LUIS FELIPE GUTIRREZ ALVAREZ

EXTRACTION ET CARACTRISTIQUES DES HUILES DE LARGOUSIER (Hippopha rhamnoides L.)

Une tude des effets de la mthode de dshydratation des fruits sur le rendement dextraction et la qualit des huiles

Mmoire prsent la Facult des tudes suprieures de lUniversit Laval dans le cadre du programme de matrise en Gnie Agroalimentaire pour lobtention du grade de Matre s sciences (M.Sc.)

DPARTEMENT DES SOLS ET DE GNIE AGROALIMENTAIRE FACULT DES SCIENCES DE LAGRICULTURE ET DE LALIMENTATION UNIVERSIT LAVAL QUBEC

2007

Luis Felipe Gutirrez Alvarez, 2007

ii

Rsum
Les huiles dargousier (Hippopha rhamnoides L.) ont t reconnues depuis longtemps pour leurs proprits nutraceutiques. Les effets du schage lair et de la lyophilisation sur les rendements dextraction et la qualit des huiles de graines et de la pulpe dargousier (cv. Indian-Summer) ont t tudis. Les extractions ont t effectues en utilisant lhexane. Les graines sches lair et celles lyophilises ont donn des rendements dextraction semblables (12%p/p), tandis que des diffrences significatives ont t trouves entre les rendements dextraction des pulpes sches lair et lyophilises (35.90.8 contre 17.10.6%p/p). Les acides -linolnique (37.2-39.6%), linolique (32.4-34.2%) et olique (13.1%) furent les principaux acides gras trouvs dans les extraits des graines, alors que les extraits des pulpes furent riches en acides palmitolique (39.9%), palmitique (35.4%) et linolique (10.6%). Le fractionnement des huiles brutes, fait par extraction en phase solide, a donn principalement des lipides neutres (93.9-95.8%). Les indices de peroxyde des huiles des graines et des pulpes furent denviron 1.8 et entre 3.0 et 5.4 meq/kg, respectivement. Les profiles de fusion des huiles ont t caractris par calorimtrie diffrentielle balayage.

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Abstract
Sea buckthorn (Hippopha rhamnoides L.) seeds and pulp oils have been recognized for their nutraceutical properties. The effects of air-drying and freeze-drying on extraction yields and quality of oils from sea buckthorn (cv. Indian-Summer) seeds and pulp were studied. Oil extractions were carried out using hexane. Air-dried (ADS) and freeze-dried (FDS) seeds, gave a similar extraction yields (12%w/w), whereas those of air-dried (ADP) and freeze-dried (FDP) pulps were significantly different (35.90.8 vs. 17.10.6%w/w). Fatty acid analysis revealed that -linolenic (37.2-39.6%), linoleic (32.4-34.2%) and oleic (13.1%) acids were the main fatty acids in seed oils, while pulp oils were rich in palmitoleic (39.9%), palmitic (35.4%) and linoleic (10.6%) acids. Lipid fractionation of crude oils, obtained by solid phase extraction, yielded mainly neutral lipids (93.9-95.8%). The peroxide values of seed and pulp oils were circa 1.8 and between 3.0-5.4 meq/kg respectively. The melting behavior of oils was characterized by differential scanning calorimetry.

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Avant-propos
De plus en plus la population sintresse la consommation daliments sant et daliments traditionnels enrichis en substances (vitamines, minraux, acides gras essentiels, etc.). Cet intrt plutt rcent, et les fortes campagnes publicitaires axes sur les effets bnfiques de ces aliments sur la sant, constituent une des habitudes alimentaires du 21me sicle. Face ce changement dans les habitudes alimentaires, les entreprises agroalimentaires et pharmaceutiques sont appeles satisfaire cette demande. Cest ainsi quaujourdhui, lon trouve dans le march principalement trois gammes de produits ayant des effets bnfiques pour lorganisme : les produits censs contribuer au bon fonctionnement du systme cardiovasculaire, les probiotiques et les produits allgs. Largousier (Hippopha rhamnoides L.), une plante presque inconnue pour la population qubcoise et inexploite commercialement au Qubec, a t import en 1938 de la Russie vers le Canada. Sa production au pays, atteint dj plus de 1.6 million de kilogrammes (Agriculture and Agri-Food Canada, 2003). Il reprsente un candidat de choix pour le march des aliments fonctionnels et nutraceutiques, cause de ses effets bnfiques pour la sant, prouvs scientifiquement depuis le 20me sicle. Dans le cadre dun programme de mise en valeur de largousier au Qubec, ce projet de recherche, sous la direction de M. Khaled Belkacemi (Ph.D), professeur agrg du Dpartement de sols et de gnie agroalimentaire de lUniversit Laval, et la codirection de Mme. Cristina Ratti, (Ph.D), professeure titulaire du Dpartement de sols et de gnie agroalimentaire de lUniversit Laval, a vis un des composants les plus importants du fruit dargousier : ses huiles. Le prsent mmoire se compose de trois chapitres, dont le premier comporte une revue de littrature sur la composition nutritionnelle des fruits de largousier, et les mthodes utilises pour extraire leurs huiles, et le deuxime prsente les hypothses et objectifs de recherche. Le troisime chapitre, dcrivant la mthodologie des travaux raliss et les

v rsultats obtenus, a t rdig en anglais sous forme darticle scientifique. Il sera soumis publication dans la revue Food Chemistry , sous le titre Effect of drying method on the extraction yields and quality of oils from Sea Buckthorn (Hippopha rhamnoides L.) seeds and pulp . M. Luis Felipe Gutirrez est le premier auteur, et Mme. Cristina Ratti et M. Khaled Belkacemi sont les coauteurs. Ils ont apport leur soutien scientifique et leurs conseils selon leurs expertises. Une conclusion gnrale est prsente la fin, donnant une vision globale de lensemble des rsultats obtenus, ainsi que les perspectives de recherche pour des travaux futurs.

vi

Remerciements
Jaimerais exprimer mes plus sincres remerciements mes directeurs de recherche, M. Khaled Belkacemi et Mme. Cristina Ratti, pour la confiance quils mont accord ds ladmission au programme, ainsi que pour le temps consacr et les conseils prodigus tout au long de ce projet. Je remercie trs chaleureusement Mlanie Plourde et Franois-Olivier Marquis-Duval pour leur aide technique dans les analyses GC. galement, Gilles Ayotte pour sa collaboration dans les analyses statistiques des donnes. Je tiens remercier aussi lquipe du laboratoire pilote, Jocelyne Giasson, Mlanie Martineau, Pascal Clich et Gatan Desnoyers. Merci galement ceux stagiaires dt, qui ont travaill avec moi, Mlanie Peng et Mirabelle Prudencio. Un remerciement spcial mes collgues et amis, Mnica Araya, Mirela Vlad-Cristea, Nassima Kemache, Huu Thuan Bui, Rabih Saad et Narindra Raharitsifa. Vos rires et paroles de soutien tout au long de la ralisation de mes travaux, ont rendu cette exprience plus agrable. Jaimerais bien remercier mon pouse, Sandra Dalila. Sa comprhension, son appui inconditionnel, ses sacrifices, et surtout son amour, ont jou un rle incontestable, sans lesquels la ralisation de ce rve naurait pas t possible. Je remercie infiniment mes parents, pour la vie, les principes et lducation quils mont procur tout au long de ma vie. Maman, merci beaucoup pour ton immense amour et pour mencourager toujours. Je voudrais finalement remercier avec gratitude le Conseil de recherches en sciences naturelles et en gnie du Canada (CRSNG), lAssociation des Producteurs dArgousier du Qubec (APAQ), et lInstitut des nutraceutiques et des aliments fonctionnels (INAF), qui ont appuy financirement la ralisation de ce projet.

A mi esposa Sandra Dalila. Gracias a tu comprensin, tu acompaamiento incondicional, tus esfuerzos y sacrificios, se ha hecho posible la realizacin de otro de mis sueos.

