UNIVERSIDAD AUTNOMA DE SINALOA UNIDAD REGIONAL NORTE

ESCUELA SUPERIOR DE AGRICULTURA DEL VALLE DEL FUERTE

MANUAL DE PRCTICAS DEL LABORATORIO DE FITOPATOLOGA

ELABORADO POR:

Ing. Jess G. Loredo Vega Ing. Jorge Daniel Mena Adriano

JUAN JOS ROS, SIN.

ENERO DE 2009

INTRODUCCIN................................................................................................................3 1.1 IMPORTANCIA DE LAS PRCTICAS........................................................................3 1.2 DEFINICIN DEL MARCO DE ACCIN DEL LABORATORIO................................4 1.3 MATERIAS QUE APOYA............................................................................................4 2. CONDICIONES DEL LABORATORIO..........................................................................5 2.1 INFRAESTRUCTURA..................................................................................................5 2.2 PERSONAL ADSCRITO..............................................................................................5 2.3 EQUIPO........................................................................................................................6 2.4 MATERIALES..............................................................................................................6 2.5 REACTIVOS.................................................................................................................6 2.6 MEDIDAS DE SEGURIDAD........................................................................................7 3. REGLAMENTO..............................................................................................................7 3.1 ORGANIZACIN.........................................................................................................7 3.2 DERECHOS Y OBLIGACIONES.................................................................................8 3.2.1 LABORATORISTAS.................................................................................................8 3.2.2 PROFESORES..........................................................................................................8 3.2.3 ESTUDIANTES.........................................................................................................9 3.2.4 TESISTAS.................................................................................................................9 3.2.5 PERSONAS EXTERNAS..........................................................................................9 3.3 PROGRAMACIN DE PRCTICAS.........................................................................10 3.4 SANCIONES..............................................................................................................10 4.- RELACIN DE PRCTICAS.....................................................................................11 4.1 Nematologa VI semestre.........................................................................................11 4.1.1 PRCTICA 1. OBSERVACIN Y RECONOCIMIENTO DE LOS NEMTODOS FITOPARSITOS EN EL LABORATORIO.....................................................................11 4.1.2 PRCTICA 2. MTODOS PARA LA EXTRACCIN DE NEMTODOS DEL SUELO (ECTOPARSITOS)...........................................................................................13 4.1.3 PRCTICA 3. MTODOS PARA LA EXTRACCIN DE NEMTODOS DE LA RAZ (ENDOPARSITOS)..............................................................................................16 4.1.4 PRCTICA 4. MANIPULACIN DE NEMTODOS..............................................18 4.1.5 PRCTICA 5. PREPARACIONES PERMANENTES DE NEMTODOS..............20 4.1.6 PRCTICA 6. IDENTIFICACIN DE GNEROS DE NEMTODOS FITOPARSITOS............................................................................................................22 4.2 Bacteriologa y virologa, VII semestre..................................................................24 4.2.1 PRCTICA 1. ESTERILIZACIN DE EQUIPO DE LABORATORIO Y DE MEDIOS DE CULTIVO....................................................................................................24 4.2.2 PRCTICA 2. ELABORACIN DE MEDIOS DE CULTIVO.................................26 4.2.3 PRCTICA 3. MTODOS PARA OBTENER CULTIVOS PUROS.......................28 4.2.4 PRCTICA 4. TCNICAS DE TINCIN PARA DETERMINAR FORMA, TAMAO Y AGRUPACIN CELULAR...........................................................................................31 4.2.5 PRCTICA 5. PRUEBAS DE PATOGENICIDAD..................................................32 4.2.6 PRCTICA 6. REACCIN DE KOH......................................................................34 4.2.7 PRCTICA 7. TINCIN DE CPSULA.................................................................35 4.2.8 PRCTICA 8. OBSERVACIN DE SNTOMAS CAUSADOS POR FITOBACTERIAS............................................................................................................37 4.3 Fitopatologa General. IV semestre........................................................................40 4.3.1 PRCTICA 1. PREPARACIN Y MANEJO DE MEDIOS DE CULTIVO..............40 4.3.2 PRCTICA 2. AISLAMIENTO DE HONGOS FITOPATGENOS A PARTIR DE PLANTAS ENFERMAS...................................................................................................44

4.3.3. PRCTICA 3. ELABORACIN DE MONTAJES MICROSCOPICOS DE HONGOS FITOPATGENOS.........................................................................................47 4.3.4 PRCTICA 4. SNTOMAS CAUSADOS POR HONGOS FITOPATGENOS.....51 4.3.5 PRCTICA 5. PRUEBAS DE PATOGENICIDAD DE HONGOS FITOPATGENOS..........................................................................................................53 4.3.6 PRCTICA 6. IDENTIFICACIN DE GNEROS DE IMPORTANCIA AGRCOLA DE LA CLASE PHYCOMYCETES..................................................................................56 4.3.7 PRCTICA 7. IDENTIFICACIN DE GNEROS DE IMPORTANCIA AGRCOLA DE LA CLASE DEUTEROMYCETES.............................................................................58 4.3.8 PRCTICA 8. IDENTIFICACIN DE GNEROS DE IMPORTANCIA AGRCOLA DE LA CLASE ASCOMYCETES....................................................................................60 4.3.9 PRCTICA 9. IDENTIFICACIN DE GNEROS DE IMPORTANCIA AGRCOLA DE LA CLASE BASIDIOMYCETES................................................................................62 4.3.10 PRCTICA 10 ELABORACIN DE MEDIOS DE CULTIVO..............................64 4.3.11 PRCTICA 11. MTODOS PARA OBTENER CULTIVOS PUROS...................66 4.3.12 PRCTICA 12. TCNICAS DE TINCIN PARA DETERMINAR FORMA, TAMAO Y AGRUPACIN CELULAR..........................................................................69 4.3.13 PRCTICA 13. PRUEBAS DE PATOGENICIDAD..............................................70 4.3.14 PRCTICA 14. OBSERVACIN Y RECONOCIMIENTO DE LOS NEMTODOS FITOPARSITOS EN EL LABORATORIO.....................................................................72 4.3.15 PRCTICA 2. MTODOS PARA LA EXTRACCIN DE NEMTODOS DEL SUELO (ECTOPARSITOS)...........................................................................................73 4.3.16 PRCTICA 16. MTODOS PARA LA EXTRACCIN DE NEMTODOS DE LA RAZ (ENDOPARSITOS)..............................................................................................76 4.3.17 PRCTICA 17. MANIPULACIN DE NEMTODOS..........................................78 4.3.18 PRCTICA 18. PREPARACIONES PERMANENTES DE NEMTODOS..........80 INTRODUCCIN 1.1 IMPORTANCIA DE LAS PRCTICAS La vinculacin teora-prctica es una necesidad ineludible en el proceso de enseanzaaprendizaje de cualquier rama de las ciencias biolgicas, premisa que se reproduce para el caso particular de las asignaturas que estn estrechamente relacionadas con el departamento de parasitologa. El presente manual se ha elaborado con fines didcticos y aplicaciones prcticas para que los estudiantes que estn cursando las materias afines, tengan las herramientas bsicas para trabajar en el manejo de microorganismos, manejo de equipo y otros materiales en el laboratorio de fitopatologa. De tal manera que se incluyen los procedimientos para el anlisis de muestras de vegetales en la identificacin y/o deteccin de agentes fitopatgenos, tambin se incluyen los pasos a seguir en la esterilizacin del material a utilizar por ejemplo cristalera y medios de cultivo, as como el manejo del material vegetal para lograr aislar al agente causal, pruebas para evaluar su patogenicidad e identificacin, adems se incluyen las diferentes frmulas para la elaboracin de medios de cultivo para tal fin. En el presente trabajo, siempre sern bien recibidas las crticas constructivas por parte de colegas y estudiantes para mejorarlo y/o actualizarlo de manera constante. 3

1.2 DEFINICIN DEL MARCO DE ACCIN DEL LABORATORIO El Laboratorio de Fitopatologa de la Escuela de Agricultura del Valle del Fuerte, es un espacio donde se llevan a cabo distintas actividades como trabajos de investigacin de tesitas, prestadores del Servicio Social, se les brinda apoyo a investigadores que imparten cursos de reas afines con prcticas de laboratorio, se atiende a otras instituciones educativas sobre el funcionamiento del mismo, sealando que su actividad principal es atender las necesidades de enseanza del plan de estudios de la E.S.A.V.F., para que los alumnos puedan realizar experimentos prcticos necesarios para comprobar los conocimientos tericos que se les imparte en el aula y proporcionarles las herramientas para realizar aplicaciones reales de los conocimientos adquiridos. En el Laboratorio de Fitopatologa se imparten prcticas relacionadas con la observacin e identificacin de microorganismos patgenos como: hongos, bacterias, nematodos, virus, etc. Tambin se observan e identifican microorganismos no patgenos de cultivos que forman parte de la microflora del suelo.

1.3 MATERIAS QUE APOYA Plan 2 Bacteriologa y Virologa Conservacin de Granos Almacenados Cultivos I Cultivos II Dinmica de Enfermedades Fitopatologa Econmica Fruticultura Especial Fruticultura General Horticultura General Micologa Microbiologa de Suelos Nematologa Proteccin Vegetal

Plan 3 Cultivos Bsicos y Oleaginosas Fitopatologa General 4

2. CONDICIONES DEL LABORATORIO 2.1 INFRAESTRUCTURA El laboratorio de fitopatologa cuenta con la infraestructura necesaria y el equipamiento suficiente para la observacin e identificacin de hongos, bacterias y nematodos fitopatgenos, y para cubrir las necesidades del mismo. AREA DE PRACTICAS PRINCIPAL Cuenta con cinco mesas de trabajo con cubierta de acero inoxidable cada una y un total de 45 sillas y 17 bancos de laboratorio, con un pintarrn, un televisor para presentacin de imgenes, un herbario fitopatolgico, cajonera para el resguardo de muestras del herbario, el laboratorio tiene una capacidad para 50 personas, un espacio apropiado para la campana de flujo laminar, con capacidad para cinco personas. Sealando que esta rea cuenta con suministro de gas el cual se requiere para trabajos de muchas de las prcticas. REA DE NEMATOLOGA Cuenta con tres mesas de acero inoxidable, dos lavamanos, una columna de Collman, centrifuga, una autoclave, archivero, vitrina para el resguardo de material, estante para libros y documentos, dos escritorios y una computadora. Con capacidad para 30 personas. REA DE PREPARACIN DE PRCTICAS Cuenta con una mesa para preparacin de prcticas, una vitrina para el resguardo de cristalera y microscopia, un lavamanos, una incubadora, una estufa Arnold, un microboy, un congelador, una vitrina para resguardo de reactivos, tres vitrinas chicas y un escritorio. Capacidad para 20 personas. 2.2 PERSONAL ADSCRITO LABORATORISTA (Turno matutino) Ing. Jess G. Loredo Vega. Ingeniero agrnomo Parasitlogo egresado de la Escuela Superior de Agricultura del Valle del Fuerte generacin 2002-2007. Profesor adscrito a esta rea cubriendo el turno respectivo por el Ing. Hugo Beltrn Pea, quien se encuentra realizando un posgrado en el Colegio de Posgraduados Campus Montecillo, en Texcoco estado de Mxico. LABORATORISTA (Turno vespertino) Ing. Julia E. Hernndez Luna. Ingeniero agrnomo Parasitlogo egresada de la Escuela Superior de Agricultura del Valle del Fuerte, generacin 1991-1996. Profesora adscrita a esta rea cubriendo el turno vespertino.

2.3 EQUIPO MICROPLATE READER FOTOCOLORIMETRO PARA ELISA MODELO-STAT FAX 3200 SERIE 3200-2155 MARCA AWARENESS TECHNOLOGY 08040952 51563 WESCO 52905 WESCO 52906 WESCO 52907 WESCO 72891 LEYCA 51559 WESCO 51562 WESCO 30123 ZEISS (1411J229923) 72890 LEYCA 141122970 ZEISS MICROSCOPIOS DE DISECCION 8615243 SWIFT 52901 WESCO 52903 WESCO 52902 WESCO 51561 WESCO 52904 WESCO MICROSCOPIO CON CAMARA DE VIDEO DIJI PLUS LABOMED Tambin se cuenta con el equipo necesario para el aislamiento y purificacin de microorganismos como campana de flujo laminar, microboy, y el equipo para la esterilizacin de materiales usados en las distintas prcticas de laboratorio. 2.4 MATERIALES El laboratorio de Fitopatologa cuenta con el material suficiente para la realizacin de las prcticas de las asignaturas afines, algunos ejemplos de estos son: 2 Campanas de secado (p/nematodos) Vidrios de reloj Tubos de ensayo Matraces Erlen Meyer de varias medidas Pipetas Mecheros de alcohol Cajas Petri Vasos de precipitado Probeta graduada 2.5 REACTIVOS Los reactivos comnmente usados en las prcticas del rea de Fitopatologa son: 6

Agar nutritivo Alcohol Lacto fenol claro Lacto fenol azul Agar bacteriolgico Agar papa dextrosa Agar agar Aceite de inmersin

2.6 MEDIDAS DE SEGURIDAD El laboratorio de fitopatologa de la E.S.A.V.F., cuenta con las siguientes medidas de seguridad: 1 extintor 2 regaderas de emergencia 1 botiqun Sealamientos de seguridad 3. REGLAMENTO 3.1 ORGANIZACIN La Escuela Superior de Agricultura del Valle del Fuerte dentro de su organizacin acadmico-administrativa cuenta con laboratorios para la docencia y la investigacin. Estos son coordinados por el Coordinador de Prcticas y bajo su cargo se encuentran los responsables de cada laboratorio; podrn nombrarse becarios o brigadistas de servicio social como personal de apoyo. Para cada uno de los laboratorios pueden estar como responsables profesores adscritos a la Institucin; stos desarrollarn actividades de docencia, investigacin y difusin afines a las funciones del laboratorio que se le haya encargado. A su vez, los encargados debern organizar sus actividades con el Coordinador de Prcticas.

Las tareas prioritarias de los laboratorios son la docencia e investigacin; en el caso de difusin, esta deber estar coordinada entre el Departamento de Difusin y la Coordinacin de los Prcticas.

3.2 DERECHOS Y OBLIGACIONES 3.2.1 LABORATORISTAS Los Responsables de laboratorio tendrn a su cargo el resguardo del material, equipo y reactivos; debern mantener actualizados los inventarios correspondientes. Es obligacin del laboratorista portar la bata y otros accesorios definidos para su laboratorio. El Responsable de laboratorio deber preparar con la debida oportunidad los materiales, equipos y reactivos que sean necesarios para las actividades programadas de los laboratorios, con excepcin de aquellas actividades destinadas exclusivamente para los tesistas. El Responsable de laboratorio deber inspeccionar, limpiar y guardar adecuadamente el equipo y materiales a su cuidado. De igual forma llevar el control para la reposicin oportuna de material y equipos daados, destruidos o faltantes. Los Responsables de laboratorio podrn permitir la entrada a los laboratorios slo a aquellos alumnos o profesores investigadores que presenten el programa de trabajo de laboratorios autorizado por el Coordinador de Prcticas y el Coordinador Acadmico. Los Responsables de Laboratorio debern coordinar y supervisar las actividades del los auxiliares de laboratorio (becarios y prestadores de Servicio Social) y otras personas externas. 3.2.2 PROFESORES Es responsabilidad del profesor programar las prcticas y otras actividades que se desarrollarn en el(los) laboratorio(s) que corresponde(n) a cada uno de los grupos y/o tesistas que atiende, al inicio de cada semestre. Cada profesor deber portar la bata y otros accesorios correspondientes cuando realice actividades en el laboratorio. Es responsabilidad del profesor, dar las instrucciones y la orientacin de la actividad de laboratorio programada a los alumnos, tan clara y detalladamente como lo requiera la seguridad de los participantes y el alcance de los objetivos de la misma. El profesor deber estar presente en el laboratorio durante el desarrollo de las actividades que haya programado. Las actividades de laboratorio para una asignatura determinada sern controladas y evaluadas por el profesor a cargo. Los profesores que requieran para alguna actividad equipo especializado, debern solicitarlo al Coordinador de Laboratorios y a la Coordinacin Acadmica, quienes decidirn sobre su uso.

