CURSO DE VIROLOGIA BSICA

Elaborado pelo Prof. Dr. Paulo Michel Roehe (Com a participao de alunos de graduao de vrios cursos) EQUIPE DE VIROLOGIA Laboratrio de Virologia Instituto de Cincias Bsicas da Sade ICBS Rua Sarmento Leite, 500 Sala 208 Porto Alegre, RS CEP 90.050 170 Fone (51) 3308 3655 & FEPAGRO Sade Animal, Instituto de Pesquisas Veterinrias Desidrio Finamor (IPVDF), Estrada do Conde 6000, Eldorado do Sul, RS - CEP 92.990 - 000 Fone (51) 3481 3711

E-mail: proehe@gmail.com

CONTEDO DESTE POLGRAFO:

OBJETIVO LITERATURA RECOMENDADA HISTRICO DA VIROLOGIA E PRINCPIOS DE VIROLOGIA BSICA MTODOS EM VIROLOGIA PATOGENIA DAS VIROSES TRANSMISSO PENETRAO NO ORGANISMO MULTIPLICAO E DISSEMINAO NO HOSPEDEIRO INFECO E DISSEMINAO DE INFECES VIRAIS MULTIPLICAO VIRAL ESTGIOS DO CICLO DE MULTIPLICAO VIRAL CLASSIFICAO DOS VRUS FAMLIAS DE VRUS ANIMAIS CARACTERSTICAS DAS FAMLIAS DE VRUS COM GENOMA DE RNA CARACTERSTICAS DAS FAMLIAS DE VRUS COM GENOMA DE DNA AGENTES NO CONVENCIONAIS (PRONS)

OBJETIVO Este material de estudo tem o objetivo de servir como texto bsico para as disciplinas onde a virologia faz parte do currculo. Foi preparado com a colaborao de muitos estudantes que trabalharam (ou ainda trabalham) junto ao Laboratrio de Virologia, ou freqentaram as aulas de virologia em determinado momento. O texto foi elaborado visando a familiarizao do aluno com o papel dos vrus na natureza, em particular daqueles que causam doenas aos homens e animais.

LITERATURA RECOMENDADA [e observaes]: Fields Virology (2005) Fields BN, Knipe DM, Howley PM, Chanock RM, Melnick JL, Monath TP, Roizman B & Straus SE (eds). Fifth edition. Lippincott-Raven. [Este livro a Bblia da virologia; porm, muito extenso e complexo para estudos de graduao]. Virologia Veterinria (2007) E.F. Flores (org). [Excelente livro, com tima parte bsica, em portugus, e a parte especial dedicada aos vrus de interesse veterinrio]. Manual of Clinical Microbiology (Publicado pela American Society of General Microbiology, ltima edio 1999). [timo em mtodos recentes de diagnstico para virologia humana]. Human Virology: A Text for Students of Medicine, Dentistry, and Microbiology (Oxford Medical Publications) by Leslie Collier and John S. Oxford (Paperback - Oct 1, 1993). Virology Methods Manual, First Edition by Hillar O. Kangro (Plastic Comb - Jan 15, 1996). [timo para o laboratrio]. Veterinary Virology, Frederick A. Murphy, E. Paul J. Gibbs, Marian C. Horzinek, and Michael J. Studdert (Hardcover - Oct 15, 1999). Human Virology. Leslie Collier and John Oxford (Paperback - Jul 20, 2006). Clinical Virology by Douglas D. Richman, Richard J. Whitley, and Frederick G. Hayden (Hardcover May 2002). Jawetz, Melnick, & Adelberg's Medical Microbiology (LANGE Basic Science) by Geo. F. Brooks, Janet S. Butel, Stephen A. Morse, and Geo. Brooks (Paperback - April 2, 2004) [Ou verses mais recentes]. Colees especficas disponveis na biblioteca do ICBS ou no Portal peridicos da CAPES: Revistas e peridicos: Virology Intervirology Archives of Virology Journal of General Virology Advances in Virus Research Virus Research Science Nature e muitas outras !!! Sites na Word Wide Web: Sites de busca: Wikipedia; [Muito bom em todos os temas da virologia; muito til]. Google: [Digite: "All the Virology on the WWW" ou ATV]. Sites: www.tulane.edu/~dmsander/www/224/Replication224.html [site relacionado a replicao viral; dentro do "all the virology"] www.micro.msb.ac.uk www.umu.se/virology/alistair [Site com jogos interativos sobre virologia] http://duke.usask.ca [Cursos de virologia, etc, etc] http://life.anu.edu.au/viruses/welcome.htm Obs.: Outros sites foram includos nos captulos apropriados, quando possvel.

Aula 1- HISTRICO DA VIROLOGIA // PRINCPIOS DE VIROLOGIA BSICA ATENO: CONSULTE O SITE: Introduction to Molecular Virology - Preparado por Ed Rybicki, Department of Microbiology at the University of Cape Town, South Africa. www.uct.ac.za/microbiology/tutorial/virtut1.html OBJETIVOS: Ao final destas aulas o aluno ser capaz de: Reconhecer alguns dos momentos histricos importantes da virologia; Reconhecer quais os mtodos mais comumente empregados para o estudo, isolamento e multiplicao viral; Definir o que um vrus e identificar seus componentes essenciais; Compreender que existem vrus em praticamente todas as espcies, sendo apenas alguns deles patognicos. HISTRICO Seculo X A.C.: China: varola (casos pouco documentados, tentativas de imunizao com crostas). Sculo XIV - Holands voador: Os navios singrando os mares sem tripulao poderiam ser causados por episdios de febre amarela. O velho marinheiro: outra histria em que os vrus desempenham papel. Raiva: desde o tempo dos faras - ces mordendo pessoas em desenhos nas pirmides. Sculo XVIII - Jenner: por volta de 1798: se torna o pai da vacinao => vacina James Phipps com suspenso de crostas de cowpox. Beijerinck (1899): com o vrus do Mosaico do Fumo demonstra que so agentes filtrveis e transmissveis. - considerado o "pai da virologia". - Transmisso com filtrados: "Humores malignos" (= vrus) "contagium vividum fluidum" Loeffler & Frosch (1898): (um pouco antes de Beijerinck, mas no to bem documentado): demonstraram a filtrabilidade do vrus da febre aftosa, primeiro vrus de mamferos identificado. Ellerman & Bang (1908): descobriram que a leucose das aves uma doena transmissvel (causada por um retrovrus!). Rous (1911): descobriu o vrus do Sarcoma das aves (Sarcoma de Rous) (outro retrovrus!). Mais adiante, o mesmo Rous mostrou que um papilomavrus causava cncer de pele em coelhos. Stanley (1935): trabalhando com o vrus do mosaico do fumo, observou que em determinadas situaes os vrus podiam ser cristalizados (e isso gerou um prmio Nobel para ele, mas tambm muita confuso: seriam os vrus elementos de transio entre os reinos mineral e animal ?). EXISTEM VRUS EM TODAS AS ESPCIES QUE TEM CLULAS: Bactrias (bacterifagos ou fagos) muito utilizados hoje em dia na biologia molecular para a transferncia e expresso de genes; Plantas uma infinidade de vrus afetam vegetais; Animais - ONDE SE CONCENTRA ESTE CURSO - neste pequeno nmero de vrus que causa doenas em animais, incluindo o homem, claro. AFINAL, O QUE UM VRUS ? a) So microorganismos que se replicam sempre dentro de clulas vivas; b) Utilizam (em maior ou menor grau) o sistema de sntese das clulas; c) Induzem a sntese de protenas capazes de transferir o genoma viral para outras clulas.

UM VRUS COMPLETO = UM VRION = UMA PARTCULA VIRAL INFECCIOSA ESTRUTURA DOS VRUS: Genoma ou Ncleo: RNA ou DNA. Por vezes, o genoma est envolto em uma camada de protenas distinta do capsdeo. Capsdeo (formado por capsmeros) O conjunto de ncleo mais capsdeo denominado nucleocapsdeo. Envelope (glicoprotenas -> peplmeros). Muitas vezes as glicoprotenas formam "espculas" (projees a partir do envelope)

TIPOS DE ACIDO NUCLICO VIRAL: FITA SIMPLES de DNA (fsDNA); FITA DUPLA de DNA (fdDNA); FITA SIMPLES de RNA (fsRNA); FITA DUPLA de RNA (fdDNA).

Foto-montagem do Dr. Vikram Misra, Saskatchewan Vet Med School, Canad.

Os vrus que tem seu genoma composto por uma fita simples de RNA pode ainda ser subdivididos em: Vrus cujo genoma tem a mesma orientao do mRNA, chamado genoma de polaridade positiva, ou simplesmente genoma de fita simples positiva; Vrus cujo genoma tem a orientao inversa do mRNA, chamados de polaridade negativa, ou genoma de fita simples negativa. O CAPSDEO VIRAL: Composio essencialmente protica. Composto por um nmero varivel de protenas. Alguns vrus: possuem uma "matriz" protica, que preenche o espao entre o genoma e o envelope (ex. herpesvrus, paramixovrus). Esta matriz, tambm protica, exerce funes variveis dentro da multiplicao ou encapsidao viral.

SIMETRIA DO NUCLEOCAPSDEO: Icosadrica ou cbica: picornavrus, parvovrus, adenovrus; Helicoidal : rhabdovrus, filovrus, bunyavrus; Complexa: somente os poxvrus, mais complexos do que os demais. Precisamos tambm saber um pouco sobre quais as

MEDIDAS COMUMENTE USADAS EM VIROLOGIA: MICRON () = 1/1000 mm (10-3 mm) NANMETRO (nm) = 1/1000 000 mm (10-6 mm) NGSTROM = 1/10 000 000 mm (10-8 mm) DALTON ( x 1000= kiloDalton, kDa) = 1.66 x 10-24 g

Caractersticas gerais, estrutura e taxonomia viral

Extrado de: http://www.ivis.org/advances/carter/part1chap1_pt/chapter.asp?la=7 In: A Concise Review of Veterinary Virology, Carter G.R., Wise D.J. and Flores E.F. (Eds.). International Veterinary Information Service, Ithaca NY (www.ivis.org), Last updated: 6-Dec-2004; A3401.1204.PT D.J. Wise1, G.R. Carter2 and E. F. Flores3
1- Department of Biology, Concord University, Athens, West Virginia, USA. 2- Virginia-Maryland Regional College of Veterinary Medicine, Virginia Tech, Blacksburg, Virginia, USA. 3- Department of Veterinary Preventive Medicine, Federal University of Santa Maria, Santa Maria, RS Brazil.

Traduzido por: E. F. Flores, Department of Veterinary Preventive Medicine, Federal University of Santa Maria, Santa Maria, RS Brazil. (17-Jun-2005). ndice o Generalidades o Estrutura viral o Taxonomia viral o Glossrio Generalidades Os vrus so os menores e mais simples microorganismos que existem. So muito menores que clulas eucariotas e procariotas. Ao contrrio destas, possuem uma estrutura simples e esttica. No possuem metabolismo prprio. Dependem da maquinaria celular para a sua replicao (parasitas intracelulares obrigatrios). Possuem DNA ou RNA como genoma, mas no possuem ribossomas e outros fatores necessrio para a produo de protenas. Por isso necessitam das funes e do metabolismo celular para produzir suas protenas e se multiplicar. O genoma viral, cido ribonuclico (RNA) ou deoxiribonuclico (DNA), codifica as informaes mnimas para: 1. Assegurar a sua replicao; 2. Empacotar o seu genoma e 3. Subverter funes celulares em seu benefcio. Alguns vrus infectam clulas procariotas (bacterifagos); outros infectam clulas eucariotas. Alguns vrus destroem as clulas infectadas, produzindo enfermidades; outros persistem em estado latente ou persistente na clula; e outros podem causar transformao tumoral nas clulas infectadas. Estrutura viral Os vrus so compostos, pelo menos, do genoma de cido nuclico RNA ou DNA e uma cobertura de protenas. Muitos vrus possuem uma membrana externa adicional denominada envelope. A cobertura protica ou capsdeo de um vrion (virus completo ou partcula vrica) composta de cpias mltiplas de uma ou mais tipos de protenas. Essas protenas se associam entre si, formando unidades estruturais denominadas capsmeros. O conjunto do genoma mais o capsdeo de um vrion denominado de nucleocapsdeo. Os vrus mais simples no possuem envelope e possuem RNA ou DNA de cadeia simples (Fig. 1.1). Os vrus envelopados contm uma membrana externa que recobre o nucleocapsdeo (Fig.1.2). Essa membrana externa (ou envelope) derivada de membranas da clula hospedeira (nuclear, do aparelho de Golgi, do retculo endoplasmtico ou membrana plasmtica). Assim como essas

membranas, o envelope constitudo de uma membrana lipdica dupla com protenas nela inseridas. As protenas do envelope viral so codificadas pelo seu genoma. Alguns vrus, como os bacterifagos, possuem caudas proticas complexas que so necessrias para a ancoragem e introduo do genoma viral na clula hospedeira.

Figura 1-1. Vrion sem envelope, com capsdeo icosadrico. O cido nuclico localiza-se no interior do capsdeo. Ilustrao cortesia de A. Wayne Roberts.

Figura 1-2. Vrion envelopado, com capsdeo helicoidal. O cido nuclico localiza-se no interior do vrion, como indica a linha pontilhada em forma de espiral. As linhas na superfcia externa do envelope representam espculas glicoproticas. Ilustrao cortesia de A. Wayne Roberts. O genoma viral O genoma dos vrus constitudo de DNA ou RNA. Nenhum vrus contm DNA e RNA simultaneamente. O DNA pode ser de fita simples (parvovirus e circovirus), fita dupla (poliomavirus, adenovirus, herpesvirus) ou fita dupla parcial (hepadnavirus). O genoma DNA pode ter as suas extremidades

covalentemente ligadas entre si (genoma circular poliomavirus e circovirus) ou possuir as extremidades livres (linear adenovirus, herpesvirus, parvovirus). O genoma dos poxvirus DNA de fita dupla linear e possui as extremidades ligadas entre si. Todos os genomas virais de RNA so lineares. A maioria deles RNA de fita simples, poucos possuem RNA de fita dupla (reovirus, bornavirus). A maioria dos genomas RNA possui um nico segmento (monopartite), enquanto alguns possuem o genoma dividido em dois segmentos (arenavirus), trs (bunyavirus), 7 ou 8 (otomyxovirus) ou 10 segmentos (reovirus). Os genomas RNA de fita simples podem ser classificados em: RNA de sentido positivo (RNA +): se o RNA genmico serve de RNA mensageiro e traduzido pelos ribossomas da clula hospedeira. RNA de sentido negativo (RNA -): se o RNA genmico complementar ao RNA que traduzido, e por isso no pode ser traduzido diretamente pelos ribossomas. Nos arenavirus e bonyavirus, um segmento do RNA genmico (sentido negativo) transcrito e origina cpias de RNA de sentido positivo (que funcionam como RNA mensageiro). No entanto, cpias destes RNAs (que seriam de sentido negativo) tambm servem de mensageiros e so traduzidas. Essa estratgia denominada de ambissense. O genoma dos vrus pode codificar desde poucas protenas diferentes (Polyomavirus, 6 a 7 genes, 5000 nucleotdeos de extenso) at mais de 70 - 100 produtos gnicos (herpesvirus, 60 a 120 genes, 120.000 a 220.000 pares de bases de extenso). Em geral, o genoma dos vrus RNA so menores, atingindo uma extenso mxima de pouco mais de 30.000 nucleotdeos (Coronavirus). Uma hiptese para explicar isto seria a de que as polimerases virais de RNA tendem a cometer mais erros do que as polimerases de DNA no processo de replicao do genoma. Assim, a fidelidade de replicao poderia limitar o tamanho do genoma. Ao contrrio, os genomas de vrus DNA podem atingir mais de 300.000 pares de bases, como se observa em alguns herpesvirus. O capsdeo A funo do capsdeo empacotar e proteger o genoma viral durante a sua transferncia entre clulas e hospedeiros. O capsdeo pode ser formado por cpias mltiplas de uma mesma protena ou por uma associao de vrias protenas diferentes. Os capsdeos construdos por cpias de uma nica protena representam um exemplo de economia gentica, pois apenas um gene pode codificar os produtos necessrios para construir o capsdeo e recobrir completamente o genoma. O capsdeo de um vrus pode possuir vrias formas geomtricas que so caractersticas de cada famlia viral. Essas incluem: o Capsdeo icosadrico sem envelope (picornavirus, polyomavirus); ou envelopado (herpesvirus). Essa forma geomtrica possui vrias faces triangulares e ngulos (Fig. 1.1.); o nmero de faces e ngulos pode variar de acordo com o nmero e tipo de associao entre as protenas estruturais constituintes. o Capsdeo helicoidal, sem envelope (virus do mosaico do tabaco) ou envelopado (rabdovirus, paramyxovirus), (Fig. 1.1 e Fig. 1.2.). Os vrus variam de tamanho, desde os circovirus com 17 - 22 nm de dimetro, at os poxvirus, que podem atingir os 300 nm. Esses vrus possuem uma forma ovide e so suficientemente grandes para serem visveis sob microscopia tica, ao contrrio dos demais cuja visualizao requer microscopia eletrnica. Vrias tcnicas tm sido utilizadas para a visualizao dos vrus. A cristalografia de raios X utilizada para determinar a estrutura fsica, assim como as dimenses e morfologia das protenas e estruturas componentes da partcula vrica. As informaes obtidas pelo uso dessa tcnica so utilizadas para construir um modelo da estrutura da partcula viral. A microscopia eletrnica utilizada para determinar-se a morfologia dos vrus e tambm com fins diagnsticos para a deteco de vrus em amostras clnicas. No captulo 2 so descritos com detalhes os mtodos utilizados para a visualizao de virus. Cinco formas estruturais bsicas De acordo com a sua morfologia, existem cinco tipos bsicos de estrutura de partculas vricas, citadas a seguir com exemplos: Icosadrico sem envelope: adenovirus e picornavirus.

Helicoidal sem envelope: vrus do mosaico do tabaco; no se conhece vrus humanos ou animais com essa estrutura. Icosadrico com envelope: togavirus e flavivirus. Helicoidal com envelope: rabdovirus e paramyxovirus. Complexos: bacterifagos e poxvirus.

Envelope O envelope viral, presente em vrus de algumas famlias, origina-se de membranas da clula hospedeira atravs de brotamento, que ocorre durante o egresso de vrions maduros da clula hospedeira. Essa membrana freqentemente derivada de uma regio da membrana plasmtica, mas pode originar-se tambm das membranas do aparelho de Golgi, do retculo endoplasmtico ou da membrana nuclear, dependendo do vrus e do compartimento celular onde ocorre a replicao. Independentemente de sua origem, o envelope composto de uma camada dupla de lipdios de origem celular com protenas associadas. As protenas do envelope so codificadas pelo vrus e constituem-se em sua maioria de glicoprotenas. O nmero de protenas do envelope pode variar de uma at mais de dez, dependendo do virus. As glicoprotenas do envelope desempenham vrias funes, incluindo a ancoragem inicial do vrion na clula, penetrao, fuso e disseminao do vrus entre clulas. A ancoragem inicial do vrion na superfcie da clula requer que o envelope esteja intacto e que as glicoprotenas estejam em sua conformao natural. Algumas drogas antivirais so dirigidas contra as protenas do envelope e podem reduzir a capacidade dos vrus de se ligarem na clula e iniciarem a infeco, reduzindo assim a sua infectividade. O processo de brotamento e a conseqente aquisio do envelope por vrions recm-formados podem ou no resultar na destruio da clula infectada. A liberao de um nmero muito grande de vrus simultaneamente pode comprometer a integridade celular e resultar na morte da clula. Muitas vezes, a liberao da prognie viral lenta e resulta em excreo viral contnua e infeco crnica ou persistente. Ao contrrio dos vrus sem envelope, cuja liberao quase sempre acompanhada de morte celular, o egresso de vrus envelopados muitas vezes compatvel com a sobrevivncia da clula hospedeira. Portanto, o processo de brotamento representa um mecanismo de liberao de prognie viral sem induzir morte celular. Protenas virais O genoma dos vrus codifica dois tipos de produtos: as protenas estruturais e as no-estruturais. As protenas estruturais so aquelas que fazem parte da estrutura fsica da partcula vrica (capsdeo, envelope), enquanto as protenas no-estruturais so produzidas dentro da clula infectada e desempenham diferentes funes na replicao viral. O nmero de protenas codificadas pelos vrus varia amplamente, desde poucas at centenas. As protenas estruturais incluem aquelas que fazem parte do capsdeo e associam-se e empacotam o genoma viral. Em alguns vrus envelopados, existe uma camada protica denominada tegumento entre o capsdeo e o envelope. As protenas que compe o tegumento tambm so estruturais. As protenas da superfcie do capsdeo e do envelope so ligantes, que interagem com receptores na superfcie da clula hospedeira. Algumas dessas protenas (as glicoprotenas) so processadas no lmen do retculo endoplasmtico, onde resduos de acar (oligossacardeos) so incorporados cadeia polipepttica. Essas protenas so enviadas ao aparelho de Golgi, a vesculas secretoras e finalmente se fusionam com a membrana plasmtica, podendo estar presentes na superfcie da clula infectada. As glicoprotenas do envelope desempenham papel importante nas interaes entre os vrions e as clulas (ligao, penetrao, fuso, disseminao entre clulas) e so alvos importantes para anticorpos neutralizantes produzidos pelo hospedeiro. As protenas estruturais so principalmente enzimas, como aquelas envolvidas no processo de transcrio do genoma, replicao e processamento de protenas. Um exemplo de protena no-estrutural a transcriptase reversa dos retrovirus, que produz cpias de DNA a partir de um molde RNA para serem incorporadas ao genoma da clula hospedeira. Alguns vrus codificam vrias protenas no-estruturais que desempenham papis acessrios na regulao da expresso gnica celular e viral, regulao das vrias etapas do ciclo replicativo do vrus, neutralizao dos mecanismos de defesa do hospedeiro, transformao celular, entre outras. Outros componentes dos vrions Lipdios

Os lipdios presentes nas partculas vricas envelopadas so derivadas das membranas celulares. So, em sua maioria fosfolipdios (50 - 60%) e o restante colesterol. O envelope dos vrus contm lipdios derivados das membranas celulares e protenas codificadas pelo vrus, as vezes formando projees (espculas). A composio lipdica total dos vrus envelopados representa aproximadamente 25 a 30% do seu peso seco. O restante formado pelo genoma e parte protica. Carboidratos Os carboidratos esto presentes essencialmente na forma de oligossacardeos nas glicoprotenas, glicolipdios e mucopolissacardeos. A composio de carboidratos corresponde aproximadamente quela da clula hospedeira. No entanto, as glicoprotenas freqentemente contm uma ligao glicosdica N- ou O-. Os carboidratos encontram-se principalmente no envelope. Alguns vrus complexos contm glicoprotenas internas ou protenas glicosiladas tambm no capsdeo. Taxonomia Viral Os vrus constituem um grupo numeroso e heterogneo. So classificados em categorias hierrquicas baseadas em vrias caractersticas. A classificao dinmica, j que novos vrus esto sendo continuamente descobertos; e novas informaes se acumulam sobre os vrus j conhecidos. A classificao e nomenclatura utilizadas neste texto estavam atualizadas at a sua submisso. As alteraes mais recentes podem ser verificadas em informativos peridicos do Comit Internacional para Taxonomia Viral (ICTV). (Disponvel em amazon.com). O esquema bsico de classificao hierrquica : Ordem - Famlia - Subfamlia - Espcie - Cepa / Tipo. Determinadas caractersticas virais definem cada uma dessas categorias taxonmicas. As Ordens possuem o sufixo: virales; as famlias possuem o sufixo: viridae; e os gneros e espcies: virus. Uma espcie de vrus representada por uma linhagem replicativa que ocupa um nicho ecolgico, por exemplo, uma enfermidade particular. Os vrus so classificados em famlias com base em muitas caractersticas. Uma caracterstica bsica o tipo de cido nuclico (DNA ou RNA) e a morfologia, ou seja, o tamanho e forma do vrion, assim como a presena ou no do envelope. O espectro de hospedeiros e as propriedades imunolgicas (sorotipos) tambm so utilizados. Propriedades fsico-qumicas como massa molecular, densidade, inativao trmica, estabilidade ao pH e sensibilidade a solventes tambm so utilizados na classificao viral. Alguns aspectos importantes na taxonomia atual so o tipo de cido nuclico, se o genoma possui cadeia dupla ou simples, a organizao dos genes no genoma e a presena de determinados genes. Essas caractersticas so utilizadas para classificarem-se os vrus em ordens ou famlias. Por exemplo, a ordem Mononegavirales est composta pelos vrus que possuem o genoma RNA de fita simples, polaridade negativa. Finalmente, a classificao se baseia nas macromolculas produzidas (protenas estruturais e enzimas), propriedades antignicas e propriedades biolgicas (infectividade, capacidade hemaglutinante, etc.). As vrias famlias so ordenadas no sumrio de acordo com as diversas caractersticas de seu cido nuclico. Neste polgrafo, as famlias so apresentadas utiizando a mesma ordem apresentada na tabela a seguir. A tabela 1.1 apresenta informaes bsicas sobre cada uma das principais categorias taxonmicas virais.