Table des matires

Rsum................................................................................................................................... ii Abstract................................................................................................................................. iii Avant-propos .........................................................................................................................iv Remerciements.......................................................................................................................vi Chapitre 1................................................................................................................................3 Revue de littrature.................................................................................................................3 1.1 Largousier..................................................................................................................3 1.1.1. Brve description et distribution gographique ..............................................3 1.1.2. Composition nutritionnelle .............................................................................4 1.1.2.1. Vitamines ................................................................................................5 1.1.2.2. Sucres......................................................................................................6 1.1.2.3. Acides organiques...................................................................................6 1.1.2.4. Minraux.................................................................................................6 1.1.2.5. Flavonodes.............................................................................................7 1.1.2.6. Lipides ....................................................................................................7 1.1.2.7. Acides gras..............................................................................................9 1.1.2.8. Carotnodes .........................................................................................14 1.1.2.9. Strols ...................................................................................................15 1.1.2.10. Dautres composants des lipides...........................................................15 1.1.3. Effets physiologiques des huiles de largousier............................................20 1.1.4. Industrie et produits base dargousier ........................................................21 1.2 Lextraction dhuiles.................................................................................................22 1.2.1. Prparation des matires premires ..............................................................24 1.2.1.1. Le schage....................................................................................................24 1.2.2. Influence de la mthode de dshydratation sur lextraction dhuiles .................29 1.3 Extraction des huiles de largousier..........................................................................30 1.3.1. Extraction des huiles de largousier par pressage...............................................30 1.3.2. Extraction des huiles de largousier par solvants................................................31 1.3.3. Extraction des huiles de largousier avec des fluides supercritiques..................34 1.3.4. Extraction enzymatique des huiles de largousier ..............................................40 1.3.5. Extraction aqueuse des huiles de largousier......................................................40 Chapitre 2..............................................................................................................................50 Hypothses et objectifs de recherche....................................................................................50 2.1. Hypothses.....................................................................................................................50 2.2. Objectif gnral..............................................................................................................50 2.3. Objectifs spcifiques......................................................................................................50 Chapitre 3..............................................................................................................................52 Effects of Drying Method on the Extraction Yields and Quality of Oils from Sea Buckthorn (Hippopha rhamnoides L.) Seeds and Pulp ........................................................................52 3.1 Rsum............................................................................................................................52 3.2 Abstract...........................................................................................................................54 3.3 Introduction.....................................................................................................................54 3.4 Materials and methods ....................................................................................................56 3.4.1 Berries..................................................................................................................56

ix 3.4.2 Air-drying experiments........................................................................................56 3.4.3 Freeze-drying experiments ..................................................................................56 3.4.4 Total lipid content of starting materials...............................................................57 3.4.5 Oil extraction with solvent...................................................................................57 3.4.6 Analytical methods ..............................................................................................58 3.4.6.1 Melting profiles.............................................................................................58 3.4.6.2 Lipid fractionation ........................................................................................58 3.4.6.3 Fatty acid composition..................................................................................59 3.4.6.4 Triglyceride composition..............................................................................59 3.4.6.5 Peroxide value...............................................................................................60 3.4.6.6 Scanning electron micrographs.....................................................................60 3.4.7 Statistical analysis................................................................................................60 3.5 Results and discussion ....................................................................................................60 3.5.1 Moisture content of the sea buckthorn materials. ................................................60 3.5.2 Total lipid of the sea buckthorn materials ...........................................................60 3.5.3 Oil extraction using solvents................................................................................62 3.5.4 Fatty acid composition.........................................................................................66 3.5.5 Triglyceride composition.....................................................................................67 3.5.6 Lipid fractions extracted by SPE .........................................................................70 3.5.7 Peroxide values of the oils ...................................................................................73 3.5.8 Melting profiles....................................................................................................74 3.6 Conclusions.....................................................................................................................78 3.6 References.......................................................................................................................79 Conclusions gnrales...........................................................................................................81 Perspectives de recherche .....................................................................................................84 Annexe 1 ...............................................................................................................................85 Matriaux et produits exprimentaux ...................................................................................85 Annexe 2 ...............................................................................................................................86 Divers espces et sous-espces de lHippopha ...................................................................86 Annexe 3 ...............................................................................................................................87 Enzymatic Oil Extraction of Sea Buckthorn (Hippopha rhamnoides L.) Pulp: A Preliminary Study .................................................................................................................87 Rsum..................................................................................................................................87 Abstract.................................................................................................................................88 Introduction...........................................................................................................................88 Materials and methods ..........................................................................................................89 Fatty acid composition..................................................................................................90 Lipid fractionation ........................................................................................................90 Melting profiles.............................................................................................................91 Experimental design and statistical analysis.................................................................91 Results and discussion ..........................................................................................................91 Fatty acid composition..................................................................................................93 Lipid fractions...............................................................................................................94 Melting profiles.............................................................................................................97 References.............................................................................................................................99

Liste des tableaux

Tableau 1.1.Teneur en acides organiques du jus du fruit de largousier cv. Indian-Summer (Adapt de Li & Beveridge, 2003 et Beveridge et al., 2002) .................................................6 Tableau 1.2. Teneur en lipides (%) des graines du fruit de largousier (H. rhamnoides) selon la sous-espce et la mthode de dtermination (Adapt de Beveridge et al., 1999; Yang & Kallio, 2005 et Yakimishen et al., 2005) ..................................................................8 Tableau 1.3. Teneur en lipides (%) des parties molles (pulpe et peau) du fruit de largousier (H. rhamnoides) selon la sous-espce et la mthode de dtermination (Adapt de Yang & Kallio, 2005 et Yakimishen et al., 2005) ................................................................................9 Tableau 1.4. Composition en acides gras de lhuile des graines du fruit de largousier (Hippopha L.) de diffrentes espces et sous-espces (Adapt de Yang et Kallio, 2005; Rongsen, 2005; Cenkowski et al., 2006) ..............................................................................12 Tableau 1.5. Composition en acides gras de lhuile des parties molles du fruit de largousier (Hippopha L.) de diffrentes espces et sous-espces (Adapt de Yang et Kallio, 2005; Rongsen, 2005; Cenkowski et al., 2006) ..............................................................................13 Tableau 1.6. Teneur en -carotne des huiles de fruits de largousier de diffrentes espces et sous-espces dHippopha L. (mg/100 g dhuile) (Tir de Yang & Kallio, 2005) ..........14 Tableau 1.7. Composition en acides gras des TAGs de lhuile des graines du fruit de largousier (Hippopha L.) de diffrentes espces et sous-espces (Adapt de Kallio et al., 2002a; Yang & Kallio, 2001;Ozerinina et al., 1987; Zhmyrko et al. 1984) .........................18 Tableau 1.8. Composition en acides grasdes TAGs de lhuile des parties molles du fruit de largousier (Hippopha L.) de diffrentes espces et sous-espces (Adapt de Kallio et al., 2002a; Yang & Kallio, 2001; Ulchenko et al., 1995; Zhmyrko et al. 1984) .......................18 Tableau 1.9. Composition en acides gras des PL de lhuile des graines du fruit de largousier (Hippopha L.) de diffrentes espces et sous-espces (Adapt de Kallio et al., 2002a; Yang & Kallio, 2001; ) .............................................................................................19 Tableau 1.10. Composition en acides gras des PL de lhuile des parties molles du fruit de largousier (Hippopha L.) de diffrentes espces et sous-espces (Adapt de Kallio et al., 2002a; Yang & Kallio, 2001) ...............................................................................................19 Tableau 1.11. Caractristiques des extractions des fruits de largousier avec divers solvants. ..............................................................................................................................................35 Tableau 1.12. Caractristiques des extractions des fruits de largousier avec chloroforme mthanol................................................................................................................................36 Tableau 1.13. Caractristiques des extractions des fruits de largousier avec le CO2 supercritique..........................................................................................................................37 Tableau 1.14. Dautres mthodes dextraction des huiles du fruit de largousier (Adapt de Li & Beveridge, 2003) ..........................................................................................................41 Table 3.1. Lipid content in sea buckthorn dry pulp of different subspecies of Hippopha rhamnoides............................................................................................................................61 Table 3.2. Oil recoveries from air- and freeze-dried sea buckthorn seeds and pulp using the Soxhlet extractor with hexane during 4 hours, over various solid to solvent ratios a ...........64 Table 3.3. Effects of variation of temperature (T) and solid to solvent ratio (R), on the extraction efficiency of oils from air- and freeze-dried sea buckthorn seeds and pulpsa. ....66 Table 3.4. Fatty acid composition (percent of total) of oils from air- and freeze-dried sea buckthorn seeds and pulps, extracted with hexane (30-68C). .............................................67

xi Table 3.5. Fatty acid composition (percent of total) in individual lipid fractions of oils from air- and freeze-dried sea buckthorn pulps, extracted with hexane using the Soxhlet extractor during 4 hours. ......................................................................................................................71 Table 3.6. Fatty acid composition (percent of total) in individual lipid fractions of oils from air- and freeze-dried sea buckthorn seeds, extracted with hexane using the Soxhlet extractor during 4 hours. ......................................................................................................................72 Table 3.7. Thermal characteristics of sea buckthorn pulp oils .............................................75 Table A.3.1. Fatty acid composition (percent of total) of oils from sea buckthorn pulp, extracted with three different commercial enzymes during 24 h at pH 5.0 and 50C ..........93 Table A.3.2. Fatty acid composition (percent of total) in individual lipid fractions of oils from sea buckthorn pulp, extracted with three different commercial enzymes during 24 h at pH 5.0 and 50C a..................................................................................................................96 Table A.3.3. Thermal characteristics of enzyme extracted sea buckthorn pulp oils a ..........97