3.2.3 ESTUDIANTES Los alumnos podrn entrar a los laboratorios exclusivamente dentro de la fecha y hora programada para la actividad y con la presencia del profesor responsable de la asignatura o del trabajo de investigacin, salvo que exista un acuerdo entre el profesor y el laboratorista. El alumno deber realizar el trabajo de laboratorio con estricto apego a las disposiciones previamente establecidas por el asesor, el profesor, y/o el laboratorista responsable. Queda prohibido realizar cualquier otra actividad fuera del trabajo indicado y la indisciplina. Es obligatorio para los alumnos:
3.2.3.1. Dejar su mochila en el sitio predestinado para ello. 3.2.3.2. Portar bata y ropa adecuada al ingresar a los laboratorios. 3.2.3.3. No fumar dentro de los laboratorios. 3.2.3.4. No introducir ni ingerir alimentos y/o bebidas en los laboratorios. 3.2.3.5. No utilizar celulares ni aparatos de sonido que perturben el desarrollo de la prctica.

Los alumnos realizarn el manejo de los materiales, equipo y reactivos con el cuidado y la responsabilidad necesarios para mantener su seguridad y la de los dems, as como para la mejor conservacin de los mismos. Los alumnos debern entregar el material y equipo empleados en perfectas condiciones, limpio y funcional. En el caso de deterioro o faltante, se obliga a reponer el mismo en un plazo mximo de 15 das. Los alumnos debern entregar su reporte de prcticas en el lapso de cinco das hbiles al Responsable del Laboratorio.

3.2.4 TESISTAS Los tesistas podrn realizar sus trabajos de investigacin y/o actividades relacionadas en los laboratorios, siempre que tengan asignado un asesor y que se hayan programado sus actividades al inicio del semestre. Los tesistas se obligan a preparar, utilizar adecuadamente, lavar, limpiar y guardar el material que requieran en el desarrollo de sus actividades. Los tesistas podrn emplear el equipo especializado nicamente para estudios previamente autorizados por el responsable del laboratorio y/o del coordinador de laboratorios. Adems el alumno ser supervisado continuamente por el asesor y/o el profesor del estudio en cuestin.

3.2.5 PERSONAS EXTERNAS En los laboratorios de la ESAVF podrn programarse actividades de docencia e investigacin, previa autorizacin del Coordinador Acadmico, para personas externas a la institucin tales como: tesistas, investigadores, profesores y estudiantes de intercambio, prestadores de servicio social, practicantes, residentes y visitas.

Las personas externas debern ajustarse a la programacin de sus actividades y tendrn todas las obligaciones relativas al uso, conservacin y resguardo de los materiales utilizados.

3.3 PROGRAMACIN DE PRCTICAS El profesor responsable de cada materia realizar la programacin de sus prcticas al inicio de cada semestre ante el Coordinador de Prcticas. Para ello se tomarn en cuenta alguno o ms de los siguientes criterios: Horarios. Los horarios se definirn en funcin de las condiciones particulares de cada laboratorio y a las necesidades propias de las prcticas a desarrollar. Nmero de estudiantes. Cada laboratorio determinar el nmero de estudiantes que pueden realizar simultneamente una prctica. Cuando el nmero de estudiantes de un grupo exceda la capacidad de un laboratorio, se realizarn equipos de trabajo de manera coordinada entre el profesor y el laboratorista. El Coordinador de Prcticas se reunir con cada uno de los laboratorios para definir la programacin de prcticas a cubrir durante el semestre que inicia. Una vez acordado el programa, dar seguimiento para asegurar el cumplimiento del mismo. Las prcticas externas y visitas a los laboratorios estarn sujetas a la disponibilidad de espacios y horarios de cada laboratorio. Para ello se debern solicitar a la Direccin de la ESAVF al menos con una semana de anticipacin.

3.4 SANCIONES El laboratorista que incumpla con sus obligaciones recibir las sanciones administrativas correspondientes por las autoridades de la ESAVF. El profesor que no programe las prcticas de su(s) materia(s) al inicio del semestre slo podr acceder a este servicio en los espacios que el laboratorio tenga fuera de la programacin oficial. Cuando un profesor y/o su grupo falte injustificadamente a una prctica programada, la prctica se dar por vista. El alumno, interno o externo, que no cumpla con alguna de sus obligaciones, no tendr derecho a uso del laboratorio por el tiempo que considere el responsable del laboratorio.

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4.- RELACIN DE PRCTICAS Plan 2 4.1 Nematologa VI semestre

4.1.1 PRCTICA 1. OBSERVACIN Y RECONOCIMIENTO DE LOS NEMTODOS FITOPARSITOS EN EL LABORATORIO. INTRODUCCIN Los nemtodos son animales con una organizacin muy sencilla, que comprenden especies parasitas de plantas (Fitoparasitas), tambin existen nemtodos saprfagos (vida libre) que favorecen la descomposicin de la materia orgnica, Omnvoros e incluso Depredadores, sin olvidar que hay nemtodos parsitos de animales (Zooparsitos), entre ellos los entomopatgenos que parasitan insectos y pueden emplearse en la lucha biolgica contra las plagas.

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Estos nemtodos los podemos encontrar en todos los lugares; el mar, agua dulce, suelo y partes areas de las plantas; donde nos causan serios daos a las plantas cultivadas, sin embargo a menudo pasan desapercibidos por los tcnicos y agricultores o sus daos son confundidos con otros factores; como la falta de fertilidad del suelo (deficiencias de nutrientes), escaso contenido de humedad, etc. Esto se debe fundamentalmente a su tamao microscpico y a que viven en el suelo y/o el interior de las races de las plantas. OBJETIVOS: Que el alumno reconozca y aprenda a diferenciar los nemtodos fitoparsitos de los de vida libre en el laboratorio. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Microscopio de diseccin Microscopio biolgico MATERIAL Vidrios de reloj Pipetas Agua DESARROLLO DE LA PRCTICA Usando los nemtodos disponibles en el laboratorio, se coloca en un vidrio de reloj una alcuota (2-5 mm) de la suspensin nemtodos-agua, enseguida se pasan al microscopio de diseccin para ser observados e identificar los nematodos fitoparsitos de los de vida libre. Y despus se observan en el microscopio biolgico. INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFA CEPEDA, S. M. (1995). Prcticas de nematologa agrcola. ED; Trillas. Mxico. 109 pp.

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4.1.2 PRCTICA 2. MTODOS PARA LA EXTRACCIN DE NEMTODOS DEL SUELO (ECTOPARSITOS) INTRODUCCIN Las muestras tradas del campo tienen que ser procesadas en el laboratorio para obtener los nemtodos y observarlos con la ayuda del microscopio para su identificacin y conteo. Hay nematodos fitoparsitos que se alimentan de las races como ectoparsitos, los que siempre estarn en el suelo; pero otros se introducen al sistema radical (endoparsitos) del cual se alimentan e incluso algunos se mueven hasta las partes reas. El mtodo de extraccin ser de acuerdo al tipo de nemtodos mencionados anteriormente. OBJETIVOS: Qu el alumno se adiestre en las diferentes tcnicas para la extraccin de nemtodos del suelo (nemtodos de vida libre y fitoparsitos). MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Centrfuga 13

Microscopio de diseccin MATERIAL Muestras de suelo con nematodos Embudos de 10-15 mm de dimetro Tubos de goma Pinzas de presin Malla de alambre Papel filtro Etiquetas Probeta Cubeta de plstico Tamiz de 100 mallas por pulgada cuadrada. Tamiz de 325 mallas por pulgada cuadrada. Tamiz de 500 mallas por pulgada cuadrada. REACTIVOS Kaoln Sucrosa DESARROLLO DE LA PRCTICA PREPARACIN DE LA MUESTRA La muestra que se recogi en el campo se esparce sobre un pedazo de plstico, se desmenuzan los terrones, se eliminan las piedras y separamos las races para procesarlas posteriormente y extraer los nemtodos endoparsitos. Una vez mullido el suelo, se procede a homogenizarlo con el fin de que las submuestras formen una muestra compuesta, finalmente se distribuye en el plstico. MTODO DEL EMBUDO DE BAERMANN: Primero se coloca un tubo de goma (8-10 cm. de largo) al cuello de un embudo de 10-15 mm. de dimetro, enseguida se lavan ambos perfectamente y luego se coloca una pinza de presin en el tubo de goma para cerrar el paso del agua. Despus se procede a llenar con agua hasta 1 cm. bajo del borde del embudo y se coloca el embudo en la gradilla. Enseguida se etiqueta con los datos necesarios como: # de muestra, hospedero, fecha y lugar de colecta Una vez que se ha hecho lo anterior, se procede a preparar una tela de alambre que de antemano est amoldada al embudo, sobre ella se coloca un papel facial (kleneex) y luego la muestra de suelo (40-50 grs.), se envuelve la muestra y se humedece con una piceta, se coloca la tela de alambre sobre el embudo cuidando que esta toque el agua del embudo. Dejamos el embudo en reposo y a las 24 horas se sacan en un vaso de precipitado unos 10 ml. de agua. En ellos van los nemtodos parsitos y saprofitos que pasaron por el papel facial y la malla. Si se desea, se pueden observar directamente los nemtodos al microscopio de diseccin, esto se hace colocando unos 5 ml. de la suspensin en un vidrio de reloj, luego se observan. En caso contrario o despus de realizado lo anterior, se procede a matarlos y fijarlos para su preservacin por tiempo indefinido. 14

MTODO COMBINADO (TAMIZ-EMBUDO DE BAERMANN): Del suelo distribuido en el plstico, se toman muestras en diversos puntos agregndose a una probeta que contiene 200 CC de agua hasta aforar a 300 CC. El contenido de la probeta se pasa a una cubeta A, con 4-5 lts. de agua, en la cual se siguen desmenuzando los terrones hasta que se disuelva bien el suelo. Se agita la solucin y la dejamos reposar durante 15-30 segundos para que se sedimente el material pesado y los nemtodos permanezcan flotando. El contenido de la cubeta A, se pasa a travs de un tamiz de 100 mallas por pulgada cuadrada a una cubeta B, en la cual se agita y la dejamos sedimentar para pasarlo por un tamiz de 325 ( 500) y lo que queda en l se pasa al embudo de Baermann. MTODO DE FLOTACIN (TAMIZ-CENTRFUGA): Lo que queda en el tamiz de 325 500 se pasa a un vaso de precipitado y se distribuyen los tubos de la centrifuga a los que previamente se les agreg 0.5-1.0 g de kaoln, el cual se mezcla bien y se centrifuga a 3000 rpm por 5 minutos, lo que permite la sedimentacin de los nemtodos junto con las partculas de suelo (favorecido por el kaoln). Despus se decanta el sobrenadante eliminando la materia orgnica suspendida. El sobrenadante eliminado se sustituye por solucin sucrosa (45 g. de solucin sucrosa o azcar refinada en 100 CC. de agua destilada) y se mezcla con la muestra. Se centrifuga a 3000 rpm durante 2 minutos y el sobrenadante se pasa por el tamiz de 325 500 mallas donde los nemtodos quedan retenidos procedindose inmediatamente a lavarlos sumergiendo el tamiz en agua para eliminar el azcar del cuerpo de los nemtodos. Con la ayuda de una piceta se pasan a un vaso de precipitado, quedando listo los nemtodos para hacer observaciones al microscopio y/o matarlos y fijarlos para estudios posteriores de identificacin y conteo. INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFA PACHECO, A. J. (2000). Manual de prcticas de laboratorio de Nematologa. Juan Jos Ros, Sin; Mxico. 20 pp. THORNE, G. (1961). Principles of nematology, MC. Graw-Hill book Co, New York, Estados Unidos. 553 pp.

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4.1.3 PRCTICA 3. MTODOS PARA LA EXTRACCIN DE NEMTODOS DE LA RAZ (ENDOPARSITOS) INTRODUCCIN Paralelamente al grupo de los nemtodos ectoparsitos (es decir, aquellos que se alimentan externamente de la raz y cuyo hbitat es el suelo), existe el grupo de los endoparsitos que se han adaptado a vivir dentro de los tejidos vegetales y que ya no dependen totalmente del ambiente del suelo, sino ms bien de lo que ocurre en la planta. As pues, podemos encontrar nemtodos desde la raz, tallos y hojas hasta en las flores, frutos y semillas, y que constituyen un serio problema para la agricultura porque son un grupo mucho ms peligroso que el anterior. Para la extraccin de estos nemtodos, existen algunos mtodos que por su sencillez y efectividad vale la pena conocerlos. OBJETIVOS: Que el alumno conozca y realice los mtodos de extraccin ms sencillos y prcticos que se conocen para extraer nemtodos endoparsitos. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO 16

Microscopio de diseccin Licuadora MATERIAL Races infectadas por nematodos Navajas Embudos Tamiz 325 mallas por pulgada cuadrada Agujas de diseccin REACTIVOS Kaoln Sucrosa DESARROLLO DE LA PRCTICA OBSERVACIN DIRECTA: Se usa en races con agallamiento, se utilizan agujas de diseccin para desmenuzar las agallas y extraer hembras, juveniles, machos y masas de huevecillos de los nemtodos que causan agallas (Meloidogyne spp. y Nacobbus spp.). INCUBACIN: Las races previamente lavadas o el follaje son cortados en pequeas piezas y se colocan en un recipiente con agua limpia dejndose reposar por unas 24-48 horas para que los nemtodos salgan de los tejidos. LICUADORA CENTRFUGA: Las races lavadas se licuan a alta velocidad durante un minuto y el licuado se centrifuga de igual forma que en la flotacin para nemtodos ectoparsitos. EMBUDO DE BAERMANN: Se procede de igual forma que lo descrito para ectoparsitos, solo que aqu usamos en lugar de suelo, pequeas piezas de races previamente lavadas. LICUADO-TAMIZADO: Lavar el material vegetal y cortar alrededor de 5 g. de races; los trocitos de raz se colocan en una licuadora en 100 ml. de agua y licuar durante un minuto. El material licuado se pasa a travs de un tamiz de 325 mallas, recogiendo el material en un vaso de precipitado. Despus observar al microscopio de diseccin. INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFA GERARDO, A. M. (2002). Manual de prcticas de Micologa. Juan Jos Ros, Sin; Mxico. 35 pp.

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4.1.4 PRCTICA 4. MANIPULACIN DE NEMTODOS INTRODUCCIN La manipulacin de los nematodos previo a su identificacin y conteo una vez que han sido extrados por las tcnicas usadas en el laboratorio, es un proceso muy importante porque lleva implcitos el matado, fijado y pesca de estos organismos. OBJETIVOS: Que el alumno conozca las tcnicas de manipulacin ms usadas para realizar la identificacin y conteo de nematodos en un anlisis nematolgico de una muestra. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Microscopio de diseccin MATERIAL Vidrio de reloj Lmpara de alcohol Pipetas Palillos de bamb Vasos de precipitado 18

Tubos de ensayo Portaobjetos REACTIVOS Agua Fijador FA. 4:10 DESARROLLO DE LA PRCTICA MATADO: Existen varios mtodos para realizar el matado de los nemtodos pero todos ellos lo hacen tratando de evitar su distorsin. Hay 2 formas generales para realizar esta operacin, ellas son: MATADO EN VIDRIO DE RELOJ: Se coloca en un vidrio de reloj una alcuota de la suspensin nemtodos-agua y enseguida se expone durante 12 segundos a la flama de una lmpara de alcohol. Despus se observan al microscopio de diseccin para verificar su muerte. MATADO EN MASA: Se pone a calentar agua en un vaso de precipitado de 500 ml., cuando alcance una temperatura de 60 C se retira de la flama y se introduce durante 34 minutos el recipiente (tubo de ensayo) que contiene 10 cc. de agua con nemtodos. Tambin se puede matar dejando hervir el agua introduciendo el tubo de ensayo durante un minuto. FIJACIN: Una vez que los nemtodos han sido matados, se deja enfriar el agua con nemtodos y se le agrega el fijador (FA. 4:10) en una porcin de 1:1. Fijador FA. 4:10 Formol al 40%.................... 10 CC. Acido glacial actico............10 CC. Agua destilada.....................10 CC. Nota: Con este fijador los nemtodos rara vez se distorsionan, pero tienden a tornarse caf y la parte posterior del estilete de los Tylenchidos se vuelven transparentes despus de unos cuantos das. PESCA DE NEMTODOS: Despus de la extraccin, matado y fijacin de los nemtodos, es necesario que sean trasladados a un portaobjetos con una gota de agua para observarlos, estudiar sus caractersticas e identificacin bajo el microscopio biolgico. El traslado se hace siempre de uno en uno con la ayuda de una varita de bamb con la punta bien adelgazada. La tcnica para pescar nematodos es la siguiente: 1.- En el centro de un portaobjetos se deposita una gota de agua. 2.- Se coloca una alcuota de la suspensin agua-nemtodos matados y fijados en un vidrio de reloj y se observan bajo el microscopio estereoscpico.

