Tema 8: Micrtomo Concepto Es un instrumento mecnico con el que se realizan secciones titulares de espesor micromtrico y por lo tanto lo suficientemente

e delgados para su posterior observacin microscpico. A menor grosor mejor estudio. Tipos: Existen 6 tipos bsicos de micrtomos pro todas tienen un principio bsico de funcionamiento. Tiene un portabloques en el que se va a apoyar el material que se va a cortar que avanza sobre una cuchilla gracias a un sistema de cremallera de forma peridica se hace incidir el bloque con la cuchilla o viceversa que va sobre el portacuchillas con lo que obtendremos secciones titulares de espesor equivalente al seleccionado por el tornillo que controla el mecanismo de avance. El mecanismo de avance puede ser manual o digitalizado. Nuestro bloque est formado por parafina. Antiguamente la fijacin del bloque era con parafinas fundida. Actualmente se realiza por medio de una pinza y es encima de ste portabloques donde existen unos tornillos que los permiten orientar el bloque de manera que queda paralela a la cuchilla. Portacuchillas consta de dos palancas que nos permiten fijar la cuchilla al micrtomo. Estos impiden que la cuchilla quede suelta y hay una palanca que controla la inclinacin de la cuchilla para cortar de forma homognea el bloque. El sistema de avance mecnico del portabloques sobre la cuchilla proporcionar cortes sucesivos de tejido a partir del bloque. Micrtomo de Oscilacin: Posee un sistema de avance de tornillo y las secciones se obtienen por un sistema oscilatorio de planaza que realiza l portabloque sobre la cuchilla al vascular sobre ella. Ventajas: simplicidad y bajo coste Desventajas: no permite obtener secciones seriadas. Micrtomo de Rotacin: Ha sido el ms empleado en anatoma patolgica. El portabloque colocado en posicin vertical se mueve de arriba abajo. Delante del filo de la cuchilla El portabloques avanza de manera automtica y constante, en cada vuelta del mango. Ventajas: Al tener mas peso, tiene ms precisin, permite obtener secciones seriadas muy finas. El mecanismo de avance es ms exacto. Desventajas: 1. El elevado precio debido a la complejidad del mecanismo de avance, que adems dificulta y encarece las reparaciones. 2. La imposibilidad de cortar con l tejidos incluidos en celoidina, en gelatina y en propiln glicol.

El micrtomo del aula es Minot Micrtomo de Deslizamiento: Existen principalmente dos tipos segn se movilice el portabloques, sobre la cuchilla permaneciendo esta fija, o viceversa, en ambos casos. El movimiento que produce el corte es el avance y retroceso de la porcin mvil sobre unas guas metlicas. 1 modelo: deslizantes o de tipo Leizls es ms estable y proporciona mejor calidad de corte ya que la vibracin de la cuchilla se elimina al permanecer fija. 2 modelo: es el que tiene una cuchilla mvil tambin llamado RehicherJung, este modelo est en desuso 3 modelo: este exista es el tipo tetrander que se utiliza para realizar secciones macromicroscpicas de rganos completos. La cuchilla est fija y lo que se desliza es el objeto. Se monta sobre una mesa especial. Ventajas: Por su diseo ocasiona pocas averas. Permite regular de forma exacta la presin de la cuchilla sobre el tejido. Debido al tamao de la cuchilla permite seccionar bloques titulares de gran tamao. Por la disposicin de esta cuchilla permite cortar bloques incluidos en celoidina. Inconvenientes: No permite realizar cortes seriados, con lo cual se enlentece el proceso. La exposicin de la cuchilla puede provocar accidentes Es casi imposible obtener secciones de un espesor inferior a 8 micras. Micrtomo de Congelacin: Se utiliza para efectuar secciones de tejido congelado y por tanto no deshidratado. La congelacin se consigue haciendo circular CO2 por el interior del portabloques procedente de una bombona y de esta forma el gas cuando se expande provoca el enfriamiento del tejido. Una vez congelada las secciones de trabajan con una cuchilla que se encuentra sobre un eje fijo de manera que el avance lo realiza el portabloques por un mecanismo directo del tornillo. Inconvenientes: Necesita CO2 y los cortes generalmente son mayores de 