Liste des figures

Figure 1.1. Fruits de largousier (Photo : Luis Felipe Gutirrez) ...........................................3 Figure 1.2. Schma de lopration dextraction dhuiles par solvants. ................................23 Figure 1.3. tapes du procd de lyophilisation (Adapt de Barbosa-Cnovas & VegaMercado, 1996).....................................................................................................................27 Figure 3.1. Mthodologie suivie pour extraire et caractriser les huiles de largousier. ......53 Figure 3.2. Scanning electron micrographs of: (a) air-dried (ADP) and (b) freeze-dried (FDP) sea buckthorn pulps. ..................................................................................................62 Figure 3.3. Oil extraction kinetics from air-dried and freeze-dried sea buckthorn seeds and pulps using the Soxhlet extractor with hexane (R=0.25 g/mL). ...........................................63 Figure 3.4. Extraction efficiency of oils from freeze-dried pulp, over various ratios of solid to solvent (g/mL), using hexane for 24 hours at three different temperatures......................65 Figure 3.5. Triglyceride composition of oils from: (a) air- and freeze-dried sea buckthorn pulps, and (b) air- and freeze-dried sea buckthorn seeds......................................................69 Figure 3.6. DSC melting curves of oils from: (a) air- and freeze-dried sea buckthorn seeds, and (b) air- and freeze-dried sea buckthorn pulps. ...............................................................76 Figure 3.7. SFI of oils from: (a) air- and freeze-dried sea buckthorn seeds, and (b) air- and freeze-dried sea buckthorn pulps. .........................................................................................77 Figure A.3.1. Oil extraction yields obtained from sea buckthorn pulp using three commercial enzymes at different concentrations..................................................................92 Figure A.3.2. Melting profiles of sea buckthorn pulp oils extracted with three different commercial enzymes during 24 h at pH 5.0 and 50C (4C/min scan rate)..........................98 Figure A.3.3. Solid fat content of sea buckthorn pulp oils extracted with three different commercial enzymes during 24 h at pH 5.0 and 50C..........................................................98

Introduction
Largousier (Hippopha rhamnoides L.) est un arbuste originaire dEurope qui a t import en 1938 de la Russie vers le Canada, principalement comme plante ornementale. Plus tard, cette plante est devenue une de celles qui convient le mieux la conservation environnementale (AAC, 2003). Ses fruits sont actuellement dun grand intrt grce leurs proprits nutraceutiques, dj prouves par les anciens mdecins traditionnels de lEurasie, et abondamment tudies surtout au dbut du 21me sicle (Zeb, 2004; Yang et Kallio, 2002; Sleyman et al., 2001, Johansson et al., 2000; Yang et al., 2000). Les fruits dargousier, de part leur richesse vitaminique, ont un contenu apprciable en huile contenant entre autres, deux acides gras essentiels, lacide linolnique (-3) et lacide linolique (-6) (Kallio et al., 2002, 2002a; Yang et Kallio, 2001; Beveridge et al., 1999). La teneur leve en tocophrols, en tocotrinols et en carotnodes de lhuile (Luhua et al., 2004; Zadernowski et al., 2003), lui confrent des proprits antioxydantes, dmontres dans de nombreuses tudes faites chez lhumain et in vitro (Gao et al., 2003; Eccleston et al., 2002). Ainsi, lhuile et autres produits drivs de largousier entreraient dans la catgorie daliments nutraceutiques et fonctionnels. Un aliment nutraceutique est un produit extrait ou fabriqu partir daliments, mais formul sous forme de pilules ou de concentrs dont les bienfaits physiologiques ou de protection contre les maladies chroniques ont t dmontres. Selon Agriculture et Agroalimentaire Canada (AAC), largousier offre au Canada dintressantes perspectives compte tenu de la prsence dun important approvisionnement en eau de haute qualit pour la transformation, dune expertise technique en extraction dhuiles et dun engagement de tous les paliers de gouvernement, envers la cration de produits valeur ajoute nouveaux et diversifis . La rgion de Matane a t nomme rgion pilote pour la culture et la transformation de largousier au Qubec, o il existe environ 36 producteurs qui cultivent largousier pour une production denviron 78.000 plantes. Le cultivar Indian Summer est le plus utilis par

2 les producteurs (96%) suivi de lespce Sinensis (MAPAQ, 2002). Cependant, les procds de transformation ne se sont pas encore dvelopps, et des travaux de recherche sont ncessaires pour trouver des conditions optimales dopration et estimer les cots de mise en march et production. Parmi les produits base dargousier, ses huiles reprsentent une bonne alternative commerciale avec une demande potentielle leve. En fait, partir de largousier, il est possible dobtenir trois types dhuile, selon quon la tire de la pulpe, de la graine ou de la peau (Li & Beveridge, 2003). Cependant, vu la difficult de sparer la peau de la pulpe, normalement on ne fait pas de distinction entre ces deux huiles, et on les nomme indistinctement huile de la pulpe ou huile des parties molles. Lextraction des huiles de largousier a t ralise depuis long temps. Plusieurs mthodes dextraction ont t appliques, mais lextraction par solvants, incluant le CO2 supercritique, prdomine. Comme pour la plupart de fruits, largousier requiert diverses oprations prliminaires avant lextraction de ses huiles. Ces oprations, normalement comportent le nettoyage, le broyage et le schage. Linformation concernant les effets de diffrents paramtres, tels que le type de solvant et la taille des particules, sur le rendement dextraction et la qualit des huiles, est relativement bien connue. Cependant, linformation disponible concernant les effets de la mthode de dshydratation sur lextraction des huiles, nest pas largement rpandue. Lobjectif global de ce travail est donc de comparer les effets de la lyophilisation et du schage lair, comme des oprations de dshydratation des fruits dargousier (cv. Indian summer), sur le rendement dextraction et la qualit des huiles obtenues, en utilisant lhexane comme solvant.

Chapitre 1 Revue de littrature

1.1 Largousier
1.1.1. Brve description et distribution gographique
Largousier (Hippopha rhamnoides L.) est une plante qui se prsente sous la forme dun arbuste ou dun arbre, dont la taille rarement dpasse trois quatre mtres de hauteur, quoique certaines varits puissent atteindre jusqu 20 mtres. Ses feuilles, troites et lancoles, sont de couleur verte argente la face suprieure (Rousseau, 2002). Les fruits se classifient comme non climatriques, et ltat mr peuvent tre jaunes, oranges ou rouges. Ils se prsentent sous forme dovale lgrement arrondie, et sont runis en grappes denses sur les rameaux (Figure 1.1.). Leur poids varie normalement entre 4 et 60 grammes/100 fruits, pouvant dpasser 60 g chez certains cultivars russes. Le poids moyen des fruits du cultivar canadien Indian-Summer , oscille entre 20-40 g/100 fruits (Li & Beveridge, 2003). Chaque fruit contient une graine brune, qui pse environ 16 mg (Harrison & Beveridge, 2002).