10

11

12

13

Partculas vricas atpicas associadas com infeces: Vrions defectivos Os vrions defectivos ou incompletos so aqueles cujo genoma no possui um ou mais genes especficos, devido a mutao ou deleo. Por isso, so incapazes de completar o ciclo replicativo na clula. No entanto, se a clula for co-infectada com outro vrus denominado vrus helper (auxiliar) o produto do gene ausente no vrus defectivo complementado pelo vrus auxiliar e aquele pode replicar. Para alguns vrus, a quantidade de partculas incompletas ou defectivas produzidas maior do que os vrions completos (at 1:1000). A produo de partculas defectivas caracterstica de algumas espcies de vrus e acredita-se que possa moderar a severidade da enfermidade clnica in vivo. Os virusides, que so exemplos de vrus defectivos, sero discutidos a seguir nesse captulo. Pseudovrions Pseudovrions podem ser produzidos durante a replicao viral, quando o genoma da clula hospedeira se fragmenta. Como resultado disso, segmentos de DNA celular so incorporados em partculas vricas, em substituio ao DNA viral. Esses pseudovrions podem ligar-se na clula hospedeira, penetrar, mas no so capazes de replicar, pois no possuem os genes virais necessrios. Prions Os prions no so vrus. So partculas proticas infecciosas associadas a encefalopatias espongiformes transmissveis (TSEs) de humanos e animais. As TSEs inlcuem a doena de Creutzfeldt-Jacob (CJD) em humanos, scrapie em ovinos e BSE em bovinos. Prions e TSEs so abordados com mais detalhes no captulo 29. Resumidamente, o exame microscpico do crebro revela grandes vacuolos nas regies do crtex e cerebelo, da a denominao de encefalopatia espongiforme. Exames mais detalhados das regies afetadas revelam depsitos de fibrilas e placas amilides associadas com a protena prion. Essas enfermidades se caracterizam pela perda do controle motor, demncia, paralisia e inevitavelmente morte. Maiores detalhes da patogenia ainda no so conhecidos. Virides Os virides so cidos nuclicos de baixo peso molecular, desnudos, extremamente resistentes ao calor, a radiao ultravioleta e radiao ionizante. Essas partculas se compem exclusivamente de um fragmento de RNA circular de cadeia simples, com algumas regies de cadeia dupla. Os virides causam, em sua maioria, doenas em plantas como a doena do tubrculo fusiforme da batata. Virusides Os virusides (tambm chamados de RNA satlites) so similares aos virides, pois so segmentos de cido nuclico de baixo peso molecular, extremamente resistentes ao calor e a radiaes ultravioletas e ionizantes. No entanto, dependem de um vrus auxiliar para a sua replicao. Os virusides replicam no citoplasma da clula, atravs de uma polimerase de RNA dependente de RNA. Nova famlia de vrus Mimiviridae Mimiviridae uma famlia viral que contm apenas um membro, Mimivirus. O nome do vrus derivado do termo "micrbio imitador". O agente foi descoberto em 1992, infectando um protozorio e at o presente o maior vrus que se conhece, com aproximadamente 400 nm de dimetro. O capsdeo possui

14

forma icosadrica, no possui envelope e o genoma uma molcula de DNA de cadeia dupla de 1.2 Mb contendo aproximadamente 1260 genes. A seqncia completa do genoma do Mimivirus foi recentemente publicada (2004). Glossrio Bacterifago: vrus que infecta clulas procariticas e possui muitas caractersticas de vrus plantas e animais. Requer uma bactria viva para realizar seu ciclo reprodutivo. Brotamento: processo atravs do qual os vrus adquirem envelope. precedido da insero glicoprotenas virais nas membranas da clula hospedeira. Esse processo ocorre mais freqentemente membrana plasmtica e confere infectividade ao vrus. Mucopolissacardeo: uma classe de polissacardeo como heparina, cido hialurnico e sulfato condroitina, que absorvem gua para formar um material espesso, mucide, gelatinoso. Oligossacardeo: um acar que contm um nmero pequeno e conhecido de unidades monosacardeos.

de de na de de

Obs.: Direiros reservados: este documento est disponvel em www.ivis.org. Documento no A3401.1204.PT.

15

MULTIPLICAO VIRAL
Os vrus seguem os mesmos princpios do dogma central da multiplicao biolgica: DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA DNA------------->RNA----------->PROTENA
Transcrio Traduo

Alguns vrus podem se utilizar do processo reverso de transcrio (atravs da enzima transcriptase reversa) para originar "cpias" de DNA, a partir do RNA viral (ex. HIV). RNA(viral)-------> DNA------------->RNA----------->PROTENA
Transcrio Transcrio Traduo reversa

Os hepadnavrus (ex. vrus da hepatite B) apresentam uma estratgia de multiplicao ainda mais incomum. Embora seu genoma seja de DNA, eles produzem novas cpias de DNA por transcrio reversa a partir do RNA gerado pelo vrus. DNA(viral)----------> RNA--------------> DNA------------->RNA----------->PROTENA
Transcrio Transcrio Transcrio Traduo reversa

O mRNA fundamental para produo de protenas virais. Por isso, o mRNA considerado a "chave" da multiplicao viral. Um vrus RNA dito de "polaridade positiva" quando seu genoma tem a mesma polaridade ou orientao do mRNA. Em outras palavras, seu genoma pode servir como mRNA e portanto, iniciar a sntese de protenas. Vrus que possuem genoma de RNA "positivo" possuem o genoma infeccioso. Porm, na natureza, nenhum genoma viral de fato infeccioso, pois necessitamos um vrion (partcula viral completa), para dar incio a um ciclo replicativo. Como isto se explica? Em condies de laboratrio, possvel transferirmos o genoma de um determinado vrus para dentro de uma clula. Um vrus cujo genoma constituido por RNA de polaridade positiva capaz de iniciar um ciclo replicativo a partir deste genoma isolado. J os vrus cujo genoma formado por RNA de polaridade negativa necessitam carregar para dentro da clula uma RNA polimerase RNA(viral)-dependente, enzima esta que no encontra presente nas clulas e sem a qual no pode ser gerado o mRNA viral. Assim, somente com a introduo do genoma dentro de uma clula, no pode ter incio um ciclo infeccioso. Portanto, esses vrus que contm genoma de RNA de polaridade negativa necessitam levar junto consigo essa enzima, a qual deve estar presente nos vrions, por ocasio da infeco. ESTGIOS DO CICLO DE MULTIPLICAO VIRAL (esquema geral) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
ADSORO E PENETRAO PELO VRION DESNUDAMENTO DO ACIDO NUCLICO VIRAL SNTESE PRIMRIA DE mRNA SNTESE PRIMRIA DE PROTENAS VIRAIS MULTIPLICAO DO GENOMA VIRAL SNTESE TARDIA DE mRNA SNTESE TARDIA DE PROTENAS VIRAIS MONTAGEM DE VRIONS NOVOS LIBERAO DE VRIONS DA CLULA

Fases: Primria ou "early" = perodo antes da replicao do cido nuclico, ocorre a produo de protenas no estruturais. Tardia ou "late" => ocorre a produo de protenas estruturais.

16

Replicao e gentica viral

Extrado de: http://www.ivis.org/advances/Carter/Part1Chap3_pt/chapter.asp?LA=7 In: A Concise Review of Veterinary Virology, Carter G.R., Wise D.J. and Flores E.F. (Eds.). International Veterinary Information Service, Ithaca NY (www.ivis.org), Last updated: 8-Feb-2005; A3403.0205.PT D.J. Wise1 and G.R. Carter2
Department of Biology, Concord University, Athens, West Virginia, USA. Virginia-Maryland Regional College of Veterinary Medicine, Virginia Tech, Blacksburg, Virginia, USA. Traduzido por: E. F. Flores y M. C. Speroto Brum, Department of Veterinary Preventive Medicine, Federal University of Santa Maria, Santa Maria, RS Brazil. (17-Aug-2005).
2 1

ndice Replicao viral o Replicao de vrus DNA o Replicao de vrus RNA Gentica viral o Mutao o "Shift e drift" antignicos Interaes entre dois vrus o Complementao o Recombinao o Reativao gentica o Mistura de fentipos Aplicaes de vrus: terapia gentica e vacinas recombinantes o Terapia gentica o Vacinas recombinantes Glossrio

Replicao viral A replicao dos vrus um processo muito complexo e diverso. Os mecanismos de replicao dependem fundamentalmente do tipo de cido nuclico e da organizao do genoma de cada vrus. Apesar da diversidade de estratgias de replicao, existem vrios aspectos em comum nas diversas etapas de replicao. O ciclo replicativo de todos os vrus contm as seguintes etapas: ligao/adsoro, penetrao, desnudamento (se necessrio), sntese protica (expresso gnica), replicao do genoma, montagem e egresso ou liberao. A adsoro (ou ligao) depende da interao fsica entre os vrions e a superfcie da clula-alvo. A adsoro essencialmente uma interao ligante-receptor. Como conseqncia, a especificidade de clulas-alvo e de hospedeiros susceptveis determinada. Sem adsoro/ligao a infeco no pode ocorrer. Por outro lado, nem todos os eventos de adsoro resultam em infeco produtiva. Em outras palavras, a adsoro necessria, mas no assegura que a replicao ir ocorrer. Penetrao refere-se introduo do cido nuclico viral na clula, internalizao do nucleocapsdeo via endocitose mediada por receptor, ou fuso do envelope viral com a membrana plasmtica. Como resultado, o genoma viral liberado e se localiza no citosol ou em vesculas endocticas. O desnudamento do genoma das protenas componentes do nucleocapsdeo pode necessitar a participao de protenas celulares ou outros fatores. O desnudamento um pr-requisito para a expresso do genoma. Aps o desnudamento, o genoma prossegue no ciclo replicativo ou uma cpia dele integrada no cromossoma do hospedeiro e permanece latente at ser ativado (retrovrus). Sntese protica (ou expresso gnica) O RNA mensageiro (RNAm) produzido e traduzido em protenas. Independentemente do tipo (DNA ou RNA; cadeia simples ou dupla; segmentado ou nosegmentado), o genoma deve ser capaz de originar RNAs mensageiros que sejam reconhecidos e traduzidos pela maquinaria celular de traduo.

17

Como ser descrito para cada grupo de vrus, existe um mecanismo nico pelo qual a maquinaria celular torna-se amplamente dedicada sntese de produtos virais em detrimento da sntese de protenas celulares. Replicao do genoma: o mecanismo de replicao depende do tipo de cido nuclico, estrutura e topologia do genoma. Nos vrus mais simples, a replicao do genoma uma tarefa executada por enzimas celulares; outros vrus mais complexos codificam as suas prprias enzimas replicativas. Maturao a montagem completa das partculas vricas. A montagem dos vrus no-envelopados consiste primariamente da associao do genoma com as protenas que formam o nucleocapsdeo. Esse processo ocorre espontaneamente atravs de interaes entre protenas e entre estas e o genoma. Na maturao dos vrus envelopados, o nucleocapsdeo adquire um envoltrio externo (envelope) que consiste de membranas celulares (nuclear, Golgi, retculo endoplasmtico ou membrana plasmtica) contendo uma camada dupla de lipdios derivadas da clula e protenas virais inseridas. O envelope adquirido por um processo denominado de "brotamento". Egresso (liberao) dos vrions. Na replicao dos vrus sem envelope, milhares de vrions recmformados so liberados pela morte e lise celular. Nos vrus envelopados, a prognie viral liberada atravs de brotamento, sem necessariamente implicar em morte celular. No entanto, muitos vrus envelopados tambm podem ser liberados pela morte e desintegrao da clula. Replicao dos vrus DNA Em geral, os vrus DNA replicam no ncleo. Excees so os poxvrus e os iridovrus (vrus de insetos e peixes) que utilizam "fbricas" citoplasmticas. Os vrus DNA que replicam no ncleo utilizam a RNA polimerase-dependente de DNA celular para a transcrio. A maioria dos poxvrus e iridovrus trazem transcriptases nos vrions, o que lhes permite replicar no citoplasma. A replicao dos vrus DNA semiconservativa e simtrica, com ambas as cadeias sendo replicadas. Em vrus DNA de cadeia dupla, como os adenovrus, a replicao das duas cadeias no segue necessariamente o mesmo mecanismo. As enzimas DNA polimerases da clula eucariota podem replicar genomas pequenos ou mdios (papilomavrus, poliomavrus), enquanto os genomas grandes geralmente codificam as suas prprias polimerases (adenovrus, herpesvrus, poxvrus). A maturao dos vrus DNA (exceo dos poxvrus e iridovrus) ocorre no ncleo. As protenas estruturais so transportadas do citoplasma para o ncleo, onde interagem entre si e com o genoma e so integradas na estrutura do capsdeo que envolve o cido nuclico. Os vrus envelopados completam a maturao atravs do brotamento na membrana nuclear (iridovrus) ou da membrana plasmtica.

Replicao dos vrus DNA de cadeia dupla Esses incluem as seguintes famlias de vrus animais: Asfaviridae, Poxviridae, Iridoviridae, Herpesviridae, Polyomaviridae, Papillomaviridae e Adenoviridae (Fig. 3.1). Os genomas variam entre 5 - 8 kb (Polyomaviridae) e mais de 300 kb (Poxviridae e Iridoviridae). Em geral, a replicao do genoma ocorre no ncleo, por enzimas do hospedeiro (para pequenos vrus como os poliomavrus e papilomavrus) ou por replicases codificadas pelo vrus (adenovrus, herpesvrus). A replicao dos poxvrus e alguns iridovrus ocorre no citoplasma, resultando na formao de corpsculos de incluso que contm as enzimas virais necessrias para a replicao, como as polimerases de DNA dependentes de DNA. O DNA de cadeia dupla pode apresentar-se circular, linear, ou linear com as extremidades ligadas. Os genomas circulares pequenos so replicados em direo bidirecional, semelhante ao que ocorre com os plasmdios. Acredita-se que a replicao do DNA dos poliomavrus (cadeia dupla circular) seja mediada por um mecanismo giratrio que contm a endonuclease e ligase. A endonuclease clivaria uma das cadeias, permitindo a replicao de um pequeno segmento. Esse "corte" seria ento reparado (ligado) pela ligase.

18

Figura 3-1. Esquema geral de replicao dos vrus DNA de cadeia dupla. Replicao dos vrus DNA de cadeia simples Inclui as famlias Circoviridae e Parvoviridae de vrus animais Os genomas variam de 3 a 6 kb. O DNA circular dos circovrus parece ser replicado por um mecanismo de "rolling circle". A replicao ocorre no ncleo e envolve a sntese de uma cadeia de DNA sentido negativo (DNA - ) para servir de molde para a sntese da cpia genmica (DNA +) dos vrions. Esse processo envolve a produo transiente de um DNA de cadeia dupla, denominado de forma replicativa. A penetrao do DNA de cadeia simples no ncleo estimula o seu "reparo" por enzimas celulares, originando a forma replicativa (cadeia dupla). No caso dos genomas circulares, a forma replicativa associa-se com histonas celulares e outras protenas nucleares e passa a ser comportar como um cromossoma do hospedeiro. Formas lineares possuem mecanismos derivados que permitem o genoma ser replicado sem perda de DNA a cada ciclo de replicao. Os genomas DNA de cadeia simples podem ser lineares de um nico componente (Parvoviridae) ou circulares de um nico componente (Circoviridae). (Fig. 3.2).

19

Figura 3-2. Esquema geral de replicao dos vrus DNA de cadeia simples. Vrus DNA de cadeia dupla com transcrio reversa Inclui a famlia Hepadnaviridae O genoma constitudo de uma molcula circular (no-covalente) de DNA parcialmente cadeia dupla, com 3.2kb. Aps a penetrao e desnudamento parcial, o DNA genmico penetra no ncleo e a cadeia incompleta completada pela DNA polimerase viral e/ou enzimas celulares. Uma vez completada, uma enzima ligase realiza a ligao das extremidades. No ncleo, o genoma comporta-se como um minicromossoma, conjugando-se com histonas celulares. No entanto, as DNA polimerases celulares no replicam o genoma viral. O genoma ento transcrito em sua integridade, originando um RNAm com a extenso total do genoma, denominado de pgRNA (RNA pr-genmico), que maior do que o molde DNA do qual foi transcrito, devido adio de uma cauda poli-A produzida. Esse intermedirio RNA que serve de molde para o DNA do vrion. RNAs mensageiros menores so tambm produzidos, dando origem polimerase viral e protenas do capsdeo. A montagem parcial dos capsdeos prossegue. Algumas cpias do pgRNA so encapsidadas nos vrions recm-formados, onde servem de molde para a polimerase viral sintetizar o cDNA (transcrio reversa). Aps a sntese da primeira cadeia de

20

DNA complementar (cDNA), a polimerase degrada o pgRNA que serviu de molde e sintetiza a cadeia complementar de DNA. Os vrions que so liberados das clulas por brotamento contm um genoma DNA de cadeia dupla. Replicao dos vrus RNA A replicao da maioria dos vrus RNA ocorre estritamente no citoplasma das clulas e independente da maquinaria nuclear. Excees so os ortomixovrus que requerem fatores da transcrio celular e os retrovrus que replicam via um intermedirio DNA. A ligao (adsoro) ocorre por interaes eletrostticas entre os vrions e os receptores celulares especficos. Os vrus penetram na clula atravs de endocitose mediada por receptor ou atravs de fuso na membrana celular ou na vescula endoctica (vrus envelopados). O desnudamento ocorre no citoplasma, ou durante a passagem (translocao) atravs da membrana celular, como parece ser o caso dos picornavrus. O RNA dos reovrus, no entanto, nunca completamente desnudo, permanecendo em partculas parcialmente desmontadas durante a transcrio e replicao. O genoma de alguns vrus RNA constitudo de uma nica molcula de RNA (no-segmentados); em outros constituim-se de mais de um segmento (segmentado). O RNA de alguns vrus animais possui funo de RNA mensageiro (sentido +) e pode ser diretamente traduzido, enquanto o genoma de outros sentido negativo (anti-sense) e deve ser inicialmente transcrito em RNAs de sentido + por polimerases de RNA dependentes de RNA virais (transcriptases). Os retrovrus possuem uma enzima transcriptase reversa (polimerase de DNA dependente de RNA), o que permite a formao de uma molcula de DNA cadeia dupla intermediria (provrus DNA), que incorporada no genoma da clula hospedeira e subsequentemente transcrita em RNAs mensageiros por polimerases de RNA dependentes de DNA do hospedeiro. Em geral, a replicao do RNA semi-conservativa e segue-se pela formao de um intermedirio replicativo (R1). O R1 consiste do RNA parental que serve de molde para a transcrio de vrias cadeias de RNA, que eventualmente se destacam do molde e servem de molde para a sntese de RNA viral. A replicao do RNA de cadeia dupla dos reovrus conservativa e assimtrica; apenas uma cadeia replicada, ao contrrio do DNA de cadeia dupla. O processo de replicao exige polimerases de RNA dependentes de RNA (replicases) que so codificadas pelo vrus. A maturao ocorre no citoplasma da clula, com o RNA viral se associando com as protenas do capsdeo e formando o nucleocapsdeo. Os vrus envelopados completam a maturao pelo brotamento na membrana do retculo endoplasmtico, aparelho de Golgi ou membrana plasmtica. Vrus RNA de cadeia dupla Inclui as seguintes famlias de vrus: Reoviridae e Birnaviridae. Os genomas desses vrus varia entre 4 a 20 - 27 kb em extenso. A adsoro ocorre via endocitose mediada por receptor. O vrion parcialmente desnudo e o ncleo da partcula permanece na vescula endoctica. A replicao atravs de mecanismo conservativo; o RNA de cadeia dupla serve de molde para a produo de RNA mensageiro por uma enzima polimerase de RNA dependente de RNA. Grande parte do restante da replicao ainda pouco conhecida. A replicao no envolve a formao de intermedirios R1. No ocorre a formao de RNA de cadeia dupla no citoplasma da clula infectada hospedeira. Todos possuem genomas lineares, segmentados. Cada segmento corresponde a um RNA mensageiro monocistrnico. Todos os genomas so lineares, mas podem ter dois segmentos (Birnaviridae) ou vrios segmentos (os reovrus possuem 10 a 12). (Fig. 3.3).

21

Figura 3-3. Esquema geral de replicao dos vrus RNA de cadeia dupla. Vrus RNA de cadeia simples, polaridade positiva Incluem as seguintes famlias de vrus animais: Caliciviridae, Picornaviridae, Astroviridae, Nodaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Togaviridae e Arteriviridae. O tamanho do genoma varia entre menos de 5 at mais de 20 - 30 kb A penetrao via endocitose mediada por receptor. Ento, o vrion desnudo e o RNA cadeia simples liberado no citoplasma. Os genomas possuem sentido de mensageiro e so totalmente ou parcialmente traduzidos em protenas na primeira etapa da replicao viral. Os picornavrus e flavivrus possuem um genoma RNA de polaridade positiva como genoma, que se comporta como um mensageiro policistrnico. O genoma diretamente traduzido em uma poliprotena extensa, que processada co- e ps-traduo em vrias protenas virais por proteases do hospedeiro e virais. Os coronavrus apresentam um padro complexo de transcrio, envolvendo vrias etapas de traduo para completar o ciclo replicativo. Possveis formas de genomas lineares so: nico-segmento com vrias ORFs (togavrus e calicivrus); nico segmento com uma nica ORF (picornavrus); dois segmentos com nica ORF (nodavrus). (Fig. 3.4).

22

Figura 3-4. Esquema de replicao dos vrus RNA de cadeia positiva. Vrus RNA de cadeia simples, sentido negativo Inclui as seguintes famlias de vrus animais: Orthomyxoviridae, Rhabdoviridae, Paramyxoviridae, Bornaviridae, Filoviridae, Deltavrus, Arenaviridae, Bunyaviridae. Os genomas variam entre 10 a 14 kb e 11 a 20 kb de extenso. Como os genomas so de sentido negativo, no so traduzidos diretamente. Por isso, esses vrus devem trazer a suas polimerases/replicases nos vrions para realizar a transcrio/replicao do genoma. Os ortomixovrus possuem genomas segmentados. O primeiro passo na replicao a transcrio dos RNA de sentido negativo pela polimerase de RNA dependente de RNA viral. Os rabdovrus possuem genomas no-segmentados. A replicao tambm requer a transcrio pela polimerase de RNA dependente de RNA viral. No caso dos vrus ambissense, a transcriptase codificada pela regio de; polaridade positiva que eventualmente mediar a transcrio das regies de polaridade negativa.

23

Possveis arranjamentos genmicos incluem: segmento nico com ORFs mltiplas (filovrus, paramixovrus, rabdovrus), dois segmentos ambissense (arenavrus), trs segmentos polaridade negativa ou ambissense (buniavrus) e seis a oito segmentos (ortmomixovrus).

Figura 3-5. Esquema de replicao dos vrus RNA de cadeia negativa. Vrus RNA de cadeia simples, polaridade positiva, com transcrio reversa Inclui os vrus de vertebrados da famlia Retroviridae Este genoma viral formado por cpias diplides de uma molcula de RNA de cadeia simples mantidas juntas por protenas. Possui cap na extremidade 5 e possui poli-A na extremidade 3 possui quatro regies codificantes caractersticas (gag-pro-pol-env). Essas regies so: gag (antgenos grupo-especfico: genes da protenas da matriz, nucleoprotena, capsdeo); pro (gene da protease); pol (genes da transcriptase reversa e RNAse H); env (genes do envelope, que ligam nos receptores). A converso do RNA em DNA de cadeia simples mediada pela enzima viral transcriptase reversa. O DNA cadeia dupla resultante chamado de provrus, finalmente integrado aos cromossomas do hospedeiro pela enzima viral integrase.

24

Uma vez integrado no genoma do hospedeiro, o DNA viral (ou provrus) permanece latente at ser ativado em produo ativa de vrions. O provrus ento transcrito em RNAs mensageiros pela RNAs polimerase II celular.

Gentica viral A seleo natural atuando nos genomas virais durante ao longo dos anos tem resultado em grande diversidade gentica para alguns vrus. Os genomas virais so as chaves para se entender como os vrus interagem com as clulas que eles infectam. O rpido conhecimento crescente da gentica viral tem levado a muitas aplicaes e tcnicas muito teis. Algumas importantes reas de interesse so discutidas a seguir. Mutao Mutao uma alterao na seqncia do genoma de um organismo. O organismo possui a mutao denominado de mutante. A alterao baseia-se na comparao com o vrus de campo (vrus de referncia). Dessa informao, cepas (vrus de campo de um mesmo vrus), tipos (sorolgicos ou biolgicos) e variantes (fenotipicamente diferentes do vrus de campo por razes genticas desconhecidas) podem ser identificados. Mutaes so eventos neutros que podem ser atuados por seleo natural. Se a mutao aumenta a sobrevivncia (transmisso e replicao) do organismo, ela possui uma vantagem seletiva. Se a mutao prejudicial a multiplicao e sobrevivncia, o organismo ser eventualmente eliminado da populao. Se a mutao no altera a sobrevivncia do organismo sobreviver ou o seu fentipo, ento a mutao pode passar despercebida. Mutaes podem ocorrer por dois mecanismos diferentes, mutaes espontneas ou mutaes induzida. Mutaes espontneas so endgenas, sendo resultado de erros das polimerases de DNA e RNA ao incorporar formas tautomricas naturais dos nucleotdeos. Os vrus DNA so tipicamente mais geneticamente estveis do que os vrus RNA; a taxa de mutao de 10-8 a 10-11 por nucleotdeo incorporado. Isso se deve, em parte, que as polimerases de DNA frequentemente possuem alguma habilidade de correo de erros. Os vrus RNA so consideravelmente menos geneticamente estveis, com taxas de mutao espontnea entre 10-3 a 10-4 por nucleotdeo incorporado. As polimerases de RNA tipicamente no possuem capacidade de correo de erros. Apesar disso, alguns vrus RNA so relativamente estveis geneticamente (poliovrus). Acredita-se que esses vrus possuem taxas de mutao to altas como os outros vrus RNA, mas so to precisamente adaptados para a replicao e transmisso que pequenos erros resultam em sua eliminao. Mutaes induzidas so exgenas, o resultado da exposio a agentes mutagnicos (qumicos ou radiao) que aumentam significativamente a taxa de mutao daquele organismo. Os mutagnicos qumicos agem ou diretamente nas bases ou indiretamente provocando mal-pareamento de bases. A radiao ultravioleta pode provoca a formao de dmeros de pirimidina, radiao ionizante pode danificar o DNA diretamente pela quebra de ligaes qumicas ou indiretamente por formar radicais livres que, por sua vez, danificam o DNA. Existe uma variedade de fentipos que so produzidos como resultado de mutaes. Alguns dos mais comuns so: Mutao de espectro de hospedeiro Mutaes que permitem a alteraro de hospedeiros de um determinado vrus do original associado com o vrus de campo. Esse tipo de alterao acredita-se tenha ocorrido com o parvovrus felino, que extendeu seu espectro de hospedeiros e tornou-se capaz de infectar ces. Mutaes letais condicionais Inclui uma srie de mutaes que replicam sob algumas condies, afora estas o vrus de campo capaz de replicao, mas o condicional no. Exemplos de mutantes condicionais letais so os mutantes temperatura-sensveis (TS) e mutantes adaptados ao frio. Mutantes temperatura sensveis tm sido utilizados na produo de vacinas e mutantes adaptados ao frio tm sido usados para anlise dos ciclos replicativos virais. Mutantes de tamanho/morfologia de placa Como resultado de mutaes, esses vrus podem produzir placas que diferem daquelas do vrus de campo. Essa informao algumas vezes se correlaciona com a infectividade de uma determinada cepa de vrus.

