Manual de FITO Revisado 2009 II

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FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN DEPARTAMENTO DE CIENCIAS AGRICOLAS MANUAL DE LABORATORIO DE FITOPATOLOGIA BIOL. MARCOS ESPADAS RESENDIZ M.C. GLORIA DE LOS ANGELES ZITA PADILLA PROLOGO Siendo la Fitopatologa la ciencia que estudia las enfermedades de las plantas, los agentes causales, su interaccin con los hospederos, la sintomatologa, as como los medios de control de stas, es notorio el papel que desempea dentro de esta ciencia el trabajo de gabinete, esto es, el anlisis de laboratorio, ya que es en ste lugar donde se establece el conocimiento de cada uno de los enunciados anteriores. El objetivo del laboratorio de Fitopatologa es adiestrar al alumno en las principales tcnicas de colecta, cultivo, identificacin y control de los organismos causales de las enfermedades de las plantas. El presente manual tiene la intencin de brindar la mnima informacin necesaria en el trabajo prctico de la Fitopatologa, tratando siempre de establecer la relacin hospedero-patgeno, al aportarles el conocimiento bsico para que en un futuro sepan y puedan diagnosticar cuando un cultivo est enfermo o daado y tengan nocin de los mtodos y tcnicas de control que podran emplear para lograr una mejor produccin. No pretende ser ste un trabajo terminado, sino que se espera enriquecerse con la ayuda y crtica de profesores y alumnos. LOS PROFESORES DE FITOPATOLOGIA
OBJETIVOS GENERALES. Al terminar el curso el alumno: Adquirir la destreza en el manejo de las principales tcnicas el diagnstico fitosanitario y podr discriminar entre ellas cuando se aplican a determinado grupo fitopatgeno para su reconocimiento y diagnstico (hongos, bacterias, nemtodos, virus)
DESARROLLO. El trabajo del laboratorio comprende a las prcticas generales y al seminario.
PRACTICAS. Estn contenidas en este manual. Se deber entregar un reporte de cada una de estas prcticas, una semana despus de haberlas concluido. Los reportes deben contener lo indicado en el manual, adems de lo que los profesores les indiquen. NO SE ACEPTAN REPORTES DE PRACTICAS EXTEMPORANEOS. SEMINARIO DE INVESTIGACION. Es un trabajo particular que deber desarrollar cada equipo a travs del semestre. Este trabajo pretende que el alumno se familiarice con algn patgeno en particular, siguiendo los postulados de Koch, para lograr la correcta identificacin del agente causal, de tal forma que pueda extrapolar sus conocimientos para un diagnstico adecuado de cualquier enfermedad vegetal en su ejercicio profesional. En la primera sesin de laboratorio se les proponen algunos temas a escoger, aunque puede ser el mismo equipo el que lo proponga. En la segunda sesin todos los equipos deben tener su tema definido. En la tercera sesin deben entregar su proyecto de trabajo, el cual debe contener los siguientes puntos: 1. INTRODUCCION. (Justificacin del trabajo, es decir, el QUE, el POR QUE y el PARA QUE). 2. OBJETIVOS. (Ante el planteamiento de un problema, se deben proponer objetivos a cumplir para poder solucionarlo). 3. HIPOTESIS. (Es la probabilidad que se supone como la solucin al problema planteado, y por lo tanto, debe corresponder a los objetivos). 4. METODOLOGIA. (Es la descripcin de los pasos a seguir para cumplir los objetivos). 5. BIBLIOGRAFIA. Cada equipo tiene que programar la fecha de siembra de las plantas que necesite, indicndolo en la metodologa. Una vez que se terminen las prcticas, todas las sesiones subsecuentes se dedican exclusivamente al desarrollo del seminario. Al finalizar el semestre, hay una sesin para la EXPOSICION DE LOS SEMINARIOS. Cada equipo tiene 15 minutos para exponer y 5 minutos para preguntas. El mismo da de la exposicin, se entrega un reporte final que contenga los siguientes puntos: 1. 2. 3. 4. INTRODUCCION. OBJETIVOS. HIPOTESIS. REVISION BIBLIOGRAFICA. Esta debe incluir: 4.1 Historia y distribucin geogrfica del patgeno. 4.2 Importancia econmica
5. 6. 7.
8. 9.
4.3 Etiologa 4.3.1 Clasificacin 4.3.2 Morfologa. 4.3.3 Patognesis 4.4 Sintomatologa 4.5 Epifitiologa 4.6 Control METODOLOGIA RESULTADOS. (Se describe lo obtenido en el experimento). DISCUSION. (Es la parte ms importante del trabajo, pues es donde se hace el anlisis de los resultados, interrelacionndolos con los objetivos e hiptesis planteados, fundamentndose en la informacin obtenida en la revisin bibliogrfica). CONCLUSIONES. (Conocimiento obtenido a travs de todo el trabajo experimental). BIBLIOGRAFIA.
El reporte debe ser en Word y con buena presentacin. A la entrega de este reporte, debe de anexarse: - la copia de por lo menos 3 artculos recientes referentes al tema del seminario. - Material didctico de apoyo, en referencia al seminario (diapositivas, lminas, preparaciones, material de herbario). NOTA: No se reciben ningn trabajo o reporte fuera de la fecha indicada. La asistencia al laboratorio es OBLIGATORIA. EVALUACION. Reportes de prcticas.................................................15% Seminario de Investigacin........................................25% Proyecto.....................................................5% Desarrollo...................................................10% Exposicin..................................................5% Reporte final...............................................5% Exmenes parciales.....................................................10% TOTAL.........50% MATERIAL NECESARIO PARA LAS PRACTICAS QUE DEBEN TRAER POR EQUIPO*. 1 m. de franela 1 m. de manta de cielo 1/2 lt. de blanqueador de ropa 1 marcador indeleble Cerillos 1 caja de porta objetos 1 caja de cubre objetos 1 rollo de masking tape 1 charola de plstico tipo panera
1 paquete de algodn 1 bolsa de detergente de 200 gr. Etiquetas engomadas de 2 x 2 cm. 1 rollo de papel aluminio 10 goteros en frascos color mbar 1 rotulador Cepillo para lavar cristalera de laboratorio *Este material es necesario desde la primera prctica
PRACTICA 1 METODOS DE COLECTA

INTRODUCCION. El diagnstico de las enfermedades de las plantas tiene tanto de arte como de ciencia. Ciertas enfermedades pueden ser reconocidas fcilmente, mientras que otras toman aos. No pueden darse normas fijas aplicables a todos los casos, cada uno requiere un enfoque diferente e individual. El diagnstico es una de las bases indispensables para lograr el control eficaz de una enfermedad. Solo cuando se conoce el agente causal puede consultarse literatura especializada que revela la experiencia de otros fitopatologos y puede servir para planear las medidas de combate. El diagnstico es ms preciso, por lo general, si el que lo realiza ha examinado personalmente la enfermedad en el campo. Un observador cuidadoso puede obtener datos valiosos que facilitan todo el proceso por ejemplo, la distribucin local de una enfermedad vara de acuerdo a las circunstancias, es decir, pueden estar afectadas todas las plantas por igual, algunas ms que otras, plantas sanas alternadas con plantas enfermas, reas bien definidas de plantas enfermas, en hileras en los bordes de la plantacin, en las partes ms bajas o distribuidas al azar. Es importante notar la presencia de focos de infeccin inicial, a partir de los cuales se extienda la enfermedad, ya que esta informacin da idea del patrn de diseminacin y de la fuente de inculo primario. En el desarrollo de la Fitopatologa prctica, es de suma importancia la colecta del material enfermo, puesto que de esto depender el que se puedan realizar las tcnicas conducentes a una identificacin acertada del patgeno en cuestin. OBJETIVOS: Conocer y manejar las tcnicas ms comunes de colecta y preservacin de material de estudio fitopatolgico.
MATERIAL Y EQUIPO UTILIZADO EN LA COLECTA DE PLANTAS ENFERMAS. Pala recta, navaja de campo, tijeras de podar, lupa de campo, serrucho, machete, cmara fotogrfica, bolsas de polietileno, etiquetas, prensa, papel secante, peridico y cartn corrugado, libreta de campo, hielera porttil, ligas, engrapadora manual, frascos de boca ancha, soluciones fijadores. DESARROLLO: Los problemas fitopatolgicos se pueden presentar en hojas, races, tallos, frutos, etc. Se pueden identificar cuando: a) Crecen anormalmente b) Se secan o se mueren c) Cuando disminuye la cosecha ao con ao y no se recupera an con fertilizantes o combatiendo malezas. d) Alteraciones en el crecimiento (achaparramiento, gigantismos, etc.) e) Decoloraciones, sobre pigmentaciones, manchas, rayados, etc. Es conveniente disponer del mayor nmero de elementos vegetales colectados que permitan lograr la identificacin del agente causal. Las partes vegetales que deben colectarse, dependen del tipo de cultivos que se trate: a) Cultivo anual. Se deber colectar varias plantas completas que presenten sntomas iniciales y en diferentes etapas de desarrollo de la enfermedad, pero que no estn en su totalidad muertas o en estado de descomposicin, pues as no son tiles para el estudio en el laboratorio. Si el cultivo ya esta muy desarrollado, colecte solo proporciones de los rganos afectados. Es conveniente colectar tambin una planta sana para que sirva de comparacin. b) Cultivo perenne. Se colectan partes representativas, como raz, tallo, hojas, flores, frutas, igualmente con sntomas iniciales y en diferentes etapas de desarrollo de la enfermedad; as mismo, se debern colectar partes que estn completamente muertas o en estado de descomposicin. Para partes vegetales carnosas, como frutos o bulbos, se deben colectar en frascos con soluciones fijadoras. En el caso de que la planta presente nodulacin en la raz, es muy probable que se trate de infestaciones de nemtodos, por lo que se deben tomar muestras del suelo que haya estado en contacto con la raz. En el caso de que las plantas sean pequeas, se debe sacar la planta entera, y sin sacudir el suelo de las races, se debe meter en una bolsa de plstico junto con 250 gr. de suelo, (aproximadamente), y cerrarla con una liga. Para evitar que los nemtodos mueran, estas bolsas no deben exponerse al sol. Es indispensable que todos los ejemplares que se colecten, vayan acompaados con los siguientes datos. a) Datos generales.
Muestra No. Localidad Fecha Cultivo (hospedero)
________________ ________________ ________________ ________________
Variedad Edad del cultivo Cultivos anteriores Predio
________________ ________________ ________________ ________________
b) Apariencia general del cultivo
Marchitez Amarillamiento Areas muertas Manchas foliares
__________________ Tizones
________________ Desarrollo anormal ________________ Otros ________________
________________ ________________ ________________
c) Partes atacadas de las plantas. Raz