10 micras y se dificulta el estiramiento. El microtomo de congelacin ha sido desplazado por el criostato, solo se utiliza para el sistema nervioso, para estudios arquitecturales e histoqumicas. Criostato o criotomo: Colocado en un mueble frigorfico con una tapadera en la parte superior y tiene una manivela que se mueve desde fuera consta de un micrtomo de tipo Minot. Semejante al convencional de parafina que est incluido en una cmara de congelacin permite obtener cortes de material sin fijar a 20C o incluso a 60. La manivela que controla la realizacin del corte est fuera mientras que la cuchilla y el mecanismo de avance est dentro de la cmara fra. La obtencin de secciones seriadas es posible gracias a la existencia de un 2

sistema antienrrollamiento que obliga al corte a deslizarse sobre la superficie de la cuchilla, en los mas modernos es posible optar por el corte manual o motorizado, as como enfriar rpidamente la muestra, a menos 60C por medio de isopentano o nitrgeno lquido. Ventajas: 1. Con el se obtienen cortes mas delgados que con el micrtomo de congelacin de 4 micras o incluso 2 que se utiliza no solo para intras en estudios histoenzimticos o inmunohistoqumicos o en grasas. Se realiza primero 1 debastado de 1020 micras se corta generalmente a 5. En ste caso la pieza saldr al revs que con el microtomo de rotacin, o de tipo Minot. Ultramicrtomo: Prcticamente es un derivado del de tipo Minot pero con mejorar tcnicas que permiten efectuar secciones de manmetros de espesor incluso en plsticos. Se obtiene en microscopia electrnica. Tiene un sistema de iluminacin mltiple con una luz incidente sobre el bloque posterior Tiene un alcance tcnico por dilatacin de una varilla, metlica que se controla por n microordenador que permite el ajuste digital en pasos de un manmetro. Tiene una platina, portacuchillas regulable apta para cuchillas de vidrio o diamante, El sistema ptico tiene un microscopio o una lupa binocular incorporado mediante un motor se regula el brazo de avance tiene una unidad de control independiente con selectores para avance macro y micromtrico regulable en amplitud y velocidad. El portabloques es una pinza redondeada como la de los taladros (como la de las brocas). Cuchillas: Tipos: Eran piezas de acero grandes que haba que mantener en buen estado lo hacia el tcnico y eran personales. Actualmente las cuchillas son desechables, se tiran cuando tienen mellas y existen cuchillas de distintos materiales como acero inox., vidrio, carburo, diamante dependiendo de lo que se va a seccionar y del medio de inclusin. Se suele utilizar de acero inox. y para incluir en parafina y de carburo de tolueno. El largo de las cuchillas variar segn el portacuchillas. Existen 4 tipos: 1. Bicncava por ambas caras: se utiliza para cortar bloques de parafina blanda en el microtomo de balanceo o de rotacin. Inconvenientes: 1. Vibra en exceso, pero si el tejido es suficientemente blando produce excelentes secciones, se utiliza tambin para celoidina blanda. 2. Planocncavas: Tambin se llaman de tipo A y B segn sea mayor o menor el frado de concavidad de la cara no aplanada. Lo de tipo A se usa para bloques de parafina en el microtomo de deslizamiento y la de tipo B se utiliza para bloques en celoidina. 3. Cuchilla biplana en cua: o de tipo C que se utiliza indistintamente para cortes criostticos en congelacin de parafina de tipo Minot. Este tipo se ha impuesto por su fcil mantenimiento y su mayor rapidez cuando la dureza de los tejidos oscila notablemente. 4. Biplana: O de tipo D. Se utiliza para cortar material congelado con el microtomo de gas carbnico o 3