25

Mutaes nonsense (mbar) Refere-se a mutaes em ponto que resultam na formao de um cdon stop de traduo na posio em que um aminocido incorporado na protena do vrus de campo. Como resultado, a protena truncada e geralmente afuncional. A mutao mais comum para o cdon UAG, chamado de mbar. Mutaes de deleo So resultado da perda de nucleotdeos em algum local do genoma, variando de apenas uma simples base at sees inteiras do genoma. Essas podem ocorrer naturalmente ou ser produzidas em laboratrio, e so usadas no desenvolvimento de vatores virais ou para atenuar um vrus para vacinas. Shift e drift antignicos Shift antignico (sem termo equivalente em portugus) refere-se troca de um antgeno associado com um patgeno viral devido a aquisio de um gene novo inteiro ou alterao de um gene pr-existente. Tipicamente, shift antignico observado naqueles vrus que possuem genomas segmentados, como os ortomixovrus, buniavrus e arenavrus. A coinfeco de uma clula com dois isolados numa mesma clula pode resultar no empacotamento de genomas misturados, contendo alguns segmentos de um vrus e outros do outro vrus. Drift antignico refere-se o resultado da acumulao de mutaes em ponto (substituies simples de bases) e tem sido identificada como o mecanismo associado com a variao antignica observada nos vrus da influenza e pode ser o mecanismo responsvel pela variabilidade observada nos rinovrus. Interaes entre dois vrus Infeces com dois ou mais vrus diferentes sabidamente podem ocorrer na natureza como tambm em cultivo. Essas so chamadas infeces mistas podem resultar em novas combinaoes virais e originar novas variantes dos vrus. A seguir so descritas algumas das interaes que podem ocorrer em infeces mistas: Complementao A complementao pode ocorrer durante uma infeco mista em que um dos vrus deficiente em um dos seus produtos gnicos. Sem essa protena, o vrus seria incapaz de ser transmitido e replicar e seria, portanto uma partcula defectiva. Numa infeco mista, se o segundo vrus envolvido sintetiza o produto (complementa o defeito), a partcula defectiva capaz de completar o processo de transmisso e replicao. Na natureza, complementao ocorre com o viruside humano da hepatite D. O viruside defectivo em um antgeno de superfcie que provido pelo vrus da hepatite B em infeces mistas. Recombinao Recombinao gentica a troca de um segmento de material gentico entre dois cromossomas virais em locais onde existe grande homologia. Como resultado, a prognie diferente dos dois vrus parentais. A recombinao freqente em vrus DNA e nos vrus RNA que possuem uma fase de DNA (retrovrus). Atualmente, trs mecanismos de recombinao j foram identificados: Recombinao intramolecular Recombinao que mediada por enzimas celulares entre duas regies de uma nica molcula de DNA de cadeia simples, resultando numa ala da regio intermediria, liberando uma molcula de DNA cadeia dupla menor e uma molcula separada de DNA de cadeia dupla. O reverso dessa reao tambm pode ocorrer, resultando na integrao de uma molcula de DNA cadeia dupla em uma outra molcula de DNA cadeia dupla. Esse tipo de recombinao ocorre tipicamente em vrus DNA no-segmentados. Recombinao por escolha-de-cpia Recombinao gentica em que a nova molcula de cido nuclico surge pela replicao de determinadas partes de cada molcula parental e pela alternncia entre as duas (maternal e parental). Esse mecanismo pouco conhecido e ocorre em vrus RNA no-segmentados. Ressortimento Ocorre em infeces mistas com variantes virais que possuam genomas segmentados infectando a mesma clula. A prognie viral pode conter alguns segmentos de um parente e outros do outro parente. Esse

26

um processo efetivo que ocorre em ortomixovrus, reovrus, arenavrus e buniavrus. Esse mecanismo no bem entendido. O ressortimento tem sido implicado no aparecimento de cepas novas altamente virulentas do vrus da influenza durante o sculo 20. Reativao gentica um caso especial de recombinao/ressortimento que ocorre em infeces mistas quando um ou os dois vrus so no-infecciosos. A prognie resultante de recombinao ou ressortimento pode ser agora infecciosa e contm marcadores dos dois parentais. Se apenas um dos parentais era defectivo, o processo chamado de reativao cruzada ou resgate de marcador. Se os dois vrus eram defectivos, o processo chamado de reativao mltipla. Mistura fenotpica Mistura fenotpica um exemplo de interao no gentica entre dois vrus. Como resultado de uma infeco mista, a prognie individual possui protenas estruturais (envelope, capsdeo) de um ou de ambos os parentais. O genoma de um dos vrus parentais pode ser encapsidado em um dos trs tipos de capsdeo (envelopes), originando seis tipos de prognie. Portanto, o fentipo e o gentipo de muitos desses vrions prognie no se correspondem. Aplicaes da gentica viral: terapia gentica e vacinas recombinantes Possivelmente as duas mais intrigantes aplicaes do conhecimento adquirido sobre replicao e gentica viral so a terapia gentica e o desenvolvimento de vacinas recombinantes. Essas tcnicas so altamente promissoras para o desenvolvimento de novas estratgias para doenas genticas e conferir proteo contra doenas humanas e animais. Terapia gentica A terapia gentica baseada no uso de vrus sem propriedades patognica, mas retendo a sua habilidade de seletivamente interagir com e transmitir seus genes (mais outros genes geneticamente manipulados) a clulas e tecidos especficos do hospedeiro. Os retrovrus so excelentes meios para a entrega de genes para clulas-alvo do hospedeiro. A forma DNA dupla cadeia de seu genoma estvel e integra-se facilmente ao genoma do hospedeiro. Os vrus so manipulados geneticamente de modo que, uma vez o provrus seja integrado ao genoma, ele no seja capaz de replicar. Freqentemente isso significa o uso de vrus auxiliares para facilitar a entrada inicial do vrus manipulado nas clulas, atravs de complementao. Uma limitao desse mtodo de terapia gentica a que em alguns casos o gene em questo necessita estar presente em todas as clulas do hospedeiro e no somente em um grupo seleto de clulas e tecidos. Os retrovrus tm sido utilizados em terapia gentica para a incorporao do gene da deaminase de adenina (ADA) nas clulas do sistema imune de pacientes com a sndrome de imuodeficincia ADA. Alm dos retrovrus, alguns outros vrus atualmente sendo pesquisados para uso potencial como vetores em terapia gentica so os adenovrus, vrus adeno-associados (parvovrus) e herpesvrus. Vacinas recombinantes Os trs tipos de vacinas preparadas com tcnicas de manipulao gentica so discutidos no captulo 6. Algumas dessas vacinas j esto em uso para prevenir doenas vricas humanas e animais. Glossrio Ambissense: Refere-se a um genomas RNA que contm seqncias informativas que so ambos sentido positivo (pode ser usado diretamente como mensageiro) e sentido negativo (deve ser transcrito para produzir RNA mensageiro). Replicao conservativa: Replicao de DNA e RNA de cadeias duplas de maneira que as cadeias originais no se tornam parte de cadeia recm-formada. Vescula endoctica: Vescula formada no processo de endocitose, o engolfamento do vrus, que pode ser mediada por receptores de superfcie ou por interaes da membrana celular. Membrana do Golgi: Membranas associadas com o aparelho de Golgi nas clulas eucariotas. O aparelho de Golgi recebe lipdios e protenas recm-sintetizados do retculo endoplasmtico, e modifica - os quimicamente e os envia aos locais apropriados da clula.

27

Corpsculos de incluso: Esses representam "fbricas" de vrus nas quais os cidos nuclicos ou protenas virais esto sendo sintetizados. Ligase: Enzima do hospedeiro que produz ligaes covalentes nos cidos nuclicos associadas com quebras na cadeia backbone de acar-fosfato. Monocistrnico: Contm informao para um s gene ou produto gnico. No-segmentados: Genoma contendo apenas um segmento. Genomas multi-componentes: Genomas que possuem mais de uma molcula de cido nuclico como genoma. Mutgenos: Agentes fsicos ou qumicos que aumentam a taxa de mutaes no DNA de um organismo. DNA de polaridade negativa: DNA cuja transcrio no origina molculas de RNAs que podem ser diretamente traduzidos como RNAs mensageiros. o molde para a criao de genomas RNA de sentido negativo. Policistrnico: Que contm informao para vrios genes ou produtos gnicos. DNA de polaridade (sentido) positiva: DNA cuja transcrio origina os genomas RNA de polaridade positiva ou que podem ser usados diretamente como mensageiros. Transcriptase reversa: Enzima viral que usa RNA como molde para produzir DNA. Replicao semi-conservativa: Replicao de RNA ou DNA de cadeia dupla na qual as cadeias originais (uma original, outra recm-sintetizada) tomam parte das recm-produzidas prognie DNA ou RNA de cadeia dupla. No-segmentados: Genomas que possuem uma nica molcula de cido nuclico como genoma. Tautmeros: Formas isomricas de compostos orgnicos e quando dois deles existem em equilbrio referido como tautomerismo. Transcriptase: Enzima viral capaz de usar uma molcula de RNA como molde para transcrio. Vrus de campo: O vrus natural, esses vrus so usados como cepas de referncia para comparao com mutantes e variantes de um vrus particular. Direitos reservados: este documento est disponvel em www.ivis.org. Documento nm. A3403.0205.PT

28

Defesas do hospedeiro contra vrus

In: A Concise Review of Veterinary Virology, Carter G.R., Wise D.J. and Flores E.F. (Eds.). International Veterinary Information Service, Ithaca NY (www.ivis.org), Last updated: 3-Mar-2005; A3405.0305.PT D.J. Wise1, G.R. Carter2 and E. F. Flores3
1Virginia-Maryland Regional College of Veterinary Medicine, Virginia Tech, Blacksburg, Virginia, USA. 2Department of Biology, Concord University, Athens, West Virginia, USA. 3Department of Veterinary Preventive Medicine, Federal University of Santa Maria, Santa Maria, RS Brazil.

Traduzido por: E. F. Flores, Department of Veterinary Preventive Medicine, Federal University of Santa Maria, Santa Maria, RS Brazil. (20-Oct-2005). ndice Defesas do hospedeiro Efeitos imunolgicos das infeces virais Glossrio Assim como os vrus, que pela sua capacidade de infectar clulas e iniciar a replicao mediada pelo hospedeiro so capazes de causar doenas, o hospedeiro e as suas clulas possuem alguns mecanismos para prevenir, minimizar ou conter infeces virais. Este captulo discute essas defesas, desde as respostas inatas e barreiras protetoras at a resposta imunolgica especfica. O resultado da interao entre o hospedeiro e o vrus pode se refletir na caracterstica da doena. A tabela 5.1 lista os mecanismos do sistema imunolgico do hospedeiro e os aspectos do ciclo replicativo viral aos quais estes so dirigidos.

29

Defesas do hospedeiro
Barreiras fsicas e qumicas As barreiras fsicas e qumicas fazem parte da resposta inata ou natural, sendo inerentes a cada hospedeiro ao nascer. Essas barreiras previnem ou limitam a infeco. Qualquer comprometimento na integridade de uma dessas barreiras permite ao vrus ter acesso s clulas do hospedeiro. Por outro lado, devido ao seu ciclo replicativo, alguns vrus so capazes de ultrapassar essas barreiras facilmente. Pele: A pele uma barreira eficiente contra muitas infeces, inclusive contra aquelas vricas. Isto porque a pele composta, em parte por clulas mortas, queratinizadas, que no suportam replicao viral. Para ultrapassar essa barreira, os vrus necessitam penetrar mais profundamente no epitlio atravs de cortes, queimaduras ou picadas de insetos. Membranas mucosas: Essas agem como barreiras fsicas, prevenindo o acesso direto s clulas do hospedeiro. Alternativamente, o muco interfere com a ligao dos vrus s clulas fornecendo receptores virais no muco. Por exemplo, os paramixovrus ligam-se em receptores cido-silico associados com as clulas do hospedeiro. A presena de glicoprotenas com resduos de cido silico no muco interfere com essa ligao. Epitlio ciliado: A ao combinada dos clios com o muco nos epitlios facilita o movimento fsico dos vrus apreendidos para fora do corpo, reduzindo a sua infectividade. Os seguintes fatores so associados com a penetrao nessa barreira: volume do inculo, tamanho da gotcula, corrente de ar, umidade e temperatura. pH cido: O pH cido do trato gastrointestinal (pH 2) rapidamente desnatura as protenas associadas com muitos vrus. No entanto, os enterovrus conseguem suportar esse pH ou usam a exposio a ele para facilitar o desnudamento e assim serem infecciosos no trato digestivo. Lgrimas: Estas proporcionam lavagem contnua para minimizar a quantidade de partculas vricas disponveis para infectar as clulas da conjuntiva. Ausncia de receptores: Isso envolve o espectro de hospedeiros ou receptores especficos de tecidos. Se o receptor necessrio para a ligao do vrus no est presente, ento a infeco no pode ocorrer. Respostas inespecficas As respostas inespecficas ocorrem em qualquer infeco viral. Essas respostas servem principalmente para limitar a disseminao do vrus a partir do stio de infeco, impedir a replicao viral e auxiliar a resposta imunolgica especfica num ataque direcionado contra o vrus. Febre: Inibe a replicao viral estimulando outros mecanismos imunolgicos e reduzindo assim a replicao viral. Alm disso, a temperatura alta tambm pode inativar diretamente as partculas vricas. A importncia da febre isoladamente durante a infeco viral no conhecida. Inflamao: Refere-se a resposta inespecfica local, caracterizada por hiperemia, edema, calor e dor. Neutrfilos e macrfagos so recrutados para a rea afetada pelas citoquinas. Esse recrutamento auxilia na limitao da infeco. A produo contnua de citoquinas e o recrutamento de clulas continuam at que o antgeno efetivamente neutralizado. O reparo tecidual ento comea a ocorrer. Em algumas situaes, a resposta inflamatria se torna crnica, levando imunopatologia induzida pelo vrus. Interferons (IFN): um grupo de glicoprotenas hospedeiro-especficas, que inibem a replicao viral atravs da degradao de RNAs mensageiros virais e inibio da traduo de protenas virais. Adicionalmente, os IFNs conferem resistncia anti-viral s clulas vizinhas. Existem trs tipos principais de IFNs produzidos pelo organismo: alfa, beta e gamma. Os IFNs alfa e beta so chamados interferons tipo I e esto envolvidos na resposta inata ou inespecfica. O IFN gamma est envolvido na resposta imunolgica especfica e ser abordado posteriormente. IFNs alfa e beta atuam especificamente inibindo a traduo de protenas virais, tendo pouco efeito na traduo de protenas celulares. Esse fenmeno denominado inibio seletiva. RNAs mensageiros virais so reconhecidos por seqncias nucleotdicas especficas do vrus que no so encontradas nas clulas hospedeiras. Alm disso, o IFN estimula a expresso de molculas do complexo maior de histocompatibilidade classe (MHC-I) e II (MHC-II) na superfcie das clulas do hospedeiro. Isso facilita o reconhecimento das clulas infectadas e o desencadeamento de uma resposta imunolgica especfica as clulas infectadas pelo vrus.

30

IFN alfa: Estvel a pH 2; a sua produo induzida por produtos da replicao viral (vrus RNA estimulam mais do que vrus DNA) e RNA de cadeia dupla. So tambm conhecidos como interferons de leuccitos. IFN beta: Estvel a pH 2; produo induzida por produtos da replicao viral (vrus RNA estimulam mais do que vrus DNA) e RNA de cadeia dupla. So tambm conhecidos como IFNs de fibroblastos. Clulas NK (natural killer): So clulas brancas do sangue, da linhagem linfopoitica. So tambm chamadas de terceira populao de linfcitos (T, B e NK), clulas nulas ou linfcitos grandes granulares. Alguns vrus, como partede seu ciclo replicativo, reduzem a expresso de molculas de MHC-I pela clula infectada. As clulas NK reconhecem as clulas que no expressam ou expressam menos MHC-I e as destroem por apoptose. Portanto, elas identificam e matam clulas infectadas por vrus. As clulas NK destroem clulas infectadas atravs de mecanimos semelhantes aos utilizados pelos linfcitos T citotxicos, descritos a seguir. So tambm importantes no reconhecimento e destruio de clulas tumorais. Fagocitose: Ao dos macrfagos e neutrfilos ao internalizar e destruir partculas virais. Os macrfagos se tornam ativados (mais eficientes para capturar e destruir) em resposta ao IFN gamma e outras citoquinas. Cascata do complemento: A maioria dos vrus no capaz de ativar o complemento pela via alternativa. No entanto, como a via clssica utiliza a interao anticorpo-antgeno para desencadear a cascata, esse mecanismo pode facilmente lisar partculas vricas e clulas infectadas.

Resposta imunolgica especfica A resposta imunolgica especfica moldada e dirigida especificamente contra o respectivo patgeno. Leva vrios dias a vrias semanas para se desenvolver. Portanto, o organismo depende das respostas inespecficas para limitar a infeco at que os mecanismos especficos tenham sido produzidos. A resposta imunolgica especfica pode ser humoral (produo de anticorpos) ou mediada por clulas. Em algumas situaes, a infeco viral resulta em imunopatologia caracterstica ou induz imunossupresso. Resposta imunolgica humoral A resposta imune humoral envolve a produo de anticorpos especficos contra antgenos especficos virais pelos plasmcitos, que so derivados dos linfcitos B. A estimulao da produo de anticorpos o mecanismo primrio envolvido na recuperao de infeces virais, em particular das infeces vricas citolticas acompanhadas de viremia e infeces virais de clulas epiteliais superfciais. Os anticorpos produzidos podem ou no possuir atividade neutralizante anti-viral, com base na sua interao com as partculas vricas e nos seus efeitos no ciclo replicativo. Na maioria dos casos, a produo de anticorpos resultante da infeco viral. Isto imunidade ativa. Alternativamente, um hospedeiro pode receber anticorpos pr-formados de um indivduo recuperado. Isto um exemplo de imunidade passiva. Anticorpos pr-formados so administrados a indivduos que possam ter sido expostos a um determinado vrus, como o vrus da raiva. Vacinas so discutidas no captulo 6. Anticorpos neutralizantes: So anticorpos que interferem com a capacidade dos vrus penetrar e replicar nas clulas. Eles podem interferir com a ligao do vrus no receptor, penetrao e/ou desnudamento. Alm disso, so capazes de danificar o envelope do vrus com o auxlio do complemento (via clssica). Anticorpos neutralizantes so mais efetivos no momento da infeco ou durante a viremia. Anticorpos no-neutralizantes: No possuem atividade neutralizante direta, mas auxiliam a controlar/combater a infeco por outros mecanismos, como aumentando a degradao dos vrions por exemplo. Adicionalmente, podem servir de opsoninas para aumentar a eficincia de fagocitose de partculas vricas. Anticorpos antivirais que se ligam protenas virais na superfcie de clulas infectadas podem tambm desencadear a cascata do complemento e levar lise celular mediada por complemento. Resposta imunolgica mediada por clulas A imunidade mediada por clulas (IMC) envolve a ao dos linfcitos T citotxicos, citotoxicidade celular mediada por anticorpos (ADCC), ao das clulas NK e macrfagos ativados. A IMC representa o mecanismo de defesa mais importante em infeces no-citolticas nas quais as membranas das clulas infectadas so alteradas pelo vrus.

31

Linfcitos T citotxicos: So linfcitos T especficos que reconhecem antgenos virais associados com molculas do MHC-I na superfcie da maioria das clulas infectadas. Esses linfcitos T possuem um antgeno de superfcie chamado de CD8. A interao das clulas infectadas como os linfcitos T citotxicos resulta na liberao de perforinas pelo linfcito T, que produzem poros na membrana da clula infectada. Tambm liberadas pelos linfcitos T citotxicos so as granzimas, um grupo de protease de serina. A ao conjunta das granzimas e perforinas resulta na destruio das clulas infectadas. Alm disso, os linfcitos citotxicos ativam a protena FAS, que induz apoptose nas clulas infectadas com vrus. Citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC): Refere-se uma resposta imune na qual clulas infectadas por vrus so recobertas por anticorpos e tornam-se alvos para ataque das clulas do sistema imune como clulas NK, macrfagos e neutrfilos. Linfcitos T auxiliares: Esses linfcitos T possuem o antgeno de superfcie CD4. So capazes de reconhecer antgenos proticos associados a molculas do MHC-II, que so encontrados apenas em alguns tipos de clulas, como macrfagos, linfcitos B e clulas dendrticas. Os linfcitos T auxiliares coordenam a resposta imune especfica aos antgenos atravs da secreo de citoquinas que estimulam a produo de anticorpos pelos linfcitosB ou estimulam produo de resposta imune mediada por clulas. Efeitos imunolgicos da infeco viral So dos resultados das interaes entre o sistema imunolgico do hospedeiro e a replicao viral.

Imunopatologia induzida por vrus Imunopatologia induzida por vrus o dano tecidual resultante da resposta imunolgica contra o vrus. Essa imunopatologia pode resultar de vrias interaes imunolgicas, como complexos antgenoanticorpo e leses teciduais devidos aos linfcitos T citotxicos, anticorpos ou complemento. O tipo e localizao da imunopatologia depende da infeco viral em particular. Alguns exemplos de imunopatologia produzida por vrus so: Uvete anterior: Complexos antgeno-anticorpo se depositam no olho, estimulando inflamao local que resulta em uvete anterior. Alm disso, complexos imunes que permanecem na circulao se depositam nos rins, resultando em imunopatologia e glomerulonefrite. Isto freqentemente observado durante o estgio de convalescena da hepatite infecciosa canina. Coriomeningite linfoctica: Causada por um arenavrus de camundongos, que resulta em leses no sistema nervoso central (SNC) resultado da destruio de clulas infectadas por vrus, pelos linfcitos T citotxicos. A encefalite dos ces velhos (vrus da cinomose, um paramyxovirus) similar em sua patogenia, pois a imunopatologia resultado da resposta imunolgica mediada por clulas contra a infeco viral persistente. Vrus da hepatite B das marmotas e dos patos: Grande parte da leso heptica associada com essas infeces so atribudas contnua ao dos linfcitos T citotxicos dCD8+ destruindo hepatcitos infectados, e no ao direta do vrus em si. Imunossupresso induzida por vrus Alguns vrus, como resultado da replicao, deprimem a resposta imunolgica do hospedeiro, e assim so capazes de estabelecer a infeco. Imunossupresso induzida por vrus pode ocorrer tanto em infeces lticas como em infeces no lticas. freqentemente observada como conseqncia de infeces vricas que envolvem infeco de linfcitos, como a infeco pelo vrus da imunodeficincia humana (HIV) e vrus da imunodeficincia felina (FIV). Escape do sistema imune Alguns vrus pelo seu mecanismo de replicao utilizado so capazes de escapar do sistema imune do hospedeiro. Existem vrios mecanismos atravs dos quais isto pode ocorrer durante a infeco. Alguns exemplos incluem a infeco de stios imunolgicos de privilgio, variabilidade antignica dos vrions, inibio do IFN-beta, reduo da expresso de MHC-I, inibio do processamento de peptdeos e expresso de estruturas homlogas s do sistema imunolgico. Stios imunolgicos de privilgio so aqueles tecidos do corpo que no esto em contato direto com a circulao e portanto ficam separados do sistema imunolgico. Esses incluem o crebro, testculos, prstata, a retina do olho e as bolsas da bochecha dos hamsters. A produo de substncias/estruturas homlogas s do sistema imune incluem:

32

O citomegalovrus produz glicoprotenas que so anlogas dos receptores de Fc da IgG. O vrus do fibroma Shope produz um anlogo do receptor do fator de necrose tumoral (TNF). O vrus do Epstein-Barr produz um anlogo da interleucina 10 (Il-10).

Os tpicos sobre variabilidade antignica (Captulo 3), reduo da expresso do MHC-I (Captulo 4) e inibio do interferon-beta (ver acima neste captulo) j foram abordados. A latncia (herpesvrus, retrovrus) tambm um mecanismo de escape imunolgico. Os adenovrus produzem pequenos segmentos de RNA que bloqueiam a ativao dos interferons. Glossrio Via alternativa do complemento: Via de ativao do complemento no qualo componente C3 clivado e o complexo C5-C9 formado sem a necessidade do C1, C2 ou C4. No requer anticorpos. Complexo antgeno-anticorpo: um complexo macromolecular formado pela interao especfica entre anticorpo e antgeno. Tambm chamado de complexos imunes. Via clssica do complemento: Srie de reaes enzimticas-substrato de ativao sequencial desencadeada por complexos antgeno-anticorpo e envolvendo todos os componentes do complemento. Citoquinas: Molculas solveis que mediam interaes entre clulas. Protena FAS: Protena transmembrana do tipo 1 da superfamlia receptor do fator de necrose tumoral (TNFR). expressa em vrios tipos de clulas incluindo aquelas da linhagem mielide. Interleukin (IL)-10: Citoquina que pode reduzir a resposta imune contra vrus pela inibio da produo de IFN-gamma. Opsonina: Substncias que liga-se a partculas, incluindo microorganismos, facilitando a sua fagocitose. Fator de necrose tumoral: Citoquina produzida por moncitos/macrfagos (TNF-alfa) e alguns linfcitos T (TNF-beta). So diretamente txicos para clulas neoplsicas e so tambm envolvidas na inflamao. Direiros reservados: este documento est disponvel em www.ivis.org. Documento nm. A3405.0305.PT

33

Preveno de doenas vricas, vacinas e drogas antivirais

In: A Concise Review of Veterinary Virology, Carter G.R., Wise D.J. and Flores E.F. (Eds.). International Veterinary Information Service, Ithaca NY (www.ivis.org), Last updated: 17-Mar-2006; A3406.0306.PT. D.J. Wise1, G.R. Carter2 and E. F. Flores3
1 Department of Biology, Concord University, Athens, West Virginia, USA. 2 Virginia-Maryland Regional College of Veterinary Medicine, Virginia Tech, Blacksburg, Virginia, USA. 3 Department of Veterinary Preventive Medicine, Federal University of Santa Maria, Santa Maria, RS Brazil.

Traduzido por: E. F. Flores, Department of Veterinary Preventive Medicine, Federal University of Santa Maria, Santa Maria, RS Brazil. (18-Nov.-2005). ndice Generalidades Vacinas Imunizao passiva Imunidade de rebanho Drogas antivirais Glossrio Generalidades Preveno de infeces O nico mtodo seguro de evitar a infeco viral evitar a exposio. Na prtica, isso pode ser obtido permitindo a convivncia apenas de animais sem evidncia de exposies prvias. Esse contato restrito referido como "rebanho fechado". Para manter efetivamente esse status fechado, todos os novos animais anexados ao rebanho e animais que vo a exposies-feiras devem ser isolados dos demais por pelo menos 2 a 3 semanas. Durante esse perodo, estes animais so monitorados para sinais clnicos e testados sorologicamente para evidncia da infeco. Prevenir a infeco atrav s da restrio de contato um mtodo efetivo em reas onde certos agentes, so relativamente raros, mas impraticvel em reas onde esses vrus so endmicos. Nesses casos, os esforos devem ser redirecionados para prevenir-se a doena, ao invs de evitar-se a infeco. Controle de infeco e doena O fundamental para o controle de infeces e enfermidades virais so boas prticas manejo. Fatores de estresse desempenham importantes papis predispondo os animais infeco e na disseminao da enfermidade. Particularmente importantes so os estresses associados a subnutrio, superpopulao e alojamento em condies sem ventilao. As prticas de manejo devem incluir medidas preventivas para proteger os fetos e recm-nascidos. Alguns vrus que produzem infeces subclnicas ou leves em animais adultos podem causar abortos ou doena grave em neonatos (exemplo: parvovrus em sunos). Ento, esforos devem ser feitos para restringir o contato de fmeas prenhes e recm nascidos com outros animais. tambm muito importante se assegurar que os recm-nascidos recebem colostro, que contm anticorpos que conferiro proteo durante as primeiras semanas de vida. Outro aspecto de bom manejo a necessidade de minimizar o contato entre diferentes espcies de animais, pois alguns vrus causam infeces inaparentes em algumas espcies e doena grave em outras. Um exemplo o vrus da pseudo-raiva, que causa infeces subclnicas em sunos adultos, mas freqentemente fatal para leites, ovinos, ces e gatos. Limpeza e desinfeco rigorosos, uso de aventais limpos e pedilvios, so essenciais para evitar a disseminao de vrus atravs de fmites (Tabela 6.1). Esses itens do manejo devem ser praticados sempre, mas especialmente durante surtos da doena. Quando um surto ocorre, todos os animais devem ser submetidos a quarentena (isolados e observados) e, se indicado, tratados sintomaticamente. Por exemplo:

34

Receber a necessria fluidoterapia de suporte, como reposio de lquidos, em casos de diarria severa. Soluo aquosa de hipoclorito de sdio efetiva na desinfeco. Ver tabela 6.1 para outros desinfetantes. Tratamento com antibiticos pode ser recomendada para prevenir contaminaes bacterianas secundrias.

Vacinas Em algumas situaes a ocorrncia de doena pode ser prevenida atravs de vacinao. Embora a vacinao no necessariamente previna a infeco, a sensibilizao prvia do sistema imunolgico permite uma resposta rpida e eliminao do vrus, antes que a doena ocorra; ou fazendo com que a doena seja leve e de curta durao. De fato, a vacinao o mtodo mais efetivo e com melhor relao custo-benefcio em sade animal. Existem dois tipos principais de vacinas virais de uso veterinrio: que so amplamente utilizada na prtica veterinria as produzidas com o vrus morto (inativado); e aquelas produzidas com o vrus vivo modificado (atenuado). Vacinas virais mortas: consistem do vrus, geralmente cultivado em cultivo celular ou em ovos embrionados e posteriormente inativado quimicamente, principalmente por formalina ou beta-propiolactona. Essas vacinas geralmente contm adjuvantes para torn-las mais imunognicas. Vacinas inativadas normalmente requerem mais de uma dose para induzir imunidade e revacinaes peridicas para manter imunidade adequada. As vacinas inativadas geralmente induzem imunidade que menos protetiva e de durao mais curta que aquela induzida pelas vacinas vivas modificadas. Vantagens das vacinas inativadas: no revertem virulncia e so seguras para uso em fmeas prenhes e em animais imunodeprimidos. Vacinas vivas modificadas: Consistem de vrus tornados menos virulentos por algum mtodo. Isso geralmente obtido atravs de mltiplas passagens em cultivos celulares, ovos embrionados ou animais de

35

laboratrio. Os vrus tambm podem ser atenuados pela deleo de genes especficos responsveis pela virulncia. A manipulao gentica de vrus foi utilizada para produzir uma vacina atenuada contra a pseudoraiva. Vacinas atenuadas geralmente conferem longa imunidade, pois a vacinao mimetiza a infeco natural. Uma vacina adequadamente atenuada no deve causar doena nos animais vacinados; mas potencialmente pode causar doena em indivduos imunocomprometidos ou em fetos. Algumas vacinas vivas modificadas podem ser administradas pelas vias oral, nasal ou genital (prepucial, vaginal) onde iro induzir resposta humoral secretria local (IgA). A principal desvantagem das vacinas atenuadas a possibilidade de causarem sinais clnicos suaves, infeces fetais letais e o risco do vrus atenuado reverter virulncia. O vrus vacinal atenuado pode ser transmitido a animais em contato. Vrios novos mtodos tm sido explorados no esforo de produzir vacinas mais seguras e eficientes. Alguns desses mtodos so descritos a seguir: Vacinas de subunidade: um tipo de vacina inativada que contm pores (protenas, fragmentos) do vrus, necessrios para induzir imunidade. Peptdeos sintticos: So produzidas atravs de sntese qumica de pequenos segmentos (peptdeos) de protenas virais e utilizadas como vacinas de subunidade mais refinadas. Vacinas recombinantes. Existem trs tipos principais: Protenas recombinantes: O gene do antgeno viral de interesse clonado e o cDNA introduzido no genoma de bactrias ou leveduras atravs de um plasmdio, que produzem a protena em grandes quantidades. Esse antgeno ento utilizado como vacina. Vetores virais: O gene (ou genes) de um vrus grande (geralmente um poxvrus, adenovrus, herpesvrus) deletado e substitudo por um gene (genes) que codificam o antgeno desejado; o ltimo introduzido no animal e expresso nas clulas infectadas. O vrus que carrega o gene do antgeno desejado chamado de vetor. Vacinas com delees de genes: Um vrus virulento tornado menos virulento pela deleo de genes ou pela substituio de regies-chave nos genes com outro material gentico. Vrias vacinas recombinantes esto sendo usadas, incluindo a protena do vrus da hepatite B expressa em levedura; protena do vrus da raiva expressa no vrus vaccnia; protenas F e HA vrus da cinomose inseridos no genoma do poxvrus do canrio. Vacinas anti-idiotpicas: Vacinas anti-idiotpicas so produzidas em duas etapas. Inicialmente, o antgeno introduzido num organismo para induzir a resposta imunolgica. Esses anticorpos so ento utilizados para imunizar um segundo animal, contra o qual produz resposta imune. Alguns desses anticorpos possuem as caractersticas do antgeno original. Esses anticorpos so chamados de anti-idiotipcos. At o presente, vacinas anti-idiotpicas tm sido apenas testadas experimentalmente. Vacinas de DNA: Nesta estratgia, o gene viral (ou genes virais) do antgeno protico introduzido no indivduo por um plasmdeo, estimulando uma resposta especifica e protetora de anticorpos. At o presente esse tipo de vacina tem sido utilizado experimentalmente. Em esforos para se obter uma vacina efetiva para prevenir uma pandemia potencial de influenza, a estratgia de vacina de DNA est sendo investigada. A sua eficcia em induzir uma resposta imunolgica apropriada em humanos deve ainda ser estabelecida. No entanto, uma vacina de DNA j foi licenciada nos Estados Unidos para a preveno da infeco pelo vrus do Nilo Ocidental em eqinos. Vacinas com marcadores antignicos: Essas vacinas nicas so defectivas em uma protena ou possuem uma protena a mais do que no est presente no vrus original. Dessa forma, a protena a menos ou a mais pode servir de marcador para o vrus vacinal. Isto permite para os testes diagnsticos a diferenciao sorolgica entre animais vacinados e animais infectados. Os testes sorolgicos diagnsticos detectam anticorpos contra o vrus de campo, mas no contra o vrus vacinal alterado. Os mtodos utilizados para criar vacinas de marcadores so a deleo de genes (falta de um peptdeo) ou a produo de vacinas de subunidade (peptdeo novo). Vacinas diferenciais esto comercialmente disponveis para o vrus da pseudo-raiva (gene deletado) e herpesvrus bovino tipo 1 (gene deletado) e outras esto atualmente sendo produzidas ou em testes para outras doenas. Vacinao in ovo

36

Esse tipo de vacinao utilizado para a preveno da doena de Marek. Ovos embrionados so inoculados com o uso de um aparelho automtico aos 18 dias de incubao. Esse procedimento, que seguro e eficaz, tambm utilizado para vacinar contra a bronquite infecciosa e bursite infeciosa. Em geral, vacinas eficazes so disponveis para os vrus que possuem um ou poucos tipos antignicos e que podem ser obtidos em grande quantidade para a produo de vacinas. Curiosamente, devido grande variabilidade antignica do vrus que a composio da vacina contra a influenza humana necessita ser regularmente (anualmente) alterada, de acordo com as cepas circulantes. Imunizao passiva Imunizao passiva refere-se transferncia de anticorpos para um animal no imune. As imunoglobulinas presentes no soro imune contm anticorpos neutralizantes que previnem a ligao do vrus s clulas susceptveis. Imunidade passiva natural inclui o recebimento de anticorpos maternos via placenta (IgG), colostro (IgG), ou mnio da gema do ovo (IgY). O recebimento de quantidades insuficientes de anticorpos maternos pode resultar em morbilidade e mortalidade altas por vrias doenas vricas de animais jovens. Na prtica clnica, as imunoglobulinas so geralmente administradas antes da exposio ou durante o perodo de incubao para alterar o curso da infeco. Anti-soro (produzido em animais doadores) protege por um perodo curto de tempo e possui uso limitado na preveno de doenas vricas. Anti-soro tem sido utilizado para prevenir a cinomose canina, panleucopenia felina e doena do Nilo Ocidental em eqinos. Em algumas criaes de eqinos e bovinos, armazenagem de colostro e posterior administrao a neonatos utilizado para aumentar a sua imunidade. Imunidade de rebanho Esse fenmeno ocorre quando uma proporo suficientemente grande de uma populao ("rebanho") foi imunizada e portanto imune a um determinado vrus. Um indivduo que eventualmente no esteja imune contra o agente fica protegido, pois o restante do rebanho incapaz de transmitir o vrus. Para ser efetiva, a vacina em questo deve prevenir a doena causada pelo vrus e a sua transmisso. Um efeito semelhante podem ser visto em doenas naturais, se a maioria da populao, recupera-se da doena e fica imune por longo tempo, alguns poucos animais que no tenham sido infectados ficam protegidos pela imunidade de rebanho desde que n o haja reservatrios animais no rebanho. Drogas antivirais Drogas antivirais possuem uso muito restrito em veterinria. No entanto, provvel que algumas drogas que so efetivas contra vrus humanos possam ser tambm efetivas contra vrus homlogos de animais. Essas drogas podem ser classificadas em duas categorias principais, de acordo com o seu mecanismo de ao. Essas so as drogas anlogas de nucleosdeos e outras no-anlogas de nucleosdeos discutidas abaixo. Em 2006, o CDC relatou que uma cepa do vrus da influenza humana tipo A desenvolveu resistncia a duas drogas anti-virais comumente utilizadas, rimantadina e amantadina. A cepa H3N2, predominante na estao da gripe, anteriormente e rotineiramente tratada com essas drogas, havia desenvolvido resistncia. Essa informao indica a necessidade do desenvolvimento de drogas antivirais adicionais e possivelmente a necessidade do uso de um coquetel de drogas para o tratamento da influenza. Nucleosdeos inibidores Tabela 6.2 Propriedades de alguns nucleosdeos inibidores.

37

Vrias drogas antivirais comerciais so anlogos de bases/nucleosdeos, que interferem com a ao das polimerase de cido nuclico virais. Os mais comuns so: acicloguanosina (aciclovir), dihidroxipropoximetilguanina (ganciclovir), adeninaarabinosida (vidarabine) e azidotimidina (zidovudine). Veja a Tabela 6.2 para uma lista de alguns nucleosdeos inibidores e os vrus contra os quais eles so utilizados. As drogas antivirais no possuem amplo uso em medicina veterinria. O aciclovir eficaz contra herpesvrus e tm sido utilizado no tratamento de infeco ocular por herpesv rus em gatos. Essa droga tambm tem sido utilizada para tratar preventivamente pssaros psitacdeos caros que tenham sido expostos ao herpesvrus. Inibidores no-nucleosdeos Interferons e drogas antivirais tm sido utilizados para o tratamento de algumas infeces virais especficas. Os interferons foram discutidos no captulo 5. Possuem funo antiviral importante, pois aparecem cedo na infeco e desempenham um papel importante na recuperao. O mecanismo de ao a inibio da sntese de protenas virais. O tratamento de animais com IFNs exgenos no praticado amplamente pela falta de IFNs espcie-especficos. Embora os IFNs no sejam necessariamente hospedeiro espcie-especficos, a sua ao depende de interaes com receptores especficos nas superfcie celular. O IFN-alfa humano, disponvel no comrcio como de DNA recombinante, possui alguma atividade cruzada com outras espcies e tem sido utilizado para tratar oralmente gatos infectados com o vrus da leucemia felina.

38

Alm dos IFNs, outras drogas que inibem a traduo de RNAm virais so a fomiversina e methisazona. A fomiversina (Vitravene) uma molcula de DNA antisense que bloqueia a replicao do citomegalovrus. A methisazona (N-metil-beta-tiosemicarbazone) especfica para RNAm dos poxvrus. A amantadina (Symmetrel) e rimantadina (Flumadine) interferem com a penetrao e/ou desnudamento de alguns vrus envelopados, mas eficaz apenas contra o vrus da influenza A em humanos. Essas drogas no so comumente utilizadas nos EUA. Saquinavir (Invirase), indinavir (Crixivan), ritonavir (Norvir) e nelfinavir (Viracept) so inibidores de proteases virais. Elas atuam ligando-se no stio ativo das proteases, impedindo a enzima de clivar outras protenas. Essas droguas so freqentemente utilizadas como parte do coquetel de drogas no tratamento do HIV em humanos. Zanamivir (Relenza) e oseltamivir (Tamiflu) inibem a liberao do vrus das clulas hospedeiras. So especficos para a protena neuraminidase do vrus da influenza; impedem a liberao do vrus e portanto limitam a disseminao do vrus.

Glossrio Adjuvantes: So substncias ou formulaes qumicas utilizadas para aumentar a resposta imune contra vacinas inativadas. Atuam pela reteno/deposio do imungeno no local da inoculao, retardando a sua eliminao (efeito depot) e conseqentemente retardando a sua liberao; o tempo de estimulao antignica prolongado e conseqentemente aumentado. Alguns adjuvantes podem tambm estimular macrfagos, linfcitos e outras clulas envolvidas na resposta imunolgica. Sais de metais, como aqueles de alumnio, emulses de leo (adjuvante de Freund) e vesculas lipdicas sintticas (lipossomas) so tambm usados como adjuvantes. Neuraminidase: Glicoprotena presente como projeo na superfcie externa do envelope dos vrus da influenza. Cliva um inibidor da protena hemaglutinina do vrus da influenza. Direitos reservados: este documento est disponvel em www.ivis.org. Documento nm. A3406.0306.PT

39

MTODOS EM VIROLOGIA:

Cultivo e caracterizao viral

In: A Concise Review of Veterinary Virology, Carter G.R., Wise D.J. and Flores E.F. (Eds.). International Veterinary Information Service, Ithaca NY (www.ivis.org), Last updated: 28-Oct-2005; A3402.1005.PT D.J. Wise1 and G.R. Carter2
1 2

Department of Biology, Concord University, Athens, West Virginia, USA. Virginia-Maryland Regional College of Veterinary Medicine, Virginia Tech, Blacksburg, Virginia, USA.

Traduzido por: M. C. Speroto Brum, Departamento de Medicina Veterinria Preventiva, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, RS, Brazil. (28-Jun-2005). ndice Mtodos de propagao de vrus Purificao e concentrao de vrus Armazenagem e infectividade Visualizao de vrus Contagem direta de partculas vricas Contagem indireta de partculas vricas Alguns mtodos empregados para a caracterizao de vrus Glossrio

Vrios mtodos para o armazenamento, visualizao, quantificao (direta e indireta) e propagao de vrus foram desenvolvidos. Existem tambm mtodos para a realizao do diagnstico de doenas produzidas pela infees vricas, muitos deles so baseados em testes sorolgicos, os quais detectam a resposta do hospedeiro ao agente. Historicamente foi observado que alguns agente causadores de doenas poderiam passar atravs de filtros nos quais as bactrias eram retidas. Os filtrados quando inoculados em meios seletivos para bactrias apresentavam resultado negativo para esse microorganismo, porm mantinham a capacidade infectante e eventualmente continham vrus. Normalmente no possvel observar os vrus com o uso de microscpio ptico, com execo dos poxvrus. A visualizao de partculas vricas somente pode ser feita com o uso de microscpio eletrnico. Alguns mtodos bsicos aplicados para o estudo de vrus sero descritos abaixo.

Como discutido anteriormente, existe uma considervel diversidade nas caractersticas fsicas dos vrus de animais. A principal caracterstica que reflete a diversidade viral a presena ou ausncia do

40

envelope. Como demonstrado na Tabela 2.1, os vrus no-envelopados de uma maneira geral so sensveis a radiao ultravioleta, relativamente termoestveise susceptveis a danos produzidos pelos cristais de gelo. Devido a presena de camada lipdica que compe o envelope viral, os vrus envelopados so inativados por solventes lipdicos (clorofrmio e ter) e detergentes (deoxicolato), so sensveis as radiaes ultravioletas e gama, relativamente termosensveis e mais facilmente danificados por cristais de gelo do que os vrus que no possuem envelope. Mtodos de propagao viral Para o isolamento, caracterizao, identificao e produo de vacinas uma considervel quantidade de partculas vricas geralmente necessria. Isso pode ser obtido pela atravs de tcnicas de propagao. Inoculao de animais Durante muito tempo a inoculao de susceptveis foi nica maneira de se obter grande quantidades de vrus. Atualmente, o uso de animais para multiplicao de vrus limitada devido a questes ticas. Somente utiliza-se animais para a amplificao viral para aqueles vrus que apresentam dificuldade de adaptao ao cultivo celular. Por exemplo, cepas vacinais do vrus da Enterite Hemorrgica dos Perus podem ser propagadas em animais ou em cultivo celular. No entanto, o uso de amostras oriundas do bao de aves parece ser mais empregada. Com o propsito de diagnstico, a inoculao de animais pode ser utilizada, em amostras suspeitas de raiva utiliza-se a inoculao de camundongos lactantes. Inoculao de ovos embrionados Previamente ao desenvolvimento das tcnicas de cultivo celular, o uso de ovos embrionados para a propagao viral foi umas das primeiras alternativas na qual no se utilizava animais. A inoculao em ovos embrionados um mtodo amplamente utilizado para a propagao de vrus influenza tipo A e a maioria de vrus avirios. Esse sistema pode ser empregado para a diferenciao de alguns vrus que produzem leses semelhantes, como vrus do cowpox e do pseudocowpox. No entanto, alguns vrus de mamferos, como o vrus da Lngua Azul, se adaptam bem a esse sistema que rotineiramente utilizado para propagao, diagnstico e pesquisa. Algumas consideraes devem ser tomadas quando do emprego dessa tcnica, dentre elas a presena de anticorpos maternais (IgY) no saco da gema. Devido a isso, indicado o uso de ovos oriundos de criatrios SPF (specific pathogen-free livres de patgenos especficos). A constante passagem de viroses em ovos embrionados tambm uma tcnica de atenuao que pode ser aplicada para a obteno de amostras virais utilizadas em vacinas vivas modificadas. Cultura de clulas e tecidos A cultura de tecidos refere-se ao crescimento e manuteno de tecidos vivos in vitro. Existem dois tipos bsicos: cultivo de explante e cultivo celular. Cultivo de explantes so pequenos fragmentos de tecidos oriundos do hospedeiro e mantidos em cultivo, enquanto que o cultivo celular resultado da dissociao do tecido em clulas individuais seguido de sua manuteno em cultivo. Vrios sistemas utilizados em virologia so baseados no emprego de cultivos celulares e no no cultivo de tecidos, sendo muitas vezes ambos termos aplicados indiscriminadamente. O cultivo de clulas pode ser subdividido em cultivo primrio, semi-contnuo e contnuo ou linhas celulares. Cultivos de explante So culturas de pequenos fragmentos de tecidos especficos retirados de animais. Cultivos de explante so teis para isolamento viral e so necessrios para o isolamento de alguns coronavrus. Demonstrao de latncia por alfaherpesvrus humanos e animais pode exigir o uso de cultivos de explantes de ganglios nervosos (trigmeo). Cultivo celular primrio Cultivo de clulas primrias so originados de tecidos frescos que foram submetidos ao tratamento com enzimas (tripsina ou outras proteases) para a individualizao das clulas. Como resultado, esse tipo de cultivo muitas vezes composto de vrios tipos celulares. Nas condies in vitro, os cultivos primrios raramente se dividem ou ento o fazem a uma freqncia muito baixa, isso denominado como limite de

41

Hayflick. Portanto, so limitados quanto ao nmero de passagem, porm so ideais para o isolamento de alguns vrus. Cultivos primrios raramente sobrevivem a 20 passagens in vitro.

Figura 2-1. Cultivo celular normal. Cortesia do A. Wayne Roberts.

Cultivo semi-contnuo Conhecido como linha celular diplide, o cultivo semi-contnuo contm o nmero normal de cromossomos de uma clula diplide da espcie da qual foi originado. Cultivos semi-contnuos so originados de cultivos primrios na qual algumas clulas podem sobreviver mais que o limite de Hayflick. Esse tipo de cultivo geralmente sobrevive entre 30 e 50 passagens in vitro. No entanto, esses cultivos so amplamente para a propagao de uma grande variedade de vrus. Geralmente so compostos por fibroblastos. Cultivo contnuo ou linhas celulares As clulas desse tipo de cultivo apresentam um nmero anormal de cromossomos, sendo chamados de cultivos heteroplides. Essas clulas so originadas de tecidos normais ou neoplsicos e so caracterizados pela habilidade de propagao indefinida in vitro. Geralmente, os cultivos contnuos ou linhas celulares so menos susceptveis a propagao viral do que os cultivos primrio ou semi-contnuo. Porm, possuem a facilidade de multiplicao em grande escala o que benfico para a pesquisa e produo de vacinas. Muitas linhas celulares esto disponveis em repositrios, como o American Type Cell Culture (ATCC). Os laboratrios de virologia geralmente mantm estoques de linhas celulares com um baixo nmero de passagens, pois essas linhas contnuas so susceptveis a alteraes nas suas caractersticas. As alteraes podem ser produzidas pela infeo com micoplasmas ou contaminao com alguns vrus (circovrus suno e vrus da diarria viral bovina). Concentrao e purificao viral Aps a adaptao e propagao inicial, os vrus podem ser separados dos debris celulares e purificados. Isso obtido aps um nmero de processos que envolvem centrifugaes (diferentes velocidades), dilise, precipitao, cromatografia e gradientes de densidades. O passo inicial desse processo uma centrifugao diferencial (baixa velocidade) (~ 2000 x g) que utilizada para remoo dos debris celulares. O seguinte passo uma centrifugao a alta velocidade (40 000 a 80 000 x g) que objetiva reduzir o volume da amostra, em alguns casos em que deseja reduzir o volume ainda mais pode ser feita uma concentrao por dilise e precipitao com metanol ou polietilenoglicol realizada a baixa temperatura (70C). A purificao obtida atravs de cromatografia ou centrifugao atravs de gradientes de densidade. Vrus envelopados podem ser purificados atravs da velocidade de sedimentao em gradientes de sacarose. J os vrus no envelopados, podem ser purificados pela centrifugao em gradientes de cloreto de csio. Infectividade e armazenamento

42

Infectividade Infectividade a habilidade que o vrus tem de infectar uma clula hospedeira. A temperatura exterior clula hospedeira afeta diretamente a capacidade do vrus manter a sua infectividade, particularmente nos casos do vrus envelopados. Os vrus no possuem atividade metablica prpria, a infectividade a maneira de avaliar a integridade da partcula aps a exposio a determinadas temperaturas. Alguns parmetros so considerados crticos: 60C, a infectividade ir diminuir rapidamente em segundos. 37C, a infectividade ir diminuir em minutos. 20C, infectividade ir diminuir em horas. a infectividade, temperaturas acima citadas, ir influenciar a transmisso pelo contato direto ( 37C) e pelos fomites ( 20C). 4C, a infectividade nos tecidos mantida por dias. Clnicos devem estar atentos para esse tipo de amostra clnica.

Temperaturas abaixo da temperatura de congelamento so usadas para armazenamento de vrus durante prolongados perodos. Nesse caso importante manter a formao de cristais de gelo nveis mnimos. Deve ser considerado que a resistncia e labilidade varia muito entre os vrus. Alguns so capazes de resistir por horas, dias, ou at meses em condies ambientais, enquanto outros so inativados em minutos sob condies semelhantes. Trs mtodos principais de conservao de vrus so: congelamento -70C com ou sem criopreservantes. congelamento -196C nitrognio lquido, para armazenamento por um longo perodo de tempo. liofilizao ou congelamento a seco, podendo ser estocados a temperatura ambiente ou congeladores convencionais.

Visualizao de vrus Os dois mtodos mais utilizados para visualizar a estrututra e morfologia dos vrus so a microscopia eletrnica e microscopia de fora atmica. Outros tipos de microscopia so empregados para observar as alteraes celulares induzidas pela replicao viral. Sem as tcnicas de visualizao dos vrus existe uma dificuldade muito grande em se estudar a estrutura ou a interao vrus-clula. A capacidade de visualizao das partculas permitiu se estimar o nmero de partculas presentes em uma suspenso. Alguns mtodos permitem estimar o nmero de partculas presente em uma soluo de forma indireta. Em ambos os casos, direta ou indireta, a quantificao sempre uma estimativa. A estimativa importante na preparao de vacinas, na determinao do nmero mnimo para produo de doena ou em investigao viral. Microscopia ptica Com o uso da microscopia ptica no possvel a observao das partculas vricas, com exceo dos poxvrus, esta tcnica pode ser utilizada para a observao do efeito da infeco viral na clula hospedeira. A alterao ou destruio causada pelo vrus na clula referido como efeito citoptico (CPE). Os efeitos citopticos observveis incluem: 1. arredondamento celular e agregados semelhantes a cachos de uva. Ex.: adenovrus 2. arredondamento celular, retrao celular, ruptura com a liberao de debris celulares. Ex.: enterovirus 3. entumecimento e arredondamento celular em reas localizadas. Ex.: herpesvrus 4. fuso de vrias clulas e formao de clulas gigantes multinucleadas (sinccio). Ex.: paramixovrus Adicionalmente, a formao de corpsculos de incluso pode ser observada, sendo caractersticas de alguns vrus.