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3.- Se localiza un nematodo en el fondo del vidrio de reloj y con la ayuda de la varita de bamb se lleva al nematodo hacia la superficie lentamente y una vez en la superficie, se saca rpidamente y se coloca en la gota de agua del portaobjetos. 4.- Nuevamente se busca otro nemtodos y se sigue el mismo procedimiento hasta trasladar por lo menos 5 nemtodos al portaobjetos. 5.- Se coloca un cubreobjetos a la gota de agua con nemtodos. Enseguida se observa al microscopio biolgico. 6.- Se estudian las caractersticas de cada nematodo para su identificacin y su posterior cuantificacin. INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFA PACHECO, A. J. (2000). Manual de prcticas de laboratorio de Nematologa. Juan Jos Ros, Sin; Mxico. 20 pp. THORNE, G. (1961). Principles of nematology, Mc. Graw-Hill book Co, New York, Estados Unidos. 553 pp.

4.1.5 PRCTICA 5. PREPARACIONES PERMANENTES DE NEMTODOS INTRODUCCIN En nemtodos fijados muchos de los detalles internos del cuerpo, especialmente gnadas, pueden ser obscurecidas por la apariencia granular del intestino. Los especimenes pueden ser aclarados procesndolos a lact fenol glicerina, los cuales son medios de montaje apropiados. Adems es muy importante con fines acadmicos o de investigacin al conservar preparaciones permanentes de nemtodos. OBJETIVOS: Que el alumno aprenda a realizar preparaciones permanentes de nemtodos para su conservacin. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Estufa Arnold MATERIAL Campana deshidratadora Vidrio de reloj Pelo de ngel Portaobjetos 20

Cubreobjetos REACTIVOS Etanol 96% Glicerina Agua destilada Lacto fenol Cloruro de calcio DESARROLLO DE LA PRCTICA Transferir nemtodos del fijador a un vidrio de syracuse o de reloj que contenga 0.5 ml. de la siguiente solucin: Solucin I: Etanol 96%.................... 20 partes Glicerina........................ 1 parte Agua destilada.............. 79 partes Colocar el vidrio de reloj es una campana deshidratadora que contiene 1/10 de su capacidad con etanol 96% y djelo cuando menos durante 12 horas en una estufa a 3540 C. Esto permite que se elimine casi toda el agua y deja a los nemtodos en una mezcla de glicerina y etanol. Llene el vidrio de reloj con la solucin II (5 partes de glicerina y 95 partes de etanol 96%) y parcialmente cerrado, colquelo durante 3 horas en una estufa a 40 C para que se evapore lentamente el etanol hasta que los nemtodos queden en glicerina pura. Los nemtodos as deshidratados son transferidos a una gota de glicerina pura (purificarla dejndola en un recipiente abierto en una campana deshidratadora que contenga cloruro de calcio) en un portaobjetos, se colocan 2 tiras de pelo de ngel, despus se coloca un cubreobjeto y el borde de ste se sella con esmalte de uas transparentes. Se colocan etiquetas adhesivas al portaobjeto con los siguientes datos: 1.- Nombre cientfico 2.- Localidad 3.- Hospedante 4.- No. de hembras y machos 5.- Colector 6.- Fecha INFORME DE RESULTADOS

BIBLIOGRAFA YEPEZ, T. G. (1972). Los nemtodos enemigos de la agricultura, Imprenta Universidad de Caracas; Universidad Autnoma de Venezuela, Facultad de Agronoma. Venezuela. 220 pp. 21

4.1.6 PRCTICA 6. IDENTIFICACIN DE GNEROS DE NEMTODOS FITOPARSITOS INTRODUCCIN Los nemtodos fitoparsitos abarcan un gran nmero de gneros y especies de gran importancia agrcola. El conocimiento de la sintomatologa, morfologa, biologa y control es de inters fundamental para el parasitlogo. El control de los nemtodos fitoparsitos, se basa en una identificacin correcta del nematodo en cuestin, de ah que sea importante conocer las caractersticas morfolgicas ms importantes de los principales gneros de estos patgenos. OBJETIVOS: Que el alumno conozca y diferencie las caractersticas morfolgicas de los principales gneros de nemtodos fitoparsitos de importancia agrcola. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Microscopio biolgico

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MATERIAL Suelo con nemtodos Montajes permanentes Portaobjetos DESARROLLO DE LA PRCTICA 1.- Elaborar montajes a partir de material vegetal enfermo o suelo procesado, los montajes se harn siguiendo la metodologa descrita anteriormente. 2.- Usando los montajes permanentes disponibles en el laboratorio, observar al microscopio biolgico los especimenes, con los objetivos 10x y 40x. 3.- Dibujar cada espcimen cuidadosamente, resaltando las caractersticas ms importantes: forma, tamao, tipo de estilete, tipo de esfago, unin del bulbo basal con el intestino, posicin de la vulva, tipo de cola, caractersticas del sistema reproductor de la hembra, etc. 4.- Se estudiarn los siguientes gneros: -Meloidogyne -Heterodera -Globodera -Punctodera -Nacobbus -Xiphinema INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFA CEPEDA, S. M. (1995). Prcticas de nematologa agrcola. ED; Trillas. Mxico.

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4.2 Bacteriologa y virologa, VII semestre. 4.2.1 PRCTICA 1. ESTERILIZACIN DE EQUIPO DE LABORATORIO Y DE MEDIOS DE CULTIVO INTRODUCCIN El microbilogo y el fitopatlogo necesitan frecuentemente trabajar con materiales y equipos estriles, en el caso de medios de cultivo la esterilidad es obligada antes de usarlos. La esterilizacin es el proceso mediante el cual se obtienen sustancias o materiales libres de organismos vivos. Los mtodos de esterilizacin pueden ser qumicos o fsicos. Entre los mtodos fsicos se encuentra el calor, las radiaciones y la filtracin. El mtodo qumico incluye el uso de gases o sustancias lquidas con propiedades biocidas. OBJETIVOS: Que el alumno comprenda el concepto de esterilizacin y aprenda a utilizar los aparatos usados en el laboratorio para este fin. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Autoclave Estufa Arnold MATERIAL Medio de cultivo Agua Cajas Petri Tubos de ensayo Pipetas Matraces Morteros Probetas REACTIVOS Medio de cultivo Agua

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DESARROLLO DE LA PRCTICA ESTERILIZACIN POR CALOR HMEDO 1). Revise que el agua se encuentre al nivel de la rejilla basal. 2). Introducir el material a utilizar. 3). Cierre el recipiente correctamente. 4). Abra la vlvula de escape para que salga el aire seco y encienda la olla de presin. 5). Un minuto despus de que empieza a salir el aire y vapor, cierre la vlvula de escape. El tiempo de esterilizacin se empieza a contar hasta que la aguja alcance 15 libras/pulgada cuadrada. 6). Mantenga el aparato de 15-20 libras durante el tiempo deseado, regulando la flama del mechero. 7). Concluido el tiempo de esterilizacin, apague el aparato, espere a que baje a cero presin antes de sacar con cuidado el material caliente. ADVERTENCIA: nunca deje el aparato encendido sin vigilancia. ESTERILIZACION CON CALOR SECO 1). Deposite el material seco y limpio en la estufa. 2). Cierre perfectamente y encienda el interruptor. 3). Ajuste el regulador a la temperatura deseada, cheque la temperatura con el termmetro y cuente el tiempo de esterilizacin cuando se alcance la temperatura requerida (100-180 oC). 4). Concluido el tiempo de exposicin, apague el aparato. ADVERTENCIA: no saque cristales muy calientes de la estufa, pues al contacto con el aire fro o caliente se revientan. INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFA Echando, E. 1971 Manual de Laboratorio para Fitopatologa General, Herrera Hermanos. Sucesores. 89 pp. Lpez, A. G. F. 1979. Manejo de hongos fitopatgenos. Departamento de Parasitologa Agrcola. UACH. 135 pp. Diversos textos de microbiologa: Bryan, Burdon. Pelckzar, etc.

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4.2.2 PRCTICA 2. ELABORACIN DE MEDIOS DE CULTIVO INTRODUCCIN Para el cultivo in Vitro de fitobacterias se requiere de la elaboracin de un medio que proporcione todos los requerimientos nutricionales que permitan su reproduccin, los cuales se les conoce como medios de cultivo. Los medios de cultivo contienen cuatro componentes esenciales: fuentes de carbono y nitrgeno, minerales y vitaminas. Existe una gran variedad de de fuentes de carbono que se pueden emplear en los medios de cultivo como son: alcoholes, pentosas, hexosas, disacridos, trisacridos, polisacridos, cidos e hidroxicidos ya sean solos o en combinacin. OBJETIVOS: Que el alumno conozca y aprenda a elaborar medios de cultivo para el aislamiento de bacterias fitopatgenas. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Autoclave Agitador magntico MATERIAL Agar Nutritivo Agua destilada Casena hidrolizada Peptona Glucosa Extracto de carne Sacarosa DESARROLLO DE LA PRCTICA AGAR NUTRITIVO Agar nutritivo 23 g Agua destilada 1000 ml Disolver el agar nutritivo en el agua, si desea puede dividir el lquido en dos matraces. Esterilizar en autoclave a 115 lbs/pulgada cuadrada durante 15 minutos y vaciar en cajas de Petri. Este medio generalmente se emplea para aislamientos de material vegetal. Es un medio til para el aislamiento de especies de Xanthomonas.

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MEDIOS DE CULTIVO DIFERENCIALES (TTC) Peptona 10 g Casena hidrolizada 1.0 g Glucosa 5.0 g Agar 12 g Agua 1000 ml Ajustar el ph a 7 y esterilizar en la forma normal, cuando el medio alcance una temperatura de aproximadamente 45-50 0C adicionar solucin acuosa de cloruro de tetrazolio al 1.0% para dar una concentracin final de 0.005%. Con este medio de cultivo se pueden detectar las colonias virulentas y avirulentas de Ralstonia solanacearum y P. s. p.v. phaseolicola. En el primer caso las colonias virulentas son blancas, fluidas, con centro rojo y para la segunda bacteria las cepas virulentas forman colonias rojas y las avirulentas son blancas. MEDIO PARA LA PRODUCCION DE LEVANA Extracto de carne 3g Peptona 10 g Sacarosa 50 g Agar 20 g Agua 1000 ml Disuelva los ingredientes, esterilice en la forma convencional y vace en cajas esterilizadas. MEDIO DE GELATINA Extracto de carne Peptona Gelatina Agua La gelatina se adiciona calienta para disolver constituyentes. Ajustar minutos. 3.0 g 5.0 g 120.0 g 1000 ml al agua y se deja hidratar durante 15 a 30 minutos y luego se la gelatina; posteriormente agregar y disolver los otros el ph a 7, vaciar a tubos y esterilizar a 120 0C durante 20

INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFA Agrios, GN. 2007. Fitopatologa. LIMUSA, Mxico. 285-288 p. Fucikovsky, Z. L. 1995 Manual de bacteriologa Bacterias fitopatgenas INSTITUTO DE FITOSANIDAD. Colegio de Postgraduados.

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4.2.3 PRCTICA 3. MTODOS PARA OBTENER CULTIVOS PUROS INTRODUCCIN El cultivo puro, es una condicin artificial en el crecimiento de bacterias bajo condiciones de laboratorio. Para determinar las caractersticas de una especie bacteriana en particular, es imperativo que el organismo sea aislado y multiplicado en laboratorio en cultivo puro. Existe una variedad de tcnicas para el aislamiento y desarrollo de bacterias como son: tcnica de estra cruzada y la de vaciado en placa. OBJETIVOS: Que el alumno conozca y aprenda a realizar las tcnicas para el aislamiento y obtencin de cultivos puros de bacterias fitopatgenas. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Cmara de flujo laminar o microboy MATERIAL Medio de cultivo Cajas Petri Lmpara de alcohol Asa bacteriolgica Material vegetal enfermo Navajas o bistur Tubos de ensayo Agua destilada estril DESARROLLO DE LA PRCTICA Tcnica de estra cruzada. Con el asa bacteriolgica previamente flameada y enfriada, se toma una gota de suspensin bacteriana del tubo de ensayo. Se procede a realizar un estriado (4 o 5 rayas) en la caja de Petri. A partir de la ultima raya del estriado # 1, se comienza a rayar el estriado # 2, esto se repite 4 5 veces cuidando de no tocar mas que la ultima raya del estriado anterior. Todo esto se realiza en el microboy previamente desinfectado y con la ayuda de una lmpara de alcohol. Al terminar se sellan las cajas y se incuban a 28 grados centgrados Durante 24-48 hrs. Tcnica de vaciado en placa. Para lograr tener colonias separadas por esta tcnica, primeramente se debe hacer una suspensin (que se puede lograr al suspender el material vegetal enfermo en agua esterilizada o en medio de cultivo lquido). De esta suspensin se toma una gota 0.5 ml y se transfieren a otro tubo matraz con medio de cultivo con agar lquido. Esta operacin se repite 2 3 veces ms, teniendo cuidado de agitar los tubos antes de hacer la transferencia. Inmediatamente despus de cada dilucin, el contenido de cada uno de los tubos se traslada a una caja Petri estril y despus del periodo de incubacin se obtendrn colonias separadas.

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AISLAMIENTO Y PURIFICACIN Uno de los requisitos para considerar a una bacteria como el agente inductor de una enfermedad, es aislarla y purificarla a partir del tejido enfermo. Para llevar a cabo esta etapa existen diferentes metodologas y la eleccin de cualquiera de ellas depender del tipo de sntoma, rgano afectado, grado de avance de la enfermedad y del material y equipo disponibles. Entre las tcnicas de aislamiento ms comunes, se encuentran las siguientes: AISLAMIENTO DIRECTO (Para muestras con marchites) PROCEDIMIENTO 1. Con una navaja flameada y enfriada, haga un corte transversal al tallo que presente flacidez incipiente, de preferencia cerca del nivel del suelo. 2. Haga una ligera presin y espere unos segundos para que de los haces vasculares salga un exudado bacteriano. 3. Con el asa previamente flameada y enfriada, tome del exudado y transfiralo a un tubo con agua destilada estril. 4. Agite el tubo para homogeneizar. 5. Con el asa flameada tome una gota de la suspensin y siembre una caja con medio de cultivo por el mtodo de estra cruzada. 6. Incube a 28 0C por 24-48 horas. INMERSIN DEL TEJIDO EN AGUA ESTERIL (Para muestras con manchas o tizones) PROCEDIMIENTO 1. Al microscopio estereoscpico observe los tejidos afectados, para detectar la presencia de exudados, escamas bacterianas, micelio u otras estructuras fungosas. 2. De la zona de avance de la enfermedad haga una preparacin en fresco y observe al microscopio compuesto. 3. Si en estas preparaciones observa nicamente clulas bacterianas, esto le indica que el sntoma se puede deber a bacterias, por el contrario, si observa micelio, lo ms seguro es que el sntoma sea ocasionado por un hongo. 4. Seleccione tejido enfermo y lvelo con agua estril. 5. Corte pequeos trocitos y desinfctelos con una solucin de hipoclorito de sodio al 1% durante 1 a 2 minutos. 6. Decante el hipoclorito de sodio y lave 3 veces con agua esterilizada. 7. Una vez transcurridos los 5 10 minutos, tome una gota de la suspensin con el asa bacteriolgica y siembre con estra cruzada una caja con medio de cultivo. 8. Despus del periodo de incubacin seleccione las colonias bacterianas que se asemejen a las del agente causal, y simbrelas una nueva caja con medio de cultivo para obtener as, suficiente cultivo puro y continuar con las pruebas de patogenicidad. 29

INMERSIN DEL TEJIDO EN AGUA ESTERIL (Muestra con sobrecrecimiento) PROCEDIMIENTO 1. Con un cepillo pequeo y cerdas suaves lave al chorro del agua la agalla o tejido con fasciacin y luego haga unas fracciones. 2. Coloque los cortes en un tubo con 3 ml de agua destilada estril y mantngalos as durante unos 10-20 minutos. 3. Pase 3 asadas de la suspensin anterior a otro tubo con 3 ml de agua estril. 4. Siembre 2 cajas con medio de cultivo por estra cruzada. 5. Incube a 22-28 0C durante 2-4 das. 6. Seleccione las colonias bacterianas con caractersticas del posible patgeno y transfiera a las otras cajas con medio de cultivo. INFORME DE RESULTADOS

BIBLIOGRAFA Rodrguez, M. M. 2001 Manual de prcticas de bacterias fitopatgenas. DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIA AGRICOLA. Universidad Autnoma de Chapingo.