Hojas Frutos
________________ ________________ ________________
Brotes o Tallos
Flores
________________ ________________
d) Distribucin de la enfermedad Plantas aisladas Areas grandes Bandas o franjas Manchones o grupos de plantas ________________ ________________ Areas pequeas ________________ ________________ Bordes de cultivo ________________ ________________
e) Condiciones prevalecientes durante la aparicin de los primeros sntomas y el desarrollo de la enfermedad. Precipitacin Vientos Granizo ________________ ________________ ________________ Humedad relativa Heladas Otros ________________ ________________ ________________
a) Labores culturales. Frecuencia de riego Incorporacin de materia orgnica Podas ________________ ________________ ________________ Fertilizaciones Aclareos Otros ________________ ________________ ________________
a) Qumicos aplicados al cultivo (concentraciones y dosis). Fertilizantes Herbicidas Defoliantes ________________ Fungicidas ________________ Insecticidas ________________ Otros ________________ ________________ ________________
a) Caractersticas del suelo. Drenaje ________________ Textura ________________
pH
________________
Otros
________________
a) Posibles diferencias y/o excesos nutricionales. Zn K P __________ Mn __________ Mg __________ Otros _ __________ N __________ Bo __________ __________ __________
Datos del laboratorio que nos ayudarn al diagnstico de la enfermedad y a la identificacin del agente causal. a) Caractersticas de las lesiones. b) Presencia de esporas, micelio, cuerpos fructferos o cualquier estructura (hacer esquemas). c) Exudaciones (color, consistencia etc.) d) Presencia de insectos o caros. e) Evidencia de daos mecnicos El material colectado puede emplearse para: a) Realizar aislamientos del agente causal. En este caso se puede prensar o preservarse en refrigeracin. b) Como material de herbario, emplendose el prensado, o bien la preservacin en fijadores* como alcohol al 70%, F.A.A. o solucin de Hesler. En el primer caso los ejemplares deben ser montados en cartulinas blancas de 25 x 45 cm., siguiendo las tcnicas de herbario acostumbradas. Todo el material preservado debe llevar su etiqueta correspondiente. *Preparacin de soluciones preservadoras. F.A.A Formol al 40% ........................... 10 ml. Acido actico glacial ................ 10 ml. Alcohol al 50% ........................100 ml. SOLUCION DE HESLER Agua destilada .......................1000 ml. Cloruro de Zinc .........................50 ml Formalina ..................................25 ml. Glicerina ...............................25 ml. NOTA: Los alumnos traern la colecta fitopatolgica BIBLIOGRAFIA.
1. Echandi, E. 1975. Manual de Laboratorio de Fitopatologa General. Herrero Hnos. Mxico. 2. Gavio, G.G. y H. Figueroa. 1975. Tcnicas Biolgicas Selectas de Laboratorio y Campo. Limusa. Mxico.
3. Gonzlez, L.C. 1977. Introduccin a la Fitopatologa. I.I.C.A. San Jose de Costa Rica. 4. Lpez A.G. 1978. Tcnicas de uso comn en el manejo de Hongos fitopatgenos. Tesis. E.N.A. Mx. 5. Narayanasamy, P. 2001. Plant pathogen detection and diseases diagnosis. Marcel Dekker Inc. 518 pp. 6. Roberts, G. y C. Boothroyd. 1972. Fundamentos de Patologa Vegetal. Acribia. Zaragoza. 7. Tuite, J. 1964. Plant Pathological Methods, Fungi and Bacteria. Burges Pobl. Co. Minneapolis. 8. Trigiano, R. N., Windham, M. T. and Windham, A. S., 2004, Plant pathology, Concepts and Laboratory. CRC Press, Boca Raton, London, New York, Washinton, D.C., 413 pp.
PRACTICA 2 PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO Y METODOS DE AISLAMIENTO.