43

Figura 2-2. Efeito citoptico de um herpesvrus equino "lento". Cortesia do A. Wayne Roberts. Microscopia de fluorescncia A microscopia de fluorescncia pode ser utilizada para a visualizao de clulas ou tecidos infectados por vrus, nesse caso emprega-se anticorpos especficos para o antgeno associados a um fluorocromo (geralmente fluorescena). Os anticorpos ligam-se especificamente nos antgenos virais dentro das clulas ou tecidos. A visualizao possvel aps a excitao do fluorocromo com a luz ultravioleta (UV) do microscpio de fluorescncia, na qual se observam as reas coloridas localizadas em um fundo relativamente escuro. Alternativamente, a visualizao pode ser realizada indiretamente atravs do uso de anticorpos no marcados (especficos para o antgeno, como os soro de animais convalescentes), seguido do uso de um anticorpo marcado com o fluorocromo que reconhece o primeiro anticorpo. As tcnicas que utilizam anticorpos fluorescentes so rotineiramente usadas no diagnstico e pesquisa viral. Microscopia eletrnica A microscopia eletrnica emprega a acelerao dos eltrons com grande energia e magnticamente, tornando possvel a visualizao da amostra. Os eltrons com alta energia possuem comprimentos de ondas curtos e isso faz com se obtenha uma melhor resoluo de estruturas muito pequenas. A microscopia eletrnica possui resoluo capaz de se visualizar grandes polmeros, como DNA, RNA e grande protenas. Para facilitar a visualizao, as amostras podem ser previamente tratadas com metais pesados, como o smio. Os eltrons chocam com o metal, os quais so visualizados na tela fluorescente. Com microscopia eletrnica possvel a obteno de imagens tridimensionais dos vrus e de sua localizao dentro da clula hospedeira (ncleo ou citoplasma) em um determinado momento aps a infeo. Como as amostras so tratadas com metais pesados, a observao dos vrus em clulas vivas no possvel. Microscopia atmica de fora A microscopia de atmica de fora mede a propriedades locais (tamanho, absoro, magnetismo, etc.) mediante a proximidade da sonda com a amostra. Isso faz com que seja possvel medir pequenas reas da amostra. Os eltrons so impulsionados entre os tomos, resultando em uma pequena, mas mensurvel fora. O resultado da fora medida transformado no contorno da superfcie da estrutura analisada. A vantagem da microscopia atmica de fora o uso de clulas ou tecidos vivos e de requerer uma quantidade mnima de amostra. Esse mtodo tem sido til para imagens detalhadas de estruturas de capsdeos e de interaes entre o vrus e a clula. Microscopia imunoeletrnica Essa tcnica permite a visualizao do complexo antgeno/anticorpo que especfico para determinado vrus. Nesse mtodo, sees ultrafinas da amostra so preparadas e incubadas com um anticorpo especfico para o vrus. Depois de seguidas lavagens, a seo incubada com protena A conjugada com partculas de ouro (com um tamanho variando entre 5 e 20 nm). A protena A liga-se regio Fc do anticorpo e a deteco feita com o uso da microscopia eletrnica.

44

Contagem direta de vrus A contagem do nmero de partculas vricas possui importncia na pesquisa e produo de vacinas. A microscopia eletrnica usada para contagem de partculas vricas em solues livres de vrus. Um determinado volume de amostra examinado e os vrus so contados. Esse nmero ento empregado para se fazer uma estimao do nmero total de partculas na amostra. Uma limitao desse mtodo que capsdeos vazios, partculas no infecciosas, so contadas. O nmero de partculas infecciosas e o nmero total so comparados possibilitando o estabelecimento de uma relao partculas totais/partculas infecciosas para uma determinada preparao de um vrus. Contagem indireta de vrus Os mtodos de contagem indiretos utilizam fatores associados com a infectividade (atividade biolgica). Os trs principais mtodos utilizados para a determinao da concentrao viral so: provas de hemaglutinao, prova de formao de placas e o mtodo da diluio limitante. Hemaglutinao A prova de hemaglutinao baseada na propriedade que muitos vrus envelopados tm de aglutinar eritrcitos. O teste realizado em microplacas e consiste da adio de clulas vermelhas diferentes concentraes do vrus, aps um perodo de incubao observa-se a hemaglutinao. A hemaglutinao o resultado da ligao de vrias partculas vricas superfcie do eritrcito. Por exemplo, so necessrios 10.000 partculas vricas de influenza por cada unidade hemaglutinante (HA). Uma HA definida como a maior diluio da amostra viral que produz hemaglutinao completa. A hemaglutinao empregada para a concentrao e purificao de alguns vrus, e tambm como um teste auxiliar na identificao de alguns vrus em amostras de cultivo celular e fludos de embries de galinhas. Especialmente de amostras vricas que no efeito citopatognico ou ento o fazem de forma discreta. Pode ser utilizada diretamente em amostras de fezes ou para determinados tipos de ensaios enzimticos. Ensaios similares de atividade enzimtica de um vrus em particular (como aqueles que possuem transcriptase reversa) podem ser realizados de maneira semelhante. Unidade formadora de placas Esta prova baseia-se na inoculao de clulas susceptveis com uma amostra do vrus e atravs da sua atividade biolgica pode-se estimar a quantidade de partculas. Nesse procedimento, diluies seriadas na base dez do vrus a ser testado so inoculadas em camadas celulares. Aps o perodo de incubao que permite o vrus adsorver nas clulas, adicionado um gel contendo agarose e meio de cultivo. O gar previne a disseminao do vrus na cultura entre as clulas a uma grande distncia, mas permite que ocorra uma transmisso clula-a-clula. Nos vrus citopticos, as clulas infectadas sero destrudas formando um rea clara indicando a morte celular aps a um perodo de incubao que pode variar entre 24 - 72 horas. O clculo do nmero de placas baseia-se na contagem do nmero de placas observadas, no fator de diluio e no volume de amostra usada para, resultando em Unidade Formadora de Placas por mililitro de amostra. Mtodo da diluio limitante Esse ensaio baseado na observao da presena da replicao viral in vitro como CPE aps a exposio de diferentes diluies da amostra a ser testada. Quando possvel, utiliza-se um vrus referncia que possu a sua concentrao pr-determinada como controle positivo. Dependendo do vrus, realizam-se diluies seriadas na base dois ou na base dez e incuba-se com clulas susceptveis. O ttulo infecioso (a recproca da maior diluio capaz de infectar 50% das culturas celulares) expresso como DICC50/ml (dose infectante para 50% dos cultivos celulares). Essa prova pode ser realizada com culturas celulares, ovos embrionados ou at mesmo com animais de laboratrios. Diferentes mtodos usados para caracterizao Existem algumas tcnicas utilizadas em virologia que so auxiliares na identificao e classificao de amostras desconhecidas de vrus. Algumas das tcnicas sero rapidamente citadas, mas se possuem especial interesse no diagnstico ou pesquisa de algum particular vrus sero descritas com mais detalhes na ocasio apropriada.

45

Sensibilidade a solventes lipdicos A sensibilidade de alguns vrus aos solventes lipdicos, como clorofrmio e ter, auxilia na taxonomia de alguns vrus. Todos os vrus que possuem envelope como a membrana externa so susceptveis aos solventes lipidcos. Todos os vrus animais envelopados, com exceo de alguns poxvrus, so sensveis ao ter. Identificao do cido nuclico A identificao realizada atravs da sntese do cido nucleico na presena de inibidores da sntese do DNA, tais como 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU). Se a sntese viral for inibida, a multiplicao do vrus estar diminuda ento do mesmo modo. Caso a multiplicao viral no for inibida, presume-se que o vrus contenha RNA como material gentico. Anlise por enzimas de restrio Enzimas de restrio so endonucleases (RE) que cortam o DNA de fita dupla em regies especficas, variando de quatro a oito seqncias de bases palindrmicas. A anlise por enzimas de restrio particularmente til para a definio do "subserotipo", na diferenciao entre vacina viva modificada e amostra virulenta, e estudo epidemiolgico de surtos. O mtodo baseia-se no tratamento do DNA viral com uma ou mais enzimas de restrio, seguido da separao dos fragmentos de acordo com o tamanho atravs de eletroforese em gel de poliacrilamida ou agarose. Os vrus RNA tambm podem ser analisados atravs desta tcnica, porm primeiro deve ser sintetizado o DNA complementar (cDNA) a partir de RNA usando a enzima transcriptase reversa, seguido de uma amplificao do cDNA pelo uso da tcnica de reao em cadeia da polimerase (PCR). Hemadsoro Os ortomixovrus e paramixovrus obtm a camada externa do envelope atravs do brotamento nas membranas celulares. Anteriormente ao brotamento, protenas codificadas pelos vrus (hemaglutininas) so incorporadas na membrana celular. Isso far com as os eritrcitos adsorvam na superfcie celular, e resultando na formao de um foco de hemadsoro que poder ser detectado microscopicamente. Mtodos imunolgicos Animais infectados com vrus respondem atravs da produo de anticorpos especficos. A deteco e avaliao desses anticorpos, os quais refletem o estado da doena, so utilizados para o planejamento de programas sanitrios em rebanhos e em estudos epidemiolgicos de surtos. A deteco dos anticorpos tambm empregada no diagnstico de doenas, e isso muitas vezes um processo demorado que requer a avaliao dos nveis de anticorpos na fase aguda e convalescente, geralmente coletados num intervalo de 10 a 14 dias. Uma medida mais rpida utilizar anticorpos especficos (soro hiperimune) para detectar os antigenos virais diretamente nas amostras clnicas. Esses anticorpos so obtidos atravs da hiperimunizao de coelhos ou cabras com vrus. Outra alternativa que podem ser empregada so os anticorpos monoclonais, se disponveis. Anticorpos monoclonais (mAbs) so preparados em camundongos aps a sua exposio com o antgeno viral, esses desenvolvero linfcitos B especficos no bao. Essas clulas sero coletadas e fusionadas quimicamente com a uma linhagem celular de plasmocitomas de camundongos que secretam IgG. Essas clulas hbridas so ento selecionadas e clonadas, resultando os hibridomas, esses sero analisados quanto a secreo de anticorpos especficos para o antgeno viral. Os hibridomas selecionados so injetados no peritnio de camundongos, onde essas clulas iro multiplicar rapidamente, resultando no acmulo de fludo asctico contendo altas concentraes do anticorpo monoclonal. A figura 2-1 descreve os passos envolvidos na preparao de anticorpos monoclonais. Anticorpos monoclonais so utilizados na tipificao e subtipificao viral. Quando ligados a substncias fluorocromos, os mAbs so utilizados na deteco de antigenos virais em tecidos. Os mAbs so tambm usados em testes de ELISAs para a identificao de vrus.

46

Figura 2-3. Os passos associados com o desenvolvimento de anticorpos monoclonais especficos. Glossrio Vrus citoptico: so vrus que alteram a aparncia das clulas em cultura. As alteraes podem incluir arredondamento, fuso, lise e liberao e produo de corpsculos de incluso. Gradiente de densidade: este procedimento empregado para separao das clulas ou molculas grandes, como protenas e cidos nuclicos, pela centrifugao atravs de um gradiente de densidade. O gradiente consiste de uma soluo (geralmente por sacarose ou cloreto de csio) formada por vrias densidades, sendo a menos concentrada na superfcie e a de maior concentrao no fundo. Devido a centrifugao as clulas e molculas movem-se atravs do gradiente e formam bandas na densidade onde sua gravidade e igual ao do meio. Palindrmicas: so seqncias de DNA que a leitura a mesma em ambas as direes. A maioria dos stios de reconhecimento das enzimas de restrio so palindrmicas. Ex.: o stio de reconhecimento da EcoRI (E. coli) :

Direiros reservados: este documento est disponvel em www.ivis.org. Documento nm. A3402.1005.PT

47

CULTIVO E IDENTIFICAO DE VRUS (texto original do polgrafo): Inoculao de animais de experimentao; Inoculao de ovos embrionados; Cultivos celulares. CULTIVOS CELULARES (1950) Inicialmente, os vrus eram propagados atravs da inoculao de animais. Mais adiante, foi observado que ovos embrionados permitiam a multiplicao de uma srie de vrus (ex. Infuenza, o vrus da gripe verdadeira). At hoje, ovos embrionados so muito utilizados em virologia. Mais modernamente (embora animais ainda sejam muito utilizados em determinadas situaes), devido a sua praticidade, para o cultivo e isolamento de vrus so utilizados cultivos celulares, que nada mais so do que clulas multiplicadas em suportes slidos (ocasionalmente multiplicadas em suspenso). So eles classificados em: Cultivos primrios: clulas diplides, primariamente extradas de rgos e geralmente muito sensveis infeces com vrus de determinada espcie. So obtidos por disperso das clulas com tripsina. So incapazes de se mlultiplicarem por mais do que 10-20 passagens em cultivos in vitro. Ex: cultivos primrios de testculos ou rim de terneiro. Linhas celulares: clulas tambm so ainda diplides, porm sofreram algumas modificaes em sua carga gentica que as torna capazes de atingir at 60-80 subcultivos in vitro tambm bastante sensveis aos vrus (usualmente da espcie de origem destas clulas). Ex: clulas de turbinados bovinos (BT). Linhagens celulares ou linhas celulares contnuas: so clulas invariavelmente heteroplides, com nmeros bastante irregulares de cromossomos, com sensibilidade varivel para determinados vrus, porm capazes de serem propagadas in vitro por um nmero indefinido de passagens.

Os cultivos celulares de clulas destes tipos acima mencionados normalmente no se multiplicam em suspenso. Necessitam estar aderidas a um suporte slido para seu crescimento (tal como uma garrafa ou plstico), caso contrrio, no so capazes de multiplicar-se; apresentamse normalmente como uma nica camada de clulas, denominada "monocamada" ou "monolayer". Observao: Existem clulas capazes de crescer em suspenso, mas estas so usadas somente em situaes especiais, como a produo de vacinas, onde o vrus j bastante conhecido e faz-se necessria a produo de uma grande massa de antgeno. Geralmente no so utilizadas clulas em suspenso para o trabalho rotineiro de diagnstico e pesquisa virolgica. Por outro lado, so sempre preferveis, quando possvel, para a produo de grandes massas de antgeno viral. Tipos de suportes para cultivos in vitro: Vidro x plstico: em geral as clulas se aderem a superfcies de vidro com facilidade. Certos tipos de vidro contm sais que no so adequados a permitir a aderncia das clulas. Igualmente certos tipos de plstico devem ser tratados previamente (p.ex. com poli-l-lisina ou plasma) para permitir uma melhor aderncia do tapete celular. Garrafas fechadas x garrafas abertas: Garrafas fechadas (ou seja, com a tampa bem fechada) contendo cultivos celulares fazem com que o prprio metabolismo celular gere condies de tamponamento adequadas ao crescimento das clulas. Por outro lado, cultivos abertos (garrafas abertas ou plsticos sem vedao adequada) tendem a levar

48

alcalinizao do meio pela entrada de oxignio, levando a que as clulas no se multipliquem adequadamente. Por essa razo, cultivos abertos devem ser mantidos em atmosfera contendo cerca de 5% de CO2, o que permite que ocorra um tamponamento adequado do meio, pela formao de HCO3. Garrafas estacionrias: as clulas podem ser cultivadas em garrafas (de plstico ou vidro) estacionrias, ou seja, mantidas sobre uma superfcie, sem sofrer movimentos. Garrafas rolantes ("rollers"): clulas tambm podem ser cultivadas em garrafas rolantes ou "rollers", onde as mesmas so mantidas sob rotao em um aparato apropriado. Tubos de ensaio (estacionrios ou rolantes): como em garrafas, as clulas podem tambm ser cultivadas em tubos de ensaio (de plstico ou vidro), estacionrios ou rolantes. Tubos com lamnulas (tubos de Leighton): tubos de ensaio contendo em seu interior uma lamnula so freqentemente usados para o exame do crescimento de vrus sobre as lamnulas e posterior colorao das clulas infectadas. Microplacas (96, 24, 12 ou 6 orifcios) muito freqentemente usadas hoje em dia: as placas de microtcnica ou microplacas so placas de plstico com orifcios de fundo chato. Cada orifcio pode ser tratado como se fosse uma garrafa, ou um tubo, independente. Com uma microplaca podem ser feitas titulaes de vrus e muitas outras provas, com um gasto mnimo de clulas e de meio de cultivo.

Como feita a DETECO DE INFECES VIRAIS? 1- Atravs do efeito observado nos animais inoculados (morte ou leses). 2- Atravs do efeito sobre os ovos embrionados (leses na membrana corio-alantide, mortalidade dos embries). 3- Atravs do desenvolvimento de alteraes nas clulas, chamadas efeito citoptico ou efeito citopatognico (ECP). Os tipos de ECP variam: lise celular; necrose; apoptose; formao de incluses; formao de sinccios (clulas gigantes multinucleadas); formao de vacolos.

4- Por algum mtodo de deteco de determinada protena viral (ex. a hemaglutinina do vrus da influenza, detectada por testes de hemaglutinao, ou a deteco da atividade de determinada enzima viral, p.ex. a transcriptase reversa). 5- Interferncia por um vrus no citopatognico (raramente usado hoje em dia). 6- Transformao morfolgica por um vrus oncognico (ex. vrus do sarcoma de Rous), normalmente acompanhada de perda de inibio por contato e aglomerao de clulas em grupos isolados. 7- Atravs de testes imunoqumicos: Alguns vrus no causam leses em cultivos celulares, sendo chamados vrus no-citopticos (ex. vrus da Rubola, ou alguns Pestivrus). Estes testes so hoje em dia muito frequentemente usados.

49

8- Atravs da visualizao do vrus por microscopia eletrnica (no muito comum, pois dependem de uma concentrao elevada de vrus e - o que mais complicado - da disponibilidade de um microscpio eletrnico). 9- Danos aos cromossomos: desarranjo do caritipo pode ser conseqncia de algumas infeces virais. Fragmentaes, rearranjos, trocas e anormalidades cromossomais podem ser detectadas. 10- Induo de apoptose: vrios vrus so capazes de induzir apoptose (morte celular programada). QUANTIFICAO DOS VRUS:

Mtodos fsicos: 1- Contagem de partculas no microscpio eletrnico: Os vrus podem ser contados a partir de uma preparao ao microscpio eletrnico, se comparados com uma suspenso de partculas de ltex de tamanho semelhante. O inconveniente desse tipo de contagem que ela reflete o nmero de partculas fisicamente presentes na preparao, mas no esclarece quantas delas so viveis ou infecciosas. A infecciosidade, entretanto, avaliada por outros mtodos, comentados abaixo. 2- Ensaios fsicos baseados em propriedades conferidas por protenas virais: alguns vrus contm protenas que lhes conferem propriedades relativamente fceis de serem quantificadas. Uma delas a hemaglutinao, propriedade pela qual um determinado vrus capaz de aglutinar hemcias. Isto fornece um mtodo simples de determinar a quantidade do agente infeccioso presente na preparao. Igualmente aqui no possvel determinar o nmero fsico de partculas virais necessrias para causar a aglutinao de um determinado nmero de hemcias; no obstante, usualmente a hemaglutinao se correlaciona adequadamente com a quantidade de unidades infecciosas presentes na preparao de vrus. 3- Testes envolvendo reaes do tipo antgeno-anticorpo: so freqentemente utilizados para quantificar os vrus presentes em uma preparao. Igualmente, necessrio estabelecer uma correlao entre testes e o nmero de partculas infecciosas, ou, melhor dizendo, unidades infecciosas, presentes na preparao. Exemplos desse tipo de teste so a imunofluorescncia ou os testes imnoenzimticos denominados ELISAs. 4- Ensaios moleculares: baseados na quantificao do genoma viral em determinada preparao (ou paciente). Estes testes tm sido muito utilizados para o acompanhamento da evoluo de pacientes com HIV e para o acompanhamento de outras enfermidades vricas onde o cultivo do agente mais demorado ou difcil. Exemplo desse tipo a PCR quantitativa ou real time PCR, onde a quantidade de produto amplificado est relacionada quantidade de genoma viral presente na amostra. Ensaios baseados em infectividade: Estes ensaios so baseados na capacidade do vrus infectar determinado cultivo, ou causar determinada leso, ou ainda causar a morte do hospedeiro (exemplos: morte de embries de galinha). Em cultivos celulares, este tipo de teste determina a capacidade de determinado vrus de causar ECP. Na maioria dos casos, hoje em dia estes so os ensaios utilizados com maior

50

freqncia. Para realiz-los, so feitas diluies seriadas da suspenso de vrus, usualmente utilizando o fator de diluio 10 (ex: 1/10 ou 10-1, 1/100-2, 1/1000 ou 10-3 = e assim por diante). Estas diluies so subseqentemente inoculadas em cultivos celulares apropriados, usualmente com quatro ou mais repeties (ou seja, 4 camundongos, ou 4 tubos, ou ainda 4 orifcios de uma placa de microtcnica) por diluio. Em alguns sistemas (p.ex. sistema de plaqueio), aps a infeco dos cultivos, adiciona-se uma camada de um meio semi-slido sobre as clulas, a fim de permitir a visualizao de "placas", originadas da multiplicao do vrus em determinados pontos da monocamada, que por encontrarse sob o meio semi-slido no tendem a espalhar-se com grande rapidez, permitindo a visualizao das placas. Aps determinado perodo de incubao do vrus em cultivo, os cultivos so examinados e quantifica-se o ECP por contagem dos poos onde o efeito ocorreu, ou utiliza-se um mtodo imunoqumico (ex. imunoperoxidase) para a deteco dos cultivos infectados.

Interaes vrus-clula e patogenia viral

In: A Concise Review of Veterinary Virology, Carter G.R., Wise D.J. and Flores E.F. (Eds.). International Veterinary Information Service, Ithaca NY (www.ivis.org), Last updated: 8-Feb-2005; A3404.0205.PT D.J. Wise1 and G.R. Carter2
1 2

Department of Biology, Concord University, Athens, West Virginia, USA. Virginia-Maryland Regional College of Veterinary Medicine, Virginia Tech, Blacksburg, Virginia, USA.

Traduzido por: E. F. Flores, Departamento de Medicina Veterinria Preventiva, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, RS, Brasil. (28-Sep-2005). ndice Interaes entre vrus e clulas hospedeiras Patogenia das infeces vricas Glossrio

O conhecimento da gentica e replicao viral necessrio para entender as interaes entre os vrus e as clulas hospedeiras. As interaes a nvel celular e a progresso de uma infeco viral em particular determina a patogenia da enfermidade e as manifestaes clnicas. A resposta imunolgica do hospedeiro infeco viral apresentada anteriormente. Interaes entre vrus e clulas hospedeiras As interaes entre os vrus e as suas clulas hospedeiras est intimamente ligada ao ciclo replicativo do vrus. As interaes do vrus com os componentes e organelas celulares durante a replicao determinam como os vrus causam doenas. Em geral, existem quatro possveis efeitos primrios de uma infeco vrica em uma clula hospedeira. A maioria das infeces no causa alteraes patolgicas ou morfolgicas aparentes na clula; entretanto a replicao pode causar citopatologia (arredondamento celular, desprendimento do tapete, formao de sinccios, etc.), transformao maligna ou lise celular (morte). Morte celular A morte celular durante a replicao pode ocorrer por vrios fatores. A causa mais comum parece ser a inibio da sntese basal de macromolculas, como protenas. Durante a replicao, o vrus induz a maquinaria celular a produzir principalmente produtos virais em detrimento dos produtos necessrios sobrevivncia da clula. Com isso, estes no esto em quantidades suficientes para manter a sua viabilidade. Alm da falta de produtos essenciais, esses eventos resultam em acmulo excessivo de produtos virais (RNA, DNA, protenas), que podem ser txicos para a clula. Na fase de liberao/egresso do ciclo replicativo de alguns vrus apoptose estimulada. Em outros casos, a inibio da sntese de macromolculas celulares provoca danos nas membranas lisossomais e liberao de enzimas hidrolticas, resultando em morte celular.

51

Efeitos celulares Efeito citoptico (ECP) refere-se a quaisquer alteraes morfolgicas celulares resultantes de infeco vrica. Clulas infectadas podem ter a sua membrana plasmtica alterada, e como resultado pode fusionar com a clula vizinha. Acredita-se que essas alteraes de membrana que levam a fuso, so resultados da insero de protenas virais durante o ciclo replicativo. O resultado da fuso de vrias clulas so clulas gigantes multinucleadas ou sinccios. A formao de sinccios caracterstica da replicao de alguns vrus envelopados como os herpesvrus e paramixovrus. A membrana celular tambm pode ficar alterada em sua permeabilidade, permitindo a entrada de ons, toxinas, antibiticos, etc. Essas clulas gigantes so algumas vezes chamadas de "clulas gigantes multinucleadas". Outro aspecto do ECP a ruptura do cito-esqueleto, levando ao arredondamento das clulas infectadas. Essas clulas podem ento formar sinccio ou morrer. A ocorrncia de ECP em amostras clnicas indica a presena de vrus no material; e o ECP tambm utilizado para a quantificao/enumerao viral em ensaios de placa. A infeco de clulas com alguns vrus (poxvrus e vrus da raiva) caracterizada pela formao de corpsculos de incluso citoplasmticos. Corpsculos de incluso so focos bem definidos que contm protenas e/ou partculas virais. Eles geralmente possuem localizao e aparncia bem determinadas, de acordo com o vrus. Transformao maligna Nesse processo, a infeco viral resulta em clulas caracterizadas por morfologia alterada, perda do controle do crescimento, propriedades biolgicas e/ou qumicas alteradas. Transformao maligna e neoplasia resultante podem ocorrer quando o genoma viral (ou parte) incorporado no genoma do hospedeiro ou quando produtos virais so oncognicos. Os vrus que causam transformao maligna so chamados vrus tumorais. Vrus de vrias famlias tm demonstrado possuir capacidade de transformar clulas. Os vrus tumorais no possuem propriedades em comum (tamanho, estrutura, composio) alm da capacidade de promover malignidade celular. A transformao maligna freqentemente caracterizada por alterao da morfologia celular. Isso inclui a perda da forma caracterstica e assuno de uma forma arredondada, refrtil como descrita para ECP. Isso o resultado de desagregao dos filamentos de actina e reduo da adeso de superfcie. Alterao no crescimento celular, o marco da transformao maligna, exibido em clulas que perdem a inibio de contato ou movimento, tem um reduzido requerimento por fatores de crescimento do soro e no respondem mais a sinais do ciclo celular. Algumas propriedades apresentadas por clulas malignamente transformadas incluem a sntese contnua de DNA, alteraes cromossomais, surgimento de novos antgenos de superfcie (ou antgenos embrionrios), e aglutinao aumentada por lectinas. Alteraes bioqumicas em clulas malignamente transformadas incluem nveis reduzidos de AMP cclico. AMP cclico o sinal qumico associado com o controle do ciclo celular e mantendo-se os nveis baixos a clula se divide. Tambm envolvidos esto a secreo aumentada do ativador do plasminognio (coagulao), fermentao para produo de cido ltico (efeito Warburg), perda de fibronectina e alteraes nos componentes carbohidratos das glicoprotenas e glicolipdios. Oncognese Embora provas da causa-efeito tenham sido difceis de obter, vrios vrus DNA e RNA tm sido associados com transformao neoplsica. Os vrus implicados em oncognese trazem consigo genes associados com crescimento celular e proliferao ou alteram a expresso da cpia celular do gene. Genes afetados incluem aqueles que estimulam e/ou inibem o crescimento celular. Os genes virais que transformam as clulas infectadas so chamados de oncogenes (v-onc genes), que estimulam a multiplicao e proliferao celular descontrolada. A descoberta dos oncogenes virais levou a outra descoberta: que as clulas contm genes anlogos, chamados proto-oncogenes (c-onc genes), que esto normalmente em repouso, mas que podem ser ativados em alguma fase do desenvolvimento celular. Proto-oncogenes celulares incluem genes que codificam fatores de crescimento, fatores de transcrio e receptores de fatores de crescimento. Vrus DNA envolvidos com oncognese incluem o vrus da doena de Marek (Herpesviridae) e os papilomavrus orais bovino, eqino e canino (Papillomaviridae). Esses vrus possuem genomas circulares epissomais (independentes do cromossoma celular, ao invs de integrados). Os oncogenes (v-onc) codificam protenas associadas com o ciclo replicativo do vrus.