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4.2.4 PRCTICA 4. TCNICAS DE TINCIN PARA DETERMINAR FORMA, TAMAO Y AGRUPACIN CELULAR INTRODUCCIN Como las clulas bacterianas son incoloras, se requiere del empleo de colorantes para hacerlas ms ntidas al microscopio, para lo cual se pueden emplear tcnicas de coloracin simples o diferenciales. Tincin simple. El azul de metileno de Loeffler es uno de los reactivos ms valiosos que se tienen para la tincin de bacterias. Es excelente para las bacterias del gnero Curtobacterium donde puede demostrar el perlado y los grnulos. En los bacilos esporulados (Bacillus), teidos con este reactivo, las esporas aparecen como cuerpos no teidos dentro de clulas azules. Tincin diferencial. Una de las tcnicas ms ampliamente utilizadas es la Tincin de Gram., porque no solo permite determinar la forma y agrupacin de las bacterias, sino tambin es de considerable valor en la identificacin y clasificacin, al separar a las bacterias en gram negativas y gram positivas. OBJETIVOS: Que el alumno aprenda a utilizar los reactivos para llevar a cabo las distintas tcnicas de coloracin de bacterias. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Microscopio biolgico MATERIAL Cultivo bacteriano Asa bacteriolgica Agua alcohol Azul de metileno Portaobjetos Lmpara de alcohol Cristal violeta Lugol Safranina INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFA Fucikovsky, Z. L. 1995 Manual de bacteriologa Bacterias fitopatgenas INSTITUTO DE FITOSANIDAD. Colegio de Postgraduados.

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4.2.5 PRCTICA 5. PRUEBAS DE PATOGENICIDAD INTRODUCCIN Cuando una planta, supuestamente infectada por una bacteria, es trada al laboratorio, se procede al aislamiento en medio artificial de cultivo segn la tcnica usual. No obstante, los resultados del aislamiento precisan ser interpretados con cautela, pues: a) las colonias desarrolladas en la caja de Petri pueden ser bacterias saprofitas, por lo que la enfermedad puede no ser provocada por estas bacterias. b) aparecen en la caja, colonias de bacterias patognicas y saprofitas las cuales no se diferencian por su aspecto. c) las colonias obtenidas, aunque sean de bacteria patognica, se presentan avirulentas o perdieron por alguna razn, la patogenicidad. La demostracin de la patogenicidad de una cepa bacteriana es un procedimiento complicado que requiere mucho tiempo para que aparezcan los sntomas tpicos de la enfermedad en a planta homloga. En la mayora de las ocasiones no siempre se dispone de este material, siendo ms difcil, an, cuando se tratan de rboles o plantas que no se encuentran en la regin. Existen pruebas de patogenicidad como la reaccin de hipersensibilidad, pudricin del tubrculo de papa, inoculacin a frutos verdes de peral o manzano las cuales se describen a continuacin. OBJETIVOS: Que el alumno aprenda a realizar pruebas de patogenicidad de bacterias fitopatgenas. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Microscopio biolgico Incubadora MATERIAL Material vegetal enfermo Agua estril Alcohol Cajas de Petri Papel filtro DESARROLLO DE LA PRCTICA PUDRICIN DEL TUBERCULO DE PAPA Para bacterias aisladas de rganos con pudricin, la patogenicidad se puede valorar con la prueba de pudricin del tubrculo de papa y los resultados se pueden observar a las 24 horas de haberse realizado.

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PROCEDIMIENTO Un tubrculo de papa de preferencia de la variedad Alpha, se lava, se seca y se desinfecta superficialmente, bandolo con etanol al 70%, seguido de un flameado (evite adicionar mucho alcohol porque al quemarse podr daar las capas externas del tubrculo y se correr el riesgo de contaminacin por bacterias esporuladas como Bacillus spp. De estos tubrculos se cortan rebanadas de 5mm de grosor y se colocan en cajas de Petri con papel filtro (previamente esterilizado) se pueden acomodar dos rebanadas por caja y una de ellas servir de testigo. A cada una de las rebanadas se les hace una insicin superficial y solo en una de ellas se pone crecimiento de la bacteria a probar. Finalmente se le adicionan unos 2-3 mm de agua estril solo para humedecer el papel y crear un ambiente hmedo, se incuban a 28 0C durante 24-72 horas. A partir de las primeras 24 horas, se palpa el tejido de cada una de las rebanadas y si la que ha sido inoculada, se siente blanda, indica que la bacteria probada sintetiza enzimas pectolticas y es muy probable que sea el agente causal de la pudricin. Al igual que la prueba anterior, tambin sirve para diferenciar especies y pato vares de Pseudomonas fluorescentes. INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFA Agrios, GN. 2007. Fitopatologa, LIMUSA. Mxico. 35 p.

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4.2.6 PRCTICA 6. REACCIN DE KOH INTRODUCCIN La determinacin del Gram de las bacterias, tambin se puede realizar de una forma ms rpida y sencilla, empleando nicamente solucin acuosa de KOH al 3%, la cual resulta ser una prueba rpida y muy sencilla en la que no influye la edad del cultivo con los resultados como sucede con la tincin de Gram y el procedimiento es como sigue: OBJETIVOS: Que el alumno conozca y aprenda a realizar la prueba de reaccin de KOH, para diferenciar a las bacterias gram negativas de las gram positivas. MATERIAL REQUERIDO MATERIAL Asa bacteriolgica Cultivo bacteriano Portaobjetos REACTIVOS Hidrxido de potasio DESARROLLO DE LA PRCTICA a) En un portaobjetos limpio coloque una gota de KOH. b) Del cultivo bacteriano puro, tome una asada. c) Mezcle el cultivo con el hidrxido durante unos segundos y levante lentamente el asa. d) Si se forma un hilo, la reaccin se considera positiva y significa que la bacteria pertenece al grupo de las gram negativas. Por el contrario si despus de unos minutos no se forma el hilo, la bacteria es un miembro de las Gram positivas. INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFA Fucikovsky, Z. L. 1995 Manual de bacteriologa Bacterias fitopatgenas INSTITUTO DE FITOSANIDAD. Colegio de Postgraduados.

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4.2.7 PRCTICA 7. TINCIN DE CPSULA INTRODUCCIN La cpsula es una capa gelatinosa y mucoide cuyo espesor puede ser escaso o por el contrario, importante, hasta el punto de duplicar el volumen de la bacteria. Este material no solamente no existe en todas las bacterias, sino que en las especies capsuladas puede no estar siempre presente. Su desarrollo se favorece cuando la bacteria se cultiva en medios con alto contenido de carbohidratos o cuando se multiplica dentro del hospedante. OBJETIVOS: Que el alumno sea capaz de utilizar los reactivos para la coloracin de la cpsula bacteriana y mejorar su observacin al microscopio. MATERIALES REQUERIDOS EQUIPO Microscopio biolgico MATERIAL Portaobjetos Lmpara de alcohol REACTIVOS Fuccina Etanol Mordente de Muir Azul de metileno Agua estril DESARROLLO DE LA PRCTICA a) Se hace un frotis de la bacteria y se fija al aire. b) La laminilla se cubre con fuccina fenicada fuerte y se calienta ligeramente durante 1 minuto. c) El frotis se lava rpidamente con etanol, y despus se lava perfectamente con agua. d) Se cubre con el mordente de Muir durante 30 seg. e) Lave con agua y posteriormente con etanol durante 30 segundos hasta que el frotis tome un color rojo plido. f) Lave perfectamente con agua. g) Tia con azul de metileno de Loeffler durante 30 segundos. h) Lave con agua y deje secar. i) Observe al microscopio compuesto, las bacterias se tien de rojo y las capsulas de azul.

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INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFA Fucikovsky, Z. L. 1995 Manual de bacteriologa Bacterias fitopatgenas INSTITUTO DE FITOSANIDAD. Colegio de Postgraduados Rodrguez, M. M. 2001 Manual de prcticas de bacterias fitopatgenas. DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIA AGRICOLA. Universidad Autnoma de Chapingo.

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4.2.8 PRCTICA 8. OBSERVACIN DE SNTOMAS CAUSADOS POR FITOBACTERIAS INTRODUCCIN Las bacterias fitopatgenas ocasionan el desarrollo de casi tantos tipos de sntomas en las plantas que infectan como los que producen los hongos. Producen manchas y tizones foliares, pudriciones blandas de frutos, races y rganos almacenados, marchitamientos, crecimientos excesivos, sarnas, cancros etc. Cualquiera de estos tipos de sntomas puede ser producido por las bacterias patgenas de varios gneros y cada gnero contiene algunos patgenos capaces de producir diferentes tipos de enfermedades. Sin embargo, las especies de Agrobacterium, slo producen crecimientos excesivos o proliferacin de los rganos. Por otra parte, los crecimientos excesivos tambin pueden ser producidos por ciertas especies de Corynebacterium y Pseudomonas. Asimismo, las dos especies fitopatgenas de Streptomyces, slo producen sarnas o lesiones en los rganos subterrneos de las plantas. Las especies de Rhizobium inducen la formacin de ndulos en las races de las leguminosas. Los sntomas pueden indicar la existencia de una enfermedad, pero ellos no son en s la enfermedad, estos son utilizados como guas para diagnosticar la naturaleza o causa de una enfermedad en particular. Entre las enfermedades bacterianas encontramos variados tipos de sntomas, los cuales son divididos en cuatro categoras: 1. Cambios de color: Alteraciones presentes en los plastidios, vacuolas o cloroplastos dando como consecuencia: Clorosis: Retardamiento o disminucin de la clorofila por anormalidades en los cloroplastos. Amarillamiento: Disminucin de clorofila e incremento de carotenos y xantofilas. Antocianocencia: coloracin prpura como resultado del incremento del pigmento antocianina. 2. Desintegracin de tejidos: Son ocasionados por la accin enzimtico o toxinas que producen los patgenos sobre la pared del hospedante y/o afectando el protoplasma celular. Pudricin: reas muertas debido a la maceracin de tejidos con presencia de exudados bacterianos. Esta pudricin puede ser de consistencia seca o hmeda. Cancro: Necrosis restringida en los tejidos corticales de tallos y raz con crecimiento secundario, usualmente delimitado por tejido sano. Necrosis: reas donde las clulas sufren primeramente plasmlisis, colapso y la muerte. En ocasiones stas reas presentan una coloracin oscura o castaa debido a la produccin de melaninas.

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Tizn: Desintegracin rpida de los tejidos seguida por la muerte celular, esta puede ser parcial o total del hospedante (produccin de toxinas) tambin definida como lesiones de crecimiento indeterminado. Mancha: Necrosis localizada en cualquier parte de la planta. 3. Desarrollo anormal del crecimiento: Ocasionado por alteraciones en las sustancias reguladoras del crecimiento ya sea aumentando o disminuyendo su concentracin. Agalla: desarrollo anormal donde las clulas daadas sufren el fenmeno de Hiperplasia (multiplicacin excesiva de las clulas) o Hipertrofia (aumento de tamao de las clulas). Fasciacin: proliferacin excesiva de brotes como consecuencia de la Hipoplasia (poca divisin celular), presentndose la planta como arrosetada. 4. Daos al sistema vascular Marchitez: Flacidez o prdida de turgencia de la planta debido al taponamiento de los vasos que conforman este sistema, ya sea por estructuras del patgeno, sustancias que las bacterias producen o estructura del tejido vegetal. OBJETIVOS: Que el alumno sea capaz de diferenciar la sintomatologa de enfermedades de importancia en plantas causadas por bacterias. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Microscopio biolgico MATERIAL Agua destilada estril Portaobjetos Material vegetal enfermo Navajas DESARROLLO DE LA PRCTICA a). Identificar los distintos tipos de sntomas ya sealados, usando para ello las muestras de material vegetal enfermo que le proporcione el instructor. b). Describir en forma sencilla al menos un tipo de sntoma caracterstico de cada enfermedad. En cada caso, indique el patgeno y el nombre comn de la enfermedad. Por ultimo sealar como diferenciar sntomas de enfermedades causadas por bacterias y hongos y discutir que tan confiable resulta la identificacin de las enfermedades en base a la observacin de sntomas.

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INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFA Agrios, G. N. 2007. Fitopatologa. LIMUSA Wiley, Mxico. pp 540-541 Bauer, L. I. 1984. Fitopatologa. LIMUSA. Colegio de Postgraduados.