INTRODUCCION En el diagnstico de las enfermedades vegetales, el trabajo de laboratorio de suma importancia, ya que ah donde se efecta la identificacin del agente causal, lo que permite la posibilidad de aplicar los mtodos de control ms adecuados. El proceso de identificacin de un patgeno requiere el aislamiento del mismo, para lo que es necesaria la elaboracin de medios de cultivo que permitan el desarrollo de dicho patgeno. OBJETIVOS Adiestrar a los alumnos en la preparacin de medios de cultivo y en las tcnicas de aislamiento de agentes fitopatgenos ms utilizadas. REVISION BIBLIOGRAFICA El diagnstico de las enfermedades se fundamenta en los Postulados de Koch. Que revisten gran importancia dentro de la Fitopatologa, ya que deben seguirse siempre que se est frente a una enfermedad de la que desconozca o se dude del agente causal. Los postulados de Koch son los siguientes. 1.- El agente causal debe estar constantemente asociado con la enfermedad. 2.- El organismo debe ser aislado y cultivado en el cultivo puro. 3.- Al inocular una planta susceptible sana, debe desarrollarse la enfermedad original.
4.- El organismo patgeno debe ser aislado de la planta infectada bajo condiciones experimentales. Aislamiento. En la naturaleza abundan los microorganismos que se desarrollan estrechamente relacionados entre s, de manera que encontramos bacterias, hongos y otros organismos de muy diversos tipos, tanto de vida libre como parsitos. Para poder estudiarlos y conocerlos se deben cultivar en modos adecuados y aislndolos del suelo o de partes vegetales enfermas. A partir de la primera muestra que se coloca en un medio de cultivo, se obtiene un cultivo mixto, del que se deben tomar nuevas muestras para realizar otros cultivos seleccionados de las diferentes colonias, hasta lograr que en el medio solo se desarrollen un tipo de organismo, stos es, un CULTIVO PURO. Para realizar aislamientos a partir del suelo, existen diversas tcnicas como el de Placa Directa y el de Dilucin en Serie. En el caso de que el patgeno se encuentre en las partes vegetales se puede proceder a realizar aislamientos directos, utilizar cmaras hmedas, colocar partes vegetales en el medio de cultivo, a travs de trampas, etc. Medios de cultivo. Los medios de cultivos son mezclas de sustancias nutritivas que se utilizan para el aislamiento, determinacin, desarrollo, reproduccin y diagnstico de aquellos organismos productores de enfermedades en las plantas, que se comportan como parsitos facultativos. Para lograr el desarrollo y produccin de las diferentes especies fitopatgenas, los medios de cultivos deben reunir caractersticas especiales, tomando en cuenta los factores que se mencionan a continuacin. Nutrientes: en el medio de cultivo, debern estar presentes elementos nutricionales tales como fuentes de carbono, nitrgenos, macroelementos (P, K, Mg, Ca), microelementos (Fe, Zn Mn, Cu, Mo ), vitaminas, etc. Humedad: Deber proporcionarse una humedad relativa favorable a los fitopatgenos que se desee cultivar, generalmente requieren de 50% o ms. Temperatura: Los valores ptimos de stas son muy variables para cada especie, pero la mayora de ellos pueden crecer en un rango de 10 a 25 C. Este es un factor determinante para el desarrollo y reproduccin. pH: Tambin en este caso, los valores ptimos son muy variables, pero en general los hongos fitopatgenos se desarrollan y reproducen mejor en pH ligeramente cido, mientras que las bacteria en uno alcalino. Luz: Este factor afecta en algunos casos la reproduccin de los fitopatgenos, pero en general no influye.
Asepsia: Los medios de cultivo deben esterilizarse y mantenerse a salvo de cualquier contaminacin. Clasificacin de los medios de cultivo. Los medios de cultivo pueden ordenarse de acuerdo a su consistencia, quedando de la siguiente manera: composicin o a su
1.- Composicin 1.1. Medios sintticos: Son aquellos medios de cultivo en los que se conoce exactamente la composicin de cada uno de sus componentes, por ejemplo: Agar Czapek. 1.2. Medios complejos o semisintticos: En estos la composicin de uno de los componentes no se conoce de manera exacta, o bien se componen de sustancias naturales y sustancias sintticas, por ejemplo: harina de maz-agar. 1.3. Medios de cultivos naturales: Se forman a partir de material vegetal natural, por ejemplo: tejidos vegetales, frutos, vainas, tubrculos, races, etc. 2. Consistencia 2.1 Medios slidos. Contienen esencialmente agar. ( 2-3 % ) gelatina ( 10-15 %) albumina etc., materiales que al enfriarse quedan completamente slidos. Muy empleados para el aislamiento y la reproduccin de hongos y bacterias. 2.2 Medios semislidos. Contienen bajas proporciones de agar y gelatina, mezclados o separados; al enfriarse permanecen en estado coloidal. Se emplean para mantener cultivos por largo tiempo. 2.3 Medios lquidos: Son preparados sin agar, gelatina u otras sustancias solidificantes, por lo que permanecen lquidos an al enfriarse, se emplean cuando se necesita incrementar el inculo de hongos o bacterias. Entre los medios de cultivos de uso frecuente en Fitopatologa estn los siguientes: 1.- PDA ( papa-dextrosa-agar) 2.- AN (agar nutritivo ) 3.- HFA ( harina de frijol-agar) 4.- V8A ( jugo V8-agar) 5.- AVA ( avena - agar ) 6.- TSA (jugo de tomate- sal- agar) 7.- MM ( medio de Martin) 8.- VFA (vaina de frijol-agar ) 9.- AA ( agua-agar) 10.- HMA ( harina de maz-agar) 11.- JFA ( jugo de frijol agar) 12.- JTA (jugo de tomate-agar) 13.- MSA ( malta-sal-agar)
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14 .- BA 15.- BK
(Bonner- Addicot) (medio B de King)
Preparacin de los medios de cultivo 1.- PDA (papa-dextrosa-agar) Este medio de cultivo se utiliza para el aislamiento, crecimiento y reproduccin de varios hongos y de bacterias como Xanthomonas y Agrobacterium. Ingredientes : Papa......................................200gr Agar........................................ 15gr. Procedimiento: Partir 200 gr. de papa sin cscara y cubrirlo con agua destilada. Se deja hervir durante 15 min. Concluido ste tiempo se cuela la infusin o caldo de papa a travs de manta de cielo. Se disuelve el agar en 500 ml. de agua destilada, calentando ligeramente, se le agrega la dextrosa y se disuelve. Se aade la solucin de agar daxtrosa al caldo de papa mezclando bien y se afora con agua destilada a 1000 ml. y se esteriliza. 2.- AA (agua-agar) Este medio de cultivo se utiliza para el aislamiento de hongos del suelo como Phytium y algunos Actinomicetos. Ingredientes: Agar.....................................15gr. Procedimientos: Se disuelve el agar en el agua destilada, calentando ligeramente, se afora a 1000 ml y se esteriliza. 3. AN ( agar nutritivo o extracto de carne-agar) Este medio de cultivo nos sirve para cultivar bacterias como Erwinia, Pseudomonas y Corynebacterium. Agua destilada.....................aforar a 1000 ml
Dextrosa.............................20gr. Agua destilada....................aforar a 1000 ml
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Ingredientes: Extracto de carne de res..................................................3gr. agua destilada.................aforar a 1000ml. Peptona...............................................15gr. agar..................................5 gr. Procedimiento: Disolver el agar en 500 ml. de agua destilada calentando ligeramente, luego agregar la peptona y el extracto de carne y disolver, por ltimo aforar con agua destilada a 1000 ml. 4.- HMA (harina de maz-agar) Este medio de cultivo sirve para aislar hongos de los gneros Pythium y Phytophthora. Ingredientes: Harina de maz ............................20gr. Peptona........................................20gr. Agua destilada.............aforar a 1000 ml. Procedimiento: En 500 ml. de agua destilada a 70 C se agrega la harina de maz y se calienta por 1 hr. a 60 C se filtra la infusin a travs de manta de cielo. La solucin filtrada se clarifica centrifugando por 20 min. a 3000 RPM. Decantar y juntar el lquido sin slidos producto de la centrifugacin. Disolver el agar, la dextrosa y la peptona en 300 ml de agua destilada calentando ligeramente. Aadir el lquido centrifugado a la solucin de agardextrosa-peptona y aforar con agua destilada a 1000 ml. Esterilizar. 5.- HFA (harina de frijol- agar) Este medio de cultivo se utiliza para cultivar algunas especies del gnero Phytophthora. Ingredientes: Harina de frijol ..................30gr. agar ..........................................20gr. Agua destilada....................aforar a1000ml. Procedimiento: En 500 ml. de agua destilada se agregan los 30 gr. de harina de frijol, se calienta la solucin a 60-70 C. Se filtra la infusin a travs de manta de cielo. La solucin filtrada se clarifica centrifugando durante 20 min a 300 RPM. Se decanta y se junta el lquido sin slidos, producto de la centrifugacin. agar................................................20gr. dextrosa..........................................20gr.
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Disolver el agar en 300 ml de agua destilada calentando ligeramente. Aadir el lquido centrifugado a la solucin de agar mezclndolo bien. Finalmente aforar con agua destilada a 1000 ml. Esterilizar. 6.- JFA ( jugo de frijol - agar) Este medio de cultivo se emplea para cultivar Colletotrichum lindemuthianum. Ingredientes: Jugo de frijol proveniente de vainas prensadas o molidas..............215 ml. Agar .................................................10 gr. Agua destilada ...............................aforar a 1000ml. Procedimiento: Obtener el jugo de frijol prensado o moliendo las vainas verdes. Disolver el agar en 285 ml. de agua destilada, calentando ligeramente. Aadir la solucin de agar al jugo de frijol y esterilizar. 7.- V8A (jugo V8- agar ) Este medio se prepara de dos formas, segn la especie de hongo que desee cultivar. Para aislar a Phytophthora infestans y Phythium. Ingredientes: Jugo V8 centrifugado*...................20ml. Agar................................................15gr. CaCo3 ..........................4.5gr. Agua destilada..........aforar a 1000 ml
B) Para aislar a Phytophthora parasitica y Ph. palmivora. Ingredientes: Jugo V8 centrifugado*.........................100 ml. Agar......................................................15gr. CaCo3............................2gr. Agua destilada..............aforar a 1000ml.
*En ambas frmulas se puede sustituir el jugo V8 por jugo de tomate simple. Procedimiento: Agregar el CaCo3 al jugo V8 o de tomate. Agitar hasta disolverlo. Dejar reposar la solucin durante 10 min. Centrifugar para clarificar durante 20 min a 3000 RPM. Se decanta y se junta el lquido sin slidos, resultante de la centrifugacin, hasta completar la cantidad requerida.
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Para la frmula A) disolver el agar en agua destilada, calentando ligeramente. Aadir a la solucin de agar el jugo V8 o de tomate centrifugado y aforar con agua destilada a 1000 ml. Para la frmula B) utilizar 900 ml. de agua destilada para disolver el agar, mezclando esta solucin con el jugo V8 o de tomate centrifugado. 8.- JTA ( jugo de tomate-agar) Este medio de cultivo se utiliza para aislar a Phytophthora capsici. Ingredientes: Jugo de tomate natural...................60 ml. Agar ...............................................14gr. Procedimiento: Se muelen los tomates y se cuelan a travs de una manta de cielo. El jugo se mezcla con el CaCo3, se agita bien y se deja reposar durante 10 min. Para clarificar, se centrfuga durante 20 min a 3000 RPM. Se decanta y se junta todo el lquido centrifugado hasta completar la cantidad requerida. Se disuelve el agar en otro poco de agua destilada (800ml. ) y se aade la solucin centrifugada, mezclando bien. Se esteriliza. 9.- AvA (avena-agar) Este medio de cultivo se utiliza para aislar especies de los gneros Phytophthora y Pythium. Ingredientes: Avena ..60 gr Extracto de levadura. 2 gr. Procedimieto: En 600 ml de agua remojar 60 gr de avena durante 24 hr. Despus hervir durante 30 min. Filtrar la infusion a traves de una manta de cielo. Para clarificar la solucin colada, centrifugar durante 20 min. a 300 RPM. Decantar y juntar el lquido sin slidos producto de la centrifugacin. Disolver el agar en 400 ml de agua destilada calentado ligeramente. Disolver el extracto de levadura en la solucin de agar. Aadir a esta solucin la infusin de avena centrifugada, mezclar bien y aforar con agua destilada a 1000 ml Esterilizar. MSA (malta -sal-agar). Este medio de cultivo se utiliza para aislar principalmente a los hongos que atacan granos almacenados. Ingredientes: NaCl.7.5 gr Agar12 g Agua destiladaaforar a 1000 ml Ca Co3...............0.6gr. Agua destilada...........aforar a 1000 ml.
Agar .7.5 gr
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Extracto de Malta ..20 gr
Agua destilada .aforar a 1000 ml
Procedimiento: En 400 ml de agua disolver el agar calentando ligeramente. Disolver el extracto de malta en la solucin de agar. En 500 ml de agua destilada disolver la sal calentando ligeramente. Aadir la solucin de extracto de malta-agar, la solucin de sal, mezclando bien. Aforar con agua destilada a 1000 ml. Esterilizar por NO MAS de 15 min. 11. TSA (JUGO DE TOMATE-SAL-AGAR). Este medio de cultivo se utiliza para aislar hongos de granos almacenados. Ingredientes: Jugo de tomate-agar (medio deshidratado) NaCl100 gr o 90 ml de jugo de tomate de lata Agua destilada ...aforar a1000 ml. Agar.15 gr (si se usa medio deshidratado) 30 gr (para jugo de tomate) Procedimiento: En 500 ml de agua destilada se disuelve el jugo de tomate-agar (medio deshidratado) y el agar, calentando ligeramente. Si se mezcla con el agar y 200 ml de agua, se centrifuga durante 20 min. a 3000 RPM, y se mezcla bien calentado ligeramente. En 400 ml de agua se disuelve la sal calentando ligeramente. Se aade a esta solucin la de jugo de tomateagar mezclando bien y se afora a 1000 ml. Esterilizar. 12. BA (Bonner- Addicott). Este medio de cultivo sirve omnivorum. Ingredientes: KNO3 (nitrato de potasio)0.808 gr MgSO4 o7H2C (sulfato de magnesio) ...0.0369 gr para aislar y desarrollar a Phymatotrichum
Ca(NO3)H2O (nitrato de calcio)0.236 gr
KH2PO4 Fosfato dicido de potasio ..0.0108 gr FeCl3 (tartato frrico)0.0010 Agar 25.000gr
KCl (cloruro de potasio).0.6486 gr gr Glucosa 20.00 gr Agua destiladaaforar a 1000 ml. Procedimiento.
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En 500 ml de agua destilada disolver el agar y la glucosa calentando ligeramente. En 500 ml de agua destilada disolver todos los dems componentes uno por uno. Aadir a la solucin de glucosa-agar la solucin del resto de los componentes, mezclando bien. Ajustar el pH a 7.0-7.5, midiendo con papel pH y agregando HCl si se necesita acidificar o NaCl si se trata de alcalinizar. 13. MM (medio de Martin). Este medio de cultivo se utiliza para aislar a los hongos del suelo. Ingredientes: Dextrosa10 gr. Peptona.. 5 gr. KH2PO4.1 gr. Agar..20gr. Procedimiento: Para preparar la solucin de Rosa de Bengala se disuelve 1 gr de colorante en 100 ml de agua; de esta solucin se toman los 3.5 ml para agregarlos a 1000 ml de medio de cultivo. En 500 ml de agua destilada se disuelve el agar, calentando ligeramente, y en los restantes 500 ml se disuelven uno a uno los dems componentes. Despus se mezclan bien las dos soluciones. La estreptomicina se prepara separadamente, momentos antes de vaciar el medio en las cajas de Petri. Se disuelve 1 gr de estreptomicina en 150 ml de agua destilada estril. Se agrega 0.05 ml de estreptomicina en solucin a cada caja de Petri (esto es para inhibir el crecimiento de las bacterias) 14. BK (B de King). Este medio de cultivo sirve para aislar diferentes gneros de bacterias. Ingredientes: Peptona...20 gr. Glicerina.10 ml MgSO41.5 gr. Agar.15 gr. K2HPO4..1.5 gr. Agua destiladaaforar a 1000 ml Estreptomicina...1 gr. MgSO4.7H2O(sulfato de magnesio hidratado)..0.5gr. Rosa de Bengala3.5 ml. Agua destiladaaforar a 1000 ml.
Procedimiento: Se disuelve el agar en 500 ml de agua calentando ligeramente y despus se le aade la glicerina. En otros 300 ml de agua se disuelven los dems componentes agregndole a esta solucin la de agar- glicerina. Se mezcla bien y se esteriliza. 15. VFA (vainas de frijol-agar). Este medio de cultivo sirve para aislar a Colletotrichum lindemuthianum.
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Ingredientes: Vainas de frijol.250 gr. Agua destilada.aforar a 1000 ml. Procedimiento: En 500 ml de agua destilada se aaden las vainas cortadas en trozos muy pequeos. Se calienta a 60 C durante 30 min. Se filtran a travs de una manta de cielo y papel filtro. Se disuelve el agar en 300 ml de agua destilada calentando ligeramente, se le aade la infusin filtrada, mezclando bien y se afora a 1000 ml. Esterilizar. MATERIALES 2 Matraces de 250 ml limpios y ertriles. 2 Pinzas de diseccin 1 Matraz con 500ml. de agua destilada estril 4 Recipientes de plstico p/desif. 1 Soporte universal con tela de asbesto 1 Probeta de 100ml. 1 Mechero 1 Gradilla 1 Agitador 6 Tubos de ensaye c/9 ml. de agua estril 1 Pizeta con cloro al 50% 2 Vasos de precipitado p/calibrar * 2 Papel filtro estril tamao de 8 x 12 cm. 1 Balanza granataria* 12 Cajas de Petri limpias y estriles 1 Frasco de agar 2 Cjas de Petri para cmara humeda 1 Frasco de dextrosa* 2 Agujas de diseccin 1 Frasco de malta 1 Centrifuga 1 Frasco de carbonato de calcio NOTA: Los reactivos para la elaboracin de los medios de cultivo puedes variar de acuerdo a la cantidad y diversidad de medios de cultivo que elabore el grupo. Vaciado del Medio de Cultivo a Cajas de Petri. Para llenar las cajas de Petri con el medio de cultivo de una manera asptica, realice lo siguiente: A. Limpiar la mesa con una solucin de cloro 2:1 en agua o benzal B. Colocar y encender el mechero o lampara de alcohol. Poner las cajas y recipientes con el medio sobre la mesa. C. Tomar el recipiente con el medio de cultivo y destaparlo con la mano izquierda; pasar la boca del recipiente sobre la llama del mechero. Conservar el tapn en la misma mano con que sostiene el recipiente del medio. D. Tomar con la mano derecha una caja y levantar la tapa lo suficiente para vertir el medio; vaciar en cada caja de 10 a 12 ml. del medio. E. Colocar la tapa de la caja de Petri suavemente en su sitio y tapar el recipiente con el medio de cultivo. F. Distribuir uniformemente el medio con movimientos de rotacin de la caja sobre una superficie horizontal. G. Deje solidificar. H. Una vez solidificado el medio, realizar pruebas de esterilidad por incubacin a 35 C durante 48 hrs. Agar.15 gr.
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TCNICAS DE AISLAMIENTO 1. Aislamiento a partir del suelo.

1.1. Placas directas. En cajas de petri con medio de cultivo solidificado, agregue
pequeas porciones de suelo son una esptula. Incube a 24 C Cuando hayan crecido colonias de hongos o bacterias, transfiera pequeas placas por separado a nuevas cajas o tubos con medio estril, con ayuda de una aguja de diseccin. Se recomienda usar agua-agar. 1.2. Dilucin en serie. Se mezcla 1gr de suelo en 10 ml de agua destilada estril. Se deja reposar de 1 a 2 min. Se transfiere 1 ml del sobrenadante a otro tubo con 9 ml de agua destilada estril y se repite as tres veces mas. Posteriormente de cada tubo se toma 1 ml y se coloca en una caja de Petri, usando una para cada dilucin. Agregue a las cajas, previamente, agua-agar o medio de Martin, a temperatura soportable por el dorso de la mano. Incube a 24 C. Las colonias de microorganismos se observan de 2 a 3 das despus .
2. Aislamientos a partir de vegetales enfermos. 2.1. Aislamiento directo. Observe al microscopio de diseccin el ejemplar enfermo; si
encuentra fructificaciones, micelio, etc., tome una muestra de este material con una aguja de diseccin estril y colquelo directamente sobre el medio de cultivo solidificado. Incube a 24C y observe a los 7 das. 2.2. Cmara hmeda. Cuando la planta presenta micelio y no hay fructificaciones o cuando no se aprecia el crecimiento del patgeno, se recurre al uso de la cmara hmeda. Se toma una porcin de tejido enfermo y se desinfecta en una solucin 2:1de cloro (NaOCl). En una caja de Petri estril, que contenga papel filtro esterilizado, se humedece con agua destilada estril. Sobre el papel se colocan pequeos trozos del vegetal enfermo y se cierra la caja. Se incuba a 24C durante 2 o 3 das y se observan resultados. 2.3. Partes vegetales en medio de cultivo. La porcin que interesa se desinfecta en cloro (NaOCl), se enjuaga con agua destilada estril y se coloca en cajas con PDA solidificado. Se incuba a 24C y se observa despus de 4 a 5 das. Cuando se desea aislar bacterias, los tejidos se lavan y se sumergen en un tubo con agua destilada estril, se hacen diluciones que se agregan a cajas con PDA. Incube las cajas a 24C y observe despus de 5 das. 2.4. Trampas. Plante semillas o porciones vegetales en suelo infectado, proporcione humedad e incube a temperatura ambiente. Despus de 4 a 5 das se podr apreciar el crecimiento del patgeno. Proceda a aislarlo con la tcnica anterior CUESTIONARIO. 1. A qu tipo de medios de cultivo (natural, semisinttico o sinttico) pertenecen los utilizados en esta prctica? Explique su respuesta. 2. Qu es la esterilizacin y cuales son los mtodos mas frecuentes para esterilizar materiales fitopatolgicos? 3. Describa los tipos de colonias que surgieron en los aislamientos a partir del suelo y partes vegetales enfermas.
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4. Calcule el numero de organismos que surgieron en los aislamientos a partir del suelo por el mtodo de dilucin, de la siguiente manera No. de colonias x dilucin empleada x volumen inicial = No. de organismos en 1ml Ejemplo: 2 colonias x
1 1000
x 10 ml = 0.02 organismos por ml.
5. Cmo realizara un cultivo de Puccinia graminis tritici y del virus del mosaico
amarillo del frijol, a partir de vegetales enfermos? BIBLIOGRAFIA