cuando el tejido es muy duro. Tcnica de corte: En anatoma patolgica es una de las funciones mas importantes, la exactitud en el diagnstico de la calidad y el espesor de los cortes, para ello necesitamos un microtomo moderno con adecuad mantenimiento cuchillas adecuadas y formacin y experiencia suficiente. La confeccin de los cortes consta de 6 pasos. Si no trabajamos el freno ha de estar puesto No se coge la cuchilla con las manos, cuando no se utiliza la cuchilla se pone una pieza que se llama guardas. Antes de empezar a cortar hay que tener preparado el material. Hay que preparar placas de parafina fras con hielo para mantener fros los bloques, prepararemos portas, lpices de grafito, agujas histolgicas Se enchufara el bao de flotacin programando la temperatura entre 4550 grados. Se debe comprobar peridicamente esta temperatura, con el termmetro. Se aadir al bao una pequea cantidad de gelatina en polvo, o bien que los cortes se adhieran al portaobjetos. Tallado y enfriamiento del bloque: Retallar un bloque es eliminar el exceso de medio de inclusin que existe en su periferia para disminuir la superficie total en contacto con la cuchilla. Esto se realiza con la parte de atrs de la hoja de bistur se consigue que el bloque oponga solo la resistencia al corte propia del tejido. Despus el bloque debe enfriarse para conseguir una consistencia ptima de la parafina. S e debe colocar a 4C si se colocara a menos de 0 la parafina tiende a cristalizar y se resquebrajara los bloques apareciendo artefactos en los tejidos. Esto no siempre se hace. Fijacin al portabloques: Existen sistemas comerciales que se adoptan a la pinza del micrtomo sino fuera as se podra hacer con parafina lquida. Orientacin y cuchilla: Hay que saber que existen 4 ngulos de control de la incidencia del bloque sobre la cuchilla: 1 es el ngulo de inclinacin, se representa por I, debe ser de 1015 grados 2 es el ngulo de arrastre, se representa por A, debe ser entre 5 y 8 grados 3 es el ngulo de corte, se representa por C, debe ser de 60 grados 4 es el de ngulo libre, es el complementario al ngulo de corte. Orientacin del bloque: Colocar el boque retallado sobre el portabloques y orientarlo de manera que quede paralelo al filo de la cuchilla, para orientarlo haba 2 tornillos. Se quita el freno y se hace descender el brazo hasta que la superficie del bloque entre en contacto con la cara interna de la cuchilla de debastado. Se comprueba que queden paralelos y sino se restablece mediante la manipulacin de los tornillos.

 Debastado y seleccin del espesor de los cortes: Para tejidos incluidos en parafina, lo 1 que hay que hacer es debastar para eso se ponen 20 micras y se elimina la 1 capa de parafina. Cuando vemos que empieza a salir tejidos se cambia el selector de micras y se pone a la que nos convenga. El espesor final ser de 2 a 5 micras, se utiliza el corte de 10 para tejido nervioso que tiene baja celularidad, los cortes mas delgados son difciles de obtener, son tiles en patologa renal, hematopoyticas y linfoide. Realizacin de las secciones: Realizaremos con una cuchilla que tengamos para debastar siempre con una parte de la cuchilla y una ve que sale el tejido, se cambia o se mueve la cuchilla y con un movimiento rtmico del volante, se generar una cinta continua de cortes que es conveniente retirarla por medio de un pincel o aguja histolgica y colocarla en el bao de flotacin que tendremos al lado. Si el tejido se resquebraja es til aadir vaho sobre el bloque, en todo momento tendremos un cubito de hielo par frotar sobre el bloque. Los cortes tienen 2 caras. La superior mate y la detrs mate ? Estirado de los cortes y confeccin de los cortes y confeccin de las preparaciones: Se coloca el corte en el bao de flotacin de manera que la cara brillante o inferior quede en contacto con el H2O al estar en H2O entre 4550 grados el corte se estira debido a la tensin superficial y flota, si existen pliegues se suelen estirar al ponerlas en el bao, a veces en la tira de cortes, segn sale, se puede coger con un porta objetos humedecido en alcohol de 50 o 70 y con este porta se deja reflotar en el bao. Despus procederemos a la captura de los cortes con nuestro porta enumerado, si nos sale mal podremos volver a reflotar y coger. Despus de montar las preparaciones y los portas hay que eliminar del H2O cualquier resto para evitar contaminaciones accidentales. Esto consigue pasando sobre la superficie del H2O un papel de filtro. Secado de los cortes: Antes de iniciar el proceso de coloracin hay que secarlos para evitar los desprendimientos. La desecacin e puede realizar de distintas formas. La desecacin puede