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Plan 3 4.3 Fitopatologa General. IV semestre. 4.3.1 PRCTICA 1. PREPARACIN Y MANEJO DE MEDIOS DE CULTIVO INTRODUCCIN Los medios de cultivo son mezclas de sustancias que se usan para el aislamiento y desarrollo de hongos, bacterias y otros microorganismos. Cabe sealas que la mayora de los hongos fitopatgenos se pueden cultivar de manera relativamente sencilla en medios adecuados. Sin embargo existen grupos de patgenos denominados parsitos obligados cuyo cultivo an no se a logrado a menos que se inoculen en plantas vivas. Los medios de cultivo requieren de ciertas caractersticas mnimas para lograr exitosamente el desarrollo de los hongos y entre los ms importantes se encuentran: 1. El medio deber contener elementos nutritivos tales como: fuentes de carbono, nitrgeno, fsforo, potasio, magnesio, cobre y molibdeno. Tambin pueden ser necesarias algunas vitaminas y otras sustancias que se hallan presentes en los materiales naturales o artificiales que componen los medios. 2. El medio no deber deshidratarse fcilmente, por que se evita manejndolo en recipientes adecuados que adems permitan su manejo en condiciones estriles es decir, evitando contaminaciones. El oxigeno es necesario en todos los casos por lo que deber permitirse la aireacin. Ya sea en las cajas de Petri o en tubos de cultivo. 3. La mayora de los medios de cultivo para hongos requieren esterilizacin antes de usarse, lo que generalmente se logra mediante calor hmedo usando autoclave u olla Express. 4. La mayora de los hongos crecen bien a temperatura de 20 a 32 oC, pero existe mucha variacin entre grupos o especies. La temperatura ptima para el desarrollo de la enfermedad que causen puede servir como punto de referencia para la temperatura de incubacin del hongo en el medio de cultivo. 5. La mayora de los hongos crecen bien a ph de 5 a 6, pero hay excepciones. La temperatura y/o Ph ptimo para la esporulacin puede ser distinto que para el crecimiento del micelio. En ocasiones es conveniente agregar pequeas cantidades de cido lctico para eliminar bacterias contaminantes en el medio, pues estas generalmente no toleran la acidez, permitiendo el crecimiento fungoso. 6. El crecimiento del micelio y sobre todo la esporulacin de los hongos en el medio, esta muy influido por la luz. Muchos hongos esporulan fcilmente sin necesidad de luz artificial o aun en plena oscuridad, pero otros requieren condiciones especiales de calidad y confiabilidad de luz. Este factor puede ser clave cuando se requieren altas cantidades de esporas con fines de investigacin o para identificar alguna especie en particular. El medio de cultivo sustituye parcialmente las propiedades nutricionales del hospedante o sustrato natural del hongo por cultivar. La utilidad del medio es 40

proporcionar energa al microorganismo, para que desarrolle en la forma ms normal posible. Por su composicin nutritiva los medios de cultivo pueden ser: 1. Medios naturales. Estn compuestos por materiales enteramente naturales, tales como partes de plantas, malta, levadura etc. se requieren en forma de extractos o decocciones o simplemente esterilizando las partes vegetales con calor u otro mtodo. Aunque se usan poco, pueden ser superiores a otros medios sobre todo en el caso de hongos de difcil esporulacin. Por ejemplo se pueden conseguir altas cantidades de esporas de Stemphylium, sembrando a este hongo en tallos de cartamo esterilizados en autoclave. 2. Medios semisintticos. Estn compuestos parcialmente por materiales naturales y sintticos, el ejemplo mas comn es el de papa dextrosa y agar, V8 agar, harina de maz, agar etc. son los ms usados. 3. Medios sintticos. Se conoce perfectamente su composicin, ejemplo medio de Komada o de Awuah y Lorbeer, para Fusarium oxisporum, por su consistencia los medios de cultivo pueden ser: a) Slidos. Contienen agentes solidificantes principalmente el agar, proporcin de 1 a 3%, el agar esta compuesto por una mezcla de carbohidratos complejos y se obtiene a partir de algas. b) Semislidos. Aunque generalmente se usan poco en micologa, estos se obtienen bajando la concentracin del agar o usando gelatina como agente solidificante. c) Lquidos. Se preparan sin agente solidificante. Se usan principalmente para obtener altas concentraciones de esporas, ejemplo: papa- dextrosa. PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO La preparacin de medios de cultivo presenta distinto grado de complejidad, pero en general se tarda una o dos horas para la elaboracin de las ms comunes. A continuacin se describe la forma de preparar el medio papa dextrosa agar, jugo V8 agar, agua agar, por ser los ms comunes n la mayora de los laboratorios de fitopatologa en el mundo. OBJETIVOS Aprender a elaborar los medios de cultivo. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Autoclave Olla Express

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MATERIAL Papas Agua destilada Matraces Tubos de ensayo Vasos de precipitado REACTIVOS Agar Dextrosa Carbonato de calcio Jugo V8 DESARROLLO DE LA PRCTICA a). Elaboracin de papa dextrosa agar (PDA). Crecen la mayora de hongos y bacterias. Papa partida 200 gr. Dextrosa (glucosa) 13 gr. Agar 18-16 gr. Agua destilada 1000 ml 1. Hierva las papas partidas en 500 ml de agua. 2. En otro recipiente disuelva el agar, calentando para ayudar a disolver. 3. Cuele el caldo de papa a travs de la manta de cielo o algodn. Mezcle ambos lquidos, agregue la dextrosa y homogenice. 4. Divida el lquido en recipientes adecuados (matraces o tubos). Tapar los matraces con tapn de algodn. En caso de requerir el medio en tubos de cultivo, se vaca a estos cuidadosamente, procurando no derramar medio en la boca de los tubos. Los tubos tambin se tapan con algodn (al igual que los matraces); en caso de ser tubos con tapa de rosca, esta deber quedar ligeramente floja durante la esterilizacin. 5. Esterilizar matraces y/o tubos en el autoclave u olla de presin de 15-20 libras/pulgada2 ( 120 oC durante 15-20 minutos) contados a partir del momento en que se alcance la presin ya mencionada. 6. Abra la olla o autoclave hasta que la presin baje a cero. Deje enfriar el medio al contacto con el aire, cuando este se encuentre tibio se vaca a cajas de Petri en condiciones aspticas, es decir en la cmara de transferencia o al manos desinfectando una mesa y auxilindose de mecheros de gas. Las corrientes de aire debern evitarse al mximo. Los tubos de ensayo se colocan en posicin inclinada hasta que el medio solidifique, apretando los tapones de rosca o algodn, segn se trate. 7. En ocasiones se agregan 2 o 3 gotas de cido lctico (antes de vaciar) para prevenir el desarrollo de bacterias. en otros casos se agregan pequeas cantidades (50-200 ppm) de antibiticos tales como la estreptomicina, penicilina, etc., tambin antes de vaciar, el cloranfenicol tolera la esterilizacin en las condiciones antes sealadas. A ciertos 42

medios selectivos tambin se le pueden incorporar PCNB, Benomyl u otros fungicidas pero en dosis bajas (mg /lt). b). Elaboracin de V8-agar. Para Phycomycetes y otros Jugo V8 Carbonato de calcio Agar Agua destilada 200 ml 3 gr 16-18 gr 800 ml

Agregue 200 ml de jugo V8 a 800 ml de agua tibia, agregue el carbonato de calcio y el agar agitando la mezcla, caliente en bao Maria hasta disolver el agar. Una vez que el agar este disuelto, lleve el volumen a 1000 ml con agua destilada. Vace el medio en recipientes adecuados y esterilice en el autoclave a 15 libras de presin durante 20 minutos. c). Elaboracin de agua-agar. Phycomycetes y otros. No crecen bacterias. Agar 16 gr. Agua destilada hasta completar 1000 ml Disuelva el agar en 800 ml de agua utilizando un bao Maria, una vez disuelto, lleve el volumen con agua a 1000 ml, vace el medio en recipientes apropiados y esterilice en el autoclave a 15 libras de presin. INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFA Agrios, GN. 2007. Fitopatologa. LIMUSA, Mxico. 285-288 p. Lpez, A.G. 1979. Manejo de Hongos Fitopatgenos. Universidad Autnoma de Chapingo, Mxico.

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4.3.2 PRCTICA 2. AISLAMIENTO DE HONGOS FITOPATGENOS A PARTIR DE PLANTAS ENFERMAS INTRODUCCIN: El aislamiento consiste en el proceso de separacin de microorganismos a partir de su sustrato natural (plantas) para hacerlas crecer en un medio de cultivo artificial. El aislamiento y cultivo persigue diversos fines, el ms comn en un laboratorio de fitopatologa es para diagnosticar la causa de una enfermedad desconocida, sin embargo, puede tener objetivos didcticos o de investigacin sobre taxonoma, fisiologa y gentica microbiana. Es comn tambin cuando se quiere tener cepas puras en la evaluacin de productos qumicos in Vitro. El cultivo de microorganismos tiene enormes ventajas que contribuyen al conocimiento de la biologa de estos. Sin embargo, hay que considerar que al cultivar un organismo: a) pueden ocurrir mutaciones b) se puede perder parcial o totalmente su patogenicidad, c) los hongos pueden o no formar cuerpos fructferos en medios artificiales; estos cuerpos pueden presentar variacin, d) existen hongos que no se pueden cultivar (parsitos obligados) y otros que requieren medios complejos para su desarrollo. Las tcnicas para aislar hongos son diversas y dependen del hongo a estudiar y de la propia experiencia del investigador. OBJETIVOS Aprender a aislar y cultivar hongos fitopatgenos MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Cmara de flujo laminar Olla Express Autoclave Microscopio estereoscopico MATERIAL Material vegetal enfermo Agua destilada Agujas de diseccin Pinzas Navajas Filtros de porcelana REACTIVOS Alcohol etlico Hipoclorito de sodio PDA 44

DESARROLLO DE LA PRCTICA INDUCCIN AL DESARROLLO MICELAR Se recomienda que el hongo crezca y esporule sobre medios de cultivo, recomendable para hongos que crecen en el interior del hospedante y/o que esporulen poco en el tejido, tales como hongos de la raz. Este mtodo es el ms usado cuando se requiere tener a un hongo en cultivo puro.

1. Lavar el material enfermo con agua corriente y secar. 2. Seleccionar al tejido vegetal afectado procurando que los trocitos queden de 0.3 a 0.5 cm de longitud. 3. Desinfectar los trocitos (ver anexos al final de la prctica). 4. Enjuagar los trocitos en 3 pasos de agua destilada estril y secarlos perfectamente, al secar bien, disminuyen las contaminaciones. 5. Pasar 4 a 5 secciones a una caja de Petri con PDA, selle la caja con cinta parafilm e incube de 20 a 25 oC. INDUCCIN A LA ESPORULACIN Se recomienda para aislar hongos que esporulen abundantemente y que atacan las partes areas de las plantas. 1. Colocar en una caja de Petri 1 o 2 hojas de papel kleenex y humedecerlo con agua destilada estril (cmara hmeda). 2. Pasar la seccin del tejido infectado a la cmara hmeda. 3. Despus de 24-72 hrs, observar con el microscopio estereoscopico, tomar las esporas con agujas de diseccin y transferir a una caja de Petri con PDA. PURIFICACIN DE CEPAS Es raro que al hacer una siembra o aislamiento, se obtenga solo al hongo deseado, normalmente tambin crecen microorganismos contaminantes de los cuales es necesario apartar al organismo de inters. Este proceso se denomina purificacin y normal mente consiste en cortar puntas de micelio del borde de la colonia en crecimiento, mediante aguja de diseccin flameada. Esta pequea porcin del hongo y agar se deposita en otras cajas con medio de cultivo estril y de esta forma se obtienen cultivos puros. Es aconsejable hacer aislamientos que la muestra sea fresca (pocas horas) y que se siembre a partir del borde de lesiones en crecimiento activo, de lo contrario la purificacin se dificulta, en ocasiones es necesario utilizar medios selectivos con antibiticos y fungicidas para purificar cepas (la experiencia es clave).

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DESINFECCIN Los tejidos enfermos contienen normalmente diversidad de organismos que invaden los tejidos muertos por el patgeno. Estos contaminantes dificultan el aislamiento, por lo que generalmente es necesaria una desinfeccin previa a la siembra. Entre los desinfectantes ms usuales se tienen a: 1. Hipoclorito de sodio. El desinfectante ms usado es el blanqueador de uso domestico (cloralex), basta mezclar una parte de esta sustancia en cinco partes de agua destilada para obtener el producto deseado ya que el blanqueador viene al 5-6%, es decir que normalmente se usa hipoclorito al 1-2%, el tiempo de exposicin vara de 30 a 90 segundos; el material viejo o muy contaminado se puede tratar por 2 a 3 minutos siempre que no se elimine el patgeno. 2. Alcohol etlico. Se usa generalmente al 70% por periodos de 30 segundos, el uso de alcohol al 95% es peligroso por su flameabilidad.

INFORME DE RESULTADOS .

BIBLIOGRAFA Agrios, G.N. 2007. Fitopatologa. LIMUSA, Mxico. 285-290 p. Lpez, A.G.F. 1979. Manejo de Hongos Fitopatgenos. Universidad Autnoma de Chapingo.

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4.3.3. PRCTICA 3. ELABORACIN DE MONTAJES MICROSCOPICOS DE HONGOS FITOPATGENOS INTRODUCCIN Por su tamao microscpico, los hongos generalmente no pueden observarse a simple vista, a excepcin de hongos macroscpico que por su propio tamao pueden ser observados superficialmente sin aparatos, siempre y cuando no se requiera estudiar detalles de las esporas, etc. Para su observacin al microscopio compuesto, los hongos requieren ser preparados y montados en portaobjetos. En estudios preliminares o de rutina se hacen preparaciones temporales desechables, pero si se desea preservar especimenes por largo tiempo es necesario elaborar montajes permanentes, los que de hacerse correctamente duran uno o varios aos en buenas condiciones. Para hacer un montaje de calidad, se requiere paciencia y experiencia, adems de la destreza individual, sin embargo, todo fitopatlogo debe intentar hacer buenas preparaciones, ya que actividades prcticas tales como el diagnostico de enfermedades dependen de alto grado de buenas preparaciones. OBJETIVOS Aprender a preparar montajes microscpicos de especimenes fungosos. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Microscopio biolgico compuesto MATERIAL Cepas de hongos Montajes permanentes de hongos Agua Cinta adhesiva Porta y cubre objetos Navajas REACTIVOS Fenol ( cristales ) Acido lctico Lactofenol azul y claro Glicerina

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DESARROLLO DE LA PRCTICA MONTAJE CON AGUJA DE DISECCIN Es til para montar estructuras que desarrollan abundantemente en la superficie del hospedante, o a partir de cepas que crecen en medio de cultivo. Es la tcnica obligada para hacer preparaciones a partir de races infectadas. El procedimiento consiste en: 1. Colocar una pequea gota de agua u otro medio de montaje en el centro de un portaobjetos. 2. con la punta de la aguja humedecida tome o roce ligeramente las esporas y/o micelio que desee montar, evite tomar material excesivo ya que dificulta la observacin posterior. De ser necesario, puede auxiliarse del microscopio estereoscopico para hacer mejor el trabajo. 3. Transferir el material a la gota del medio de montaje, coloque cuidadosamente un cubreobjetos y observe con los objetivos 10x y 40x. 4. Para montajes temporales use agua o lactofenol, para preparaciones permanentes use lactofenol y selle con esmalte para uas. MONTAJE MEDIANTE CINTA ADHESIVA Es la tcnica ms rpida y fcil, sobre todo para personas inexpertas. Las preparaciones son exclusivamente temporales. No usar para hacer montajes a partir de races, especialmente si estas presentan suelo adherido. El mtodo consiste en: 1. Colocar una gota de agua u otro medio de montaje en el centro de un portaobjetos. 2. cortar un trozo de cinta, 1 o 2 cm ms grande que la longitud del portaobjetos, no use trozos de cinta ms pequeos o ms grandes. 3. Tomar la cinta por los extremos con dos de los dedos, deposite suavemente la parte engomada sobre la superficie del hospedante o crecimiento del hongo en medio de cultivo, evite presionar demasiado, pues tomara material en exceso y/o tambin se pegaran setas u otras estructuras de la planta que dificultaran la observacin. 4. Tome la cinta con las dos manos y pguela sobre el portaobjetos, vigile que la cinta pegue rpidamente en ambos extremos del cristal, pues de lo contrario despegara fcilmente, observe al microscopio con los objetivos 10x y 40x. Las mejores preparaciones no son aquellas que presentan mucho material, sino las que contienen las estructuras tpicas del hongo, ms aun si se encuentran bien separadas y arregladas en forma esttica. CORTES DE CUERPOS FRUCTFEROS Cuando se quieran observar estructuras que se encuentran parcial o totalmente inmersas en el hospedante y/o encerradas en cuerpos fructferos, es necesario hacer cortes transversales que permitan observar perfectamente la forma y ubicacin interna de las esporas, estos cortes se pueden hacer con aparatos especiales, pero generalmente se efectan de manera manual mediante el siguiente mtodo: 48

1. Coloque el material enfermo bajo el microscopio de diseccin, separe una porcin superficial del tejido enfermo mediante un corte longitudinal procurando no daar los cuerpos fungosos, esto facilitara los cortes de los cuerpos ya que solo manejaremos una pequea porcin de tejido, el tamao de la muestra puede variar, pero se aconseja dejar tiras de +/- 1 a 3 cm de largo por +/- 1 a 3 mm de ancho, con un grosor de +/- 0.5 a 2 mm; esto depende de muchos factores tales como el tamao de los cuerpos a cortar, consistencia del tejido etc., la experiencia es bsica. 2. Con una navaja de rasurar sin usar, separe el tejido adyacente que se encuentra adelante y a los lados del cuerpo fructfero; este quedara delimitado y listo para los cortes definitivos. 3. Coloque el dedo ndice de la mano izquierda junto al cuerpo a cortar, cuide de no presionar directamente al cuerpo, de tal forma que al recargar la navaja en el dedo ndice, este gue y regule el espesor de los cortes, estos deben ser lo ms delgado posible (cortes transversales de un solo tajo). 4. Los cortes que van quedando adheridos o por un lado de la navaja, se toman con una aguja de diseccin humedecida y se transfieren al portaobjetos, en el que previamente se a depositado una gota de medio de montaje. Coloque al portaobjetos y observe al microscopio. MEDIOS DE MONTAJE 1. Agua destilada. til para montajes temporales, se puede agregar detergente en bajas cantidades para reducir la formacin de burbujas. 2. Lactofenol. Aunque existen otros medios, este es uno de los ms usados por su fcil preparacin y alta eficiencia, adems tambin funciona como solucin fijadora y restauradora de la turgencia del material. PREPARACIN DEL LACTOFENOL Fenol (cristales) cido lctico Glicerina Agua destilada 20 gr 20 ml 40 ml 20 ml

Para obtener una mezcla rpida, calentar ligeramente el agua hasta disolver el fenol, agregue enseguida la glicerina y el cido lctico, se pueden agregar (opcional) colorantes tales como el azul algodn u otros, para teir las esporas y para que la observacin sea ms agradable a la vista. ABLANDAMIENTO DE TEJIDOS SECOS Las tres tcnicas descritas se pueden hacer con tejido fresco y seco. En el caso de cortes de material seco o duro se puede reblandecer los trozos a cortar en una solucin de hidrxido de potasio (KOH) al 2%, esto facilita los cortes, el periodo de exposicin es variable, pero comnmente basta de 3 a 5 minutos, la exposicin prolongada reblandece excesivamente los tejidos y/o desintegra las estructuras fungosas. 49

INFORME DE RESULTADOS

BIBLIOGRAFA Echando, E. 1971. Manual de Laboratorio para Fitopatologa General, Herrera Hermanos. 13-14 p. Streeta, R.B. 1972 Tha Diagnosis of Plant diseases, Univ. Arizona Press. Lpez, A.G. 1979. Manejo de Hongos Fitopatgenos. UACH. 25-29 p.