52

Vrus RNA associados com oncognese incluem membros da famlia Retroviridae (e.g. vrus da leucose aviria e vrus da leucemia felina). Esses vrus integram seus genomas (ou uma cpia do genoma) no cromossoma da clula hospedeira, chamados de provrus ou DNA proviral. Integrao viral mediada pelas extremidades do genoma, chamados de LTRs (repeties terminais longas). Os LTRs contm promotores/enhancers, alm das seqncias envolvidas na integrao do provrus no genoma do hospedeiro. Os retrovrus podem causar oncognese codificando seus prprios oncogenes ou por alterao na expresso de oncogenes celulares ou proto-oncogenes causada pela insero do provrus no cromossoma celular prximo a esses genes. Ausncia de alteraes morfolgicas ou funcionais Algumas vezes, a infeco e produo de prognie viral podem ocorrer sem alteraes detectveis na clula hospedeira. Isso chamado de infeco endosimbitica. Isto provavelmente depende das necessidades replicativa de cada vrus. Muito provavelmente o vrus necessite funes celulares que j estejam ativas para a replicao e, portanto no necessita alterar funes da clula. Patogenia das infeces vricas Patogenia refere-se origem e mecanismos de produo das doenas. Infeces vricas podem ser agudas, crnicas, latentes ou persistentes. A primeira etapa no processo da doena a exposio. Exposio e transmisso A exposio pode ocorrer pelo contato direto com um animal infectado, por contato indireto com secrees/excrees de um animal infectado, ou atravs de vetores mecnicos ou biolgicos. Transmisso do vrus da me para a prognie (transplacentria, perinatal, colostro) chamada transmisso vertical. As outras formas de transmisso so chamadas de transmisso horizontal. A reativao de um vrus latente, no replicando, pode ocorrer em um indivduo sem necessidade de sofrer infeco do vrus de uma fonte de infeco externa. Porta de entrada (via de penetrao) Os vrus podem penetrar no hospedeiro atravs do trato respiratrio (gotculas em aerossis), trato digestivo (contaminao oro-fecal), trato gnito-urinrio (cpula, inseminao artificial), conjuntiva (gotculas em aerossis) e atravs de leses de pele (arranhes, agulhas, picadas de insetos). O estabelecimento ou no da infeco depende da capacidade do vrus encontrar e infectar clulas susceptveis. A susceptibilidade de um hospedeiro a um determinado vrus depende essencialmente de receptores celulares, que permitem a ligao e posterior internalizao do vrus. Infeces localizadas e sistmicas Aps a infeco, o vrus replica em tecidos prximos (ou no prprio) ao local de entrada (replicao primria). Alguns vrus permanecem confinados a esse local e produzem infeces localizadas. Um exemplo so os resfriados comuns de humanos e infeces semelhantes em animais causadas pelos rinovrus. Outros vrus produzem infeces disseminadas (sistmicas) pela disseminao a outros rgos pela via sangunea, linftica ou nervosa. A disseminao inicial de um vrus pelo sangue denominada de viremia primria. A viremia pode ocorrer com vrus livre no plasma ou por vrus associado clulas sanguneas. Aps replicao nesses rgos, pode haver mais uma etapa de viremia e disseminao aos rgos-alvo. Um bom exemplo de vrus que causa infeco sistmica o vrus da doena de Teschen de sunos (teschovrus suno 1). O vrus transmitido pela via fecal-oral. Inicialmente replica nas clulas das tonsilas e migra para o intestino e linfonodos mesentricos. Desses linfonodos, o vrus penetra em nervos e invade o sistema nervoso central (CNS). Uma vez no CNS induz sinais neurolgicos como ataxia, tremores, incoordenao, rigidez dos membros, convulses, paralisia e coma. A predileo de um vrus por determinado tecido ou tipo de clula denominada tropismo. Mecanismos de infeces virais A replicao viral nos rgos-alvo ocasiona leses celulares. O nmero de clulas infectadas/afetadas e a extenso das leses podem resultar em disfuno tecidual/orgnica e em manifestaes clnicas de doena. O intervalo entre a penetrao inicial do agente e o incio dos sinais clnicos denominado de perodo de incubao. O perodo de incubao curto em infeces nas quais o vrus replica na porta de entrada (exemplo: influenza) e mais longo nas infeces generalizadas (cinomose). Alguns vrus infectam

53

animais sem provocar qualquer sintomatologia clnica. Essas infeces so denominadas infeces subclnicas (assintomticas ou inaparentes). Existem numerosos fatores que podem influenciar o resultado de uma infeco viral. Esses incluem imunidade pr-existente, fatores genticos do animal, idade, fatores relacionados ao estresse (nutrio, alojamento, etc.). Os mecanismos de produo das doenas por vrus so muito complexos. A doena pode resultar dos efeitos diretos do vrus nas clulas do hospedeiro, como morte celular, ECP e transformao maligna. Alternativamente, a doena pode ser resultado da resposta fisiolgica e imunolgica do hospedeiro. Um exemplo de efeitos fisiolgicos indiretos a infeco por rotavrus, que causa diarrias em crianas e animais jovens. A diarria pode ser causada pela infeco de clulas eritrocticas que so estimulados a produzir citoquinas, levando a estimulao de neurnios intestinais e secreo excessiva de lquidos e eletrlitos na luz do intestino grosso. Um exemplo de resposta imunolgica mediando a patogenia de uma infeco viral a doena de Borna, em eqinos. O vrus dissemina-se do CNS para nervos perifricos atravs de axnios. O hospedeiro responde presena de neurnios infectados montando uma resposta imunolgica mediada por clulas. Macrfagos, neutrfilos e linfcitos T citotxicos especficos so ativados para destruir os neurnios infectados com o vrus de Borna. Isso resulta em inflamao crnica do CNS que leva a manifestao de sinais neurolgicos associados. Dois termos importantes utilizados na discusso de infeces por vrus e bactrias so patogenicidade e virulncia. Patogenicidade refere-se capacidade do vrus ou outro micrororganismo/parasita de causar doena. Virulncia refere-se ao grau de patogenicidade. Vrus avirulento aquele incapaz de causar doena. Um vrus atenuado aquele cuja capacidade de causar doena foi reduzida geralmente por mltiplas passagens em cultivo celular, ovos embrionados ou animais. Excreo viral A excreo o mecanismo utilizado para liberar a prognie viral do hospedeiro infectado com a finalidade de infectar novos hospedeiros e assim manter o vrus na populao de hospedeiros. Os vrus so excretados principalmente pelas aberturas e cavidades corporais. Em infeces localizadas, o vrus excretado no mesmo local utilizado para invadir o animal (a porta de entrada). Em infeces generalizadas, o vrus pode ser excretado por vrias vias. Nem todos os vrus so excretados pelos seus hospedeiros. Esses incluem alguns vrus que replicam no CNS, como em encefalites, e em hospedeiros terminais. Escape (evaso) do sistema imune Na tentativa de controlar ou eliminar a infeco, o hospedeiro inicia uma resposta inflamatria. Os principais componentes dessa resposta so os interferons, linfcitos T citotxicos, linfcitos B produtores de anticorpos, vrias molculas efetoras e o complemento. Esses componentes atuam em conjunto e sinergisticamente para tentar eliminar o vrus do organismo. Nesse esforo de eliminar o vrus, a resposta inflamatria pode causar muitas das leses e sinais clnicos observados nas infeces vricas. A resposta imunolgica do hospedeiro a vrus foi discutida anteriormente . Interferons ( e ) so produzidos por clulas infectadas pelo vrus. Eles atuam para impedir a continuao da replicao viral na clula infectada e nas clulas vizinhas. Os interferons tambm aumentam a expresso de antgenos virais nas clulas infectadas, facilitando o reconhecimento por linfcitos T citotxicos. Alguns vrus (adenovrus) produzem RNAs que bloqueiam a fosforilao de um fator de iniciao, reduzindo a capacidade do interferon em bloquear a replicao viral. Linfcitos T citotxicos destroem clulas infectadas por vrus atravs da liberao de perforinas, que produzem poros na clula infectada. As granzimas so ento liberadas dentro da clula infectada, induzindo a degradao de componentes celulares. Finalmente, os linfcitos T citotxicos induzem apoptose das clulas hospedeiras infectadas. Alguns vrus reduzem a expresso de antgenos do MHC classe I (MHC-I) na superfcie das clulas hospedeiras (citomegalovrus, herpesvrus bovino tipo 1, adenovrus). Como os linfcitos T citotxicos no so capazes de detectar antgenos virais que no estejam associados ao MHC-I, as clulas infectadas no so detectadas e no so destrudas, permitindo ao vrus persistir no hospedeiro. No entanto, clulas com expresso reduzida ou nula do MHC-I podem ser reconhecidas pelas clulas natural killer (NK), que as destroem de maneira similar aos linfcitos T citotxicos. Linfcitos B secretam de anticorpos especficos que neutralizam os vrions quando so estes liberados das clulas. Os complexos antgeno-anticorpo, por sua vez, pode ativar o sistema complemento.

54

O complemento auxilia na resposta, estimulando a inflamao e a neutralizao/inativao viral e destruio de clulas infectadas. As vrias molculas efetoras (citocinas) que so produzidas por clulas do sistema imunolgico desempenham mltiplas funes, incluindo a induo de febre e atrao de clulas inflamatrias (neutrfilos e macrfagos) ao local de injria tecidual. Alguns vrus expressam protenas homlogas aos receptores de citocinas (o vrus vaccnia expressa e liberam receptores para a interleucina 1 (Il-1), que estimula a febre). Quando as clulas do sistema imunolgico produzem IL-1, grande parte dessa liga-se ao vrus. Isso reduz a quantidade da Il-1 disponvel para mediar seus efeitos biolgicos. Isso contribui para aumentar o tempo de sobrevivncia do vrus no hospedeiro. Outro mecanismo para escapar do sistema imune possuir vrios tipos antigenicamente diferentes (sorotipos). Uma resposta imunolgica contra um sorotipo no protege necessariamente contra outros sorotipos do mesmo vrus. Por exemplo, existem mais de 100 sorotipos diferentes do rinovrus e 24 sorotipos do vrus da lngua azul. Infeces virais persistentes Alguns vrus possuem a habilidade de resistir a resposta imunolgica do hospedeiro e produzir infeces persistentes. Isso pode ser obtido por vrios mecanismos, incluindo a destruio de linfcitos T causando imunossupresso, o escape de vigilncia imunolgica atravs da alterao dos antgenos de superfcie e a inibio da produo de interferon. Existem trs tipos clnicos principais de infeces persistentes: Infeces crnicas Os hospedeiros produzem e excretam grandes quantidades do vrus continuamente, por um longo perodo. Como conseqncia, o vrus pode ser continuamente transmitido a outros indivduos. Alguns portadores crnicos so assintomticos ou manifestam sinais leves da doena. Exemplos so a infeco pelo vrus da arterite viral eqina, panleucopenia felina e poliomavrus avirio. Infeces latentes Nesse tipo de infeco, o vrus mantido no hospedeiro em uma forma no-produtiva. Os herpesvrus so os exemplos mais clssicos. O genoma viral mantido em neurnios sob uma forma circular fechada periodicamente reativado (geralmente sob condies de estresse) resultando em replicao produtiva e excreo viral. Infeces latentes tambm ocorrem com retrovrus nos quais o genoma integrado no genoma da clula hospedeira. Transformao celular e malignidade podem resultar se a integrao do transcrito viral causa alteraes do controle do ciclo celular. Infeces por vrus lentos Esse termo refere-se s infeces cujos perodos entre a infeco e o inicio da doena so muito longos. Nesses casos, a replicao viral no lenta, mas o perodo de incubao e a progresso da doena sim. Um exemplo a panencefalite esclerosante subaguda, que se desenvolve vrios anos aps a infeco com o vrus do sarampo (paramixovrus). A encefalite do co velho, devida recrudescncia do vrus da cinomose, parece ser uma condio semelhante. Glossrio Antgeno: Substncia, geralmente exgena ao organismo mas ocasionalmente em seu interior -, que o sistema imune reconhece como estranha ou no-prpria. Quando reconhecida induz uma resposta de anticorpos especficos contra ela. Apoptose: Uma forma de morte celular programada, caracterizada por fragmentao do DNA nuclear. Citocinas: Um grupo diverso de protenas pequenas (<30 kilodaltons) solveis, produzidas pelos leuccitos e que mediam vrias funes na resposta imunolgica. Linfcitos T citotxicos: Clulas que reconhecem fragmentos de protenas virais associados com molculas do MHC-I. So apenas efetivos para matar clulas que contm antgenos estranhos. Endosimbitica: Forma de simbiose na qual um organismo vive no interior de outro. Granzimas: Um grupo de proteases de serina, que penetram na clula-alvo atravs dos poros na membrana produzidos pelas perforinas, onde interagem com mecanismos celulares e mediam degradao de DNA e apoptose.

55

Interferons: Compreendem trs tipos de protinas (alfa, beta e gama). Todas as trs formas possuem ao inespecfica contra vrus, mas os IFNs alfa e beta so mais potentes. Interleucinas: Um grupo de citocinas produzidas por clulas efetoras do sistema imunolgico e que atuam em outras clulas efetoras da resposta imunolgica. Lectinas: Glicoprotenas de plantas que ligam-se especificamente em certos acares, alguns dos quais presentes na superfcie das clulas. Macrfagos: So os principais fagcitos dos tecidos, rgos e membranas serosas como a pleura e peritnio. Antgenos do MHC classe I (MHC-I) (complexo maior de histocompatibilidade): Conjunto de genes que codificam protenas marcadoras-prprias ou antgenos de incompatibilidade. Esses antgenos esto presentes na superfcie de todas as clulas do organismo e servem para identific-las como prprias e no estranhas ao organismo. Alguns tipos de antgenos do MHC esto presentes na superfcie de clulas do sistema imune. A regio dos genes do MHC em humanos chamada de HLA (human leucocyte antigen) est localizada no cromossomo 6. Clulas naturalmente assassinas (natural killer, NK): Linfcitos com atividade citotxica, que compreendem aproximadamente 5 a 15% dos linfcitos circulantes, e no possuem os marcadores de linfcitos B e T. Possuem a capacidade de destruir certas clulas tumorais e clulas infectadas por vrus, que no apresentam molculas de MHC na superfcie celular e o mecanismo de destruio semelhante ao utilizado pelos linfcitos T citotxicos. Neutrfilos: So clulas fagocticas de vida curta que contm grnulos com compostos bactericidas no seu interior; so os mais numerosos dos leuccitos circulantes (aproximadamente 60 a 70% em humanos). Microscopicamente, possuem um ncleo com forma irregular, bi- ou tri-lobulado, so tambm chamados leuccitos polimorfonucleares (PMNs). Perforinas: So protenas formadoras de poros que requerem a presena de clcio para polimerizar e formar canais que atravessam a membrana plasmtica das clulas alvo. Direiros reservados: este documento est disponvel em www.ivis.org. Documento nm. A3404.0205.PT

56

PATOGENIA DAS VIROSES (TEXTO ORIGINAL DO POLGRAFO) Entende-se por patogenia (pato= doena; genia = gerao): o mecanismo pelo qual um agente leva ao desenvolvimento de determinada doena. Em virologia, o estudo da patogenia das viroses importante para descobrir o mecanismo pelos quais os vrus atacam o hospedeiro e causam enfermidade. O conhecimento da patogenia das infeces permite, por exemplo, facilitar a busca de novos mtodos de preveno (como novas vacinas) e tratamento (como novos quimioterpicos). Patogenicidade: refere-se ao potencial de alguns microorganismos de causarem danos com maior ou menor gravidade em seus hospedeiros. A grande maioria dos vrus so apatognicos. Na gua do mar: at 107 partculas virais por ml. No solo, idem. No so virulentos, no causando quaisquer danos ao hospedeiro durante um processo infeccioso.

Portanto, observe: os vrus so capazes de causar infeces, muitas vezes independente do fato de causarem doena. Os vrus podem apresentar variantes ou amostras mais ou menos patognicas. Ex: gripe verdadeira ou Influenza: Trs vrus distintos (A, B e C): porm as grandes pandemias tm sido sempre causadas por amostras do vrus do tipo A. O tipo A, portanto, mais patognico do que os vrus B e C. Existem tambm amostras de vrus completamente apatognicas: o caso de algumas amostras de vrus da Peste Suna Clssica, um vrus de tremenda importncia na suinocultura, e os reovrus, que nfectam o homem e diversas outras espcies. Amostras de vrus de baixa ou moderada patogenicidade so tambm chamadas amostras atenuadas. Muitas destas amostras so utilizadas como vacinas. Estas vacinas so chamadas vacinas com vrus vivo modificado, ou vrus vivo atenuado. Ex: vacina contra a varicela, contra a varola (no mais usada). As amostras atenuadas, de baixa ou nenhuma patogenicidade, ocorrem na natureza. No entanto, podem tambm ser criadas em laboratrio. Os mtodos tradicionais de obteno de amostras atenuadas incluem sucessivas passagens em cultivos celulares, ou passagens em clulas ou hospedeiros diferentes do hospedeiro natural, cultivos em temperaturas diferentes. A vacina contra a raiva do tipo Flury (o nome refere-se pessoa de quem a amostra foi isolada), no passado largamente utilizada para a imunizao de animais, foi atenuada por sucessivas passagens em ovos embrionados. Por outro lado, a amostra Bartha do vrus da Doena de Aujeszky dos sunos (ou Pseudorraiva) contm uma deleo naturalmente adquirida. Variaes na virulncia ou patogenicidade das amostras so um reflexo do processo natural de evoluo, que nos vrus acelerado por sua composio simples, pelo tamanho diminuto de seu material gentico e pela ausncia de enzimas de reparo durante a multiplicao do genoma. Durante a multiplicao viral so geradas quantidades incalculveis de genomas com pequenas mutaes. As caractersticas antignicas e genotpicas de um vrus so determinadas por aqueles que ocorrem em maior nmero. O conceito de quasispcies, ou seja, de que as populaes virais so representativas de uma populao onde determinado gentipo ocorre com maior frequncia, ser abordado no captulo sobre multiplicao viral.

57

TRANSMISSO A transmisso de infeces virais pode se dar: a) de pessoa a pessoa; b) de animal para animal; c) de animal para animal, porm com envolvimento eventual de pessoas (zoonoses); d) atravs de vetores artrpodos, eventualmente envolvendo pessoas ou animais. As maneiras de transmisso de viroses podem ser definidas como segue: 1- Contato ou Contgio (contagioso= que pode ser adquirido por contato), que pode ser subdivivido em: contato direto (ex. quando o vrus transmitido diretamente de um indivduo infectado para outro) e contato indireto (quando o vrus transmitido atravs de fmites, objetos, gua, alimentos ou locais contaminados, sem haver contato direto entre o indivduo infectado e aquele que vai ser infectado). Muitas vezes formas simples de transmisso de infeces passam depercebidas. Tomemos como exemplo os resfriados, que so transmitidos essencialmente de duas formas: atravs de aerossis gerados por espirros (pelo ato de assuar o nariz, ou expelir ar com
fora para eliminar o muco, ou ainda pela fala, que geram partculas de muco ou perdigotos)

contendo vrions, ou ainda atravs do contato com mos contaminadas. Portanto, um espirro incontido, ou um aperto de mo, podem ser responsveis pelo seu prximo resfriado! Cabe aqui um outro comentrio de carter scio-epidemiolgico: Os agrupamentos de indivduos facilitam a transmisso de infeces. Assim, so comuns infeces que se alastram em grupos de estudantes, em excurses e outras atividades que requeiram a formao de grupos.

Em animais mantidos em confinamento a transmisso de infeces facilitada. Por isso, aves criadas em avirios modernos, sunos, ces mantidos em canis, bovinos confinados e quaisquer outros grupos de animais devem ser mantidos sob rgido controle sanitrio. .

Didaticamente, poder-se-ia incluir como uma forma de transmisso por contato a transmisso de infeces por via placentria, onde ocorre o evidente contato entre a me e o novo indivduo que est sendo gerado. Este tipo de transmisso chamado de transmisso vertical, isto , aquela que ocorre por via placentria (ex. rubola e citomegalovirose em humanos; parvovirose em sunos; pestivrus em bovinos e sunos). Normalmente, infeces transmitidas por via placentria so tambm transmitidas por alguma outra forma de contgio na vida extra-uterina. Infeces transmitidas aps o nascimento so ditas infeces de transmisso horizontal. Nas infeces virais, a transmisso horizontal a forma mais comum de contgio. Felizmente, nem todos os vrus cruzam a barreira placentria. Alguns, como os citados acima, so notrios por essa capacidade.

58

O resultado da infeco fetal pode variar de acordo com uma srie de variveis, que vo desde o tipo e virulncia da amostra de vrus, at o momento exato da gestao em que ocorre a infeco fetal. PENETRAO NO ORGANISMO: O incio do processo infeccioso: requer adsoro a clulas com receptores que permitam sua penetrao. Isto se d atravs das portas de entrada do organismo, representadas usualmente pela pele e mucosas. A maioria dos virus ingressa nos hospedeiros atravs da pele ou membranas mucosas do sistema respiratrio e trato digestivo. Uma pequena parcela das infeces: inicia no trato urogenital e conjuntiva. Outras infeces: necessitam que algo seja capaz de romper a pele, uma das mais poderosas barreiras contra infeces, para dar incio ao processo infeccioso. Enquanto intacta, a pele impermevel maioria dos microorganismos. Uma vez rompida ou perfurada (p.ex. atravs de cortes, injees ou picadas de insetos) estes agentes conseguem penetrar no hospedeiro e dar incio infeco (ex.: Hepatite B, a AIDS e a Febre Amarela). Via de regra, os vrus penetram no organismo por uma das seguintes formas: 1- Inalao Ocorre quando o agente aspirado juntamente com o ar. Nesses casos, o vrus pode encontrar-se suspenso no ar, em gotculas aerossolisadas, ou na poeira suspensa por movimentos do ar. Exemplos: infeces virais respiratrias (rinovrus, adenovrus), hantavrus. 2- Ingesto O trato gastrointestinal (TGI) fornece grande resistncia a infeces. Poucos so os microorganismos capazes de resistir ao ambiente gastrointestinal: Enterovrus (vrus da poliomielite ou Paralisia Infantil, os vrus das Hepatites A e E) so transmitidos por ingesto, a partir de gua ou objetos (fmites) contaminados. A parte superior do TGI, incluindo a boca e o faringe, so as partes mais expostas do sistema, mas as mucosas apresentam caractersticas especiais para combater infeces. Alm dos epitlios de revestimento e das enzimas presentes na saliva (que podem inibir alguns vrus por sua ao proteoltica), h a imunoglobulina A (IgA) secretria, que atua sobre os vrus e pode inclusive neutraliz-los. Um grande nmero de infeces virais, em seus estgios iniciais de multiplicao, envolvem as amgdalas ou tonsilas. Estes rgos linfides, por sua localizao anatmica, so freqentemente utilizados como stio primrio de multiplicao de vrus. Exemplos: rubola, cachumba, polio. Animais: peste suna clssica, diarria viral bovina. O esfago raramente stio primrio de multiplicao dos vrus. O estmago, com seu pH extremamente cido, igualmente desfavorece a instalao de vrus. Na verdade, a passagem atravs deste rgo exige que os agentes infecciosos tenham acentuada resistncia a pH cido (Ex: rotavrus). Aps o pH estomacal, os vrus, a seguir, tem que submeter-se ao pH alcalino do intestino, presena de fagcitos, enzimas proteolticas inibidoras de vrus, bile,

59

detergentes intestinais, e - alm disso tudo - a uma nova bateria de anticorpos IgA secretrios. Caso todas essas barreiras sejam suplantadas, aqueles vrus que se multiplicam nas clulas intestinais - ou que utilizam estas clulas como stio de multiplicao primria - podero dar incio a seu ciclo replicativo. 3- Inoculao Vrias so as formas de inoculao de agentes, muitas delas provocadas pelo prprio hospedeiro. Picadas de insetos configuram um importante mtodo de penetrao viral, pois durante a sua alimentao os vetores (mosquitos, pulgas, carrapatos) inoculam os vrus diretamente na corrente sangunea do hospedeiro, processo esse denominado transmisso mecnica. o caso das arboviroses (isto , viroses transmitidas por atrpodos). Alguns vrus, alm de serem mecanicamente transmitidos, podem desenvolver parte de seu ciclo replicativo no inseto (ex. febre amarela). A inoculao percutnea (isto , atravs da pele, como em injees e transfuses)via injees tambm uma via extremamente eficaz de infeco. Incluem-se aqui os usurios de drogas injetveis, bem como procedimentos mdicos que requerem transfuses e quaisquer outros que possibilitem contato com sangue ou outros produtos infectados.

MULTIPLICAO E DISSEMINAO NO HOSPEDEIRO Mecanismos de distribuio do vrus no organismo Em muitos casos, os vrus se multiplicam diretamente na porta de entrada. Ex: vrus que atacam epitlios (ex. Herpes Simples, Papilomavrus) e vrus que afetam o trato respiratrio (ex. Influenza, Rinovrus e Adenovrus). Usualmente permanecem confinados exclusivamente a estas superfcies, com um mnimo de penetrao nos tecidos. Alm do contato clula-clula, estes vrus podem ser levados a outros stios mais distantes no aparelho respiratrio pelo prprio muco que irriga as mucosas. Nesses casos, o agente usualmente no se dissemina pelo corpo do indivduo infectado. Outros vrus so capazes de estabelecer uma infeco localizada e a partir da se disseminar por todo o organismo (ex. varola), causando sinais clnicos em locais diferentes daquele usado como porta de entrada. Nesses casos (infeces sistmicas) passam por um perodo de multiplicao inicial, localizada, para posteriormente distribuir-se pelo organismo infectado, como segue. Infeces sistmicas: Uma vez vencida a barreira representada pelos epitlios (pele ou mucosas), o vrus exposto s clulas de defesa do organismo. Caso haja leso tecidual, ocorre reao inflamatria. Os capilares se tornam mais permeveis ou se rompem, com o extravasamento de citocinas, moncitos e linfcitos. Clulas polimorfonucleares e macrfagos teciduais (clulas de Langerhans) tentaro destruir o vrus invasor. Se o vrus for destrudo, seus componentes sero processados por clulas da linhagem macrofgica (denominadas clulas apresentadoras de antgeno, ou APCs) e que levaro estes componentes virais para apresent-los a outros componentes do sistema imune. Por outro lado, alguns vrus se multiplicam dentro dessas clulas e as utilizam para sua disseminao. Assim, a clula contendo o vrus (ou seus antgenos processados) ir ao linfonodo que drena a regio infectada. Tendo atingido o linfonodo, o vrus poder, via circulao linftica, atingir a circulao sangunea (o que se chama viremia primria) e espalhar-se por todo o organismo, seja dentro de

60

macrfagos e/ou moncitos (ex.: HIV, Mononucleose Infecciosa, Citomegalovirose, Diarria Viral Bovina), seja circulando livremente no plasma (ex: Diarria Viral Bovina; Hepatites B, C, e Delta, parvovrus), ou mesmo, embora mais raramente, adsorvidos a eritrcitos (como o vrus da Peste Suna Africana), ou plaquetas (vrus da Coriomeningite Linfoctica dos camundongos). Aps esta viremia inicial, a qual freqentemente passa despercebida, ocorre uma viremia secundria, onde um grande nmero de partculas virais encontrado em circulao. Como conseqncia desse nvel maior de viremia, os vrus distribuem-se nos rgos-alvo do indivduo em maior quantidade.