Figure 1.1. Fruits de largousier (Photo : Luis Felipe Gutirrez)

4 Six espces (H. rhamnoides, H. salicifolia, H. tibetana, H. neurocarpa, H. gyantsensis et H. goniocarpa) et 12 sous-espces de largousier ont t identifis (Li & Beveridge, 2003), dont deux (lHippopha rhamnoides L. subsp. sinensis Rousi et lHippopha rhamnoides L. subsp. Rhamnoides) sont les plus utilises pour des fins commerciales (Yang & Kallio, 2001). Largousier est naturellement distribu dans les rgions froides de lAsie et lEurope. Les principales populations naturelles dargousier ont t trouves en Chine, Russie et lHimalaya Indien (Singh, 2003). De nos jours, largousier pousse dans environ une trentaine de pays (incluant lAfghanistan, lAllemagne, le Belarus, le Bhoutan, le Danemark, la Finlande, la France, le Npal, la Norvge, le Pakistan, les Pays-Bas, la Pologne, la Rpublique Tchque, la Roumanie, le Royaume-Uni, la Sude et lUkraine), et il a aussi t introduit en lAmrique du Nord et du Sud, Canada et Bolivie, respectivement. Au Canada, largousier est cultiv en Colombie-Britannique, Alberta, Saskatchewan, Manitoba, Qubec et Terre-Neuve (Harrison & Beveridge, 2002). Au Qubec, la rgion de Matane a t nomme rgion pilote pour la culture et la transformation de largousier. Dans cette rgion, il existe environ 36 producteurs, possdant approximativement 78.000 plantes. Le cultivar Indian Summer est le plus utilis, suivi de la sous-espce sinensis (MAPAQ, 2002). Les plantes femelles commencent la production de fruits 4-6 ans aprs lensemencement (Li & Beveridge, 2003), et en milieu naturel, elles peuvent donner un rendement fruitier de 0.751.5 t/ha (Lu, 1992). Schroeder & Yao (1995) ont rapport une production de fruits de 4-5 t/ha en Saskatchewan, tandis quen Colombie-Britannique on a rapport des rendements entre 20-25 t/ha (Li & Beveridge, 2003).

1.1.2. Composition nutritionnelle

Largousier, appel souvent plante miracle, prsente une composition chimique et nutritionnelle unique, faisant delle une source de grand intrt pour lindustrie des aliments fonctionnels et produits nutraceutiques (Oomah & Mazza, 1999).

5 Les baies dargousier sont parmi les fruits les plus nutritifs et les plus riches en vitamines. Ils contiennent jusqu dix vitamines diffrentes, des acides gras essentiels, des sucres, des oligo-lments, des flavonodes, des pigments, ainsi que de lhuile (Yang & Kallio, 2002a). Ils sont aussi riches en protines et en lments chimiques, y compris du fer, du calcium et du manganse (AAC, 2003).

1.1.2.1. Vitamines Les fruits dargousier sont trs riches en vitamines (C, E, A, B1, B2, F, K et P) (Lu, 1992). Des tudes ralises avec des fruits de la sous-espce sinensis ont donn des concentrations en vitamines A, B2 et C beaucoup plus leves que celles contenues dans dautres fruits et lgumes tels que la carotte, la tomate et lorange (Zeb, 2004). La teneur en vitamine C peut varier de 30.4 mg/100 g, chez les fruits de la sous-espce gyantsensis (Rongsen, 2005), 2500 mg/100 mg chez les fruits de la sous-espce chinoise sinensis (Schroeder & Yao, 1995). Pour le cultivar Indian-Summer, Beveridge et al (2002; 1999) ont rapport une teneur en vitamine C oscillant entre 137-193 mg/100 g. Comme le contenu de vitamine C est influenc par plusieurs facteurs, tels que le degr de maturation, lorigine et le temps de la cueillette, les conditions et le temps de stockage, ainsi que par des facteurs gntiques et gographiques, il existe une grande variation de la teneur en vitamine C entre les diffrentes sous-espces et varits. Les tocophrols et tocotrinols (vitamine E) sont aussi trouvs dans des quantits apprciables dans les fruits dargousier. La teneur totale de ces composants varie de 100 300 mg/kg et de 10 150 mg/kg dans les graines et les baies fraches, respectivement (Yang & Kallio, 2002a). Rcemment, Cenkowski et al. (2006) ont trouv des concentrations de tocophrols et tocotrinols variant entre 273.6 et 430.3 mg/100 g et entre 127.4 et 173 mg/100 g, pour les huiles des graines et la pulpe dargousier respectivement, chez le cultivar Indian-Summer.

6 1.1.2.2. Sucres La teneur en sucres des fruits dargousier varie selon lorigine, la sous-espce, le temps de la rcolte et leur tat de maturit. Elle oscille entre 2.0 et 3.3%, quoique certains fruits originaires de la Russie peuvent atteindre jusqu 7.0% (Singh, 2005). Le cultivar IndianSummer prsente un contenu de sucres solubles qui varie entre 9.3 et 17.3 Brix (Li & Beveridge, 2003). Or, les principaux constituants des sucres du fruit de largousier sont le glucose et le fructose, avec des faibles quantits de xylose et dalcools de sucre, tels que le mannitol, sorbitol et xylitol (Li & Beveridge, 2003).

1.1.2.3.Acides organiques Les fruits de largousier ont une teneur leve en acides organiques, parmi lesquels il est possible de mentionner les acides malique, citrique, tartrique, succinique, quinique et oxalique. Daprs Rongsen (2005), la teneur en acides organiques des baies dHippopha varie entre 1.64-5.95%, tant beaucoup plus leve que celle du fruit de citron. Le Tableau 1.1. prsente la composition en acides organiques du fruit de largousier (cv. Indian Summer). On y observe, limportance de lacide quinique, dont la concentration est environ le double de la concentration en acide malique. Tableau 1.1.Teneur en acides organiques du jus du fruit de largousier cv. Indian-Summer (Adapt de Li & Beveridge, 2003 et Beveridge et al., 2002) Acide (mg/mL) Acide malique Acide citrique Acide tartrique Acide quinique Acide oxalique 1.1.2.4. Minraux Les fruits de largousier contiennent des nombreux lments minraux et oligolments. Selon Solonenko & Privalov (2005) la composition minrale du jus est leve, et il contient tendue 11.4 15.5 1.58 2.21 0.67 3.29 19.6 26.5 0.13 0.50

7 tous les micro et macrolments essentiels. Le potassium, le calcium, le phosphore, le magnsium, le sodium et le fer sont les lments les plus reprsentatifs du fruit, bien que dautres lments tels que le cuivre, le manganse, le zinc, le nickel, le strontium, le vanadium, le molybdne, le slnium, le bore, le baryum, laluminium, le soufre, le chlore et le plomb aient t aussi rapports.

1.1.2.5. Flavonodes Plusieurs tudes ont dmontr la prsence de flavonodes dans les fruits et les feuilles de largousier (Tolkachev & Sheichenko, 2005; Tsybikova et al., 2005; Guan et al., 2005; Hkkinen et al., 1999; 1999a). Les principaux flavonodes identifis sont la leucocyanidine, la cathcine, les flavonols (isorhamntine, querctine, quassine et cameline) et des traces de flavanone. Les flavonols peuvent reprsenter environ 87% de tous les composs phnoliques, dont le principal est la querctine (87.3%), suivie de faibles proportions des acides ellagique (4.4%), frulique (3.1%), p-coumarique (2.8%) et p- hydroxybenzoque (2.8%) (Hkkinen et al., 1999a).

1.1.2.6. Lipides Une des caractristiques principales des fruits de largousier est leur richesse en lipides. Contrairement dautres fruits, largousier synthtise et accumule des lipides dans toutes les parties du fruit, et par consquent, il est possible dobtenir trois types dhuile, selon quon la tire de la pulpe, de la graine ou de la peau (Li & Beveridge, 2003). Cependant, vu la difficult de sparer la peau de la pulpe, normalement on ne distingue pas ces deux huiles, et on les nomme indistinctement huile de la pulpe ou huile des parties molles. Yang et Kallio (2002a; 2005; 2005a) ont ralis une rvision trs complte de la teneur et des effets physiologiques des lipides du fruit de largousier. Daprs ces auteurs, le contenu en huile des graines est gnralement constant (environ 10%) et indpendant des caractristiques morphologiques et origines, bien que des valeurs plus leves (jusqu 1516%) aient t rapportes pour quelques cultivars (Kallio et al. 1999; Kallio et al. 2002a;

