Dr. Horacio Cagnoni Ing. Mnica C: Rivoire Ing. Laura Alderete T.P.

N 4: ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUA DE CONSUMO Y SUPERFICIAL TCNICA DEL N.M.P ( Numero Mas Probable )

MATERIALES Tubos de ensayo Tapas Campanitas de Durghans Gradillas Pipetas de10 ml esterilizadas Autoclave Frascos estriles Cinta de esterilizacin Mechero de Bunsen Ansa para sembrado

REACTIVOS MEDIO PARA CULTIVO MAC CONKEY a) Solucin de caldo Mac Conkey Doble: Se pesan 70 g de caldo y se lleva a un litro con agua destilada. b) Solucin de caldo Mac Conkey Simple : Se pesan 35 g de medio y se lleva a 1 litro de agua destilada MEDIO PARA CULTIVO CITRATO DE KOSER DESHIDRATADO Se pesan 2,850 g y se diluye en 500 ml de agua destilada SOLUCION DE TIOSULFATO DE SODIO AL 3 % : Se pesan 3 g de Tiosulfato de Sodio en 100 ml de agua destilada

PREPARACIN DEL MATERIAL: Medios de cultivo:

Se deber preparar series de 5 tubos con solucin de caldo Mac Conkey de concentracin doble dispensando 10 ml en cada tubo; dentro de cada uno se colocara una Campana de Durghans ( con la parte abierta hacia abajo) . Tapar todos los tubos, colocar cinta de esterilizacin y esterilizar en autoclave a 120 C y 1 atm de presin durante 15 minutos.

De la misma forma se debe preparar tubos con solucin de medio de cultivo de concentracin simple dispensando, en este caso, 5 ml y una campana de Durghans. Tapar y esterilizar en autoclave. Tambin se preparan tubos con 5 ml de medio Koser, se tapan y esteriliza en autoclave a 120 C y 1 atm durante 15 minutos. Se deben esterilizar tambin de la misma forma las pipetas de 10 ml para ser utilizadas en la etapa de sembrado.
Envases :

Se utilizaran frascos de vidrio neutro con tapn hermtico y capacidad de 200 a 250 ml ; esterilizados en autoclave a 120 C y 1 atm de presin , durante 15 minutos. Se deben colocar previamente dentro de cada envase 3 ml de solucin de Tiosulfato de Sodio al 3 % para inhibir la actividad del cloro en caso que estuviera presente en la muestra a extraer. El frasco debe conservarse correctamente y no abrirse hasta el momento de la toma de muestra.

TCNICA Sembrado: Se realizara en un ambiente totalmente asptico con en mechero de Bunsen encendido permanentemente. Para cada muestra se utiliza una serie de cinco tubos de los preparados con Caldo de Cultivo de concentracin Doble De cada muestra extrada se toma con la misma pipeta esterilizada cinco porciones del agua a analizar de 10 ml cada una, que se colocaran respectivamente en un tubo de la serie. Es importante rotular correctamente el primer tubo de cada serie con el lugar al que pertenece la muestra y la fecha en la que fue sembrada. Se llevan finalmente a incubacin en estufa de cultivo a 37 C durante 48 hs. Luego de ese lapso de tiempo se observan los resultados y se determinan si hay algn tubo positivo

Repique A este procedimiento se someten todos los tubos que segn la interpretacin de resultados se consideren positivos. De esta forma se toma, por cada tubo positivo, un tubo de los preparados con Mac Conkey simple y uno de Koser. Tomando el ansa y colocndola sobre la llama del mechero hasta que llegue a rojo se siembran en ambas serie de tubos cada positivo. Inmediatamente los tubos de Mac Conkey Simple sembrados se incuban en bao trmico a 42 C durante 48 hs. y, los sembrados con Koser se colocan en estufa de cultivo a 37 C por el mismo lapso de tiempo. Finalmente, pasado este tiempo, se observa los tubos y se leern los datos en la tabla de equivalencias correspondiente para poder obtener as los resultados.

INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS

Se considera POSITIVO todo aquel tubo de Mac Conkey doble que durante el tiempo de incubacin de la primera etapa haya sufrido cambio de color ( de violeta a amarillento ) y haya tambin desarrollado presencia de ms de un 10 % de gas dentro de la campana , siendo estos los que se repican en la siguiente etapa. Cuando en la primer etapa todos los tubos sembrados de la serie de Mac Conkey doble correspondiente a la misma muestra permanecen inalterables, o bien, solo cambian de color, o , solo desarrollan gas en la campana , se consideran NEGATIVOS , lo cual implica que dicha muestra tiene en este momento un resultado clasificado como BUENA o APTA . Luego del tiempo de incubacin a los que se someten los tubos positivos repicados en Mac Conkey Simple, se consideran POSITIVOS y NEGATIVOS aquellos que hayan sufrido idnticos cambios que los explicados para la primera etapa, En el caso de los tubos repicados en Koser se considera NEGATIVO aquel que permanece inalterable, y , POSITIVO aquel que desarrolla turbiedad . En estos mismos se realizara la deteccin de Pseudomonas que se concreta cuando se visualiza en el medio un viraje a color verdoso, lo que indicara POSITIVA la presencia de Bacterias Pseudomona Aeruginosa . De esta forma es importante considerar al finalizarse la incubacin de la etapa de sembrado contar y anotar la cantidad de tubos positivos que se repican de cada muestra y, luego del repique contar el nmero de tubos positivos obtenidos de cada medio. Estos son los nmeros con los que finalmente se leen en la tabla los resultados del Numero Ms Probable de presencia de bacterias de

cada tipo halladas en las muestras analizadas, que determinan la aptitud o no de la misma.