1. Agrios, G. N. 2005.Plant pathology. 5th ed. Elsevier academic Press. Amsterdam, Boston, Heidelberg, London, New York, Oxford, Paris, San Diego, san Francisco, Singapore, Sydney, Tokyo. 992 pp. * 2. Dhingra, O. D., and Sinclair J. B. 1985. Basic Plant Pathology Methods. CRC Press. 355 pp 3. Echandi, 1975. Op. cit. 4. French, E.R. y Her. 1980. Mtodos de Investigacin Fitopatolgica. IICA. Costa Rica. 5. Gavio, G. C., C. Jurez y H. Figueroa. 1975. Op. cit. 6. Lpez A.G. 1978. Op. cit. 7. Narayanasamy, P., 2001, Plant pathogen detection and disease diagnosis. Marcel Dekker Inc., 518 pp. 8. Schots, A., Dewey, F. M. and Oliver, R., 1994. Modern assay for plant pothogenic fungi. C A B International, 267 pp. 9. Trigiano, R. N., Windham, M. T. and Windham, A. S., 2004, Plant pathology, Concepts and Laboratory. CRC Press, Boca Raton, London, New York, Washinton, D.C., 413 pp.
PRACTICA 3 GENERALIDADES DE MICROORGANISMOS

INTRODUCCION. En el proceso de diagnstico de las enfermedades de las plantas, la identificacin del agente causal ocupa un lugar preponderante. Las enfermedades vegetales pueden ser causadas por agentes abiticos y biticos. Las tcnicas de identificacin particularizan en los agentes biticos, es decir, en los microorganismos fitopatgenos, entre los que encontramos virus, viroides, micoplasmas, espiroplasmas, riquettsias, bacterias, hongos y nemtodos. De estos, algunos son tan pequeos o requieren de tcnicas microscpicas tan elaboradas para su observacin, que
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es imposible determinar su morfologa en un laboratorio escolar, en tanto que otros se prestan a su trabajo en stos. Concretamente, los que resultan mas fciles de identificar son las bacterias, los hongos y los nemtodos. OBJETIVOS. Reconocer las caractersticas morfolgicas que distinguen a las bacterias, a los hongos y a los nemtodos, en preparaciones temporales y permanentes.
PRIMERA PARTE: VIRUS (esta parte se har con equipos que trabajen virus fitopatgenos en su seminario) Purificacin de partculas virales REACTIVOS Fosfato potsico Sulfito de sodio Cloroformo Tetracloruro de carbono Glicol-polietileno (PEG) SOLUCIONES Solucin 1: Fosfato potsico 0.5M (1:2 p/v), pH=7.5, con 0.5% sulfito de sodio. Solucin 2: Glicol-polietileno al 6% (PEG). Solucin 3: Fosfato de potasio 0.25 M, pH=7.5 Solucin 4: glicol-polietileno al 20.0% (PEG). METODOLOGA 1. Pesar un gramo del tejido cosechado 2. Lavarlo bajo el chorro de agua corriente 3. Someterlo a un lavado con Tween 20 sobre agitador magntico por 3 minutos 4. Lavarlo con una solucin de cloro al 10% por 4 minutos en agitador magntico 5. Enjuagar con agua destilada estril (150 ml en vaso de precipitado) sobre agitador magntico por un minuto. 6. Dar un enjuage final con con agua destilada estril (150 ml en vaso de precipitado) sobre agitador magntico por un minuto. 7. Secar en papel filtro. 8. Colocar en bolsa para macerar 9. Agregar 2 ml de la solucin 1 10. Macerar 11. Agregar 1 ml de la solucin al macerado 12. Macerar 13. Decantar en un tubo tipo Ependorf, en caso necesario agregar 1 ml de solucin 1 para facilitar la decantacin. 14. El macerado se homogeniza durante un minuto.
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15. Enseguida se agregan al homogenizado Cloroformo y Tetracloruro de carbono (0.5:1 v/p de cada uno). 16. Homogeneizar dos minutos ms. 17. Centrifugar a 5000 rpm durante cinco minutos. 18. El sobrenadante que resulta se trata con la solucin 2 y se agita en fro (4 C) durante dos horas. 19. Se centrfuga a 8 500 rpm durante diez minutos. 20. El precipitado obtenido se resuspende en la solucin 3 y se incuba durante seis horas. 21. Despus se centrfuga a 10,000 rpm durante diez minutos. 22. Al sobrenadante se aade la solucin 4 (2 ml PEG/5 ml sobrenadante). 23. Se incuba durante una hora en fro (4 C). 24. El precipitado se centrfuga a 12,000 rpm durante diez minutos. 25. Despus se resuspende en la solucin 3 (0.5 ml de solucin por cada 100 g de tejido). 26. Despus de doce horas, se centrfuga a 10,000 rpm durante diez minutos. 27. Se usa el sobrenadante para el diagnstico. RESULTADOS:
SEGUNDA PARTE: BACTERIAS Las bacterias son microorganismos pertenecientes al reino Monera. Se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza. Su forma puede ser esfrica, bacilar o espiralada. Se encuentran constituidos por una cpsula de secrecin, pared celular, membrana y citoplasma este ltimo conteniendo grnulos de grasa, vacuolas, pigmentos y material gentico disperso, es decir, carecen de ncleo verdadero. La pared celular determina la forma de las bacterias y es selectiva, pudiendo contener aminocidos aromticos, cido murmico y azcar. Dependiendo de la cantidad de estos, las bacterias pueden teirse de rojo o de violeta al seguir la tcnica de tincin de Gram. Se conocen aproximadamente 1600 especies de bacterias. La mayora son saprfitas obligadas, y como tales benefician al hombre porque ayudan descomponiendo grandes cantidades de materia orgnica y deshechos animales y vegetales. El manual de Bergey cita 180 especies de bacterias reconocidas como fitopatgenas, de las cuales, con pocas excepciones, todas son saprfitas facultativas, por lo que pueden ser cultivadas en medios artificiales. Ciertas bacterias son flageladas y pueden desplazarse en medios lquidos. Algunas forman esporas, aunque no es el caso de las fitopatgenas. Todas las bacterias fitopatgenas conocidas hasta el presente son aerobias, an cuando existen anaerobias facultativas, facultad que no ejercen dentro del tejido vegetal. ACTIVIDADES.
1. Elaboracin de preparaciones temporales y permanentes de bacterias. 2. Tincin de bacterias por el mtodo de Gram, Tincin de cpsula y productos de
excrecin, Tincin de flagelos.
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3. Observacin de preparaciones temporales permanentes de bacterias. 4. Esquematizacin de lo observado, indicando los nombres de las estructuras.
MATERIALES Y METODOS. Porta y cubreobjetos Caja de petri Agujas de diseccin Cultivos de bacterias Preparaciones de bacterias Mordiente para tincin de flajelos Tejidos vegetales enfermos Cristal violeta para tincin de Gram Safranina para tincin de gram Tinta china bacteriolgica Sulfato de cobre Lugol Cristal violeta para flagelos Alcohol etlico
ANTES DE EMPEZAR A TRABAJAR, DESINFECTE LA MESA CON CLORO TECNICA PARA REALIZAR PREPARACIONES TEMPORALES Trabaje cerca de la flama. Flamee el asa o aguja de diseccin para evitar contaminaciones. Con el asa tome una pequea muestra de microorganismos del cultivo, colquela en un portaobjetos limpio con una gota de agua destilada. Coloque el cubreobjetos, evitando que se formen burbujas colocando inclinado, y cuando el lquido se haya extendido por el borde, deje caer el cubreobjetos suavemente. Observe la preparacin al microscopio usando diferentes objetivos. Siempre se empieza por 10X. Recuerde que a 100X es necesario usar aceite de inmersin. Puede teir la preparacin siguiendo las tcnicas adecuadas. TINCION DE PRODUCTOS DE EXCRESION Y CAPSULA DE BACTERIAS. 1. Coloque en un portaobjetos una gota de tinta china bacteriolgica, agregue una pequea muestra de bacterias, coloque el cubreobjetos y observe. 2. Haga un frotis, squelo al aire, agregue cristal violeta durante 2 min. Lave con sulfato de cobre al 2 % Squelo con papel absorbente. Las cpsulas aparecen en color azul y violeta y los cuerpos bacterianos en azul obscuro. COLORACION DE GRAM. Reactivos: Solucin de Cristal violeta con oxalato de amonio: Solucin A: Cristal violeta2.0g. Alcohol etlico20ml Solucin B Oxalato de amonio..0.8g. Agua destilada.80ml Mezclar las soluciones A y B Solucin lugol
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Yodo1.0g. KI.2.0g Agua destilada...100ml.
Colorante de contraste ( solucin de afranina) Safranina al 2.5% en alcohol etlico al 95%................10ml. Agua destilada100ml. En una gota de agua coloque una pequea masa de bacterias esparcindolas a lo largo. Debe de ser un cultivo de 24 horas. Fije la preparacin al aire o con calor (a la flama). Cubra la preparacin con cristal violeta 1 min. y decante. Cubra la preparacin con lugol 1 min y lave con agua corriente. Decolore con alcohol etlico por 30 seg. agitando para una decoloracin homognea, lave con agua corriente. Cubra la coloracin con safranina 1 min. y lave con agua corriente. Absorba el agua con papel sin frotar. Observe al microscopio. TINCION DE FLAGELOS DE BACTERIAS. *Mordiente: Acido tnico..20 gr Agua caliente..80ml Posteriormente adicionamos 15 ml Trixido de Cromo al 2.5%, finalmente dejamos reposar durante cuatro das a temperatura de 180, filtramos y usamos Cristal violeta Cristal violeta..0.5g Fenol2.5g Etanol a 97%................................................20ml. Glicerina80ml. Agua destilada100ml. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Se prepara un frotis y se seca al aire. Se aade el mordiente filtrado y se deja de 1 a 5 min. Se lava con agua cuidadosamente. Se cubre con cristal violeta se deja actuar 2 min. Se repite el lavado de la misma forma. Se seca la preparacin al aire. Se observa al microscopio con el objetivo de inmersin. TERCERA PARTE: HONGOS Los hongos comprenden al grupo ms numeroso de microorganismos fitopatgenos, siendo adems los causantes de las mayores prdidas econmicas agrcolas, debido al gran nmero de enfermedades que ocasionan.
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Se considera que todas las plantas son susceptibles al ataque de por lo menos un hongo, y muchas son afectadas por un gran nmero de estos organismos. El hbitat de los hongos es muy amplio, ya que se encuentran en el suelo, en el agua y dentro o sobre plantas y animales. Pueden desarrollarse en condiciones climticas muy variadas, encontrndolos en rangos de temperatura que van desde los 0C hasta los 50 . Los hongos pertenecen al reino Fungi, son microscpicos y macroscpicos, uni y pluricelulares, carentes de clorofila. Estn constituidos por clulas redondas u ovales solitarias o en plasmodios, o ms frecuentemente por estructuras alargadas y ramificadas llamadas hifa, cuyo conjunto se denomina micelio. Cada hifa est constituida por una pared celular que protege a la membrana celular y al contenido protoplasmtico, en donde se encuentran dispersos sus ncleos verdaderos, as como las mitocondrias, ribosomas, retculo endoplsmico y grnulos de sustancias de reserva. Si las hifas estn separadas en celdas, se dice que el micelio es septado, y si el protoplasma es continuo en las hifas el micelio es cenoctico. En algunos hongos el micelio llega a formar pseudotejidos. Prosnquima y pseudoparnquima . Entre las estructuras de reproduccin asexual estn , los odos, clamidosporas, esporangios y conidios, estos ltimos solitario o agrupados en sinemas, esporodoquios, acrvulos o picnidios. Algunas estructuras de reproduccin sexual son las oosporas, ascas -libres o en apotecios, peritecios y cleistotecios- y basidios, que nacen directamente de una espora de resistencia o en basidiocarpos. ACTIVIDADES. 1. Elaboracin de preparaciones temporales y permanentes de hongos, utilizando diferentes tcnicas de tincin. 2. Observacin de preparaciones permanentes de hongos. 3. Esquematizacin de lo observado, indicando los nombres de las estructuras.
MATERIALES Y METODOS. Porta y cubreobjetos Mechero o lampara de alcohol Caja de Petri Agujas de diseccin Tejidos vegetales enfermos Azul de lactofenol azul de metileno rojo congo lugol preparaciones de hongos cultivos de hongos Azul de algodn
PREPARACIONES TEMPORALES DE HONGOS 1. Con una asa estril (o una aguja de diseccin ), tome una pequea muestra de hongos y colquela en un portaobjetos con una gota de agua destilada. 2. Extienda el micelio y agregue una gota de azul de metileno.
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3. Coloque el cubreobjetos y observe al microscopio. TINCION CON ROJO CONGO. 1. 2. Realice una preparacin temporal de hongos, usando lactofenol en lugar de agua para colocar el micelio. Coloque el cubreobjetos y por un extremo agregue una gota de rojo congo*, permita que se difunda y observe al microscopio. Esta tcnica se puede seguir, sustituyendo colorantes. IMPORTANTE. Al final de cada prctica todo el material biolgico y medios de cultivo: Antes de lavarlo se esteriliza, los desechos slidos se colocan en el lugar indicado para estos, se lava, se seca se vuelve a esterilizar y se entrega al laboratorista en las mismas condiciones en que lo recibi para llevar a cabo la prctica
MICROCULTIVO
Introduccin. Una vez que se tiene el resultado de las diferentes tcnicas de aislamiento como lo es la obtencin de la cepa pura, el siguiente paso para cumplir a cabalidad con el segundo postulado de Koch, es la identificacin del agente causal y una herramienta ms para cumplir con este objetivo, en caso que este agente causal sea un hongos como en la mayora de las enfermedades que limitan la produccin agrcola: es la tcnica de microcultivo; con esta tcnica se obtienen las distintas fases del ciclo de vida de los hongos, que va de germinacin de la espora, formacin del tubo germinativo, hifas, micelio, diferenciacin de las estructuras reproductivas asexuales y sexuales. Se debe dar un manejo de tiempos en el desarrollo de los hongos para poder observar las estructuras desde el inicio de su formacin. Por ejemplo esta tcnica resulta sumamente til para aquellos hongos en los que es difcil observar la formacin de los condios sobre los conidiforos y la forma y estructura de stos; porque, al efectuar el preparado correspondiente, se desprenden y/o se rompen. Mediante este mtodo se puede observar bajo el microscopio, su crecimiento y esporulacin en todos sus detalles y as tener elementos morfolgicos de estructuras somticas y reproductivas completas para as poder hacer la identificacin con mayor confiabilidad y conocer a los hongos como agentes causales de enfermedades en los cultivos de importancia agrcola Dhingra, and Sinclair(1985) Trigiano, Windham,. and Windham,, (2004) Objetivo. Conocer la tcnica de microcultivo para la caracterizacin de estructuras somticas y reproductivas para identificar morfolgicamente a los hongos fitopatgenos.
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Materiales y Mtodos. Recipiente con alcohol al 96%. Pinzas de diseccin. Aguja de diseccin. Bistur. Caja de Petri estriles con PDA. Caja con cepa pura. Caja de Petri con portaobjeto, cubreobjeto y triangulo de vidrio (estril). Pipeta. Puntas. Agua estril. Papel paraf
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1. Con un bistur estril se cuadricula el medio de cultivo de la caja de Petri con PDA en cuadros de aproximadamente 1 cm2. este paso se realiza en el interior de una campana de flujo laminar preparada para trabajar bajo condiciones aspticas 2. Dentro de la cmara de flujo laminar, con la ayuda de un bistur estril, uno de los cuadros de PDA se transfiere al portaobjetos que esta en la cmara de microcultivo ;este portaobjetos debe de estar sobre el triangulo de vidrio 3. Con la aguja de diseccin estril o con una asa bacteriolgica estril se lleva el inculo a las orillas superiores e inferiores del cuadro de PDA 4. Se coloca el cubre objetos sobre el cuadro de PDA inoculado, procurando que quede bien centrado. 5. Se agregan 2ml de agua estril, en el fondo de la cmara de microcultivo para mantener la humedad, sin mojar el rea de crecimiento del hongo. Los pasos 1-5 se llevan a cabo en el interior de una campana de flujo laminar o en mesas de trabajo en condiciones aspticas 6. Se sella el dispositivo de microcultivo con papel parafilm y se rotula. 7. El crecimiento del hongo se detiene cada 24, 8. se repiten los pasos del 1 al 7 para mas microcultivos, y detener su desarrollo a la 48, 72 y 96 hrs. respectivamente BIBLIOGRAFA Dhingra, O. D., and Sinclair J. B. 1985. Basic Plant Pathology Methods. CRC Press. 355 pp SB 732.5 D45 Mier, T., Toriello, C. y Ulloa, M. Hongos microscpicos saprobios y parsitos: Mtodos de laboratorio. 2002. UAM IB UNAM. 90pp. QK 603 M55. Muller, G. M., Bills, F. G. and Foster, S. M., 2004, Biodiversity of fungi inventory and monitoring methods, Elsevier Academic Press. 777pp. C.B. QK600.3 M84 Narayanasamy, P., 2001, Plant pathogen detection and disease diagnosis. Marcel Dekker Inc., 518 pp. C.B. SB731 N37 Schots, A., Dewey, F. M. and Oliver, R., 1994. Modern assay for plant pothogenic fungi. C A B International, 267 pp. C.B. SB733 M63 Trigiano, R. N., Windham, M. T. and Windham, A. S., 2004, Plant pathology, Concepts and Laboratory. CRC Press, Boca Raton, London, New York, Washinton, D.C., 413 pp. C.B. SB732.56 P53 Narayanasamy, P. 2001. Plant pathogen detection and diseases diagnosis. Marcel Dekker Inc. 518 pp. SB 731 N37.
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MEDIDA DE ESTRUCTURAS DE AGENTES FITOPATGENOS CON MICROSCOPIO PTICO Introduccin. Para identificar a un agente fitopatgeno y cumplir cabalmente con el segundo postulado de Koch de adems de los datos correspondientes al aspecto de los sntomas que hayan causado en su hospedante, o de las colonias que hayan formado sobre las placas en medios de cultivo, de los datos morfolgicos que hayan resultado de la tcnica de microcultivo es necesario saber las medidas de las estructuras somticas y reproductivas que se observan en el microscopio ptico para tener una identificacin confiable del agente causal. Por ejemplo si se habla de hongos fitopatgenos las estructuras que se miden para identificarlos son: picnidios, acrvulos, esporodoquios, sinemas, peritecios, apotecios, clestotecios entre otras. La The American Phytopathological Society en todas sus obras de enfermedades de los cultivos agrcolas, las claves que usa para la identificacin de los diferentes grupos de hongos fitopatgenos estn en funcin del tamao de las estructuras somticas y de reproduccin de este grupo de fitopatgenos. La identificacin del agente causal es bsica para precisar el diagnstico y as poder establecer el mejor mtodo de control para estas limitantes biolgicas en la produccin agrcola. Objetivo. Que el alumno aprenda a calibrar y medir clulas, estructuras somticas y reproductivas de importancia taxonmica de agentes fitopatgenos con el microscopio. ptico para su identificacin morfolgica Material. Un microscopio ptico. Un micrmetro ocular. Un portaobjetos micromtrico. Preparaciones permanentes y/o temporales de estructuras fitopatgenos. Metodologa. Calibracin de los lentes objetivos. 1.- Se coloca en el ocular del microscopio ptico el micrmetro ocular aunque a menudo se trabaja con el ocular micromtrico permanente puesto en el microscopio. Hay que evitar que quede invertida la escala (Ver Fig 1).
Fig 1.- A.- Colocacin de la reglilla ocular, y B.- Escala de la reglilla ocular micromtrica 2.- Sobre la platina del microscopio se pone el micrmetro del objeto similar portaobjeto como si fuese una preparacin.
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Fig 2.- Escala de la reglilla portaobjeto 3.- Moviendo la platina se hace coincidir el margen de una raya del ocular micromtrico con una del portaobjetos micromtrico. Puesto que las rayas del portaobjetos aparecen tanto ms gruesas cuanto mayor son los aumentos, la superposicin de las lneas ha de ser siempre al comienzo del margen exterior de stas.
3.- Moviendo la platina se observa a travs de microscopio con ambas reglillas colocadas se les puede ver superpuestas en el campo visual, y se puede saber cuantas lneas del micrmetro ocular concuerdan con cuantas lineas del micrmetro del objeto se hace coincidir el margen de una raya del micrmetro ocular con una del micrmetro del objeto. Ver figura 3
Fig 3.- Vista simultnea del ocular y de la reglilla micromtrica 4.- Cuando se observa a travs del microscopio con ambas reglillas micromtricas colocadas, se les puede ver superpuestas en el campo visual, y se puede saber cuntas lneas del micrmetro ocular concuerdan con cuntas lneas del micrmetro del objeto. En el campo visual, la reglilla ocular se encuentra graduada del 0 al 10 a un lado la reglilla del objeto con 100 divisiones; como cada lnea del micrmetro del objeto corresponde a 10 micras, se hacen coincidir ambas reglillas en el cero, en el otro extremo de las reglillas se observa cual de las 100 lneas de la reglilla ocular coinciden con otra de la reglilla del portaobjetos. Y se hacen los clculos correspondientes. Ejemplos 1: Se hace coincidir los ceros de ambas reglillas (ver imagen 1) y se observa que en el otro extremo de las reglillas el 100 de la reglilla ocular coincide con el 97 de los trazos de la reglilla del objeto, es decir 0.97 mm; por lo tanto, una lnea del micrmetro ocular es equivalente a 0.009 mm = 9 m y este valor es el que utilizamos para definir el tamao de cada estructura que se mide, es obvio que esta calibracin es para este microscopio, con ese ocular y objetivos respectivamente. Esta operacin se deber repetir cuando se cambie de microscopio o de objetivos para evitar errores. Ejemplo 2: Se hace coincidir los ceros de ambas reglillas (ver imagen 2) y se observa que siete divisiones del ocular micromtrico coinciden con dos divisiones del portaobjetos micromtrico. Puesto que cada divisin de ste equivale a 10 m, el
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valor de cada divisin del ocular se obtiene mediante una simple regla de tres: 7 divisiones del ocular = 20 m; una divisin del ocular = 20/7 = 2.8 m (Ver Fig 4).
Fig 4.- Vista simultnea del ocular y de la reglilla micromtrica, donde coinciden la primera lnea de las dos reglillas y la lnea 2 de la reglilla portaobjetos con la siete de la ocular b).- Medicin de ejemplares y estructuras de micromicetes. 1.- Una vez que se ha cuantificado el valor de cada lnea en la reglilla del ocular ( 9 y 2.8 m en los ejemplos), se puede retirar el portaobjetos micrmetro y en su lugar se puede colocar un portaobjetos normal con el espcimen a medir y se deja colocado el micrmetro ocular, de manera que se puede colocar una clula o estructura celular cualquiera, en este caso, se hace coincidir una raya de la escala con los mrgenes de la estructura fngica elegida, y se cuenta el nmero de divisiones de la escala comprendidas en la longitud y en el ancho de dicha estructura. Ejemplo 3: Si la estructura del hongo se extiende a lo largo de 16 lneas y cada una de ellas vale 9 micras, segn se explic antes, por tanto el tamao total de esta clula es de 16 x 9, es decir 144 micras.
2.- Si se llega a cambiar el objetivo por otro menor aumento se debe repetir la operacin para encontrar nuevos valores en la reglilla, esta medicin se puede realizar en un microscopio mono o binocular, pero en este ltimo caso se tiene que mantener inalterada la distancia interpupilar, puesto que el cambio altera la distancia mecnica y el valor del micrmetro depende de ella. BIBLIOGRAFIA Barrera, E. H y R. Crdenas 1997 El microscopio ptico FES- Iztacala-UNAM P y V editores. Estado de Mxico. 86pp. Barthelemy, E. R. Dawson, R. J., y A. E. Lee. 1984. Tcnicas para el Laboratorio de Biologa. 2. Edicin. CECSA editor. Mxico, D. F. Mxico. 148 pp. Mateu, B. 1972. Atlas de Microscopia. 4. Edicin. Jover Ediciones. Barcelona, Espaa. 96 pp. Muntaola, M. 1999. Gua de los hongos microscpicos. 1. Edicin. Omega editores. Barcelona, Espaa. 167 pp. ____________. 1996. El Microscopio ptico. FES Zaragoza UNAM. Mxico, D. F. Mxico.
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AISLAMIENTO DE DNA FUNGICO DE CULTIVOS PUROS CON DNeasy Plant Mini Kit (esta prctica solo se realizara s los alumnos seleccionan a hongos fitopatgenos en su seminario) OBJETIVO: Obtener DNA de cultivos puros de hongos fitopatgenos. INTRODUCCIN: MATERIALES Y METODOS 100 g. tejido vegetal Mortero con pistilo estril Tubos eppendorf Hielo Nitrgeno lquido Esptula Pipetas de plstico Gradillas eppendorf y de unicel Balanza Bao mara Centrifuga Vortex Reloj Autoclave Horno Pipetas de 10 ul Pipetas de 100 ul Pipetas de 1000 ul DNeasy Plant Mini Kit
1.- Pesar directamente en un mortero 100 mg de tejido fungico y macerarlo con nitrgeno lquido hasta un polvo fino usando el pistilo, transferir el tejido en polvo a un tubo eppendorf permitiendo que el nitrgeno se evapore impidiendo que las muestras se descongelen. Contine inmediatamente con el paso 2. 2.- Aadir 400 ul de Buffer AP1 y 4 ul de RNAsa solucin stock (100 mg/ml) para unmximo de 100 mg (peso fresco) o 20 mg (peso seco) de tejido vegetal y agitar vigorosamente en vortex. 3.- Incubar la mezcla por 10 minutos a 65o C. Mezclar dos o tres veces durante la incibacin invirtiendo el tubo. 4.- Aadir 130 ul de buffer AP2 a el lisado, mezclar e incubar por 5 minutos en hielo. Opcional centrifugar el lisado por 5 minutos a alta velocidad 5.-.Aplicar o transferir el lisado a el QIA Shredder spin column (tubo lila) sentado en un tubo de 2 ml y centrifugar por 2 minutos a mxima velocidad. 6.- Tranferir el flujo del paso 5 a un nuevo tubo (no abatecido) sin provocar disturbios o perturbar el peller de desechos celulares. 7.- Aadir 1.5 volmenes de buffer AP3/E a el lisado clarificado y mezcle por pipeteo. 8.- Aplicar 650 ul de la mezcla del paso 7, incluyendo el precipitado que pudo haberse formado a el DNeasy mini spin colum sentado en un tubo colector de 20 ml (abastecido). Centrifugar por 1 minuto a = a 6000 xg corresponde a = 8000 rpm para la mayora de las centrfugas y desechar el fluido. 9.- Colocar la DNeasy a un nuevo tubo colector de 2 ml (abastecido) aadir 500 ul de buffer AW a el DNeasy colum y centrifugar por un minuto a = 6000 xg ( = 8000 rpm). Desechar el fluido y reusar el tubo colector en el paso 11.
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11.- Aadir 500 ul buffer AW a el DNeasy colum y centrifugar dos minutos a una mxima velocidad para secar la membrana. 12.- Transferir el DNeasy colum a tubos de cetrfuga de 1.5 ml o de 2 ml (no abastecidos) pipetesr 100 ul de buffer AE precalentado (65oC) directamente en la membrana de DNeasy. Incubar por 5 minutos a temperatura de la boratorio y despus centrifugar por un minuto a = 6000 xg (= 8000 rpm) para diluir. 13.- Repetir la dilucin (paso 12) como esta descrito. RESULTADOS ELECTROFORESIS PARA DE DNA DE HONGOS FITOPATOGENOS Kit (esta prctica solo se realizara s los alumnos seleccionan a hongos fitopatgenos en su seminario) MATERIAL, EQUIPO Y SUSTANCIAS Recipiente de unicel con hielo Marcador 50 ng/l se usa para DNA de banda grande o 3 l para un pozo del gel y 6 l para otro pozo; el marcador se pone en los pozos de los extremos delas muestras. Se colocan directamente del tubo al pozo. O bien, marcador XIV se usa para DNA de banda pequea, 3 l para un pozo y 6 l para otro pozo, el marcador se pone en los pozos de los extremos, una vez que se ponen las muestras en el gel. Se colocan directamente del tubo al pozo. Muestras de DNA de productos DNeasy en este caso, son las siguientes muestras: P16, P25, P26, P27, S27, S28, S26, CAB, TA29 (10 l por muestra) Tinte para electroforesis 2 l para cada una de las muestras de DNA Gradilla Gel de agarosa en TAE1X (ver elaboracin de gel de agarosa) Rotulador Papel de parafilm rotulado con el nombre de las muestras (diseo de corrimiento) en el orden que se colocan en el pozo del gel. Micropipetas de 10 l Puntas blancas estriles Pipetas de plstica Centrfuga Equipo de electroforesis Analizador de geles Flor-S
PROCEDIMIENTO a) Colocar el gel de agarosa dentro de la cmara de electroforesis. b) Cubrir el gel con el amortiguador TAE1X hasta que quede sumergido a 4 mm de profundidad respecto a la superficie del TAE; cuidar de no formar burbujas en la placa de gel, se si formaran, retirarlas con la pipeta de 10 l
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c) Sacar las muestras de DNA del congelador y descongelarlas a temperatura de laboratorio en una gradilla. d) Centrifugar las muestras de DNA a alta velocidad durante 5-10 segundos y se colocan en un recipiente de unicel con hielo. e) En un trozo de papel parafilm, rotular en el siguiente orden las muestras de DNA y marcadores. M 3 l 50 ng/l P16 Todas P25 las P26 P27 S27 10 l S26 M +2 l 6 l de de 50 DNA tinte ng/l S28 CA8 TA29
muestras llevan
f) Colocar en el papel parafilm 2 l de tinte y en esta gota formada en el papel , se colocan los 10 l de DNA de la correspondiente muestra. Este mismo procedimiento se lleva a cabo para cada una de las muestras de ADN. (Se forma en el papel una gota de 12 l de cada muestra) g) Los marcadores se aplican directamente del tubo que los contiene, en un extremo se colocan 3 l a una concentracin de 50 ng/l y en el otro extremo se colocan 6 l a la misma concentracin, como lo indica el esquema h) En el mismo orden, colocar cuidadosamente las muestras de ADN tenidas (gotas) en los respectivos pozos de gel, evitando derramarlas en los pozos adyacentes. i) Tapar la cmara de electroforesis. Asegurarse de que los electrodos de la tapa tengan el rojo al frente y el azul atrs en la tapa y en la consola de mando el rojo (+) en la parte de arriba y azul (-) en la parte de abajo, encender la fuente deponer a 75 voltios y dejarla que corra durante 40-45 minutos. Resultados Bibliografa
Dhingra, O. D., and Sinclair J. B. 1985. Basic Plant Pathology Methods. CRC Press. 355 pp SB 732.5 D45 Narayanasamy, P., 2001, Plant pathogen detection and disease diagnosis. Marcel Dekker Inc., 518 pp. C.B. SB731 N37 Schots, A., Dewey, F. M. and Oliver, R., 1994. Modern assay for plant pothogenic fungi. C A B International, 267 pp. C.B. SB733 M63 Trigiano, R. N., Windham, M. T. and Windham, A. S., 2004, Plant pathology, Concepts and Laboratory. CRC Press, Boca Raton, London, New York, Washinton, D.C., 413 pp. C.B. SB732.56 P53 Narayanasamy, P. 2001. Plant pathogen detection and diseases diagnosis. Marcel Dekker Inc. 518 pp. SB 731 N37
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CUARTA PARTE: NEMATODOS Los nemtodos son organismos fitopatgenos que pertenecen al reino Animal y son probablemente los organismos pluricelulares ms abundantes en el mundo, despus de los insectos. Su tamao flucta entre unas cuantas micras hasta 0.5-1 mm. Los nemtodos son gusanos cilndricos con cuerpo alargado y delgado con simetra bilateral. Su cutcula es lisa, no segmentados y carecen de patas u otros apndices. Presentan todos los sistemas fisiolgicos principales de los animales como lo son el sistema excretor, nervioso, reproductor y digestivo. Durante el ciclo de vida de los nemtodos se llegan a presentar cinco estados y cuatro mudas. En algunas especies de nemtodos la primera y segunda etapa larval no puede infectar a las plantas y sus funciones metablicas son realizadas a expensas de la energa almacenada en el huevecillo. Los nemtodos fitopatgenos presentan gneros ectoparsitos, los cuales pasan toda su vida en el suelo y se alimentan externamente de las races de las plantas hospederas, por ejemplo ,Cricononemoides, Hemicycliophora, Cacopaurus,etc. Otros gneros son endoparsitos, produciendo lesiones internas en los tejidos vegetales. Generalmente se ubican en el parnquima cortical, o bien llegan hasta el cilindro central de las races hospederas, en donde permanecen o migran hacia otros rganos de las plantas, por ejemplo, Aphelenchoides, Anguina, Ditylenchus, etc. Otros gneros pasan una parte de su vida como endoparsitos y la otra parte la pasan en el suelo que se encuentra alrededor de las races que parasitan , a estos se les conoce como nemtodos semiendoparsitos, Algunos ejemplos de estos son Meloidogyne, Heterodera y Tylenchus. ACTIVIDADES. 1. 2. 3. 4. Extraccin de nemtodos . Observacin de nemtodos vivos. Observacin de preparaciones permanentes y temporales de nemtodos. Esquematizacin de lo observado, indicando los nombres de las estructuras.
MATERIALES Y METODOS. Plstico de 1 m 2 Probeta 2 cubetas Tamices de 100, 100 y 325 mallas /cm2 Pizeta Vasos de precipitados Preparaciones permanentes Muestra de suelo Tubos de centrfuga Centrfuga Agitadores Cajas de petri pequeas Caoln Solucin azucarada (55 gr. de azcar +100 ml de agua)