8 Yang & Kallio, 2002). Par contre, la teneur en lipides des parties molles (pulpe et peau) varie considrablement selon lorigine et dautres facteurs tels que le temps de la cueillette, lapplication de fertilisants inorganiques, ltat de maturit des fruits et le climat. Des valeurs variant entre 4% et 34% (en poids sec) ont t rapportes dans la littrature, dont les plus leves (30-34%) correspondent aux sous-espces caucasica et turkestanika, et les plus faibles (4-12%) la sous-espce sinensis (Yang et Kallio, 2005). Les travaux rcents de Yakimishen et al. (2005) indiqurent que la teneur en huile du cultivar Indian-Summer varie selon la mthode dextraction, entre 10.3% et 19.7% et 3.4% 11.7% pour les parties molles et les graines respectivement. Les Tableaux 1.2. et 1.3. montrent la teneur en lipides des graines et des parties molles du fruit de largousier respectivement, selon la sous-espce ou varit, et la mthode de dtermination. Tableau 1.2. Teneur en lipides (%) des graines du fruit de largousier (H. rhamnoides) selon la sous-espce et la mthode de dtermination (Adapt de Beveridge et al., 1999; Yang & Kallio, 2005 et Yakimishen et al., 2005) Sous-espce ou varit Turkestanika Mthode de dtermination Extraction Soxhlet avec ther dithylique Hexane Extraction avec ther de ptrole Extraction avec chloroforme Non dfinie Chloroforme:Mthanol (2:1) Extraction Soxhlet avec ther de ptrole Extraction Soxhlet avec n-hexane Extraction avec ther de ptrole Non dfinie Chloroforme:Mthanol (2:1) Extraction Soxhlet avec ther de ptrole Chloroforme:Mthanol (2:1) Chloroforme:Mthanol (1:1) Extraction avec ther de ptrole Extraction avec CO2 supercritique Extraction par pression Non dfinie Teneur en lipides (%) 5.3-15.7 11.8 9.3-9.7 11.8-12.4 9.5-10.5 10.1-16.5 8.2-10.3 10.1-10.8 8.1-12.3 6.9-11.4 4.2-10.7 8.2-10.4 7.0-14.2 10.2-11.7 8.2 5.3 3.4 9.69-20.2

Mongolica Sinensis

Rhamnoides Indian-Summer

9 Tableau 1.3. Teneur en lipides (%) des parties molles (pulpe et peau) du fruit de largousier (H. rhamnoides) selon la sous-espce et la mthode de dtermination (Adapt de Yang & Kallio, 2005 et Yakimishen et al., 2005) Teneur en lipides (%) Extraction Soxhlet avec ther de ptrole 30.1-33.2a Caucasica Extraction Soxhlet avec ther de ptrole 23.2-34.0b Extraction Soxhlet avec hexane 17.8-26.7b Turkestanika Chloroforme:Mthanol (1:2) 7.4c Extraction avec ther de ptrole 29.5d Extraction avec chloroforme 31.2d Extraction avec ther dithylique 34.4d Non dfinie 21.2-29.1e Non dfinie 16.0-28.0e Mongolica Chloroforme:Mthanol (2:1) 5.4f Extraction Soxhlet avec ther de ptrole 5.6-9.2b Sinensis Extraction Soxhlet avec ther de ptrole 0.6-1.1c Extraction Soxhlet avec hexane 7.1-8.9b Extraction Soxhlet avec ther de ptrole 20.0f Extraction Soxhlet avec ther de ptrole 11.4-27.6d Extraction avec ther de ptrole 4.1-12.3d Non dfinie 4.1-8.9 Chloroforme:Mthanol (2:1) 2.8f Chloroforme:Mthanol (2:1) 0.8-2.6g Extraction Soxhlet avec ther de ptrole 4.8-5.4f Rhamnoides Chloroforme:Mthanol (2:1) 3.2f Chloroforme:Mthanol (2:1) 1.7-4.1g Extraction avec ther de ptrole 11.9b Indian-Summer Chloroforme:Mthanol (1:1) 19.7b Chloroforme:Mthanol (1:1) 2.0c Extraction avec CO2 supercritique 10.3b Extraction aqueuse 0.7b a Fruit sans ppins, b Parties molles sches, c Jus frais, d Pulpe sche, e Peau, f Parties molles fraches, g Baies surgeles Sous-espce ou varit Mthode de dtermination

1.1.2.7.Acides gras Les huiles issues des baies de largousier sont uniques parce que leur composition en acides gras varie selon quon les tire de la graine ou des parties molles (pulpe et peau). Plusieurs tudes sur la composition en acides gras des huiles du fruit de largousier de diffrentes

10 espces, sous-espces et origines ont t ralises (Cenkowski et al., 2006; Ranjith et al., 2006; Yin et al., 2005; Yakimishen, 2004; Cakir, 2004; Yang & Kallio 2005; 2002; 2002a; 2001; Kallio et al., 1999; 2002a; Beveridge et al., 1999). Lhuile des graines est caractrise par sa teneur lev en acides gras insaturs (85-90%), parmi lesquels deux acides gras essentiels, lacide linolique ou omga-6 (18:2n-6) et lacide -linolnique ou omga-3 (18:3n-3) peuvent reprsenter jusqu 70%. Les proportions de ces deux acides gras sont gnralement 30-40% et 20-35%, respectivement (Yang & Kallio, 2002a). Cependant, des valeurs particulirement faibles ont t rapportes pour des baies sauvages chinoises de la sous-espce neurocarpa (19% dacide linolique et 8% dacide -linolnique) (Yang & Kallio, 2005). Dautres acides gras normalement trouvs dans les graines sont les acides olique (18:1n-9, 13-30%), palmitique (16:0, 720%), starique (18:0, 2-9%) et vaccnique (18:1n-7, 2-4%) (Yang & Kallio, 2002a; 2005) (Tableau 1.4.). Lhuile des parties molles est caractrise par sa forte teneur en acides gras saturs. Elle comporte principalement les acides palmitolique (16:1n-7, 16-54%), palmitique (16:0, 1747%), olique (18:1n-9, 2-35%), et des faibles proportions en acides linolique (18:2n-6, < 10%), -linolnique (18:3n-3, < 3%) et starique (18:0, 0.2-3%) (Ranjith et al., 2006; Cenkowski et al., 2006; Ulchenko et al., 1995; Kallio et al., 1999; 2002a; Yang et Kallio, 2001;2002a, 2005) (Tableau 1.5.). La teneur leve en acide palmitolique, un acide gras rare dans le royaume vgtal, caractrise donc lhuile des parties molles du fruit de largousier comme la source principale dacide palmitolique, suivi de lhuile de noix de macadamia (Macadamia integrifolia) qui en contient environ 20%. Tenant compte de lintrt accru que lon attribue au rle physiologique des acides gras insaturs (Spitz et al., 1992; Katsouyanni et al., 1991), lhuile de la pulpe dargousier attire beaucoup lattention. Les travaux de Yamori et al. (1986) ont indiqu quun apport accru dacide palmitolique dans lalimentation pourrait amliorer le mtabolisme des cellules musculaires lisses vasculaires. De plus, une concentration leve en acide palmitolique, pourrait avoir des effets

11 hypocholestrolmiques et hypotriglycridmiques, et rduire les risques daccident vasculaire crbral (Yang et Kallio, 2002a).

12

Tableau 1.4. Composition en acides gras de lhuile des graines du fruit de largousier (Hippopha L.) de diffrentes espces et sousespces (Adapt de Yang et Kallio, 2005; Rongsen, 2005; Cenkowski et al., 2006)

Espce / Sous-espce / Cultivar 16:0 7.5-9.0 7.9 7.7-9.6 13.6 8.6-11.1 6.7-13.2 10.3 13.9 13.1 12.9 14.3 14.2 9.3 7.6 6.7-7.5 14.8 18.1 16:1n-7 0.3-1.2 0.9 0.4-1.9 3.8 2.5-8.4 0.3-1.1 3.2 0.7 4.2 3.3 1.6 1.4 3.5 0.4 2.4 2.1

H. rhamnoides ssp. mongolica H. rhamnoides ssp. caucasica H. rhamnoides ssp. sinensis H. rhamnoides ssp. yunannesis H. rhamnoides ssp. turkestanika H. rhamnoides ssp. rhamnoides H. rhamnoides ssp. luviatilis H. salicifolia H. goniocarpa ssp. litangensis H. goniocarpa ssp. goniocarpa H. gyantsensis H. neurocarpa ssp. stellatopilosa H. neurocarpa ssp. neurocarpa H. tibetana Cultivar Indian-Summer Cultivar Hergo Cultivar Leikora

Acides Gras (%) 18:0 18:1n-9 18:1n-7 2.0-4.5 14.1-22.0 2.0 3.7 16.3 2.1-3.3 12.9-29.7 1.9-2.5 2.0 14.9 3.4 2.1-2.8 12.9-24.0 3.1 1.8-7.7 13.7-21.1 1.8-3.8 2.5 21.7 2.7 18.9 3.0 2.6 18.0 3.4 2.4 12.8 4.1 4.4 21.9 3.4 2.8 20.6 2.9 2.0 17.0 2.8 2.1 15.1 2.5 2.4-2.8 13.0-13.6 1.9-2.3 6.6 29.9 7.0 31.6 -