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4.3.4 PRCTICA 4. SNTOMAS CAUSADOS POR HONGOS FITOPATGENOS INTRODUCCIN De manera sencilla podemos decir que una enfermedad es toda alteracin de la fisiologa o de la estructura normal de la planta, lo suficientemente prolongada para producir sntomas visibles y ocasionar daos en la calidad y/o cantidad de la produccin. En consecuencia, los sntomas son manifestaciones visibles de tal anormalidad, cada enfermedad fungosa es causada generalmente por un solo patgeno y presenta sntomas que son caractersticos; si bien es cierto que algunas enfermedades presentan sntomas idnticos, por lo que se requieren estudios de laboratorio para diferenciarlas. Por lo anterior, el conocimiento de los sntomas es indispensable para el diagnostico de enfermedades, sobre todo a nivel de campo, las enfermedades fungosas pueden agruparse en base a los sntomas principales, de la siguiente manera: 1. Enfermedades vasculares. Estos hongos atacan principalmente los vasos conductores, el micelio, esporas y algunos productos de su metabolismo taponean o destruyen los vasos, evitando el flujo de agua y nutrientes hacia la parte superior de la planta, a consecuencia de lo anterior generalmente se derivan tres tipos de sntomas: a) Marchitamiento. El sistema conductor es bloqueado gradualmente y la planta muestra flacidez que inicialmente se observa solo en horas calurosas, al paso del tiempo la planta muere. b) Amarillamiento. Puede o no presentarse con la marchitez, pero generalmente se presenta al inicio de la enfermedad, cuando los tejidos estn parcialmente incluidos por el hongo. Se inhibe la sntesis de clorofila o esta se destruye por la accin de toxinas fungosas. c) Defoliacin. La obstruccin del sistema vascular o el ataque directo al follaje provocan desprendimiento de hojas. 2. Enfermedades de tipo necrtico. Algunos hongos invaden inicialmente los tejidos parenquimatosos, si bien es cierto que con el tiempo tambin alcanzan los vasos conductores, los sntomas ms comunes de este tipo son: a) Manchas foliares. Estos hongos parsitos destruyen la lmina foliar, ramas o superficies de frutos, las manchas son de tamao pequeo, es decir que solo alcanzan un tamao y forma determinada a pesar de que el ambiente sea favorable, con frecuencia las lesiones estn limitadas por las nervaduras principales. b) Tizones. El patgeno causa manchas necrticas extensivas en cualquier rgano de la parte area de la planta, las lesiones crecen de forma relativamente indefinida mientras existan condiciones ambientales favorables, los rganos afectados presentan aspecto de quemaduras por fuego. c) Pudriciones. Estos patgenos producen enzimas que destruyen la lmina media de la pared celular y como resultado, las clulas pierden su integridad, se plasmolizan y mueren. Las pudriciones pueden ser blandas o secas. 3. Enfermedades hiperplasicas. Algunos patgenos estimulan anormalmente las clulas, induciendo su divisin excesiva (hiperplasia) o provocan su crecimiento 51

exagerado (hipertrofia), a simple vista se aprecian tumores o agallas en distintos rganos de la planta. OBJETIVOS Reconocer distintos tipos de sntomas causados por hongos fitopatgenos. MATERIALES REQUERIDO EQUIPO Microscopios de diseccin y biolgico compuesto. MATERIAL Material vegetal enfermo. REACTIVOS Lactofenol claro. DESARROLLO DE LA PRCTICA 1. Identifique los distintos tipos de sntomas ya sealados, usando para ello las muestras de material vegetal enfermo que le proporcione su instructor. 2. Describa en forma sencilla al menos un tipo de sntomas tpico representativo de cada grupo, sealando: color, tamao, forma, borde, consistencia etc. En cada caso, indique el patgeno y el nombre comn de la enfermedad. 3. Haga un dibujo sencillo pero explcito de cada tipo de sntomas que observe. RESULTADO DE LA PRCTICA Se consideran los dibujos y la descripcin

BIBLIOGRAFA Agrios, G.N. 2007. Fitopatologa. LIMUSA. Mxico. 284 p. Gonzlez, L.C. Introduccin a la Fitopatologa IICSA. Walker, J.C. Patologa Vegetal. OMEGA. Barcelona, Espaa.

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4.3.5 PRCTICA 5. FITOPATGENOS INTRODUCCIN.

PRUEBAS

DE

PATOGENICIDAD

DE

HONGOS

Los hongos causan enfermedades mediante un proceso que indica cuando las esporas (o micelio) que germina y el patgeno penetra a los tejidos sanos, al paso de das y meses el patgeno invade los tejidos, produciendo sobre la superficie del hospedante nuevas generaciones de esporas. La identificacin de enfermedades se basa en gran parte en el reconocimiento de sntomas tpicos de cada enfermedad, en caso de duda o de enfermedades poco conocidas, es necesario un estudio de laboratorio para determinar la causa del problema. En laboratorio, el fitopatlogo analiza las plantas y en base al microorganismo detectado a los sntomas y apoyndose en literatura especializada da un diagnostico del problema, sin embargo estos diagnsticos con frecuencia tienen alto grado de incertidumbre, ya que es raro encontrar a un solo microorganismo asociado a la enfermedad en estudio, en ocasiones hay 2, 3, 4 o ms organismos creciendo en los tejidos enfermos. Aqu cabe la interrogante cul de todos es el causante del problema en estudio?. El diagnostico rpido y preciso es indispensable para tomar medidas de control, diagnsticos equivocados conducen a fallas en el control, que pueden conducir a prdidas totales, por lo anterior, el investigador tiene que probar experimentalmente en ocasiones a todos los microorganismos asociados para establecer la causa de la enfermedad. Los ensayos que se utilizan para probar la capacidad de un organismo para causar una enfermedad, se denominan pruebas de patogenicidad. Estas pruebas tienen que satisfacer cuatro reglas o postulados fueron desarrollados por Roberto Koch en el siglo pasado y sealan que: 1. El microorganismo debe estar asociado con la enfermedad, a su vez esta no debe aparecer sin que el microorganismo este o haya estado presente. 2. El microorganismo debe aislarse en cultivo puro y deben establecerse sus caracteres especficos (forma, tamao, fisiologa, etc.) 3. El microorganismo puro debe reproducir los sntomas de la enfermedad cuando se inocule en plantas sanas de la misma variedad o tipo del cual fue aislado, este proceso deber efectuarse bajo ambiente favorable a la enfermedad. 4. El microorganismo debe ser reaislado del hospedante inoculado y debe mostrar las mismas caractersticas en cultivo, que el microorganismo inoculado originalmente en plantas sanas. En el caso de parsitos obligados, es necesario hacer adaptaciones que permiten cumplir los postulados de Koch. 53

OBJETIVOS Conocer la metodologa para probar la patogenicidad de hongos fitopatogenos y cumplir los postulados de Koch. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Microboy. MATERIAL Frutos enfermos (de tomate ) Agujas de diseccin Lmparas de alcohol. Bolsas de plstico. Papel absorbente REACTIVOS PDA infectado con hongo Hipoclorito de sodio. DESARROLLO DE LA PRCTICA 1. Colecte frutos de tomate enfermos por pudricin agria (Geotrichum candidum), observe y describa los sntomas, observe al microscopio el cuerpo (micelio y esporas) del hongo y haga dibujos detallados de estos. 2. Desinfecte frutos de tomate sumergindolos en hipoclorito de sodio al 2% por dos minutos, los frutos debern estar sanos y sin golpes, de preferencia maduros y consistencia firme. 3. Provoque heridas de 0.5 a 1.0 cm de profundidad en los frutos desinfectados, para ello utilice una aguja de diseccin esterilizada, a la flama de un mechero. 4. Coloque sobre las heridas un disco pequeo de PDA-hongo (micelio y esporas) o gotas de agua estril con esporas en suspensin de cultivos jvenes y puros de Geotrichum candidum. Tome otros frutos desinfectados e inoclelos de la misma forma, pero sin causar heridas previas, deje frutos con o sin heridas sin inocular, como testigos. 5. Coloque los frutos inoculados y no inoculados por separado, en una bolsa o recipiente que contenga papel absorbente humedecido con agua destilada estril (cmara hmeda). 6. Incube de 2 a 4 das a temperatura de 25 a 39 oC. 7. Al detectar sntomas de la enfermedad en los frutos inoculados, proceda a hacer el reaislamiento de manera similar a como realiz el aislamiento, cheque las caractersticas del hongo desarrollando en los frutos inoculados antes de hacer el reaislamiento. 8. Compare las caractersticas morfolgicas del hongo inoculado, compare tambin los sntomas reproducidos artificialmente con los que presentaron los frutos infectados naturalmente. 54

INFORME DE RESULTADOS

BIBLIOGRAFA Agrios, G.N. 2007. Fitopatologa, LIMUSA. Mxico. 35 p. Gonzlez, L.C. 1981. Introduccin a la Fitopatologa. IICA. San Jos Costa Rica. 12-13 p. Bauer, L.I. 1984. Fitopatologa. LIMUSA. Colegio de Postgraduados.

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4.3.6 PRCTICA 6. IDENTIFICACIN DE GNEROS DE IMPORTANCIA AGRCOLA DE LA CLASE PHYCOMYCETES INTRODUCCIN Los phycomycetes son hongos de hbitat acutico o semi acutico que abarcan a numerosos gneros y especies de gran importancia agrcola. El conocimiento de la sintomatologa, biologa, morfologa y control es de inters fundamental para el parasitlogo. El control de enfermedades se basa en une identificacin correcta del patgeno, de ah que sea importante conocer las caractersticas ms sobresalientes de los principales gneros de esta clase. OBJETIVOS Conocer y diferenciar las caractersticas morfolgicas de los principales gneros de importancia agrcola de la clase phycomycetes. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Microscopio de diseccin y biolgico. MATERIAL Material vegetal enfermo. Cinta adhesiva. Agujas de diseccin. Navajas y bistur. Montajes permanentes DESARROLLO DE LA PRCTICA 1. Elaborar montajes a partir de material vegetal enfermo o de cultivos proporcionados por el laboratorio, los montajes se harn con cinta o aguja, tal como se sealo en prcticas anteriores (de ser necesario, hacer cortes). 2. Usando los montajes frescos o preparaciones permanentes disponibles en el laboratorio, observar al microscopio compuesto los especimenes, con los objetivos 10x y 40x. 3. Dibujar cada espcimen cuidadosamente, resaltando las caractersticas ms importantes: tipo de micelio, esporangios, esporangioforo y oosporas. 4. Se estudiaran los siguientes gneros: a) Pythium b) Phytophthora c) Peronospora d) Bremia 56

e) Plasmopara f) Pseudoperonospora g) Rhizopus h) Albugo i) Otros INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFA Agrios, G.N. 2007. Fitopatologa. LIMUSA-Wiley. Mxico. Alexopoulos, C.J. Introduccin a la Micologa. Frezz, M.J.1950. Las especies de Phytophthora en la Argentina. Ministro de Agricultura, Buenos Aires, Argentina. Romero, C.S. 1988. Hongos Fitopatgenos. Universidad Autnoma de Chapingo.

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4.3.7 PRCTICA 7. IDENTIFICACIN DE GNEROS DE IMPORTANCIA AGRCOLA DE LA CLASE DEUTEROMYCETES. INTRODUCCIN La mayor parte de los gneros y especies de importancia agrcola de la regin, pertenecen a esta clase. La sintomatologa vara desde pudriciones de la raz y tallo, manchas y tizn en el follaje as como marchitez y pudriciones en frutos. El conocimiento de la forma y color de las esporas y/o cuerpos fructferos es indispensable para la identificacin de estas especies. El diagnstico correcto es prerequisito para el control de las enfermedades causada por estos o cualquier patgeno. En ese sentido, el conocimiento de la morfologa de cada gnero es de vital importancia para el fitopatlogo. OBJETIVOS Conocer y diferenciar en base a morfologa los principales gneros de importancia agrcola de la clase Deuteromycetes. MATERIALE REQUERIDO EQUIPO Microscopio de diseccin. Microscopio biolgico compuesto. MATERIAL Material vegetal enfermo Cinta adhesiva Agujas de diseccin Navajas o bistur. Montajes permanentes. DESARROLLO DE LA PRCTICA 1. Elabore preparaciones temporales mediante la tcnica de la aguja, cinta adhesiva o cortes. 2. Use las preparaciones sealadas o montajes permanentes proporcionados por su instructor y observe al microscopio compuesto con los objetivos 10x y 40x. 3. Dibuje cada espcimen cuidadosamente, resaltando las caractersticas ms importantes: micelio septado, conidios y conidioforos, esporodoquios y sinemas, acrvulos y picnidios. 4. Se estudiaran los siguientes gneros: a) Oidium b)Oidiopsis 58

c)Alternaria d) Helminthosporium e) Corynespora f) Botrytis g) Geotrichum h) Aspergillus i) Phymatotrichum j) Colletotrichum k) Macrophomina l) Rhizoctonia INFORME DE RESULTADOS

BIBLIOGRAFA Agrios, G.N. 2007. Fitopatologa. Ed. LIMUSA-Wiley. Mxico. Alexopoulos, C.J. 1969. Introduccin a la Micologa, EUDEBA, Buenos Aires, Argentina. Barnett, H.L. 1960. Ilustrated genera of imperfecti fungi. Burguess, Minneapolis.