hacerse de esta forma rpida introducindose los portas en un cestillo y este en una estufa que se encuentra previamente a 60 grados durante 3035 minutos. Tambin se puede dejar hasta 37 grados hasta el da siguiente. Problemas en el corte: (FOTOCOPIAS) Sistemas de Adhesin al porta: El porta debe estar bien desengrasado, para ello despus de lavarlo con agua y jabn y enjuagarlo con agua destilada se pueden dejar en una solucin de alcohol clorhdrico formado por 1 mL de HCl en 1000 mL de alcohol etlico de 96 o bien dejarlo en alcohol ter a partes iguales durante un da. Se deja secar y se coge por los bordes (Se deja secar inclinados). Para los procedimientos ms rutinarios o procedimientos ms habituales, la adhesin del tejidos al porta queda garantizada con un desengrasado meticuloso. Para tcnicas histoqumicas inmunolgicas o de biologa molecular se necesita impregnar los portas con sustancias adhesivas que eviten que se desprendan los cortes, para ello se utilizan sustancias naturales como la albmina de huevo o gelatina o bien sistemas comerciales formados por resinas y compuestos del tipo poli L lisina 5

que son mas caros pero proporcionan mayor adhesividad. Albmina glicerinada de Mayer: Los reactivos son: Clara de huevo recin extrado 50 mL Glicerol o glicerina 50 mL Salicilato sdico o fenol o timol una gota o 1gr. Se mide la clara y se bate a punto de nieve se le aade la misma cantidad de glicerina, se mezcla se agita y se filtra y se le pone un antibacteriano que puede ser salicilato sdico, fenol o timol. Del filtrado se impregna cada parte con una pelcula y se deja secar el aire. Posteriormente, durante el desparafinado se van a coagular la albmina y se aumenta la adhesin al porta. Gelatina: se hace a una concentracin al 5%, se disuelve en agua destilada y se puede disolver primero en agua caliente sin que llegue a hervir porque perdera sus propiedades de cohesin, cuando est a temperatura ambiente se aade el fenol (antibacteriano) del preparado anterior se aade 3 o 4 cucharaditas por litro de agua al bao de flotacin. En otros sitios aaden directamente una cucharada de gelatina en polvo al bao para tcnicas de enzimologa o de inmunohistoqumica (ihq) no podemos usar protenas animales ya que pueden producirse reacciones cruzadas. Resinas: son sustancias de alto peso molecular derivadas del fenol y son el sistema que proporciona mayor adhesin, habitualmente se utiliza una solucin de resina en acetona en proporcin 1:10 antes de su uso. Tcnica de corte en material congelado: Tcnica de corte en el criostato: por las especiales caractersticas de este instrumento, es un microtomo minot o de rotacin, situado en el interior de una cmara congeladora, es posible conseguir secciones de hasta 2 micras. Congelacin del material: para la realizacin de tcnicas histoenzimticas o inmunoqumicas es imprescindible que el tejido no haya sido fijado y que la congelacin, no se haya realizado lentamente en la cmara fra del criostato, debido a la formacin de cristales intratisulares de hielo que esto provoca. Si el criostato dispone de un sistema de congelacin ultrarrpido a 50C con isopentano se empleara tambin isopentano enfriado en nitrgeno lquido, con ello se consigue que el tejido est suficientemente congelado cuando se coloque en la cmara de corte del criotomo incluso puede ser necesario esperar algn tiempo hasta que se alcance la temperatura idnea para el corte. La realizacin de los cortes se facilita antes de ser congelado, el tejido se coloca dentro de una gota de medio sinttico de OCT de esta forma se provoca la inhibicin del tejido en el medio, adems se favorece la fijacin al portabloques del criostato. Hidratacin: Con ella conseguimos hidratar nuestros cortes para ellos e pasara por una batera de alcoholes con concentracin decreciente se puede hacer de diversas maneras. 1 forma: Con 2 cubetas de alcohol absoluto. Una cubeta de 96 y otra de agua. Se hacen pases rpidos en cada una de ellas. 2 forma: Cubetas de 100, 2 de 96 y 1 de 80. Despus de esta hidratacin hay que colorear. Siempre acaba en agua. Y segn la tcnica, despus de colorear habr que deshidratar aclarar y montar. 6