18:2n-6 35.0-39.6 45.2 27.6-43.6 33.2 32.0-36.2 34.7-43.0 32.8 37.6 36.1 28.4 32.8 38.5 33.4 38.4 35.3-36.3 13.6 13.9

18:3n-3 29.0-36.9 25.7 20.2-36.3 26.6 13.7-27.3 25.4-38.5 28.7 21.1 20.4 32.0 16.9 17.5 28.7 32.1 35.9-38.5 3.5 5.7

13

Tableau 1.5. Composition en acides gras de lhuile des parties molles du fruit de largousier (Hippopha L.) de diffrentes espces et sous-espces (Adapt de Yang et Kallio, 2005; Rongsen, 2005; Cenkowski et al., 2006)

Espce / Sous-espce / Cultivar 16:0 27.3-40.2 47.0 16.6-32.0 24.7 20.9-34.2 20.4-46.8 40.7 20.8 27.5 25.7 18.7 16.6 30.8 34.3-35.5 35.5-45.8 31.1-36.4 16:1n-7 32.2-53.8 16.4 12.1-35.0 34.3 15.8-54.8 27.1-42.4 26.8 36.0 38.3 17.6 5.6 2.9 35.4 34.4-38.5 16.6-18.2 20.2-21.4

H. rhamnoides ssp. mongolica H. rhamnoides ssp. caucasica H. rhamnoides ssp. sinensis H. rhamnoides ssp. yunannesis H. rhamnoides ssp. turkestanika H. rhamnoides ssp. rhamnoides H. rhamnoides ssp. luviatilis H. salicifolia H. goniocarpa ssp. litangensis H. goniocarpa ssp. goniocarpa H. gyantsensis H. neurocarpa ssp. stellatopilosa H. neurocarpa ssp. neurocarpa Cultivar Indian-Summer Cultivar Hergo Cultivar Leikora

Acides Gras (%) 18:0 18:1n-9 18:1n-7 0.6-3.3 1.6-13.7 35.0 0.8-1.9 12.5-28.1 6.2-9.9 0.6 16.3 8.3 2.1-2.3 11.0-33.9 0.2-1.1 13.3-20.8 8.3-10.7 0.6 26.4 1.0 22.0 11.9 0.7 6.8 8.2 2.3 12.1 9.9 10.0 14.1 6.8 4.5 22.0 6.2 1.6 19.9 9.1 1.1-1.2 3.2-3.5 6.9-7.3 1.2-1.6 22.9-26.8 0.7-2.4 24.3-34.1 -

18:2n-6 5.2-14.0 1.6 2.6-27 9.9 1.0-1.5 3.5-16.5 3.6 3.9 13.7 27.3 35.9 40.6 1.3 12.4-13.5 < 0.1-1.6 < 0.1-3.3

18:3n-3 0.4-14.4 1.2-13.7 2.1 0.3-0.4 0.7-6.8 1.2 1.8 1.6 1.8 2.1 3.2 0.5 1.1-2.0 0.3-1.7 < 0.1-2.5

14 1.1.2.8. Carotnodes Des 600 carotnodes connus dans la nature, 39 ont t identifis dans les fruits dargousier (Singh, 2005). La teneur en carotnodes peut varier grandement selon la source de lhuile (50 et 2139 mg/100 g) (Beveridge et al., 1999). Les huiles de la pulpe sont plus riches en carotnodes que les huiles des graines, lesquelles en contiennent habituellement des faibles quantits (20 85 mg/100 g dhuile) (Li & Beveridge, 2003). Le -carotne constitue environ 15-55% des carotnodes totaux, variant ses teneurs typiques entre 100-500 et 20100 mg/100 g chez les huiles de la pulpe et des graines respectivement (Yang & Kallio, 2002a). La prsence dautres carotnodes dans les fruits dargousier, tels que le carotne, le -carotne, le -carotne, le licopne, le -zacarotne, la cryptoxanthine, la sintexanthine, la lutine et la zaxanthine a t aussi rapporte (Li & Beveridge, 2003). Le Tableau 1.6. prsente les valeurs de la teneur en -carotne des huiles issues de la pulpe et des graines de fruits dargousier de diffrentes espces et sous-espces rapportes rcemment par Yang & Kallio (2005). On remarque que les valeurs les plus leves, dans les huiles de graines et la pulpe, ont t trouves chez lespce H. salicifolia (485.2 mg/100 g et 97.5 mg/100 g respectivement), tandis que les valeurs les plus faibles sont rpertories chez les espces H. neurocarpa et H. rhamnoides sous-espces mongolica et turkestanika (13.0-18.4 mg/100 g et 122.7-169.2 mg/100 g respectivement). Tableau 1.6. Teneur en -carotne des huiles de fruits de largousier de diffrentes espces et sous-espces dHippopha L. (mg/100 g dhuile) (Tir de Yang & Kallio, 2005) Espce / Sous-espce H. salicifolia H. gyantsensis H. neurocarpa H. tibetana H. rhamnoides ssp. sinensis H. rhamnoides ssp. yunannesis H. rhamnoides ssp. turkestanika H. rhamnoides ssp. mongolica Huile de la pulpe 485.2 271.6 148.6 394.3 363.9 364.8 169.2 122.7 Huile des graines 97.5 22.1 13.0 17.3 33.6 21.2 18.4 14.6

15 1.1.2.9. Strols La teneur en strols de lhuile du fruit de largousier oscille entre 2.2 et 8.8%, et varie selon lorigine, la sous-espce, la mthode dextraction des huiles et lpoque de la cueillette des fruits (Li & Beveridge, 2003; Yang et al., 2001). En termes de poids frais, elle oscille entre 0.1-0.2% chez les graines, et entre 0.02-0.04% dans les parties molles (Yang & Kallio, 2002a). Daprs Mironov et al. (1989), environ 50% des strols seraient contenus dans les lipides de la peau du fruit, alors que les lipides de la pulpe et des graines en contiendraient 20% et 30%, respectivement. Yang et al. (2001) ont trouv des contenus de strols variant entre 12 et 23 g/kg, 10 et 29 g/kg et 13 et 33 g/kg dans les huiles des graines, des parties molles (pulpe et peau) et des fruits entiers respectivement, chez les sous-espces sinensis et rhamnoides. Le sitostrol a constitu entre 57 et 76% des strols totaux des graines, et entre 61 et 83% des strols totaux des parties molles. Dautres strols trouvs dans cette tude furent lisofucostrol (13-21%), le stigmastanol (1-5%), le citrostadienol (2-5%) et le campestrol (2-3%) dans les graines, tandis que lisofucostrol, le stigmast-8-n-3-ol et lobtusifoliol ont constitu ensemble entre 3-9% des strols totaux des parties molles. Cenkowski et al. (2006) ont rapport le -sitostrol comme le principal strol identifi dans les huiles de graines (environ 97% des strols totaux) et de la pulpe (96-98% des strols totaux), chez le cultivar Indian-Summer. Dautres strols trouvs dans cette tude furent le campestrol (17.2 22.5 mg/100 g dhuile de graines, et 6.6 12.4 mg/100 g dhuile de la pulpe) et des faibles quantits de cholestrol et stigmastrol.

1.1.2.10.

Dautres composants des lipides

Outre les tocophrols, les tocotrinols, les carotnodes et les strols, les triglycrides (TAGs), les phospholipides (PL), les acides gras libres, et les mono et diglycrides sont les principaux constituants des lipides du fruit de largousier. Leurs proportions et compositions varient selon lorigine, la mthode dextraction, la sous-espce et le degr de maturit des fruits, parmi dautres facteurs (Yang & Kallio, 2005).