INFECO E DISSEMINAO DE INFECES VIRAIS Infeco => superfcies do organismo (ou inoculao) => linfonodos=> viremia primria=> rgos => viremia secundria=> rgos "alvo". (Modificado a partir de: Mims C.A. & White D.O.(1984) Viral pathogenesis and Imunology. Blackwell, 1984) Infeces do sistema respiratrio: A contaminao do trato respiratrio se d usualmente pela inalao de gotculas de secrees de indivduos contaminados (por aerossis contendo gotculas que carregam vrions), hbitos sociais (beijos, cumprimentos com as mos). Mos: podem levar auto-inoculao por contato com olhos, narinas, ou abrases.

Para combater essas infeces, as principais defesas do sistema respiratrio so os macrfagos e um tapete de epitlio ciliado, recoberto por muco. Estes possuem a funo de varrer a superfcie de todo o epitlio respiratrio, retirando corpos estranhos que se encontrem na superfcie da mucosa respiratria. Entretanto, mudanas no padro normal de limpeza destes epitlios podem levar a um desequilbrio, com conseqente aumento da suscetibilidade a infeces. Tais mudanas podem ocorrer, por exemplo, por fatores ambientais (mudanas de temperatura, variaes de umidade do ar), uso de agentes lesivos mucosa (p.ex. fumo, inalao de drogas), ou alergias respiratrias. Caso o vrus esteja presente no epitlio, poder ser desencadeada uma nova infeco. Infeces do sistema nervoso: Os vrus so capazes de causar infeces no sistema nervoso, o fazem ou via corrente sangunea, por via linftica, ou ainda por via neuronal, trafegando no interior de neurnios. Um exemplo tpico desse ltimo caso o vrus da raiva, que trafega via neurnios at atingir o sistema nervoso central. Outro exemplo importante (e freqente) so as infeces por herpesvrus, que podem estabelecer latncia em gnglios nervosos. APARELHO UROGENITAL So poucos os vrus que afetam diretamente o prprio trato urogenital. Mesmo assim, este tambm apresenta seus mecanismos de defesa. A uretra freqentemente lavada com urina estril, remoendo mecanicamente os potenciais invasores. Na vagina, populaes de lactobacilos comensais acidificam o meio, dificultando assim o ataque por determinados vrus. Na verdade, como no estmago, poucos so os vrus capazes de resistir a pH to cido.

61

O prprio HIV, se no contasse com a proteo fornecida pelo efeito tamponador dos lquidos seminais, seria rapidamente inativado se exposto diretamente ao pH vaginal. Outro exemplo, o Herpes Simples Humano tipos I e 2 e os Papilomavrus. Igualmente, os Poliomavrus (BK e JC), os quais so normalmente transmitidos via trato respiratrio; subsequentemente instalam-se nos tbulos renais e ureteres e estabelecem uma infeco latente, onde apesar da presena do genoma viral, no ocorre a produo de vrus infeccioso. Em algumas situaes (gestao, imunodeficincias, administrao de drogas imunossupressoras) estes vrus podem ser reativados e disseminados em grandes quantidades pela urina. Outro exemplo o citomegalovrus (um betaherpesvrus), o qual tambm estabelece uma infeco latente, porm em clulas linfides. Por ocasio da gestao, o vrus eliminado na urina em cerca de 10-15% das gestantes normais, bem como em grande quantidade na urina de crianas infectadas congenitamente. CONJUNTIVA A conjuntiva protegida pelas secrees das glndulas lacrimais e constantemente lavada por essas secrees, atravs do movimento das plpebras. Atravs dessas secrees e do movimento palpebral, os microorganismos so removidos via ductos lacrimais, indo ter cavidade nasal ou trato digestivo. No obstante, alguns vrus so capazes de causar infeco via conjuntiva, uma vez que receptores presentes na mucosa conjuntival so capazes de permitir sua adsoro e subsequente multiplicao. Esse o caso dos rinovrus, principais agentes causadores de resfriados, bem como dos adenovrus. Estes ltimos podem inclusive causar infeces oculares que podem assumir propores epidmicas, como o caso da conjuntivite hemorrgica, enfermidade que ocasionalmente se manifesta na forma de epidemias, em nosso meio. Muito comumente, as pessoas se auto-inoculam com microorganismos atravs do contato direto das mos com a conjuntiva ocular. Se a pessoa houver tocado as mos de algum contaminado, a transmisso pode se efetivar novamente... A seguir, apresentada uma tabela com as caractersticas mais marcantes da infeces localizadas, em comparao co infeces generalizadas ( ou sistmicas). Tabela. COMPARAO ENTRE DOENAS VIRAIS AGUDAS LOCALIZADAS OU SISTMICAS.(*) Infeces localizadas Infeces sistmicas

________________________________________________________________ Local da patologia Perodo de incubao Viremia Imunidade Papel da IgA secretria Importante Usualmente pouco importante Porta de entrada Curto Ausente Varivel Distante da porta de entrada Mais longo Presente Usualmente longa

__________________________________________________________________________ (*) Modificado a partir de Brooks GF, Butel JS & Ornston LN: Jawetz, Melnick & Adelbergs Medical Microbiology, Lange, 1995.

62

Diagnstico laboratorial de infeces vricas

In: A Concise Review of Veterinary Virology, Carter G.R., Wise D.J. and Flores E.F. (Eds.). International Veterinary Information Service, Ithaca NY (www.ivis.org), Last updated: 3-Mar-2005; A3407.0305.PT D.J. Wise1, G.R. Carter2 and E. F. Flores3
1

Department of Biology, Concord University, Athens, West Virginia, USA. Virginia-Maryland Regional College of Veterinary Medicine, Virginia Tech, Blacksburg, Virginia, USA. 3 Department of Veterinary Preventive Medicine, Federal University of Santa Maria, Santa Maria, RS Brazil.
2

Traduzido por: E. F. Flores, Department of Veterinary Preventive Medicine, Federal University of Santa Maria, Santa Maria, RS Brazil. (14-Dec-2005). ndice Mtodos diagnsticos Isolamento viral Neutralizao viral Testes de proteo Coleta e remessa de amostras Glossrio

Mtodos diagnsticos Os mtodos bsicos de diagnstico virolgico so o isolamento viral, deteco de vrus ou de produtos virais em amostras clnicas (mtodos diretos); e deteco e quantificao de anticorpos anti-virais especficos (mtodos indiretos). Cada mtodo possui seus mritos, mas a demonstrao direta do vrus e/ou de produtos virais o mtodo mais efetivo e til para diagnstico de rotino. Mtodos de demonstrao (diretos) Os mtodos diretos incluem a visualizao dos vrions por microscopia eletrnica, deteco do genoma viral atravs de sondas de DNA e deteco de antgenos virais por imunofluorescncia. Esse ltimo mtodo tem sido o mais util em laboratrios de diagnstico. Mtodos sorolgicos gerais Nos estgios tardios da infeco, a pesquisa de anticorpos especficos no soro pode ser o nico mtodo possvel de diagnstico. Isso pode ser feito por vrias tcnicas sorolgicas. As tcnicas mais utilizadas em laboratrios de diagnstico so a soro-neutralizao (SN), inibio da hemaglutinao (HI), imunodifuso em gel de gar (IDGA) e testes imunoenzimticos (ELISAs). Esses mtodos baseiam-se no fato de que a atividade viral pode ser inibida e/ou protenas virais so ligadas por anticorpos especficos. Diluies do soro so testadas e os resultados so expressos como a recproca da maior diluio do soro na qual a atividade antiviral pode ser detectada. De maneira ideal, resultados do teste de amostras coletadas na fase convalescente devem ser comparados com resultados de amostras coletadas na fase aguda da infeco (duas coletas, 14 a 21 dias de intervalo). O diagnstico positivo se ocorrer um aumento igual ou superior a quatro vezes nos ttulos de anticorpos entre as amostras pareadas. Os resultados de uma nica coleta (no-pareada) e teste so mais difceis de ser interpretados. Para os vrus que produzem infeces agudas auto-limitantes, testes positivos indicam apenas uma exposio prvia ao agente, devido infeco natural ou vacinao. A interpretao pode ser facilitada pelo teste de um grupo de animais que estiveram doentes comparando-se com um grupo que no apresentou a doena, pois ttulos mais altos geralmente so indicativos de refletem infeco recente. Para os vrus que produzem infeces persistentes ou latentes (exemplos: herpesvrus e retrovrus), sorologia positiva indica que o animal um portador potencial do agente. Resultados positivos de testes obrigatrios oficiais so sempre significativos independentemente do ttulo de anticorpos. Por essa razo, outros testes de padronizao mais fcil, na forma de kits, foram desenvolvidos. Exemplos so o teste de imunodifuso em gel de gar (IDGA), tambm conhecido como teste de Coggins, para anemia infecciosa eqina e ELISA e aglutinao em ltex (LA) para doena de Aujeszky.

63

Os resultados desses testes so considerados simplesmente positivos ou negativos. Uma discusso sobre as diferentes tcnicas diagnsticas apresentada a seguir nesse captulo. Isolamento viral Uso: isolamento e identificao de vrus. A fase aguda da doena a melhor fase para se demonstrar e se isolar o vrus. Com a progresso da doena ocorre a produo de anticorpos, o que reduz a excreo viral e reduz ou elimina o vrus dos tecidos. As manifestaes clnicas da doena geralmente direcionam a escolha do material clnico apropriado para o diagnstico, como secrees nasais e oculares no caso de infeces do trato respiratrio superior; fezes em infeces entricas, sangue em infeces sistmicas, etc. Os vrus requerem clulas vivas para replicar. No laboratrio, clulas vivas so utilizadas em forma de cultivos celulares, cujas clulas so obtidas por digesto enzimtica de tecidos animais. As clulas so cultivadas em superfcie/frascos de vidro ou plstico. Quando amostras clnicas contendo vrus so inoculadas em clulas susceptveis, o vrus (se vivel) replica e produz patologias celulares que se caracterizam por alteraes morfolgicas nas clulas, denominadas genericamente de efeito citoptico (ecp). Em alguns casos, o vrus replica sem induzir patologia celular e a demonstrao de sua presena requer o uso de tcnicas de deteco de antgenos ou corpsculos de incluso por imunofluorescncia (IF). O tempo necessrio para se isolar um vrus varia entre menos de 24 horas at vrias semanas. Imunofluorescncia (IF) Uso: deteco de antgenos virais em amostras clnicas ou em clulas de cultivo infectadas. O teste de imunofluorescncia (IF) detecta antgenos virais em clulas infectadas utilizando anticorpos anti-virais especficos marcados com uma substncia fluorescente (isotiocianato de fluorescena, FITC). Testes de IF podem ser realizados em cortes congelados de tecidos, esfregaos sanguneos, impresses de tecido ou em clulas de cultivo. Os resultados podem ser obtidos em menos de 1 hora e so confiveis desde que o anticorpo utilizado seja especfico e as amostras estejam em boas condies. Existem dois tipos principais de imunofluorescncia: direta (IFD) e indireta (IFI). No mtodo direto, o anticorpo anti-vrus marcado. O anticorpo marcado usado para detectar antgenos virais em cortes de congelamento, esfregaos sanguneos, raspados, etc... A tcnica indireta (IFI) realizada em duas etapas. A amostra a ser testada inicialmente incubada com um anticorpo anti-viral no-marcado. Aps um determinado perodo de incubao para que ocorra a ligao anticorpo-antgeno (geralmente 1 hora ou menos), a preparao lavada e ento incubada com um anticorpo anti-espcie do anticorpo primrio, marcado com FITC. O anticorpo anti-espcie ir se ligar no anticorpo anti-viral no-marcado, e se isso ocorre, emitir luz fluorescente considerando-se o resultado como positivo. Ambas as tcnicas (IFD e IFI) possuem vantagens e desvantagens. A IFD mais rpida e mais utilizada principalmente pela disponibilidade de conjugados. A tcnica indireta (IFI), por outro lado, mais sensvel e mais especfica (se anticorpos monoclonais so utilizados); mais demorada mas requer apenas um tipo de anticorpo marcado com FITC se todos os anticorpos anti-virais foram preparados na mesma espcie. A IF a tcnica mais utilizada no diagnstico virolgico de rotina. Um grande nmero de conjugados est disponvel comercialmente para a deteco de uma grande variedade de vrus. Conjugados para a deteco de vrus de caninos e felinos so disponveis no comrcio. Uma variao da tcnica pode ser utilizada para a deteco e quantificao de anticorpos. Essa tcnica envolve a infeco de cultivos celulares com um vrus e a preparao de lminas de microscopia multipost com essas clulas infectadas. O soro pode ser testado para a presena de anticorpos especficos incubando-se com as clulas infectados, seguido da adio de um anticorpo contra IgG da espcie do soroteste, conjugado com FITC. A emisso de fluorescncia pelos spots de cultivos indica que a amostra positiva para anticorpos anti-virais especficos. Imunoperoxidase Uso: deteco de antgenos virais em amostras clnicas ou em clulas de cultivo. O princpio da tcnica de imunoperoxidase muito semelhante ao da imunofluorescncia. A diferena que o anticorpo conjugado com uma enzima (peroxidase ou fosfatase alcalina) ao invs de fluorescena. Embora a enzima esteja conjugada ao anticorpo, ela permanece ativa e, quando entra em contato com um substrato, age sobre este, resultando em mudana de cor. Essa tcnica possui a vantagem sobre a IF

64

de no necessitar microscpio de fluorescncia e especialmente til para a deteco de antgenos virais em leses histopatolgicas. Ensaios imunoenzimticos (ELISAs) Uso: deteco de antgenos ou anticorpos. A sensibilidade dos testes de ELISA equivalente do radioimunoensaio (RIA), que e similar em princpio. Um sistema de fase slida utilizado na maioria dos testes de ELISA. Para a deteco de vrus, os anticorpos especficos so inicialmente imobilizados na superfcie de tubos ou placas de poliestireno e a amostra-teste contendo o vrus suspeito ento adicionada. Se o vrus est presente, ir se ligar nos anticorpos adsorvidos. Aps lavagem, anticorpos anti-virais especficos conjugados com uma enzima (peroxidase ou fosfatase alcalina) so adicionados. Os anticorpos conjugados reagem com o complexo anticorpo-antgeno originando um efeito "sanduche". Aps nova lavagem, o substrato da enzima adicionado, resultando na produo de colorao. Alguns testes podem ser visualizados e interpretados visualmente, mas a anlise por espectrofotmetro aumenta a sensibilidade. Um teste ELISA indireto utilizado para a deteco de anticorpos. O antgeno inicialmente imobilizado no suporte slido, seguido da adio do soro-teste. Aps lavagem, um anticorpo antiimunoglobulina conjugado com a enzima adicionado, seguido de adio do substrato da enzima. Variaes do teste ELISA incluem o ELISA competitivo para a deteco de anticorpos, no qual o anticorpo anti-imunoglobulina conjugado com a enzima substitudo por um anticorpo anti-viral conjugado com a enzima. A intensidade da colorao desenvolvida pelo substrato inversamente proporcional ao nvel de anticorpos presentes na amostra-teste. Em outras palavras, se o anticorpo especfico se ligou, o anticorpo conjugado com a enzima no ir se ligar. Portanto, resultados positivos so aqueles em que no ocorre desenvolvimento de colorao no substrato ou a colorao menos intensa do que nos controles negativos. Outra variao o ELISA de cintica, utilizado para a deteco de anticorpos contra o agente da doena de Lyme em ces, vrus da leucemia felina, peritonite infecciosa felina, toxoplasmose felina e herpesvrus bovino tipo 1 (BHV-1). No ELISA de cintica, a reao monitorada continuamente durante um certo perodo, ao invs de ser interrompida aps um certo tempo de incubao. Testes imunoenzimticos do tipo ELISA e aglutinao em ltex (LA) detectam antgenos virais capturando-os atravs de anticorpos especficos adsorvidos em suportes apropriados. Essas tcnicas permitem um diagnstico rpido e so freqentemente disponveis para uso em consultrios e clnicas. Kits comerciais incluem ELISAs e kits LA para a deteco de rotavrus em fezes de vrias espcies animais, e kits de ELISAs rpidos para a deteco de parvovrus canino em fezes e antgenos do vrus da leucemia felina no sangue. Aglutinao em ltex (LA) Uso: deteco de antgenos ou anticorpos. Os testes de LA possuem um princpio semelhante aglutinao bacteriana na qual partculas de ltex recobertas com anticorpos aglutinam-se quando misturadas com o antgeno correspondente, identificando-o. Alternativamente, as partculas de ltex podem ser recobertas com antgenos para a deteco de anticorpos. Esses testes so de fcil execuo e permitem a obteno dos resultados em minutos. Kits comerciais para uso em clnicas so disponveis para a deteco de anticorpos para algumas doenas e tambm para a deteco de alguns vrus. Microscopia eletrnica (ME) Uso: demonstrao de vrus em amostras clnicas. Na tcnica de ME sob colorao negativa, preparaes solubilizadas em gua destilada de amostras clnicas so "coradas" com uma soluo de tomos pesados. Essa tcnica primariamente utilizada para o exame de amostras clnicas suspeitas de conter um grande nmero de partculas virais, como fezes (coronavrus, rotavrus e parvovrus), leses vesiculares e de leses de "pox" (herpesvrus e poxvrus). A preparao e o exame da amostra por ME podem ser completados em menos de 30 minutos. Imunoeletromicroscopia Uso: detectar e identificar vrus.

65

A tcnica de ME mencionada acima para demonstrao de vrus pode tambm ser utilizada para se identificar vrus. O vrus incubado com soro hiperimune especfico, resultando em aglutinao das partculas que pode ser visualizada ao microscpico eletrnico. Soro-neutralizao (SN) Uso: detectar e quantificar anticorpos. A SN tcnica mais utilizada para a deteco e quantificao de anticorpos contra vrus de interesse veterinrio. O teste considerado o mais confivel de todos os testes sorolgicos, sendo menos sujeito variao e de interpretao mais objetiva. O teste baseia-se na capacidade de anticorpos especficos neutralizarem o vrus correspondente e assim prevenir a sua replicao e a conseqente produo de citopatologia em cultivo celular; ou sinais clnicos, leses e mortalidade em ovos embrionados ou animais. Os testes de SN so quase exclusivamente realizados utilizando cultivos celulares. O vrus em questo previamente cultivado, quantificado e estocado em alquotas ultra-baixa temperatura. Esse vrus deve ser quantificado (titulado) vrias vezes para que se determine exatamente a quantidade de vrus presente. Diluies do soro-teste so colocadas em placas de microtitulao, seguido da adio de uma quantidade fixa da suspenso viral aproximadamente 100 a 300 doses infecciosas por cavidade. Aps a incubao do vrus com as diferentes diluies do soro-teste, geralmente 1 - 2 horas a temperatura ambiente (alguns sistemas utilizam 37C ou 4C), as clulas indicadoras so adicionadas. As placas so ento incubadas a 37C e observadas diariamente para o aparecimento de efeito citoptico (ecp). A presena de anticorpos especficos no soro-teste impede a produo de ecp pelo vrus. Os testes de SN so tambm utilizados para se identificar isolados de vrus desconhecidos, essencialmente da mesma forma descrita acima. A nica diferena a que a especificidade dos anticorpos conhecida e o vrus desconhecido. Se um determinado anticorpo inibe a produo de ecp pelo agente desconhecido, ento a identificao do vrus est feita. Inibio da hemaglutinao (HI) Uso: deteco e quantificao de anticorpos. O princpio do teste de inibio da hemaglutinao (HI) semelhante ao da SN, com a diferena que a atividade viral inibida pelo soro-teste a capacidade hemaglutinante. Os testes de HI so muito sensveis e altamente especficos, e so particularmente teis para quantificar anticorpos contra vrus hemaglutinantes que no replicam bem em cultivo celular ou produzem ecp discreto ou dificilmente reconhecvel. Exemplos so os vrus da Influenza tipo A de vrias espcies animais, vrus da Doena de Newcastle e parvovrus suno. Os testes de HI so realizados em placas de microtitulao. Diluies do soro-teste so realizadas, seguidas da adio de um volume igual de uma suspenso contendo aproximadamente 4 a 8 unidades hemaglutinantes do vrus (uma unidade hemaglutinante a maior diluio da suspenso viral capaz de produzir hemaglutinao completa). A suspenso apropriada de eritrcitos ento adicionada e as placas so incubadas durante 1 a 2 h a 4C (para a maioria dos vrus). Se o anticorpo especfico estiver presente no soroteste, a aglutinao dos eritrcitos vai ser inibida e essas clulas iro rolar e sedimentar, formando um boto. Clulas que se aglutinam, ao contrrio, iro formar uma camada fina sobre o fundo da cavidade, ou em formando boto de bordas irregulares. O soro-teste freqentemente contm inibidores inespecficos da hemaglutinao; e deve ser adsorvido com eritrcitos antes do teste. Fixao de complemento (FC) Uso: deteco e quantificao de anticorpos. Os testes de FC so especialmente teis como mtodos auxiliares no diagnstico de infeces agudas ou recentes, pois detectam principalmente IgM, a primeira classe de imunoglobulinas a ser produzida em resposta infeco. O teste envolve o uso de antgeno viral, complemento obtido de cobaios e um sistema indicador de eritrcitos sensibilizados de ovinos. A sensibilizao dos eritrcitos realizada pela sua incubao com anticorpos especficos, chamados de hemolisina, produzidos em coelhos. O antgeno e o complemento so titulados e diludos. Se o soro-teste no contm anticorpos especficos para o agente, o complemento fica livre para reagir com os eritrcitos sensibilizados, produzindo lise. A presena de anticorpos em quantidade suficiente produz a formao de complexos antgeno-anticorpo, que seqestram o complemento, no permitindo que este produza lise dos eritrcitos.

66

Imunodifuso Uso: deteco de anticorpos especficos ou antgenos. As duas tcnicas mais usadas de imunodifuso so o sistema de difuso dupla e a imunoeletroforese. Os dois testes so realizados em meios semi-slidos, geralmente gar ou agarose. A diferena principal entre os dois testes que na imunoeletroforese o antgeno previamente separado por eletroforese, e ento recoberto com um gel contendo o anticorpo. Nos dois testes, o antgeno e os anticorpos se difundem no gel de gar, formando uma linha de precipitao no local onde se encontram e reagem. A imunodifuso dupla um dos testes sorolgicos mais utilizados em diagnstico. O melhor exemplo o teste de Coggins para a anemia infecciosa eqina. O teste de imunodifuso pode ser tornado mais sensvel utilizando-se um marcador radioativo, possibilitando a deteco de complexos antgeno-anticorpo que no so visveis a olho nu. O istopo iodo (I125) o marcador mais utilizado, tanto para marcar o antgeno como os anticorpos. A marcao ocorre pela incorporao do I125 no amino-cido tirosina. Os resultados so obtidos pela exposio do gel ou lminas a um filme de raios X que captura as linhas radioativas (precipitao). Testes de proteo Uso: identificao de vrus. Os testes de proteo so utilizados para a identificao de vrus quando outros mtodos mais simples no so disponveis. Eles envolvem a induo de imunidade ativa ou passiva em animais seguido de desafio com o agente em questo. Um exemplo foi o teste de proteo utilizado para a identificao do vrus da peste suna clssica. O teste foi realizando inoculando-se soro hiperimune especfico simultaneamente com sangue ou suspenso de bao de um animal suspeito de estar infectado. Se o agente fosse o vrus da peste suna clssica, a imunidade passiva produzida pelo anti-soro anti-vrus da peste suna clssica protegeria o suno do desafio. Os animais desprotegidos contrairiam a doena. Hibridizao de cidos nuclicos Uso: deteco de cidos nuclicos DNA ou RNA virais em amostras clnicas. A hibridizao de cidos nuclicos consiste das seguintes etapas: O cido nuclico de cadeia dupla de um vrus desnaturado com substncia alcalina para a separao das cadeias. As cadeias simples do cido nuclico so imobilizadas em um suporte slido, geralmente uma membrana de nylon ou nitrocelulose, para impedir que as cadeias de se reassociem. O cido nuclico se liga na membrana atravs da cadeia lateral de fosfatos; as bases nitrogenadas projetam-se externamente. Uma sonda (DNA de fita dupla ou RNA; de origem conhecida contendo a seqncia de nucleotdeos especfica quela do vrus alvo conjugada com um istopo radioativo ou enzima) incubada com a membrana. Ocorre a formao de pontes de hidrognio entre as bases complementares. As sondas que no se ligaram so removidas por lavagem e a hibridizao detectada atravs de um mtodo de deteco da sonda.

Vrios tipos de hibridizao em suporte slido so utilizados: Hibridizao Southern: Tcnica utilizada para a deteco de um fragmento de DNA especfico. Hibridizao Northern: Utilizada para detectar-se seqncias despecficas de RNA. Hibridizao Dot blot: Procedimento similar ao Southern e Northern, pode ser utilizado tanto para DNA como para RNA. A diferena que o cido nuclico-alvo imobilizado em focos (pontos) na membrana, similar aos de uma placa de microtitulao. Hibridizao in situ: O princpio semelhante ao Southern e Northern hibridizao (deteco de um sequencias de nucleotdeos especficas atravs de sondas marcadas), com a diferena que, ao invs do material suspeito ser extrado e imobilizado em membranas de nitrocelulose, a deteco realizada diretamente em cortes histolgicos do tecido ou clulas. Essa tcnica tem uso limitado em diagnstico mas muito til em pesquisa e estudos de patogenia.