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4.3.8 PRCTICA 8. IDENTIFICACIN DE GNEROS DE IMPORTANCIA AGRCOLA DE LA CLASE ASCOMYCETES. INTRODUCCIN Los miembros de esta clase se caracterizan porque producen esporas de origen sexual en bolsas o sacos membranosos llamados ascas. Esta clase es de gran importancia sobre todo en zonas frescas o fras y de alta humedad relativa, en el noroeste de Mxico no es comn encontrar a la fase sexual de estos hongos, no as la fase asexual (conidios) de algunas especies de gran importancia, tales como la cenicilla. OBJETIVOS Reconocer algunos gneros de importancia agrcola de la clase Ascomycetes. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Microscopios de diseccin Microscopios biolgico compuesto MATERIAL Material vegetal enfermo Cinta adhesiva Agujas de diseccin Navajas o bistur. Montajes permanentes. 1. Use las preparaciones permanentes que le proporcione el instructor para observar al microscopio, en caso de haber material disponible, haga montajes temporales de estructuras de Ascomycetes siguiendo la tcnica de raspado con agujas o haciendo cortes de material vegetal con cuerpos fructferos. 2. Dibuje cada espcimen resaltando: ascosporas y cuerpos fructferos. 3. Se observaran los gneros: a) Erisyphe b) Uncinula c) Ceratocystis e) Phyllachora f) Otros

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INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFA Agrios, G.N. 2007. Fitopatologa. LIMUSA-Wiley, Mxico. Alexopoulos, C.J. 1969. Introduccin a la Micologa, EUDEBA. Buenos Aires, Argentina. Romero, C.S. 1988. Hongos Fitopatgenos. Universidad Autnoma de Chapingo, Mxico.

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4.3.9 PRCTICA 9. IDENTIFICACIN DE GNEROS DE IMPORTANCIA AGRCOLA DE LA CLASE BASIDIOMYCETES.

INTRODUCCIN Esta clase es de gran importancia fitopatolgica ya que incluye a los chahuixtles o royas, as como a los carbones, estas enfermedades causan prdidas de millones de dlares al ao en diversas zonas agrcolas del mundo, algunos basidiomycetes causan pudricin de races de rboles o atacan madera. El conocimiento de la sintomatologa y de las caractersticas morfolgicas de estos hongos es importante para las enfermedades que causan, por lo antes dicho en esta prctica se pretende que el estudiante se relacione con estos dos aspectos indispensables para el diagnstico de royas y carbones. OBJETIVOS Identificar y diferenciar los principales gneros causantes de royas y carbones. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Microscopios de diseccin Microscopios biolgicos compuestos MATERIAL Material vegetal enfermo. Cinta adhesiva. Agujas de diseccin. Navajas y bisturs

DESARROLLO DE LA PRCTICA 1. Elabore preparaciones temporales mediante el mtodo de la aguja y cinta. 2. Use estas preparaciones temporales o montajes permanentes proporcionados por su instructor para observar al microscopio con los objetivos 10x y 40x. 3. Dibuje cada espcimen cuidadosamente., resaltando las caractersticas ms importantes: uredosporas y teliosporas. 4. Se observaran los gneros: a) Puccinia b)Uromyces c) Phragmidium 62

d) Hemileia e)Neovossia f) Ustilago g) Entiloma h) Otros

INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFA Agrios, G.N. 2007. Fitopatologa. LIMUSA-Wiley, Mxico. Alexopoulos, C.J. 1969. Introduccin a la Micologa. EUDEBA, Buenos Aires, Argentina.

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4.3.10 PRCTICA 10 ELABORACIN DE MEDIOS DE CULTIVO INTRODUCCIN Para el cultivo in Vitro de fitobacterias se requiere de la elaboracin de un medio que proporcione todos los requerimientos nutricionales que permitan su reproduccin, los cuales se les conoce como medios de cultivo. Los medios de cultivo contienen cuatro componentes esenciales: fuentes de carbono y nitrgeno, minerales y vitaminas. Existe una gran variedad de de fuentes de carbono que se pueden emplear en los medios de cultivo como son: alcoholes, pentosas, hexosas, disacridos, trisacridos, polisacridos, cidos e hidroxicidos ya sean solos o en combinacin. OBJETIVOS: Que el alumno conozca y aprenda a elaborar medios de cultivo para el aislamiento de bacterias fitopatgenas. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Autoclave Agitador magntico MATERIAL Agar Nutritivo Agua destilada Casena hidrolizada Peptona Glucosa Extracto de carne Sacarosa DESARROLLO DE LA PRCTICA AGAR NUTRITIVO Agar nutritivo 23 g Agua destilada 1000 ml Disolver el agar nutritivo en el agua, si desea puede dividir el lquido en dos matraces. Esterilizar en autoclave a 115 lbs/pulgada cuadrada durante 15 minutos y vaciar en cajas de Petri. Este medio generalmente se emplea para aislamientos de material vegetal. Es un medio til para el aislamiento de especies de Xanthomonas.

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MEDIOS DE CULTIVO DIFERENCIALES (TTC) Peptona 10 g Casena hidrolizada 1.0 g Glucosa 5.0 g Agar 12 g Agua 1000 ml Ajustar el pH a 7 y esterilizar en la forma normal, cuando el medio alcance una temperatura de aproximadamente 45-50 0C adicionar solucin acuosa de cloruro de tetrazolio al 1.0% para dar una concentracin final de 0.005%. Con este medio de cultivo se pueden detectar las colonias virulentas y avirulentas de Ralstonia solanacearum y P. s. p.v. phaseolicola. En el primer caso las colonias virulentas son blancas, fludas, con centro rojo y para la segunda bacteria las cepas virulentas forman colonias rojas y las avirulentas son blancas. MEDIO PARA LA PRODUCCION DE LEVANA Extracto de carne 3g Peptona 10 g Sacarosa 50 g Agar 20 g Agua 1000 ml Disuelva los ingredientes, esterilice en la forma convencional y vace en cajas esterilizadas. MEDIO DE GELATINA Extracto de carne 3.0 g Peptona 5.0 g Gelatina 120.0 g Agua 1000 ml La gelatina se adiciona al agua y se deja hidratar durante 15 a 30 minutos y luego se calienta para disolver la gelatina; posteriormente agregar y disolver los otros constituyentes. Ajustar el pH a 7, vaciar a tubos y esterilizar a 120 0C durante 20 minutos. INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFA Agrios, G.N. 2007. Fitopatologa. LIMUSA, Mxico. 285-288 p. Fucikovsky, Z. L. 1995 Manual de bacteriologa Bacterias fitopatgenas INSTITUTO DE FITOSANIDAD. Colegio de Postgraduados.

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4.3.11 PRCTICA 11. MTODOS PARA OBTENER CULTIVOS PUROS INTRODUCCIN El cultivo puro, es una condicin artificial en el crecimiento de bacterias bajo condiciones de laboratorio. Para determinar las caractersticas de una especie bacteriana en particular, es imperativo que el organismo sea aislado y multiplicado en laboratorio en cultivo puro. Existe una variedad de tcnicas para el aislamiento y desarrollo de bacterias como son: tcnica de estra cruzada y la de vaciado en placa. OBJETIVOS: Que el alumno conozca y aprenda a realizar las tcnicas para el aislamiento y obtencin de cultivos puros de bacterias fitopatgenas. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Cmara de flujo laminar o microboy MATERIAL Medio de cultivo Cajas Petri Lmpara de alcohol Asa bacteriolgica Material vegetal enfermo Navajas o bistur Tubos de ensayo Agua destilada estril DESARROLLO DE LA PRCTICA Tcnica de estra cruzada. Con el asa bacteriolgica previamente flameada y enfriada, se toma una gota de suspensin bacteriana del tubo de ensayo. Se procede a realizar un estriado (4 o 5 rayas) en la caja de Petri . A partir de la ultima raya del estriado # 1, se comienza a rayar el estriado # 2, esto se repite 4 5 veces cuidando de no tocar mas que la ultima raya del estriado anterior. Todo esto se realiza en el microboy previamente desinfectado y con la ayuda de una lmpara de alcohol. Al terminar se sellan las cajas y se incuban a 28 grados centgrados Durante 24-48 hrs. Tcnica de vaciado en placa. Para lograr tener colonias separadas por esta tcnica, primeramente se debe hacer una suspensin (que se puede lograr al suspender el material vegetal enfermo en agua esterilizada o en medio de cultivo lquido). De esta suspensin se toma una gota 0.5 ml y se transfieren a otro tubo matraz con medio de cultivo con agar lquido. Esta operacin se repite 2 3 veces ms, teniendo cuidado de agitar los tubos antes de hacer la transferencia. Inmediatamente despus de cada dilucin, el contenido de cada uno de los tubos se traslada a una caja Petri estril y despus del periodo de incubacin se obtendrn colonias separadas.

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AISLAMIENTO Y PURIFICACIN Uno de los requisitos para considerar a una bacteria como el agente inductor de una enfermedad, es aislarla y purificarla a partir del tejido enfermo. Para llevar a cabo esta etapa existen diferentes metodologas y la eleccin de cualquiera de ellas depender del tipo de sntoma, rgano afectado, grado de avance de la enfermedad y del material y equipo disponibles. Entre las tcnicas de aislamiento ms comunes, se encuentran las siguientes: AISLAMIENTO DIRECTO (Para muestras con marchitez) PROCEDIMIENTO 7. Con una navaja flameada y enfriada, haga un corte transversal al tallo que presente flacidez incipiente, de preferencia cerca del nivel del suelo. 8. Haga una ligera presin y espere unos segundos para que de los haces vasculares salga un exudado bacteriano. 9. Con el asa previamente flameada y enfriada, tome del exudado y transfiralo a un tubo con agua destilada estril. 10. Agite el tubo para homogeneizar. 11. Con el asa flameada tome una gota de la suspensin y siembre una caja con medio de cultivo por el mtodo de estra cruzada. 12. Incube a 28 0C por 24-48 horas. INMERSIN DEL TEJIDO EN AGUA ESTERIL (Para muestras con manchas o tizones) PROCEDIMIENTO 9. Al microscopio estereoscpico observe los tejidos afectados, para detectar la presencia de exudados, escamas bacterianas, micelio u otras estructuras fungosas. 10. De la zona de avance de la enfermedad haga una preparacin en fresco y observe al microscopio compuesto. 11. Si en estas preparaciones observa nicamente clulas bacterianas, esto le indica que el sntoma se puede deber a bacterias, por el contrario, si observa micelio, lo ms seguro es que el sntoma sea ocasionado por un hongo. 12. Seleccione tejido enfermo y lvelo con agua estril. 13. Corte pequeos trocitos y desinfctelos con una solucin de hipoclorito de sodio al 1% durante 1 a 2 minutos. 14. Decante el hipoclorito de sodio y lave 3 veces con agua esterilizada. 15. Una vez transcurridos los 5 10 minutos, tome una gota de la suspensin con el asa bacteriolgica y siembre con estra cruzada una caja con medio de cultivo. 16. Despus del periodo de incubacin seleccione las colonias bacterianas que se asemejen a las del agente causal, y simbrelas una nueva caja con medio de cultivo para obtener as, suficiente cultivo puro y continuar con las pruebas de patogenicidad. 67

INMERSIN DEL TEJIDO EN AGUA ESTRIL (Muestra con sobrecrecimiento) PROCEDIMIENTO 7. Con un cepillo pequeo y cerdas suaves lave al chorro del agua la agalla o tejido con fasciacin y luego haga unas fracciones. 8. Coloque los cortes en un tubo con 3 ml de agua destilada estril y mantngalos as durante unos 10-20 minutos. 9. Pase 3 asadas de la suspensin anterior a otro tubo con 3 ml de agua estril. 10. Siembre 2 cajas con medio de cultivo por estra cruzada. 11. Incube a 22-28 0C durante 2-4 das. 12. Seleccione las colonias bacterianas con caractersticas del posible patgeno y transfiera a las otras cajas con medio de cultivo. INFORME DE RESULTADOS

BIBLIOGRAFA Rodrguez, M. M. 2001 Manual de prcticas de bacterias fitopatgenas. DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIA AGRICOLA. Universidad Autnoma de Chapingo.

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4.3.12 PRCTICA 12. TCNICAS DE TINCIN PARA DETERMINAR FORMA, TAMAO Y AGRUPACIN CELULAR INTRODUCCIN Como las clulas bacterianas son incoloras, se requiere del empleo de colorantes para hacerlas ms ntidas al microscopio, para lo cual se pueden emplear tcnicas de coloracin simples o diferenciales. Tincin simple. El azul de metileno de Loeffler es uno de los reactivos ms valiosos que se tienen para la tincin de bacterias. Es excelente para las bacterias del gnero Curtobacterium donde puede demostrar el perlado y los grnulos. En los bacilos esporulados (Bacillus), teidos con este reactivo, las esporas aparecen como cuerpos no teidos dentro de clulas azules. Tincin diferencial. Una de las tcnicas ms ampliamente utilizadas es la Tincin de Gram, porque no solo permite determinar la forma y agrupacin de las bacterias, sino tambin es de considerable valor en la identificacin y clasificacin, al separar a las bacterias en gram negativas y gram positivas. OBJETIVOS: Que el alumno aprenda a utilizar los reactivos para llevar a cabo las distintas tcnicas de coloracin de bacterias. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Microscopio biolgico MATERIAL Cultivo bacteriano Asa bacteriolgica Agua alcohol Azul de metileno Portaobjetos Lmpara de alcohol Cristal violeta Lugol Safranina INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFA Fucikovsky, Z. L. 1995 Manual de bacteriologa Bacterias fitopatgenas INSTITUTO DE FITOSANIDAD. Colegio de Postgraduados.

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4.3.13 PRCTICA 13. PRUEBAS DE PATOGENICIDAD INTRODUCCIN Cuando una planta, supuestamente infectada por una bacteria, es trada al laboratorio, se procede al aislamiento en medio artificial de cultivo segn la tcnica usual. No obstante, los resultados del aislamiento precisan ser interpretados con cautela, pues: a) las colonias desarrolladas en la caja de Petri pueden ser bacterias saprfitas, por lo que la enfermedad puede no ser provocada por estas bacterias. b) aparecen en la caja, colonias de bacterias patognicas y saprfitas las cuales no se diferencian por su aspecto. c) las colonias obtenidas, aunque sean de bacteria patognica, se presentan avirulentas o perdieron por alguna razn, la patogenicidad. La demostracin de la patogenicidad de una cepa bacteriana es un procedimiento complicado que requiere mucho tiempo para que aparezcan los sntomas tpicos de la enfermedad en a planta homloga. En la mayora de las ocasiones no siempre se dispone de este material, siendo ms difcil, an, cuando se tratan de rboles o plantas que no se encuentran en la regin. Existen pruebas de patogenicidad como la reaccin de hipersensibilidad, pudricin del tubrculo de papa, inoculacin a frutos verdes de peral o manzano las cuales se describen a continuacin. OBJETIVOS: Que el alumno aprenda a realizar pruebas de patogenicidad de bacterias fitopatgenas. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Microscopio biolgico Incubadora MATERIAL Material vegetal enfermo Agua estril Alcohol Cajas de Petri Papel filtro DESARROLLO DE LA PRCTICA PUDRICIN DEL TUBERCULO DE PAPA Para bacterias aisladas de rganos con pudricin, la patogenicidad se puede valorar con la prueba de pudricin del tubrculo de papa y los resultados se pueden observar a las 24 horas de haberse realizado.

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PROCEDIMIENTO Un tubrculo de papa de preferencia de la variedad Alpha, se lava, se seca y se desinfecta superficialmente, bandolo con etanol al 70%, seguido de un flameado (evite adicionar mucho alcohol porque al quemarse podr daar las capas externas del tubrculo y se correr el riesgo de contaminacin por bacterias esporuladas como Bacillus spp. De estos tubrculos se cortan rebanadas de 5mm de grosor y se colocan en cajas de Petri con papel filtro (previamente esterilizado) se pueden acomodar dos rebanadas por caja y una de ellas servir de testigo. A cada una de las rebanadas se les hace una insicin superficial y solo en una de ellas se pone crecimiento de la bacteria a probar. Finalmente se le adicionan unos 2-3 mm de agua estril solo para humedecer el papel y crear un ambiente hmedo, se incuban a 28 0C durante 24-72 horas. A partir de las primeras 24 horas, se palpa el tejido de cada una de las rebanadas y si la que ha sido inoculada, se siente blanda, indica que la bacteria probada sintetiza enzimas pectolticas y es muy probable que sea el agente causal de la pudricin. Al igual que la prueba anterior, tambin sirve para diferenciar especies y patovares de Pseudomonas fluorescentes. INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFA Agrios, G.N. 2007. Fitopatologa, LIMUSA. Mxico. 35 p.

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4.3.14 PRCTICA 14. OBSERVACIN Y RECONOCIMIENTO DE LOS NEMTODOS FITOPARSITOS EN EL LABORATORIO. INTRODUCCIN Los nemtodos son animales con una organizacin muy sencilla, que comprenden especies parasitas de plantas (Fitoparasitas), tambin existen nemtodos Saprfagos (vida libre) que favorecen la descomposicin de la materia orgnica, Omnvoros e incluso Depredadores, sin olvidar que hay nemtodos parsitos de animales (Zooparsitos), entre ellos los entomopatgenos que parasitan insectos y pueden emplearse en la lucha biolgica contra las plagas. Estos nemtodos los podemos encontrar en todos los lugares; el mar, agua dulce, suelo y partes areas de las plantas; donde nos causan serios daos a las plantas cultivadas, sin embargo a menudo pasan desapercibidos por los tcnicos y agricultores o sus daos son confundidos con otros factores; como la falta de fertilidad del suelo (deficiencias de nutrientes), escaso contenido de humedad, etc. Esto se debe fundamentalmente a su tamao microscpico y a que viven en el suelo y/o el interior de las races de las plantas. OBJETIVOS: Que el alumno reconozca y aprenda a diferenciar los nemtodos fitoparsitos de los de vida libre en el laboratorio. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Microscopio de diseccin Microscopio biolgico MATERIAL Vidrios de reloj Pipetas Agua DESARROLLO DE LA PRCTICA Usando los nemtodos disponibles en el laboratorio, se coloca en un vidrio de reloj una alcuota (2-5 mm) de la suspensin nemtodos-agua, enseguida se pasan al microscopio de diseccin para ser observados e identificar los nematodos fitoparsitos de los de vida libre. Y despus se observan en el microscopio biolgico. INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFA CEPEDA, S. M. (1995). Prcticas de nematologa agrcola. Ed; Trillas. Mxico. 109 pp.

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4.3.15 PRCTICA 2. MTODOS PARA LA EXTRACCIN DE NEMTODOS DEL SUELO (ECTOPARSITOS) INTRODUCCIN Las muestras tradas del campo tienen que ser procesadas en el laboratorio para obtener los nemtodos y observarlos con la ayuda del microscopio para su identificacin y conteo. Hay nematodos fitoparsitos que se alimentan de las races como ectoparsitos, los que siempre estarn en el suelo; pero otros se introducen al sistema radical (endoparsitos) del cual se alimentan e incluso algunos se mueven hasta las partes reas. El mtodo de extraccin ser de acuerdo al tipo de nemtodos mencionados anteriormente. OBJETIVOS: Qu el alumno se adiestre en las diferentes tcnicas para la extraccin de nemtodos del suelo (nemtodos de vida libre y fitoparsitos). MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Centrfuga Microscopio de diseccin MATERIAL Muestras de suelo con nematodos Embudos de 10-15 mm de dimetro Tubos de goma Pinzas de presin Malla de alambre Papel filtro Etiquetas Probeta Cubeta de plstico Tamiz de 100 mallas por pulgada cuadrada. Tamiz de 325 mallas por pulgada cuadrada. Tamiz de 500 mallas por pulgada cuadrada. REACTIVOS Kaolin Sucrosa DESARROLLO DE LA PRCTICA PREPARACIN DE LA MUESTRA La muestra que se recogi en el campo se esparce sobre un pedazo de plstico, se desmenuzan los terrones, se eliminan las piedras y separamos las races para procesarlas posteriormente y extraer los nemtodos endoparsitos. Una vez mullido el suelo, se procede a homogenizarlo con el fin de que las submuestras formen una muestra compuesta, finalmente se distribuye en el plstico. 73

MTODO DEL EMBUDO DE BAERMANN: Primero se coloca un tubo de goma (8-10 cm. de largo) al cuello de un embudo de 10-15 mm. de dimetro, enseguida se lavan ambos perfectamente y luego se coloca una pinza de presin en el tubo de goma para cerrar el paso del agua. Despus se procede a llenar con agua hasta 1 cm. bajo del borde del embudo y se coloca el embudo en la gradilla. Enseguida se etiqueta con los datos necesarios como: # de muestra, hospedero, fecha y lugar de colecta Una vez que se ha hecho lo anterior, se procede a preparar una tela de alambre que de antemano est amoldada al embudo, sobre ella se coloca un papel facial (kleneex) y luego la muestra de suelo (40-50 grs.), se envuelve la muestra y se humedece con una piceta, se coloca la tela de alambre sobre el embudo cuidando que esta toque el agua del embudo. Dejamos el embudo en reposo y a las 24 horas se sacan en un vaso de precipitado unos 10 ml. de agua. En ellos van los nemtodos parsitos y saprfitos que pasaron por el papel facial y la malla. Si se desea, se pueden observar directamente los nemtodos al microscopio de diseccin, esto se hace colocando unos 5 ml. de la suspensin en un vidrio de reloj, luego se observan. En caso contrario o despus de realizado lo anterior, se procede a matarlos y fijarlos para su preservacin por tiempo indefinido. MTODO COMBINADO (TAMIZ-EMBUDO DE BAERMANN): Del suelo distribuido en el plstico, se toman muestras en diversos puntos agregndose a una probeta que contiene 200 cc de agua hasta aforar a 300 cc. El contenido de la probeta se pasa a una cubeta A, con 4-5 lts. de agua, en la cual se siguen desmenuzando los terrones hasta que se disuelva bien el suelo. Se agita la solucin y la dejamos reposar durante 15-30 segundos para que se sedimente el material pesado y los nemtodos permanezcan flotando. El contenido de la cubeta A, se pasa a travs de un tamiz de 100 mallas por pulgada cuadrada a una cubeta B, en la cual se agita y la dejamos sedimentar para pasarlo por un tamiz de 325 ( 500) y lo que queda en l se pasa al embudo de Baermann. MTODO DE FLOTACIN (TAMIZ-CENTRFUGA): Lo que queda en el tamiz de 325 500 se pasa a un vaso de precipitado y se distribuyen los tubos de la centrifuga a los que previamente se les agreg 0.5-1.0 g de kaoln, el cual se mezcla bien y se centrifuga a 3000 rpm por 5 minutos, lo que permite la sedimentacin de los nemtodos junto con las partculas de suelo (favorecido por el kaoln). Despus se decanta el sobrenadante eliminando la materia orgnica suspendida. El sobrenadante eliminado se sustituye por solucin sucrosa (45 g. de solucin sucrosa o azcar refinada en 100 cc. de agua destilada) y se mezcla con la muestra. Se centrifuga a 3000 rpm durante 2 minutos y el sobrenadante se pasa por el tamiz de 325 500 mallas donde los nemtodos quedan retenidos procedindose inmediatamente a lavarlos sumergiendo el tamiz en agua para eliminar el azcar del cuerpo de los nemtodos. Con la ayuda de una piceta se pasan a un vaso de precipitado, quedando listo los nemtodos para hacer observaciones al microscopio y/o matarlos y fijarlos para estudios posteriores de identificacin y conteo. 74

INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFA PACHECO, A. J. (2000). Manual de prcticas de laboratorio de Nematologa. Juan Jos Ros, Sin; Mxico. 20 pp. THORNE, G. (1961). Principles of nematology, Mc. Graw-Hill book Co, New York, Estados Unidos. 553 pp.

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4.3.16 PRCTICA 16. MTODOS PARA LA EXTRACCIN DE NEMTODOS DE LA RAZ (ENDOPARSITOS) INTRODUCCIN Paralelamente al grupo de los nemtodos ectoparsitos (es decir, aquellos que se alimentan externamente de la raz y cuyo hbitat es el suelo), existe el grupo de los endoparsitos que se han adaptado a vivir dentro de los tejidos vegetales y que ya no dependen totalmente del ambiente del suelo, sino ms bien de lo que ocurre en la planta. As pues, podemos encontrar nemtodos desde la raz, tallos y hojas hasta en las flores, frutos y semillas, y que constituyen un serio problema para la agricultura porque son un grupo mucho ms peligroso que el anterior. Para la extraccin de estos nemtodos, existen algunos mtodos que por su sencillez y efectividad vale la pena conocerlos. OBJETIVOS: Que el alumno conozca y realice los mtodos de extraccin ms sencillos y prcticos que se conocen para extraer nemtodos endoparsitos. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Microscopio de diseccin Licuadora MATERIAL Races infectadas por nematodos Navajas Embudos Tamiz 325 mallas por pulgada cuadrada Agujas de diseccin REACTIVOS Kaolin Sucrosa DESARROLLO DE LA PRACTICA OBSERVACIN DIRECTA: Se usa en races con agallamiento, se utilizan agujas de diseccin para desmenuzar las agallas y extraer hembras, juveniles, machos y masas de huevecillos de los nemtodos que causan agallas (Meloidogyne spp. y Nacobbus spp.). INCUBACIN: Las races previamente lavadas o el follaje son cortados en pequeas piezas y se colocan en un recipiente con agua limpia dejndose reposar por unas 24-48 horas para que los nemtodos salgan de los tejidos.

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LICUADORA CENTRFUGA: Las races lavadas se licuan a alta velocidad durante un minuto y el licuado se centrifuga de igual forma que en la flotacin para nemtodos ectoparsitos. EMBUDO DE BAERMANN: Se procede de igual forma que lo descrito para ectoparsitos, solo que aqu usamos en lugar de suelo, pequeas piezas de races previamente lavadas. LICUADO-TAMIZADO: Lavar el material vegetal y cortar alrededor de 5 g. de races; los trocitos de raz se colocan en una licuadora en 100 ml. de agua y licuar durante un minuto. El material licuado se pasa a travs de un tamiz de 325 mallas, recogiendo el material en un vaso de precipitado. Despus observar al microscopio de diseccin. INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFA GERARDO, A. M. (2002). Manual de prcticas de Micologa. Juan Jos Ros, Sin; Mxico. 35 pp.

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4.3.17 PRCTICA 17. MANIPULACIN DE NEMTODOS INTRODUCCIN La manipulacin de los nematodos previo a su identificacin y conteo una vez que han sido extrados por las tcnicas usadas en el laboratorio, es un proceso muy importante porque lleva implcitos el matado, fijado y pesca de estos organismos. OBJETIVOS: Que el alumno conozca las tcnicas de manipulacin ms usadas para realizar la identificacin y conteo de nematodos en un anlisis nematolgico de una muestra. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Microscopio de diseccin MATERIAL Vidrio de reloj Lmpara de alcohol Pipetas Palillos de bamb Vasos de precipitado Tubos de ensayo Portaobjetos REACTIVOS Agua Fijador F.A. 4:10 DESARROLLO DE LA PRCTICA MATADO: Existen varios mtodos para realizar el matado de los nemtodos pero todos ellos lo hacen tratando de evitar su distorsin. Hay 2 formas generales para realizar esta operacin, ellas son: MATADO EN VIDRIO DE RELOJ: Se coloca en un vidrio de reloj una alcuota de la suspensin nemtodos-agua y enseguida se expone durante 12 segundos a la flama de una lmpara de alcohol. Despus se observan al microscopio de diseccin para verificar su muerte. MATADO EN MASA: Se pone a calentar agua en un vaso de precipitado de 500 ml., cuando alcance una temperatura de 60 C se retira de la flama y se introduce durante 34 minutos el recipiente (tubo de ensayo) que contiene 10 cc. de agua con nemtodos. Tambin se puede matar dejando hervir el agua introduciendo el tubo de ensayo durante un minuto.

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FIJACIN: Una vez que los nemtodos han sido matados, se deja enfriar el agua con nemtodos y se le agrega el fijador (F.A. 4:10) en una porcin de 1:1. Fijador F.A. 4:10 Formol al 40%.................... 10 cc. Acido glacial actico............10 cc. Agua destilada.....................10 cc. Nota: Con este fijador los nemtodos rara vez se distorsionan, pero tienden a tornarse caf y la parte posterior del estilete de los Tylenchidos se vuelven transparentes despus de unos cuantos das. PESCA DE NEMTODOS: Despus de la extraccin, matado y fijacin de los nemtodos, es necesario que sean trasladados a un portaobjetos con una gota de agua para observarlos, estudiar sus caractersticas e identificacin bajo el microscopio biolgico. El traslado se hace siempre de uno en uno con la ayuda de una varita de bamb con la punta bien adelgazada. La tcnica para pescar nematodos es la siguiente: 1.- En el centro de un portaobjetos se deposita una gota de agua. 2.- Se coloca una alcuota de la suspensin agua-nemtodos matados y fijados en un vidrio de reloj y se observan bajo el microscopio estereoscpico. 3.- Se localiza un nemtodo en el fondo del vidrio de reloj y con la ayuda de la varita de bamb se lleva al nemtodo hacia la superficie lentamente y una vez en la superficie, se saca rpidamente y se coloca en la gota de agua del portaobjetos. 4.- Nuevamente se busca otro nemtodos y se sigue el mismo procedimiento hasta trasladar por lo menos 5 nemtodos al portaobjetos. 5.- Se coloca un cubreobjetos a la gota de agua con nemtodos. Enseguida se observa al microscopio biolgico. 6.- Se estudian las caractersticas de cada nemtodo para su identificacin y su posterior cuantificacin. INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFA PACHECO, A. J. (2000). Manual de prcticas de laboratorio de Nematologa. Juan Jos Ros, Sin; Mxico. 20 pp. THORNE, G. (1961). Principles of nematology, Mc. Graw-Hill book Co, New York, Estados Unidos. 553 pp.

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4.3.18 PRCTICA 18. PREPARACIONES PERMANENTES DE NEMTODOS INTRODUCCIN En nemtodos fijados muchos de los detalles internos del cuerpo, especialmente gnadas, pueden ser obscurecidas por la apariencia granular del intestino. Los especimenes pueden ser aclarados procesndolos a lactfenol glicerina, los cuales son medios de montaje apropiados. Adems es muy importante con fines acadmicos o de investigacin al conservar preparaciones permanentes de nemtodos. OBJETIVOS: Que el alumno aprenda a realizar preparaciones permanentes de nemtodos para su conservacin. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Estufa Arnold MATERIAL Campana deshidratadora Vidrio de reloj Pelo de angel Portaobjetos Cubreobjetos REACTIVOS Etanol 96% Glicerina Agua destilada Lactofenol Cloruro de calcio DESARROLLO DE LA PRCTICA Transferir nemtodos del fijador a un vidrio de syracuse o de reloj que contenga 0.5 ml. de la siguiente solucin: Solucin I: Etanol 96% .................... 20 partes Glicerina ........................ 1 parte Agua destilada .............. 79 partes Colocar el vidrio de reloj es una campana deshidratadora que contiene 1/10 de su capacidad con etanol 96% y djelo cuando menos durante 12 horas en una estufa a 3540 C. Esto permite que se elimine casi toda el agua y deja a los nemtodos en una mezcla de glicerina y etanol. Llene el vidrio de reloj con la solucin II (5 partes de glicerina y 95 partes de etanol 96%) y parcialmente cerrado, colquelo durante 3 horas en una estufa a 40 C para que se evapore lentamente el etanol hasta que los nemtodos queden en glicerina pura. 80

Los nemtodos as deshidratados son transferidos a una gota de glicerina pura (purificarla dejndola en un recipiente abierto en una campana deshidratadora que contenga cloruro de calcio) en un portaobjetos, se colocan 2 tiras de pelo de ngel, despus se coloca un cubreobjeto y el borde de ste se sella con esmalte de uas transparentes. Se colocan etiquetas adhesivas al portaobjeto con los siguientes datos: 1.- Nombre cientfico 2.- Localidad 3.- Hospedante 4.- No. de hembras y machos 5.- Colector 6.- Fecha INFORME DE RESULTADOS

BIBLIOGRAFA YEPEZ, T. G. (1972). Los nemtodos enemigos de la agricultura, Imprenta Universidad de Caracas; Universidad Autnoma de Venezuela, Facultad de Agronoma. Venezuela. 220 pp.

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