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EXTRACCION DE NEMATODOS POR EL METODO DE TAMIZADOCENTRIFUGADO 1. Se coloca la muestra de suelo sobre un plstico, se deshacen los terrones y se retiran las basuras, piedritas, races, etc. Se remueve bien la tierra para homogeneizarla. En una probeta o vaso de precipitados se ponen 200 ml de agua y se agrega suelo hasta que la marca del agua llegue a 400 ml. Esto se hace con el objeto de tener una referencia del tamao de la poblacin que se encuentra en 200 ml de suelo, sobre todo si se desea hacer un estudio cuantitativo. Esta mezcla se vaca en una cubeta A con un poco ms de agua, se deshacen los grumos y se vaca el sobrenadante en los tamices de 100, 200 y 325 sobrepuestos y se recoge en la cubeta B. Esta operacin se repite 2 veces ms. La arenilla que quedo en el tamiz de 325 se recoge en un vaso de precipitados con una pizeta, procurando que el ngulo que forma el chorro de agua con el tamiz sea lo ms agudo posible, nunca recto, ya que de esta forma el agua ayudara a pasar a los nemtodos a travs de la malla del tamiz y los daara. El agua que se recogi en la cubeta B, se vierte a travs del tamiz de 325 y se recoge en la cubeta A. Esta operacin se repite dos veces ms. La arenilla que qued en el tamiz se recoge con una pizeta de la misma forma que se mencion en el nm. 5 y se pasa al mismo vaso de precipitados. La arenilla recogida se distribuye en los tubos de centrfuga y se le agrega un poco de caoln a cada tubo. Se agitan bien.
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10. Se centrifugan durante 5 min. a 2900 rpm. 11. Se tira el sobrenadante. 12. Al sedimento se le agrega la solucin azucarada y se agita bien. 13. Se centrifugan durante 3 min. a 2900 rpm. 14. Se pasa el sobrenadante por el tamiz de 325 y se lava perfectamente bien hasta eliminar por completo la solucin azucarada. 15. Se recoge el sedimento con una pizeta y se pasa a una caja de petri pequea con un poco de agua. 16. Se observa al microscopio.
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Este mtodo de extraccin brinda la oportunidad de obtener casi todos los nemtodos del suelo de una forma rpida. El suelo retenido en los tamices se centrifuga para separar a los nemtodos de las partculas orgnicas mediante la flotacin de los mismos en una solucin de gravedad especfica mayor de la que poseen los nemtodos. Se emplea el caoln para sedimentar a los nemtodos y poder eliminar el agua sobrenadante de la muestra. La solucin azucarada, como tiene una gravedad especfica mayor a la que presentan los nemtodos, hace que estos floten y queden suspendidos en la solucin. EXTRACCION DE NEMATODOS POR EL METODO DE EMBUDOS DE BAERMAN Este mtodo se basa en los principios de movilidad de los nemtodos y de mayor densidad de estos que el agua, por lo que este mtodo funciona solamente para nemtodos muy mviles, normalmente los nemtodos parsitos tienen escasa movilidad, siendo los de vida libre los que ms se mueven y los que ms abundantes resultan en este mtodo de extraccin
MATERIALES. Embudos preferentemente de vidrio de 15 cm. de dimetro Una pinza Mohr
CUESTIONARIO. 1. Describa la morfologa de la que obtuvo su colonia de bacterias. Indique si es Gram (+) o Gram (-). 2. En qu se diferencian bioqumicamente las bacterias Gram (+) y las Gram( -)? 3 . Cmo estn organizadas las clulas de los hongos? 4. Seale 3 ejemplos de hongos fitopatgenos de cada clase de hongos, mencionando la
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enfermedad que provocan. 5. En qu se diferencian los nemtodos de vida libre de los fitopatgenos? Seale por lo menos 3 caractersticas. 6. Qu importancia tienen las tcnicas de tincin de microorganismos? BIBLIORAFIA.
1.- Agrios, G. N. 2005.Plant pathology. 5th ed. Elsevier academic Press. Amsterdam, Boston, Heidelberg, London, New York, Oxford, Paris, San Diego, san Francisco, Singapore, Sydney, Tokyo. 992 pp. * 1. Barne H, H. L. end Hunter B. B. 1987. Illustrated genera of imperfect fungi. Fourth edition. MacMillan Publishing Company. 218 pp. QK 625 D1 B3 2. Bridge, P. D. 1998. Applications of PCR in mycology. CAB, International. C.B. QK603 A66 3. Cummins, G. B. and Hiratsuka, Y. 2003. Illustrated genera of rust fungi. Third Edition. APS Press 225 pp. OK 627. A1 4. Dhingra, O. D., and Sinclair J. B. 1985. Basic Plant Pathology Methods. CRC Press. 355 pp SB 732.5 D45 5. French, E.R.; Herbert, T.T. 1980 Mtodos de investigacin fitopatolgico, I.I.C.A. San Jos, Costa Rica. 6. Hanlin, R. T. 1997. Illustrated genera of ascomycetes. Volume 1. APS Press. 263 pp. QK 623.A1 H35 7. Len Gallegos, H. M. y Cummins, G. B. 1981. Uredinales (royas) de Mxico. SARH. Vol 1. 440 pp. y Vol 2 492 pp. C3 8. Klman Vnky. 2002. Illustrated genera of smut fungi. APS Press. Second edition. 238 pp. QK 628 A1 V35. 9. Mier, T., Toriello, C. y Ulloa, M. Hongos microscpicos saprobios y parsitos: Mtodos de laboratorio. 2002. UAM IB UNAM. 90pp. QK 603 M55. 10. Muller, G. M., Bills, F. G. and Foster, S. M., 2004, Biodiversity of fungi inventory and monitoring methods, Elsevier Academic Press. 777pp. C.B. QK600.3 M84 11. Narayanasamy, P., 2001, Plant pathogen detection and disease diagnosis. Marcel Dekker Inc., 518 pp. C.B. SB731 N37 12. Schots, A., Dewey, F. M. and Oliver, R., 1994. Modern assay for plant pothogenic fungi. C A B International, 267 pp. C.B. SB733 M63 13. Trigiano, R. N., Windham, M. T. and Windham, A. S., 2004, Plant pathology, Concepts and Laboratory. CRC Press, Boca Raton, London, New York, Washinton, D.C., 413 pp. C.B. SB732.56 P53
PRACTICA 4 SINTOMATOLOGIA
INTRODUCCION. La Sintomatologa es la rama de la Fitopatologa que estudia la los sntomas y los signos que producen los patgenos en las plantas que atacan. El conocimiento de la sintomatologa es indispensable para el diagnstico de las enfermedades.
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se dice que un SINTOMA es la manifestacin visible de una condicin patolgica en una planta sensible, y un SIGNO es la estructura o evidencia del patgeno mismo, producida dentro o fuera de los tejidos del hospedero. Debido a la gran cantidad de sntomas que existen, se han agrupado bajo diversas condiciones, dependiendo de diversos factores tales como el lugar de aparicin, del efecto del medio ambiente, del nmero de patgenos involucrados, etc. As, tenemos que los sntomas que ocurren en los rganos directamente atacados por los patgenos se llaman Sntomas primarios, en cambio, a los que aparecen en otro rgano de la planta, no atacado directamente por el patgeno, sino como una secuela de este, se llaman sntomas secundarios. En algunas ocasiones los hospederos son atacados simultneamente por ms de un patgeno, provocando sntomas complejos. Otras veces los sntomas no se expresan totalmente, debido a condiciones ambientales favorables al patgeno, denominado a estos sntomas enmascarados. Tpicamente cada enfermedad produce varios sntomas caractersticos, que generalmente aparecen en series subsecuentes durante el curso de la enfermedad. A dicha serie se le denomina sndrome. Desde el punto de vista morfofisiolgico, los sntomas se agrupan en necrosis, hipoplasias e hiperplasias. OBJETIVOS. Identificar los diferentes sntomas y signos que ocurren en enfermedades vegetales, mediante la observacin de material fresco y de herbario. ACTIVIDADES. Identificacin de sntomas y signos en ejemplares vegetales enfermos utilizando las claves incluidas en la metodologa. MATERIALES Y METODOS Ejemplares fitopatolgicos de herbario Ejemplares fitopatolgicos frescos Lupas Microscopios compuestos Microscopio estereoscpico Agujas de diseccin Navaja Los ejemplares a identificar se observan cuidadosamente, utilizando la lupa y el microscopio cuando sea necesario, y se siguen las claves indicadas a continuacin.
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1. NECROSIS. Caracterizadas por la degeneracin y muerte celular Si se presentan antes de que ocurra la muerte celular..........1.1. PLESIONECROSIS Si se manifiestan hasta que las clulas y los tejidos mueren..1.2. HOLONECROSIS 1.1. PLESIONECROSIS El tejido foliar toma coloraciones amarillentas debido a la destruccin de la clorofila.................................................1.1.1. AMARILLEO Presencia de tejidos dbiles, flcidos, debido a la prdida de la turgencia celular provocada por la carencia de agua, casi siempre por el taponamiento de los vasos conductores a causa de los patgenos..............................1.1.2. MARCHITEZ Manchas traslcidas, acuosas, como pequeas gotas de agua contenidas dentro de los espacios intercelulares. Estas acumulaciones de lquidos provienen de clulas que han sufrido daos en sus membranas celulares.......................1.1.3. HIDROSIS 1.2. HOLONECROSIS Si se presentan en tejidos de almacenamiento...................1.2.1. Si se presentan tejidos verdes.............................................1.2.2. Si se presentan tejidos leosos............................................1.2.3. 1.2.1.Tejidos de almacenamiento Los tejidos sufren rpidamente una pudricin.............1.2.1.1. PODREDUMBRE 1.2.1.1. PODREDUMBRE Si es antecedida por hidrosis con un reblandecimiento de los tejidos. 1.2.1.1.1. PUDRICIN BLANDA. El agua es eliminada rpidamente de los tejidos, por lo que el rgano atacado se seca, quedando con un aspecto arrugado, seco duro....1.2.1.1.2. MOMIFICACIN 1.2.2. Tejidos verdes. Marchitez y cada de las plantitas de almcigo, como consecuencia de la necrosis del cuello del tallo...... 1.2.2.1 AHOGAMIENTO "DAMPING-OFF" Necrosis localizada alrededor del borde de la hoja1.2.2.2. CHAMUSCADO Necrosis extendida en toda la lamina foliar de forma irregular.1.2.2.3. TIZON Zonas de tejido necrtico, bien definidas, diversos colores y tamaos, en ocasiones rodeadas por un borde prpura o de algn otro color................1.2.2.4. MANCHAS Manchas necrtica que posteriormente se rasga y cae, dejando pequeos agujeros................................................................1.2.2.5.TIRO DE MUNICION
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Mancha necrtica sobre la cual hay crecimiento micelial obscuro... 1.2.2.6. RONCHA ERUPCION Manchas necrticas muy pequeas extendidas en todo el rgano............................ 1.2.2.7. ABIGARRADO Zonas alargadas en necrosis, a lo largo de venas y tallos..1.2.2.8. RAYADO Zonas necrticas alargadas, en las regiones intervenales de la lmina .................. .1.2.2.9.BANDEADO Repentina desecacin debilitacin y muerte de toda la hoja debido a la accin indirecta de la actividad del patgeno................................ 1.2.2.10.QUEMADURA Necrosis epidrmica que da como resultado un blanqueado de la epidermis y de los tejidos adyacentes en el fruto y hojas.............................1.2.2.11. ESCALDADURA Muerte repentina de brotes o yemas foliares..1.2.2.12. AGOSTAMIENTO Necrosis extensiva que provoca la cada de los frutos .1.2.2.13. DESGRANAMIENTO 1.2.3. Tejidos leosos Necrosis restringida a los tejidos corticales del tallo o raz, generalmente rodeado de un callo de tejido sano............................................1.2.3.1.CANCER(CANCRO) Necrosis extensiva que se origina en el apndice de brotes corre hacia su base, generalmente despus de la hibernacin...............1.2.3.2.MUERTE REGRESIVA Exudado de tejidos leosos, de consistencia acuosa, generalmente coloreados vivamente..................................................................1.2.3.3. SANGRADURA Exudados de consistencia viscosa (gomosa),generalmente en frutos . ..1.2.3.4. GOMOSIS 2. HIPOPLASIAS. Sntomas caracterizados por la debilidad de rganos o plantas para desarrollarse completamente. Debilidad para alcanzar un tamao normal.............................2.1. ENANISMO Crecimiento escaso de los entrenudos. Lo que ocasiona que las hojas estn muy juntas.........................................................................................2.2. ARROSETADO Supresin completa de color en hojas o frutos. .2.3.BLANQUEO Las plantas adquieren una coloracin amarillenta, debido a la no formacin de clorofila................................................................................2.4. CLOROSIS Moteado de colores verdes y amarillos o bien de tonos verdes.........2.5. MOSAICO
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Debilidad completa de la planta para desarrollar algn rgano.2.6. SUPRESION (EXTINCION) Tono amarillento blanquecino, en ocasiones acompaado por enanismo; los tallos con crecimiento excesivo, que se tornan quebradizos (aparece en plantas mantenidas en la obscuridad)..............................2.7. ETIOLACION 3. HIPERPLASIAS. Sntomas que resultan de un desarrollo excesivo en tamao y color, de algn rgano de la planta o de la planta completa, o bien por un desarrollo precoz de los rganos. Sntomas con desarrollo excesivo.............................3.1. GIGANTISMO Sntomas con acumulacin excesiva de pigmentos 3.2. HIPERCROMIA Los rganos se desarrollan fuera de lugar o con otras formas3.3. METAPLASIA 3.1. GIGANTISMO. Se da un torcimiento de los brotes o enrollamiento de las hojas por crecimiento excesivo de una parte del rgano. 3.1.1.. RIZAMIENTO (VERRUCOSIS) Sobrecrecimiento de tejido epidrmico, en forma de pequeas lesiones, speras, elevadas, formadas por clulas con paredes suberizadas. 3.1.2. COSTRA (ESCARA) Marchitez causada por hinchamientos de las clulas epidrmicas y subepidrmicas, provocada por la acumulacin excesiva de agua.........3.1.3. INTUMESCENCIA Hinchazn provocada por la acumulacin excesiva de material nutritivo, generalmente encima de un rea constreida............3.1.4. SARCOSIS Hinchazn localizada, que envuelve a rganos completos... .3.1.5.TUMEFACCION (tumores, ndulos agallas) Desarrollo de rganos adventicios alrededor de un punto local... 3.1.6. FASCICULACION "ESCOBA DE BRUJA" Crecimiento laminar de tallos u otros rganos cilndricos, provocando que estos tomen forma aplanada, extendida..3.1.7. FASCIACION Desarrollo continuado despus de que se alcanza el desarrollo normal...... .3.1.8. PROLIFERACION Crecimiento de tejido sano, como respuesta a una lesin, generalmente rodeando cnceres; proviene de la difusin del patgeno dentro de las reas adyacentes al tejido sano........................3.1.9. CALLO 3.2. HIPERCROMIA
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Coloracin verdosa, en tejidos normalmente carentes de clorofila, debido a la produccin y acumulacin de sta en los rganos..3.2.1. VIRESCENCIA Coloracin prpura resultante del desarrollo excesivo de antocianinas... 3.2.3. ANTOCIANESCENCIA Coloracin cobriza, resultado de diversos procesos, algunas veces por deficiencia de potasio............................................................................. 3.2.3. BRONCEADO 3.3. METAPLASIA Desarrollo de rganos en posiciones anormales................3.3.1. HETEROTOPIAS Desarrollo de Ptalos u otros rganos florales en forma de hojas............................ 3.3.2.FILODIOS Desarrollo de hojas juveniles en plantas maduras...3.3.3. JUVENILODIOS 4. SIGNOS Se observa el crecimiento vegetativo del hongo, como un micelio de color blanquecino o grisceo, en pequeos manchones o de forma continua. En algunas ocasiones se observan conidios y cleistotecios. Todos son producidos por Erysiphales...............................4.1. OIDIO O CENICILLA POLVOSA Se observa el crecimiento del hongo, con micelios, esporangios, etc., con apariencia de fieltro suave, localizado en el envs de las hojas; casi siempre se observa en el haz una mancha en correspondencia. Son producidos por Peronosporales.. 4.2. MILDIU O CENICILLA VELLOSA Se caracteriza por la presencia de pequeas pstulas o ampollas subepidrmicas, de color blanco, constituidas por fructificaciones de Albuginceas..... 4.3. ROYA BLANCA O MAL DE LA CAL Presencia de pstulas que contienen una gran cantidad de esporas de uredinales; son circulares en dicotiledneas y alargadas en monocotiledneas. Su color vara del amarillo al caf oscuros, pudiendo ser anaranjadas...................................4.4. ROYA Se presenta una masa de color negro, compuesta por teliosporas de Ustilaginales, la cual puede estar cubierta por una membrana, o bien, puede estar desnuda. 4.5. CARBON O HUITLACOCHE. Estructura de hongos -micelio y conidios- de color oscuro, producidos por Meliolaceas o Capnodiaceas. Llegan a formar sobre la epidermis de las hojas, frutos o ramas, verdaderas costras4.6. FUMAGINA U OLLIN
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Se presentan casi siempre sobre manchas foliares o de frutos, y son las fructificaciones como acrvulos, picnidios, apotecios, etc... 4.7. PUNTUACIONES NEGRAS Es la apariencia de polvo sobre manchas de diversos rganos, corresponden casi siempre a fructificaciones de Moniliales.4.8 EFLORESCENCIAS GRISACEAS. Son exudados bacterianos, de tipo cremosos, de color blanquecino, amarillento u otros4.9. ZOOGLEAS.
BIBLIOGRAFIA.
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* En Biblioteca de la FES Cuautitln C-4
PRACTICA 5
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GENERALIDADES SOBRE EL CONTROL QUIMICO DE ENFERMEDADES

INTRODUCCIN. La produccin agrcola mundial sufre anualmente grandes perdidas debido a enfermedades causadas por agentes de diversa ndole, entre los que se encuentran los virus, las bacterias, los hongos y los nemtodos. La necesidad de prevenir o controlar el desarrollo de las enfermedades ha motivado la creacin de nuevos qumicos capaces de obtener la deseada toxicidad selectiva hacia los patogenos problema. Hoy da se tiene la capacidad de controlar algunos patogenos con un amplio espectro de compuestos qumicos. La principal excepcin la constituyen los virus, que hasta ahora han desafiado todos los intentos de control directo mediante compuestos qumicos. Los compuestos qumicos utilizados para prevenir o controlar el desarrollo de las enfermedades se clasifican por: 1. Su origen qumico. a. Orgnicos b. Inorgnicos 2. Modo de accin. a. De contacto o residuales. La accin se restringe al sitio de aplicacin. b. Sistmicos. Son transportados en la savia de la planta, pudiendo ser acroptalos si se mueven de las races al follaje, o bien, basiptalos si se mueven de las races al follaje, o bien, basiptalos si el movimiento es a la inversa. 3. Modo de aplicacin. a. Protectivos/ Profilcticos. Se requieren varias aplicaciones para proteger los nuevos brotes y para reforzar la capa de crecimiento antes de la infeccin. b. Curativos. El tratamiento se realiza. durante el perodo de incubacin. c. Erradicativos. El tratamiento se realiza despus del periodo de incubacin 4. Sitio de aplicacin. a. Foliar. Se aplica al follaje. b. Tratamiento al suelo. Se aplica al suelo contra fitopatgenos transmitidos por esta va y para algunos sistmicos de transmisin area. c. tratamiento a la semilla. Se aplica a la semilla contra fitopatgenos transmitidos por el suelo y contra los transmitido por la misma semilla. d. Tratamiento postcosecha. Se aplica para proteger a los productos cosechados. OBJETIVOS.
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Conocer algunos productos fitosanitarios - pesticidas- utilizados para el control de enfermedades, sus caractersticas mas importantes, as como su manejo y modo de accin. MATERIALES Y METODOS. Etiquetas de productos qumicos comercialmente utilizados para el control o prevencin de enfermedades. Los alumnos sern los encargados de conseguir las etiquetas en las casas comerciales o directamente con los fabricantes de dichos productos, con la finalidad de obtener la siguiente informacin: a. Nombre (s) comercial (es) b. Nombre qumico c. Tipo o modo de accin d. Origen e. Toxicidad f. Formulacin g. Fitotoxicidad CUESTIONARIO. 1. Defina que es un fungicida, un nematicida y un bactericida. 2. Defina. a. Fungicida protectivo, residual o de contacto. b. Fungicida curativo o sistmico. 1. Mencione los principales factores que afectan la efectividad de campo de un producto qumico al momento de su aplicacin. Explique cada uno de ellos. 2. Durante una entrevista a un productor, este menciona que nunca utiliza la dosis indicada en la etiqueta del producto, puesto que el fabricante solo quiere ganar mas dinero haciendo que el productor aplique una dosis superior a la realmente necesaria. Cmo respondera usted a este comentario?. h. Usos i. Enfermedades importantes que controla o previene j. Dosis k. Aplicacin l. Precauciones m. Informacin adicional.
BIBLIOGRAFIA
1. Agrawal, A. A., Tuzun, S. and Bent, E. 2000. Induce plant defensor against pathogens and herbivores. APS Press. 390 pp SB 750 I54 2. Deacon J. W., Microbial control of plant and diseases, 1983, Washington, berkshire,: Van Nostrand Reinhold, 88 pp. 3. Deng, J. L., and Jones, J. D. G. 2001. Plant. Pathogens and integrated defense responses to infection. Nature 411, 826- 833.
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4. Fox, R. T. 1993. Principles of diagnostic techniques in plant pathology. CAB International. 213 pp. SB 731 F69 5. Maloy, O. C. 1993. Plant diseases control. Principles and practice. John Wiley & Sons Inc. 346 pp. SB 731 M338 6. Strange, R. N., 1993. Plant Diseases Control. Towards environmentally acceptable methods. Chapman & Hall. 354 pp. SB 7326 S77. 7. Vidhyasekaran, P. 1988. Physiology of Disease Resistance in Plants. Volume 1. CRC. Press. pp 149 SB 750 V54. Volume 2 pp 128. SB 750 V54.
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Manual de FITO Revisado 2009 II