BACTERIOLOGA DE AGUAS SUPERFICIALES

TCNICA DEL N.M.P POR DILUCIN

MATERIALES
Se utilizan los mismos materiales que para la tcnica en agua de consumo, la nica diferencia radica en que las pipetas a utilizar deben ser de 1 ml.

REACTIVOS SOLUCION DE PEPTONA DE CARNE AL 2 %: se prepara pesando 2 g de peptona en 100 ml de agua destilada. Dispensar en tubos de ensayo 9,3 ml de esta solucin, tapar y esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 120 C y 1 atm de presin . Se utiliza un tubo para preparar cada dilucin. MEDIO DE CULTIVO MAC CONKEY SIMPLE: Ver tcnica anterior. Se utiliza una serie de tres tubos por dilucin en la siembra; y los necesarios para el repique. MEDIO DE CULTIVO KOSER: ver tcnica anterior. Se utilizan los necesarios para el repique.

TCNICA: Siembra: El mecanismo fundamental es la realizacin de una serie de diluciones para cada muestra. De esta forma, en primer lugar se homogeniza correctamente la muestra a sembrar. Se toma una pipeta de 1 ml y se siembra con ella una serie de tres tubos de caldo Mac Conkey simple, colocando 1 ml en cada uno .Esta serie es llamada serie O, y es la correspondiente a la muestra pura, sin diluir. Utilizando la misma pipeta se coloca 1 ml de muestra en el primer tubo de peptona, se homogeniza en el interior y; cambiando la pipeta se procede a sembrar, tomando

sucesivamente 1 ml de esta dilucin la segunda serie de tres tubos de Mac Conkey simple. Esta es la serie llamada A correspondiente a una dilucin 1/10. Utilizando la misma pipeta, se toma, 1 ml de la dilucin A hecha en peptona y se colocan en un nuevo tubo de peptona, se homogeniza, y; cambiando la pipeta se siembra la siguiente serie de tres tubos Mac Conkey simple, a la que se rotula como serie B y corresponde a una dilucin 1/100. Sucesivamente se repite el mecanismo las veces que sean necesarias segn tantas diluciones requiera la muestra de a cuerdo a la carga bacteriana estimada que posea. Se rotulan sucesivamente C, D, E, F, etc. a cada nueva dilucin. Finalizada la siembra se colocan las series en incubacin en estufa de cultivo, a 37 C, durante 48 hs, tiempo luego del cual se procede a contar y anotar la cantidad de tubos positivos y negativos obtenidos de cada serie de diluciones sembradas.

Repique: Esta etapa de la tcnica es similar a la explicada anteriormente para bacteriologa de agua de consumo.

INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS: Los resultados se determinan igual que para la bacteriologa anterior, donde se consideran tubos positivos y negativos segn se explico ; y en base a estos se repican los positivos , siempre y cuando sea necesario discriminar el tipo de bacterias; si no se procede a la lectura de los resultados en las tablas correspondientes utilizando el numero de tubos positivos y negativos obtenidos para cada serie sembrada de cada dilucin. Las condiciones de aptitud o no de dicha muestra se determina segn las caractersticas del proceso o lugar al que la muestra pertenece comparando los resultados segn las normativas vigentes en cuanto a los valores lmites permitidos para ese tipo de efluente especifico, es decir si supera o no los valores mximos permitidos exigidos por la ley en el proceso, etapa o lugar que la muestra representa puntualmente.

Recuento en Placa Agar. Medio de cultivo recomendado para el recuento de bacterias aerbicas en aguas y aguas residuales. Tambin es recomendado como medio general para determinar

poblaciones microbianas. Fundamento

La productividad de este medio, est basada en el alto contenido nutricional de sus componentes, que permite el desarrollo de las bacterias presentes en la muestra. Siembra

- Tcnica De Pour Plate: sembrar 0.1 o 1 ml y agregar 15 ml del agar recuento en placa fundido y enfriado a 45-50 C. - En superficie: por estriado Incubacin Durante 24-48 horas a 32-35 C en aerobiosis. Resultados Efectuar el recuento en las placas que tienen entre 30-300 colonias. Expresar el resultado como UFC/ml (tener en cuenta el factor de dilucin). Almacenamiento: Medio deshidratado: a 10-35 C. Medio preparado: a 2-8 C

APELLIDO Y NOMBRE DEL ALUMNO:

FIRMA DEL DOCENTE:

FECHA: