, benzol ou toluol.

b) Hidratao - executada quando o corante utilizado solvel em gua. Deve ser gradativa, com lcoois de teor decrescente, para evitar o rompimento dos tecidos.

c) Colorao - os corantes so compostos qumicos com determinados radicais cidos ou bsicos que possuem cor, e apresentam afinidade de combinao com estruturas bsicas ou cidas dos tecidos. Rotineiramente, usa-se hematoxilina, corante bsico, que se liga aos radicais cidos dos tecidos, e eosina, corante cido que tem afinidade por radicais bsicos dos tecidos. Os componentes que se combinam com corantes cidos so chamados acidfilos e os componentes que se combinam com corantes bsicos so chamados basfilos. Por exemplo, os ncleos das clulas, onde predominam substncias cidas (DNA), so basfilos, ou seja, coram-se pela hematoxilina (corante bsico de cor roxa); por sua vez, o citoplasma, onde predominam substncias bsicas (protenas estruturais), acidfilo, corando-se pela eosina (corante cido de cor rosa).

10. Desidratao - visa retirar a gua, quando os corantes utilizados forem solues aquosas, a fim de permitir perfeita visualizao dos tecidos, pois a gua possui ndice de refrao diferente do vidro, e ainda prevenir a difuso dos corantes. Para isto usam-se banhos em lcoois de teor crescente. 11. Diafanizao - a diafanizao feita com xilol, a fim de tornar os cortes perfeitamente transparentes. 12. Montagem - a etapa final da tcnica histolgica, e consiste na colagem da lamnula sobre o corte, com blsamo do Canad, que solvel em xilol e insolvel em gua. A lamnula impede que haja hidratao do corte pela umidade do ar ambiente, permitindo ento que estas lminas se mantenham estveis por tempo indefinido. Aps a montagem, levam-se as lminas estufa, para secagem do blsamo do Canad.

Figura 1. Etapas da Tcnica Histolgica:

Figura 2. Diferentes planos de cortes histolgicos:

Figura 3. Diferentes planos de cortes histolgicos (continuao):

(Fonte das figuras : Bacha & Wood, 1991)