67

As tcnicas de anlise de restrio enzimtica, reao da polimerase em cadeia e microarranjo so particularmente teis e so discutidas a seguir. Anlise de restrio enzimtica (REA) Uso: identificao de vrus especificos. A anlise de restrio enzimtica (REA) utiliza enzimas chamadas endonucleases de restrio para traar o perfil da seqncia do genoma dos vrus. A presena de mutaes e/ou variabilidade gentica em determinados pontos de clivagem no genoma de alguns isolados do vrus resulta em diferentes padres de clivagem, quando so separados em gel de agarose. Essa anlise chamada de anlise de polimorfismo de tamanhos de fragmentos (RFLP) e tem sido utilizada para caracterizar e comparar entre isolados de campo de um determinado vrus. A tcnica requer grande quantidade de DNA total ou parcialmente purificado, um grupo de enzimas para clivar o DNA, a capacidade de separar os fragmentos de DNA resultantes por eletroforese e um mtodo de documentar os resultados. A restrio enzimtica de vrus com genomas grandes como o citomegalovrus, pode resultar em 20 a 50 fragmentos de DNA, enquanto vrus com genomas pequenos, como os adenovrus, geralmente produzem 5 a 10 bandas de DNA. No fcil, nem sempre necessrio, correlacionar o padro de clivagem (mais ou menos bandas) com mutaes em stios especficos do genoma, sem a realizao de estudos extensivos de hibridizao ou mesmo o seqenciamento dos genomas comparados. Uma limitao importante do mtodo a de que a presena da mutao n ser detectada se ocorrer exatamente em um dos locais reconhecidos e clivados pelas enzimas utilizadas. O uso de vrias enzimas simultaneamenteaumenta a probabilidade de detectar-se mutaes em um determinado genoma ou parte do genoma. Reao da polimerase em cadeia (PCR) Uso: deteco/identificao de vrus especficos ou genes especficos. A reao da polimerase em cadeia (PCR), mtodo in vitro de replicao de DNA, capaz de amplificar (multiplicar) segmentos de DNA mais de um milho de vezes. Uma cpia nica do genoma viral se presente na amostra clnica amplificada, produzindo milhes de cpias que ento podem ser facilmente detectadas por eletroforese. Isso obtido atravs da criao de uma reao que, alm da amostra de DNA (que potencialmente contm o DNA-alvo do vrus), contm dois oligonucleotdeos (primers) com seqncias complementares as extremidades opostas de cada uma das cadeias da seqncia alvo, deoxinucleotdeos trifosfato e uma enzima DNA polimerase termoestvel (Taq polimerase). A mistura ento submetida a uma srie de ciclos de temperatura para permitir e facilitar a replicao do DNA e conseqentemente multiplicar o DNA. A seguir descrito um ciclo tpico: A primeira etapa de um ciclo do PCR a desnaturao do DNA da amostra, pelo aquecimento da reao a 95C. Segundo, a reao resfriada para permitir a hibridizao dos primers na seqncia-alvo de DNA. Terceiro, a reao ento aquecida a 72C para permitir a polimerizao do DNA a partir dos primers pela Taq DNA polimerase. Esse ciclo de temperaturas repetido 35 a 40 vezes. Mais de um milho de cpias do DNA podem ser obtidas dessa maneira. Quando o nmero de ciclos planejado concludo, o DNA alvo resultante separado por eletroforese em gel e analisado atravs da viasulizao das bandas de DNA ou atravs de hibridizao Sorthern com sondas especficas. Vrios testes diagnsticos baseados em PCR so comercialmente disponveis. A PCR pode ser utilizada tambm para o estudo de vrus RNA pelo uso da enzima transcriptase reversa que produz cpias cDNA a partir alvo RNA. Essa tcnica chamada de transcriptase reversa, RTPCR. Outras variaes da PCR incluem a PCR em tempo real, na qual a anlise espectrofotomtrica dos produtos realizada simultaneamente reao; e a PCR aninhada (nested-PCR) que utiliza dois conjuntos de primers, sendo um conjunto especfico para uma regio interna amplificada pelo primeiro conjunto. Cada uma dessas variaes so teis quando a quantidade de cido nuclico muito pequena. A eficcia da PCR em tempo real para diagnstico em amostras clnicas ainda no foi estabelecida.

68

Radioimunoensaio Uso: deteco de antgeno ou anticorpos. Atualmente, o radioimunoensaio raramente utilizado em laboratrios de diagnstico virolgico. Existem dois tipos de RIA: em fase lquida e em fase slida. No sistema em fase lquida, os complexos antgeno-anticorpo so precipitados pela adio de anti-imunoglobulinas. O precipitado coletado por centrifugao e seco. A quantidade de radioatividade no precipitado, comparada com a radioatividade total, a quantificao da reao antgeno-anticorpo. A marcao realizada com I125 (veja imunodifuso), em qualquer um dos trs componentes da reao. No sistema de fase slida, o anticorpos imobilizado na superfcie interna de um tubo de poliestireno e ento adicionado do antgeno. Resumidamente, o material clnico adicionado ao tubo previamente recoberto internamente com o anticorpo especfico. Se o antgeno est presente, liga-se no anticorpo adsorvido. Aps lavagem, um anticorpo anti-viral marcado com 125I adicionado, reagindo com o complexo imobilizado num efeito "sanduche". O tubo lavado e a quantidade de radioatividade determinada. Embora as tcnicas de deteco de antgeno descritas acima so utilizadas com primeiro teste diagnstico, muitas vezes essas tcnicas no so aplicveis pois amostras clnicas apropriadas no puderam ser obtidas de animais vivos. Da mesma forma, tcnicas rpidas de deteco de antgeno no so disponveis para vrios vrus. Nesses casos, recorre-se ao isolamento viral. Microarranjo (microarray) Uso: identificao de vrus especficos ou seqncias virais especficas. O desenvolvimento dos "microarranjos" foi impulsionado pela aplicao da tecnologia de robtica na rotina da biologia molecular, mais do que por qualquer avano tecnolgico. As tcnicas de Southern e Northern blot para a deteco de DNA e RNA mensageiro serviram de base tecnolgica para a hibridizao em microarranjo. A construo dos microarranjos envolve a deposio de seqncias especficas de DNA em pontos na superfcie de uma lmina de vidro ou chip de slica atravs de robtica. Um nico chip pode conter at 50.000 genes. Os chips (ou lminas) so ento expostos a uma fonte de DNA marcado com substncia fluorescente. Um computador monitora a fluorescncia nos diferentes pontos da superfcie do chip, indicando onde o DNA marcado se ligou no DNA imobilizado na lmina/chip. Como milhares de seqncias de DNA podem estar presentes no chip, possvel atravs deste teste analisar vrios patgenos simultaneamente. Isso particularmente importante para a deteco de microrganismos usados como armas biolgicas e diagnstico de doenas. Vrios microarranjos so comercialmente disponveis, como o CapitalBio_SARSarrayTM-1.8 Sistema de Deteco para identificar estgios precoces de infeco pelo vrus da SARS. Alm dos microarranjos de cidos nuclicos, microarranjos de protenas tambm tm sido utilizados. Nesses casos, procura-se protenas especficas. Coleta e remessa amostras O diagnstico laboratorial de uma doena clnica depende em grande parte do tipo e condio do material submetido. Depende tambm da ao coordenada do veterinrio de campo e do tcnico laboratorial. Devido ao fato da maioria dos testes laboratoriais serem especficos para um determinado agente, um histrico clnico adequado deve acompanhar todos os materiais submetidos. Isso permite ao pessoal do laboratrio realizar testes adicionais, se necessrio e indicado. Regras gerais de coleta e remessa de material so apresentadas a seguir. A maioria dos laboratrios fornece um formulrio de remessa de amostras que deve ser preenchido com as informaes pertinentes. Na ausncia desse formulrio, o veterinrio deve fornecer um histrico o mais completo possvel. Devem, entrar em contato com o laboratrio para esclarecer quaisquer dvidas. Animais Animais vivos, doentes, devem ser preferidos aos de animais mortos. Sempre que possvel, esses animais devem ser enviados ao laboratrio para um exame e necropsia completos. Se o problema afeta um rebanho, mais de um animal deve ser enviado. nibus e transportadoras podem ser utilizados para transportar animais de pequeno porte, desde que acondicionados apropriadamente em caixas ou embalagens apropriados prova de vazamentos. No congele animais a serem submetidos para a necropsia.

69

Tecidos Para evitar contaminao durante a necropsia, recomenda-se coletar uma srie de tecidos antes de realizar-se um exame minucioso. rgos/tecidos recomendados para se coletar so: pulmo, rins, fgado, bao, intestino delgado e grosso, linfonodos regionais. O crebro ou a cabea devem ser coletados em suspeita de doena do sistema nervoso central. Outros tecidos que contenham leses observadas durante o exame tambm devem ser coletados. Uma poro de cada tecido deve ser acondicionada em sacos plsticos impermeveis e refrigerados. Cada tecido/rgo deve ser preferencialmente acondicionado em um saco individual. Segmentos de intestino devem ser obrigatoriamente acondicionados em separado, para se evitar contaminao bacteriana, pois seno e xame bacteriolgico ser comprometido. Tecidos coletados prximo ao final de semana devem ser enviados na prxima segunda-feira. Devido ao fato de que muitos vrus produzem leses caractersticas microscpicas pequenos fragmentos (0.5 cm de espessura) de cada tecido devem ser acondicionados em frascos com formol tamponado a 10% para exames histolgicos. Em casos de doena neurolgica, recomenda-se enviar uma metade longitudinal do crebro. Essas amostras no devem ser congeladas. Fezes Fezes devem ser coletadas de animais doentes e acondicionadas em frascos hermeticamente fechados. Embora swabs saturados em fezes sejam adequados para alguns exames virolgicos individuais, algumas gramas de fezes permite um espectro maior de exames, incluindo bacteriolgico e parasitolgico. AS amostras devem ser submetidas ao laboratrio utilizando gelo reciclvel. Swabs Swabs nasais e oculares so teis para o isolamento de vrus de animais com doena do trato respiratrio superior. Infeces genitais tambm podem ser diagnosticadas pelo exame de swabs coletados do trato reprodutivo (vulva, vagina, pnis, prepcio). Os swabs devem ser coletados de animais com a infeco aguda e acondicionados diretamente em tubos contendo um meio de transporte para vrus. A coleta de material de vrios animais, em diferentes estgios da infeco, aumenta a probabilidade de isolamento do agente. Swabs so teis tambm para coletar-se amostras de leses vesiculares. Vesculas frescas devem ser rompidas e os swabs embebidos com o contedo. Dois swabs devem ser sempre coletados, um para microscopia eletrnica e outro para o isolamento de vrus. O swab para isolamento deve ser acondicionado em meio de transporte e o swab para microscopia eletrnica deve ser colocado em um tubo contendo um pequeno volume (uma a duas gotas) de gua destilada. Material descamativo de leses mais avanadas tambm deve ser submetido. Existem vrios meios comercialmente disponveis que auxiliam a manter a viabilidade dos vrus durante o transporte ao laboratrio. A maioria desses meios contm soluo inica balanceada, protenas e antibiticos para impedir proliferao bacteriana. Vrios laboratrios fornecem seus prprios meios de transporte quando requisitados por veterinrios de campo. Lminas Vrias doenas infecciosas podem ser diagnosticadas pelo exame de lminas preparadas a partir de sangue ou tecidos. Esfregaos sanguneos so utilizados para o diagnstico da leucemia felina, enquanto esfregaos sanguneos e raspados conjuntivais so usados no diagnstico da cinomose. Raspados conjuntivais so particularmente teis no diagnstico de infeces por herpesvrus e clamdias em gatos. Impresses do fgado, bao e pulmes so especialmente teis no diagnstico de infeces por clamdias e herpesvrus em psitacdeos. As lminas devem conter um nmero suficiente de clulas para permitir um exame detalhado, mas no devem se muito espessas a ponto de dificultar a colorao. Um raspador conjuntival ou outro aparelho (borda cega de uma lmina de bisturi ) podem ser usados para raspar a conjuntiva; swabs de algodo no so adequados. Sacos conjuntivais purulentos ou com secreo contaminada devem ser lavados antes da coleta do raspado. Impresses de tecido devem ser feitas atravs de presso leve do tecido (previamente adsorvido em papel-toalha para remover o sangue) contra a superfcie da lmina. As lminas devem ser secas ao ar e remetidas ao laboratrio em suportes especiais para prevenir a sua quebra. O envio de vrias lminas permite um exame mais detalhado, incluindo citolgico.

70

Soro Amostras de sangue devem ser coletadas em tubos estreis sem anticoagulante. Estes devem ser enviados ao laboratrio em caixas de isopor com gelo, em estantes para impedir que se rompam. Amostras de sangue no devem ser congeladas ou aquecidas em excesso. Se as amostras no puderem ser enviadas ao laboratrio em poucas horas, o soro deve ser separado e refrigerado ou congelado. Glossrio Aliquotar: Dividir (como uma soluo) em partes iguais. Primers: pequenas seqncias de DNA ou RNA utilizados como iniciadores para a sntese de cido nuclico. O primer hibridiza com a sua regio complementar na molcula molde do cido nuclico e fornece a oxidrila 3 para o incio da sntese. Os primers delimitam a regio que vai ser amplificada. Na PCR, dois primers (as vezes mais) oligonucleotdeos sintticos (em torno de 20 nucleotdeos) so complementares a regies nas cadeias opostas flanqueiam a regio alvo; as extremidades oxidrila 3 so orientadas uma na direo da outra. Na PCR, a seqncia alvo em uma amostra geralmente de 100 a 2000 pares de bases de extenso. Primers desenhados e arbitrrios podem ser usados. Testes regulatrios: so testes realizados por imposio de legislao oficial de rgos governamentais para doenas animais de interesse sanitrio estratgico. Endonuclease de restrio: so enzimas derivadas de bactrias, que reconhecem e cortam o DNA em sequencias especficas. Polimorfismo de tamanhos de fragmentos (RFLP): revelam muitas diferenas no DNA entre indivduos de uma mesma espcie. RFLPs resultam da clivagem do DNA por enzimas de endonucleases de restrio, separao dos fragmentos por eletroforese e visualizao das bandas (fragmentos de DNA) pela colorao com brometo de etdio. Taq polimerase: DNA polimerase utilizada na PCR. derivada de uma bactria aqutica denominado Thermus aquaticus que vive em guas de gisers; a termoestabilidade da enzima permite seu uso na PCR. Direiros reservados: este documento est disponvel em www.ivis.org. Documento nm. A3407.0305.PT

71

CLASSIFICAO DOS VRUS Objetivos: Ao final desta aula o aluno ser capaz de reconhecer os fundamentos da taxonomia viral e reconhecer alguns membros importantes das principais famlias de vrus. A BASE DA CLASSIFICAO Estrutura (genoma, morfologia, presena de envelope); Estratgia de replicao; Parentesco antignico (sorologia; diviso em sorotipos); Seqncia de nucleotdeos (genotipos)

TAXONOMIA Ordem: duas ordens: Mononegavirales e Nidovirales Famlia: designao termina com: ...viridae Sub-famlia: ...virinae Genero: ...vrus Exemplo: o vrus Herpes Simples Humano pertence : Famlia: Herpesviridae Sub-famlia: Alfaherpesvirinae Gnero: Simplexvirus Ordens: Somente duas at o presente: Mononegavirales (paramixo, rhabdo, filo e bornaviridae) Nidovirales (coronaviridae & arteriviridae) Observe: nomes escritos em itlico! Outros: nome de uso (nome coloquial) TODAS AS FAMLIAS TEM VRUS CONSIDERADOS "PADRO" DA ESPCIE, denominados "TYPE SPECIES", ou prottipo da famlia. ______________________________________________

FAMLIAS DE VRUS ANIMAIS

COM RNA DE FITA SIMPLES POLARIDADE POSITIVA: Togaviridae, Flaviviridae, Caliciviridae, Astroviridae, Picornaviridae E ainda a ordem Nidovirales: Coronaviridae, Arteriviridae O nome Nidovirales deriva do fato de que estes vrus possuem uma origem de multiplicao comum para vrios mRNAs. COM RNA DE FITA SIMPLES POLARIDADE NEGATIVA: Fitas simples em dois ou mais segmentos de RNA: Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae E ainda a ordem Mononegavirales (vrus com fita simples em um segmento nico): Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Bornaviridae E mais: Deltavirus (corresponde ao o vrus da Hepatite Delta; ainda no classificado)

72

COM RNA DE FITA DUPLA: Birnaviridae Reoviridae FAMLIAS COM VRUS QUE FAZEM TRANSCRIO REVERSA: Retroviridae (RNA) Hepadnaviridae (DNA) FAMLIAS COM DNA DE FITA SIMPLES: Parvoviridae Circoviridae FAMLIAS COM DNA DE DUPLA FITA: Papilomaviridae Adenoviridae Herpesviridae Iridoviridae Poxviridae ________________________________________________________________ CARACTERSTICAS DAS FAMLIAS DE VRUS COM GENOMA DE RNA

(aqui apresentadas em ordem alfabtica)

Famlia: Arenaviridae Pleomrficos (globulares) 50-300 nm Envelopados Duas fitas simples de RNA (L e S) Contem ribossomos Usualmente so vrus latentes de roedores Gnero Arenavirus: Coriomeningite linfoctica Febre Lassa Febres hemorrgicas Argentina e Boliviana Famlia: Arteriviridae Organizao semelhante aos coronavrus: Vrus da Arterite Eqina Vrus da PRRS Vrus elevador da Lactato Dehidrogenase Famlia: Birnaviridae Icosadricos (60-65 nm) No envelopados RNA bisegmentado VPg Resiste a ter e clorofrmio Gneros: Entomobirnavirus Aquabirnavirus Avibirnavirus: Doena infecciosa da bursa das aves (Gumboro)

73

Famlila: Bornaviridae (Ordem: Mononegavirales) Vrus Borna: RNA de fita simples Ainda no visualizado Causa encefalites raras em eqinos e ovinos Somente registrada na Alemanha e Sua Famlia: Bunyaviridae (Ordem: Mononegavirales) Globulares (100nm) Envelopados Trs segmentos de RNA de fita simples, polaridade negativa Gneros: Bunyavirus (18 grupos antignicos, 161 arbovrus, 4 ainda no agrupados; Cullicoides) Ex.: Capim, Melo, Ororoca, Tucunduba, Guaroa e muitos outros. Phlebovirus ( 8 grupos antignicos, transmitidos por Phlebotomum). Nairovirus (6 grupos antignicos, pelo menos 33 vrus transmitidos por carrapatos). Tospovirus (13 vrus transmitidos carrapatos) Hantavirus (pelo menos 6 vrus, no-arbo, transmitidos por roedores)

Famlia: Caliciviridae Lembram um clice floral ao microscpio eletrnico Icosadricos (35-40 nm) No envelopados RNA simples + (infeccioso) VPg e poli-A Resiste a ter e clorofrmio Exemplos: Vrus que causam gastroenterites humanas Calicivrus felinos Hepatite "E" (classificao incerta) Famlia: Coronaviridae Ordem: Nidovirales Pleomrficos (tende a globular) 60-200 nm Envelope Peplmeros espaados RNA simples, positiva, com poli-A (alguns com VPg) Gneros: Coronavirus; Torovirus Coronavrus humano (HCV) (resfriados) Bronquite infecciosa das aves Gastroenterite transmissvel dos sunos (TGE) Peritonite Infecciosa dos felinos Encefalite hemaglutinante dos suinos Gnero flutuante (ou seja, ainda no bem definido): Arterivirus (Ordem: Nidovirales) Vrus da doena misteriosa dos sunos (PRRS) Vrus elevador da lactato dhidrogenase Vrus da arterite eqina

74

Famlia Filoviridae Ordem: Mononegavirales Filamentosos (ramificaes) 80 x 14 000 nm RNA simples negativa Simetria helicoidal Gnero: Filovirus Ex.: Marburg, Ebola (doenas hemorrgicas no homem) Famlia Flaviviridae Globulares (45 nm) Envelopados RNA simples positiva Sensiveis a ter e clorofrmio

Gnero Flavirirus: Febre amarela, Dengue 1,2,3,4; Encefalite Japonesa Gnero Pestivrus: Peste suna clssica, Diarria viral bovina; Border disease (doena da fronteira) Gnero sem nome definido: Hepatite C Famlia Orthomyxoviridae Pleomrficos 100-120 nm Nucleocapsdeo segmentado com 7(tipoC) ou 8(tipos A e B) de RNA de fita simples negativa Nucleocapsdeos com simetria helicoidal Hemaglutinina (H ou HA) e Neuraminidase (N ou NA) Rearranjos genticos Gneros: Influenzavirus A, B Influenzavirus C Famlia Paramyxoviridae (Ordem: Monegavirales) Pleomrficos (tendncia a globular) Simetria do nucleocapsdeo helicoidal Envelopados Protenas de Fuso, HA e NA Uma s fita de RNA simples, negativa, linear 1- Subfamlia Paramyxovirinae: Gneros: Paramyxovirus: Parainfluenza (PI) 1e 3. Rubulavirus: Caxumba, PI 2, 4a e 4b, Em aves: Newcastle Morbillivirus: Sarampo, Cinomose dos ces. 2- Subfamllia Pneumovirinae Gnero: Pneumovirus: Vrus Respiratrio Sincicial Humano (HRSV), Bovino (BRSV) Famlia: Picornaviridae Icosadricos (20-30 nm) No envelopados RNA simples + (infeccioso) Resiste a ter e clorofrrmio Gneros Hepatovrus (Hepatite A) Enterovrus (Polio 1,2,3; Coxsackie, ) Rinovrus (resfriados, mais de 120 tipos)

75

Cardiovrus (Encefalomiocardite) No envelopados 2 capsdeos 70 - 80 nm 10 a 12 segmentos RNA duplo Outros gneros da Famlia Picornaviridae: Orthoreovirus Orbivirus Rotavirus

Famlia Retroviridae Nucleocapsdeo icosadrico (80-120 nm) Envelope (com glicoprotenas inseridas) 2 cpias do genoma de RNA fita simples, positivo VPg, poli-A Gneros: (Ainda sem nome): o Avirios tipo "C" o Mamferos tipo "B" o Mamferos tipo "C" o Mamferos tipo "D" o BVL-HTLV: Vrus da Leucose/leucemia bovina e Human T cell leukemia virus (HTLV I e II); Lentivrus: HIV (1 e 2), BIV, SIV, Visna-Maedi, CAEV, EIAV. Spumavrus: Spumavirus humano, felino e smio. Famlia Rhabdoviridae (Ordem Mononegavirales) Forma de bala RNA simples negativa Nuleocapsdeo helicoidal Gneros: Vesiculovirus: Estomatite Vesicular, Cocal, Jurona, Carajs Lyssavirus: Raiva, Labos Bat, Mokola, Obodhiang, Kotonkan Famlia Togaviridae (web site: life.anu.edu.au/viruses/Ictv/fr-index.htm) Simetria icosadrica Envelopados, sensveis a solventes orgnicos Pleomrficos 70 nm dimetro 3 (alguns 4) protenas estruturais: C (capsdeo); envelope (E1 e E2, que so glicoprotenas que formam heterodmeros formando espculas visveis (donde a origem do nome "toga") Genoma RNA fita simples, polaridade positiva (infeccioso), com 9700-11800 nucleotdeos Multiplicao intracitoplasmtica Gneros Alphavirus: so arbovrus: Encefalites Eqinas Leste, Oeste Rubivirus: no arbo: Rubola

76

Famlia Toroviridae RNA de fita simples positiva com > 20 kb Simetria helicoidal Capsdeo dobrado como um "feijo", ou disco Vrus Berne & vrus Breda Vrus no classificado: Gnero: Deltavrus - Vrus da Hepatite Delta ________________________________________________________________ CARACTERSTICAS DAS FAMLIAS DE VRUS COM GENOMA DE DNA: Famlia Adenoviridae (tutorial: http://www-micro.msb.le.ac.uk/335/Adenoviruses.html) Sem envelope,icosadricos (70-90 nm) DNA duplo linear (36 kb) Potencial oncognico (inativam p53 e Rb) Transformao in vitro Gneros: Mastadenovrus (mamferos) Aviadenovrus (aves) Famlia: Circoviridae Menores vrus com genoma de DNA DNA fita simples: 1,76 a 3,7 kb Simetria icosadrica, 1a 3 protenas no capsdeo Circovrus dos sunos, Vrus da anemia das aves Humanos: "Transfusion transmitted virus" (TTV) ? Famlia: Hepadnaviridae: Fita dupla parcial de DNA Envelopado Utilizam transcrio reversa em seu ciclo multiplicativo 2 Gneros: Orthohepadnavirus (Hepatite B) Avihepadnavirus)

Famlia Herpesviridae Envelope (120-200 nm) DNA duplo linear (at 240 kb) Codificam mais de 70 polipeptdeos Subfamlia: Alphaherpesvirinae Herpes simples tipo 1 (herpesvrus humano 1) Herpes simples tipo 2 (herpesvrus humano 2) Varicella Zoster (Herpesvirus humano 3) Subfamlia: Betaherpesvirinae Cytomegalovrus (Herpesvirus humano 5); (Herpesvirus humano 6) e (Herpesvirus humano 7)

77

Subfamlia: Gammaherpesvirinae: 2 gneros: Lymphocryptovirus: Vrus Epstein-Barr (EBV) e (Herpesvirus humano 4) Rhadinovirus: Herpesvrus saimiri Herpesvirus humano 8 (Herpesvrus associado ao Sarcoma de Kaposi; KSHV) Famlia Iridoviridae Icosadricos (120-300 nm) Envelope DNA duplo linear (175 kb) Peste suna africana=> distinto

Famlia Parvoviridae Icosadricos, no envelopados, 18-26 nm, icosadricos. 60 capsmeros por nucleocapsdeo Fita simples de DNA, 5000 nucleotdeos. Genoma pode ser de fita simples negativa, com terminaes palindrmicas (repeties invertidas). Trs gneros: Parvovirus (espcie tipo: minute virus of mice, MVM) Erythrovirus (espcie tipo: vrus B19) Dependovirus

Sites:

http://www.wadsworth.org.databank/virus.htm http://www.medscape.com/SCP/IIM/1997/v14.n08/m3079.moore/m3079.moore.html#Vir Famlia Papovaviridae

Sem envelope (45-55 nm) DNA duplo "supercoiled" circular o Ex: Poliomavrus Famlia Papilomaviridae

Sem envelope (45-55 nm) DNA duplo "supercoiled" circular o Ex: Papilomavrus (causadores de verrugas; muitos associados a diversos cnceres),

Famlia Poxviridae Os maiores vrus conhecidos : estrutura do nucleocapsdeo complexa Com ou sem envelope (200-300 nm) Multiplicao intracitoplasmtica Varola (j erradicada), Vrus do molusco contagioso Hepatite G (GBa e GBb; GBV) Vrus no classificado Semelhante aos pestivrus quanto a sua organizao genmica. No h evidncia clara de que cause hepatites.

_______________________________________________________________

78

AGENTES NO CONVENCIONAIS (PRONS): Prons=> NO SO VRUS! So proteinas, desprovidas de cido nuclico, altamente resistentes a calor, formaldedo e nucleases. Eliminados por agentes disruptores de gorduras (fenol, ter, soda e hipoclorito de sdio). Capazes de se propagar por alterao de protenas celulares normais, similares, presentes nas clulas (denominadas PrPc, para PrP celular). Responsveis por neuroencefalopatias espongiformes (Creutzfeld-Jacob disease (CJD), Gerstman- Straussler-Schenker ou GSS; Encefalopatia espogiforme bovina (BSE ou "sindrome da vaca louca") e outras. O texto completo sobre prons com fotos esto neste link: http://www-micro.msb.le.ac.uk/335/Prions.html REFERNCIAS Web site http://life.anu.edu.au/viruses/ictv/

79