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DESARROLLO. El trabajo del laboratorio comprende a las prcticas generales y al seminario.

PRACTICA 1 METODOS DE COLECTA

Muestra No. Localidad Fecha Cultivo (hospedero)

________________ ________________ ________________ ________________

Variedad Edad del cultivo Cultivos anteriores Predio

________________ ________________ ________________ ________________

b) Apariencia general del cultivo

Marchitez Amarillamiento Areas muertas Manchas foliares

________________ Desarrollo anormal ________________ Otros ________________

________________ ________________ ________________

c) Partes atacadas de las plantas. Raz

________________ ________________ ________________

a) Caractersticas del suelo. Drenaje ________________ Textura ________________

PRACTICA 2 PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO Y METODOS DE AISLAMIENTO.

(Bonner- Addicot) (medio B de King)

Dextrosa.............................20gr. Agua destilada....................aforar a 1000 ml

Extracto de Malta ..20 gr

Agua destilada .aforar a 1000 ml

Ca(NO3)H2O (nitrato de calcio)0.236 gr

TCNICAS DE AISLAMIENTO 1. Aislamiento a partir del suelo.

x 10 ml = 0.02 organismos por ml.

amarillo del frijol, a partir de vegetales enfermos? BIBLIOGRAFIA

PRACTICA 3 GENERALIDADES DE MICROORGANISMOS

excrecin, Tincin de flagelos.

Yodo1.0g. KI.2.0g Agua destilada...100ml.

MATERIALES. Embudos preferentemente de vidrio de 15 cm. de dimetro Una pinza Mohr

GENERALIDADES SOBRE EL CONTROL QUIMICO DE ENFERMEDADES

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