16 La teneur en TAGs totaux des fruits dargousier oscille gnralement entre 3 et 6%, malgr quils peuvent atteindre jusqu 14% dans certains cultivars russes (Li & Beveridge, 2003). Chez les sous-espces rhamnoides et sinensis, Yang et Kallio (2002) ont trouv que la teneur en TAGs des graines et des fruits entiers varia entre 5.7% et 13.0%, et entre 1.3% et 3.7% respectivement, tandis que chez la sous-espce mongolica, Kallio et al. (2002a) ont rapport une teneur en TAGs denviron 8.3% et 4.8% dans les graines et les fruits entiers respectivement. Daprs Yang et Kallio (2001), les TAGs constituent 85 90% des huiles des graines et de la pulpe du fruit de largousier. Manninen et al. (1995) ont rapport que lhuile des graines est constitue principalement de TAGs indice dacyle de 54 (environ 74% des TAGs totaux), tandis que lhuile de la pulpe est constitue principalement de TAGs indice dacyle de 48, 50 et 52 (environ 69% des TAGs totaux). La teneur en phospholipides (PL) des graines et des fruits de largousier (sous-espces sinensis, rhamnoides et mongolica) oscille entre 0.4-1.0% et 0.1-0.4% respectivement (Kallio et al., 2002a; Yang & Kallio, 2001; 2002). La lacide phosphatidique (PA), le lyso phosphatidylcholine (PC), la (LPI) et la lyso phosphatidylthanolamine (PE), le phosphatidylinositol (PI), le phosphatidylglycrol (PG), phosphatidylinositol phosphatidylcholine (LPC) ont t identifies dans les graines de largousier par Isamukhamedov & Akramov (1982), qui ont en trouv un contenu de phospholipides de 0.6%. Le contenu de lipides polaires du fruit de largousier est de 8% dans les graines, 3.3% dans la pulpe, et 8.9% dans la peau selon Li & Beveridge (2003). Les travaux rcents de Pintea et al. (2001), ont indiqu que les lipides polaires comprenaient des phospholipides (61%) et des galactolipides (39%). La composition en acides gras des classes des lipides des fruits dargousier a t tudie depuis longtemps (Ulchenko et al., 1995; Ozerinina et al., 1987; Zhmyrko et al. 1984; Mamedov et al., 1981). Quelques donnes correspondant la composition des TAGs et PL

17 des huiles des graines et de la pulpe dargousier, sont prsentes dans les Tableaux 1.7. 1.10.

18

Tableau 1.7. Composition en acides gras des TAGs de lhuile des graines du fruit de largousier (Hippopha L.) de diffrentes espces et sous-espces (Adapt de Kallio et al., 2002a; Yang & Kallio, 2001;Ozerinina et al., 1987; Zhmyrko et al. 1984)

Espce / Sous-espce / Cultivar 16:0 8.6 8.3 7.0 7.1 5.8 7.2 16.8 7.5 16:1n-7 0.6 0.9 19.7 2.5

H. rhamnoides ssp. mongolica H. rhamnoides ssp. sinensis H. rhamnoides ssp. rhamnoides Cultivar Dar Katuni Cultivar Maslichnaya Cultivar Shcherbinka-1 Argousier Ukrainien rgion Paltau Argousier Ukrainien rgion Zeravshan a : Exprim comme 18:1.

Acides Gras (%) 18:0 18:1n-9 18:1n-7 3.3 17.9 2.1 2.3 19.3 2.1 2.8 17.3 2.6 a 2.7 16.6 2.7 12.5a a 2.5 15.1 1.4 18.6a 2.5 18.9a 18:2n-6 38.6 40.6 38.6 39.5 41.3 39.5 28.9 43.4

18:3n-3 29.1 27.5 31.7 33.5 37.7 34.6 14.6 25.2

Tableau 1.8. Composition en acides grasdes TAGs de lhuile des parties molles du fruit de largousier (Hippopha L.) de diffrentes espces et sous-espces (Adapt de Kallio et al., 2002a; Yang & Kallio, 2001; Ulchenko et al., 1995; Zhmyrko et al. 1984)

Espce / Sous-espce / Cultivar 16:0 33.9 23.7 22.3 34.5 36.9 39.6 38.1 40.2 37.2 16:1n-7 32.8 22.1 24.2 37.3 40.1 37.0 32.6 32.2 49.9

H. rhamnoides ssp. mongolica H. rhamnoides ssp. sinensis H. rhamnoides ssp. rhamnoides Cultivar Maslichnaya Cultivar Dar Katuni Cultivar Novost Altai Cultivar Nomernoi Cultivar Zolotoi pochatok Argousier Ukrainien rgion Paltau

Acides Gras (%) 18:0 18:1n-9 18:1n-7 1.2 4.6 6.4 1.5 17.7 6.6 1.3 17.9 7.4 a 2.2 11.0 1.3 10.8a a 2.0 11.4 3.3 10.8a a 2.9 13.6 12.1a

18:2n-6 15.5 18.0 16.5 12.4 10.2 8.1 11.4 10.0 0.6

18:3n-3 5.6 10.3 10.5 Tr. Tr. Tr. Tr. Tr. -

19

Tr. : Traces, a : Exprim comme 18:1.

Tableau 1.9. Composition en acides gras des PL de lhuile des graines du fruit de largousier (Hippopha L.) de diffrentes espces et sous-espces (Adapt de Kallio et al., 2002a; Yang & Kallio, 2001; ) Acides Gras (%) 16:0 17.0 13.6 11.5 5.2 14.3 3.8 20.0 4.9 4.7 6.0 10.0 4.3 16:1n-7 18:0 18:1n-9 18:1n-7 18:2n-6 47.7 45.9 45.6 18:3n-3 14.8 11.9 18.7

Espce / Sous-espce / Cultivar

H. rhamnoides ssp. mongolica

H. rhamnoides ssp. sinensis

H. rhamnoides ssp. rhamnoides

Tableau 1.10. Composition en acides gras des PL de lhuile des parties molles du fruit de largousier (Hippopha L.) de diffrentes espces et sous-espces (Adapt de Kallio et al., 2002a; Yang & Kallio, 2001) Acides Gras (%) 16:0 21.1 15.9 17.0 21.5 15.1 18.6 16:1n-7 18:0 1.6 1.8 2.2 18:1n-9 18.5 16.6 16.5 18:1n-7 9.2 9.5 8.6 18:2n-6 22.2 25.7 24.2 18:3n-3 16.2 15.4 12.9

Espce / Sous-espce / Cultivar

H. rhamnoides ssp. mongolica

H. rhamnoides ssp. sinensis

H. rhamnoides ssp. rhamnoides

20

1.1.3. Effets physiologiques des huiles de largousier

Largousier a t utilis dans les mdecines tibtaines et mongoles pendant plus de mille ans pour le traitement de lexpectoration et de la toux, ainsi que pour amliorer la circulation sanguine et le fonctionnement du systme digestif (Yang & Kallio, 2002a). En 1977, le Dpartement Chinois de Sant Publique a list largousier dans le Dictionnaire des mdecines chinoises (Mingyu, 1994), et rcemment le Ministre Chinois de la Sant a classifi lhuile dargousier dans la catgorie des aliments fonctionnels (Li & Beveridge, 2003). Les effets physiologiques des huiles du fruit de largousier sont nombreux et la recherche sur leurs utilisations mdicinales est encore en dveloppement. Yang & Kallio (2002a; 2005a), ayant fait une compilation exhaustive des effets physiologiques des lipides de largousier, affirment que les effets antioxydants, les effets sur la peau et la muqueuse, les effets sur des facteurs de risque des maladies cardiovasculaires, les effets sur les fonctions immunes et les applications anticancreuses, sont les principaux bienfaits des huiles du fruit de largousier. Les huiles des graines et de la pulpe dargousier ont montr des effets positifs dans le ralentissement du processus doxydation et dans la stabilisation de structures membranaires (Rui & Gao, 1989; Gao, 2005), ainsi que des effets protecteurs contre les dommages de tissu provoqus par intoxication chimique chez les modles animaux (Wu & Meng, 2003). Sleyman et al. (2002) ont montr quun extrait huileux du fruit dargousier, mlang avec lhuile de mas (1/1 v/v), pourrait tre employ comme supplment dittique par les personnes qui fument, afin dempcher le stress oxydatif caus par la nicotine. Selon certaines tudes, lhuile et le jus dargousier renferment des composs de nature anticancreuse (Xu et al. 2001). Lhuile de graines a t employe comme traitement auxiliaire des patients avec diffrents cancers recevant la chimiothrapie (Li, 1993). Ce traitement a fait augmenter le taux de transformation des lymphocytes et le taux de

21 formation de rosette E, et il a allg les effets hmotoxiques et les perturbations gastrointestinales provoques par la chimiothrapie (Li, 1993). Lhuile des graines dargousier a aussi t utilise avec succs comme traitement topique pour les brlures de la peau de premier et deuxime degr (Zhao, 1994). Le traitement avec lhuile des baies dargousier, extrait lhexane, a acclr le processus curatif des blessures de la peau des lapins, par rapport au traitement fait avec lhuile de tournesol (Mironov et al., 1989). Chez les rats, lhuile des parties molles (pulpe et peau) dargousier a montr des meilleurs effets curatifs sur des blessures de la peau, que lhuile des graines (Mironov et al., 1989). Dautres tudes rapportent les effets des extraits des feuilles et du fuit de largousier sur la gurison des blessures cutanes, ainsi que contre la toxicit larsenic et contre les dommages oxydants induits par la radiation, chez les rats (Gupta & Flora, 2006; Goel et al., 2005; Gupta et al., 2005). Sleyman et al. (2001) ont rapport les effets antiulcreux dun extrait lhexane des fruits dargousier chez le rat. Ils ont trouv que ce type dextrait pourrait empcher que des dommages gastriques se produisent. Chez lhumain, les tudes de Yang et al. (1999; 2000), traitent des effets dune supplmentation dittique avec les huiles de la graine et de la pulpe de largousier sur la dermite atopique. Ce traitement a donn des rsultats encourageants. Johansson et al. (2000) ont ralis une tude afin dvaluer les effets de lhuile de la pulpe de largousier sur des facteurs de risque des maladies cardiovasculaires. Ils ont trouv quune supplmentation avec lhuile de la pulpe de largousier pourrait servir comme traitement des personnes qui prsentent des tendances de coagulation sanguine, et quelle pourrait aussi faire diminuer et empcher lagrgation plaquettaire, et par consquent le risque de maladies cardiovasculaires.

1.1.4. Industrie et produits base dargousier

Malgr que lutilisation de largousier en Europe et Asie soit connue depuis des sicles, lactivit industrielle de largousier na dbut en Russie que depuis les annes 40 (Li &

22 Beveridge, 2003). Les premiers produits ont fait partie de la dite des astronautes, qui ont aussi utilis des crmes base de largousier pour la protection de la radiation cosmique (Li & Beveridge, 2003). Cest dans les annes 80 que la Chine tablit les premires plantations, et partir de 1982 prs de 150 industries se sont tablies, produisant environ 200 produits (Li & Beveridge, 2003). Plus rcemment, des industries se sont tablies en Allemagne et dautres pays, incluant le Canada (Yakimishen, 2004). Les produits faits base de largousier occupent une place importante principalement dans les industries pharmaceutique, cosmtique et alimentaire. En Chine et Russie, les fruits et les huiles de largousier sont utilises comme matires premires pour llaboration daliments fonctionnels et dingrdients pour les mdecines naturelles, ainsi que pour la fabrication des produits cosmtiques (Yang & Kallio, 2005a). Dans le cas des industries pharmaceutique et cosmtique, il est possible de trouver des mdicaments sous diverses formes (pilules, capsules, comprims, poudres, arosols, liquides et liniments) lesquels peuvent servir au traitement de diffrentes maladies telles que linflammation des muqueuses buccale, rectale et vaginale, lrosion cervicale, les lsions causes par les rayonnements, les brlures, les ulcres duodnaux, gastriques et cutans (Li & Beveridge, 2003), ainsi quune grande varit de crmes, pommades, shampooings, savons, solutions topiques et protecteurs solaires. Lindustrie alimentaire comprend une large gamme de produits dargousier, tels que les jus, les liqueurs, la crme glac, les bonbons, les confitures, les barres nergtiques, les vins et les ths.

1.2 Lextraction dhuiles

Les procds dextraction dhuiles varient largement selon la source do elles soient issues. Dans le cas de graines et pulpes de fruits, cette opration se ralise principalement par des mthodes mcaniques (extraction par pression), laide de solvants (extraction par solvants), ou par une combinaison des deux.

23 Lextraction par solvants est la mthode la plus largement rpandue pour lobtention dhuiles issues de matriaux olagineux. Il sagit dune opration de transfert de matire impliquant le contact entre un solide qui contient le solut, et un solvant qui le solubilise. Elle comporte gnralement une squence de trois tapes: lextraction de lhuile (faite par des contacts successives entre le solvant et le solide), la dsolvantation du solide (faite gnralement par chauffage la vapeur), et finalement la rcupration de lhuile de la miscella (faite par vaporation et/ou distillation) (Figure 1.2.).
Matriau solide (Graines ou Baies) Nettoyage Rduction du contenu en eau (Cuisson, Schage) Rduction de la taille (broyage, crasement) Extraction par solvants

Solide lixivi limination des traces du solvant pour utilisation postrieure

Miscella (Solvant + Huile) Distillation

Solvant

Huile

Figure 1.2. Schma de lopration dextraction dhuiles par solvants. Compte tenu du fait que lextraction dhuiles est une opration trs ancienne, elle a t abondamment tudie. Des nouvelles mthodes, telles que les extractions assistes par micro-ondes ou par ultrason, lextraction acclre par solvants, lextraction avec des fluides supercritiques, et lextraction assist par des enzymes, ont t dveloppes petite et grande chelle, afin de maximiser les rendements, de diminuer la consommation de solvants, de rduire le temps dextraction, de faire les oprations plus slectives, et de

24 contribuer la prservation de lenvironnement. Dautre part, il est bien connu que les rendements dextraction et la qualit finale de lhuile sont affects principalement par la mthode dextraction, le type et la quantit de solvant, la temprature, le temps dopration, la taille des particules et la teneur en eau du solide.

1.2.1. Prparation des matires premires

Indpendamment de la mthode utilise, lextraction dhuiles comporte gnralement diverses oprations prliminaires, telles que le nettoyage, le dcorticage, le broyage, la floconnisation, la cuisson et/ou schage, et dans certains cas la dtoxication (Fils, 2000; Williams, 1997). De ces oprations, le schage revte une grande importance, vu quil cause des changements physiques, chimiques et structuraux, qui affectent les proprits de transport et la qualit des produits (Okos et al., 1992).

1.2.1.1. Le schage Le schage est un procd de conservation des aliments dont le but et dliminer la majorit de leau quils contiennent, afin que les microorganismes ne puissent plus se dvelopper, et pour ralentir la plupart des ractions de dgradation. Comme tape prliminaire lextraction dhuiles, lobjectif du schage est de rduire la teneur en eau jusquenviron 23%, pour favoriser les rendements dextraction (Williams, 1997; Bernardini, 1983). Le schage est une opration complexe, dans laquelle les transferts de matire et chaleur se produisent simultanment. Malgr quil puisse tre ralis par diverses mthodes, en gnral tous les procds de schage peuvent tre groups dans trois catgories (Beaudry et al., 2004): le schage au soleil, le schage sous conditions atmosphriques (y compris les tuves, les tunnels de schage, et les schoirs lit fluidifi, micro-ondes, et par atomisation), et le schage sous conditions sub-atmosphriques (y compris le schage sous vide et la lyophilisation). Daprs Flink & Knudsen (1987), le schage lair et la lyophilisation sont les mthodes les plus utilises pour rduire la teneur en eau des produits alimentaires solides.

25 1.2.1.1.1. Le schage lair Dans une opration typique de schage lair, le produit dshydrater est plac dans un environnement ferm, et mis en contact avec une courant dair chaud. La chaleur, transmise au produit principalement par convection, gnre un gradient de temprature dans le solide, causant lvaporation de leau libre du produit, laquelle migre constamment vers la surface (par diffusion et/ou coulement capillaire, parmi dautres mcanismes), pour tre postrieurement entrane par lair circulant (Menon & Mujumdar, 1987). Dans cette premire tape du processus, la vitesse de schage, contrle principalement par les proprits physiques de lair (la temprature, lhumidit et le dbit), est gnralement constante (Chen & Johnson, 1969). la fin de la priode de schage vitesse constante, leau libre narrive plus la surface du produit, et il commence une priode vitesse dcroissante, toujours plus longue que celle vitesse constante. Dans cette deuxime priode, la vitesse de schage est gouverne par les proprits physiques du solide, et les transferts de chaleur et de matire sont hautement dpendants de la microstructure du produit (Aguilera & Stanley, 1999). Le schage lair est une mthode de dshydratation largement rpandue cause de sa simplicit et des cots de production relativement bas. Nanmoins, lobtention de produits secs non uniformes, les longues priodes de schage, et les effets ngatifs sur la qualit des produits finaux sont ses principaux dsavantages.

1.2.1.1.2. La lyophilisation La lyophilisation est une mthode de dshydratation qui consiste liminer par sublimation, la majeure partie de leau contenue dans un produit. Cette opration se ralise habituellement des faibles conditions de pression et de temprature (au-dessous du point tripe de leau), et comporte principalement deux tapes: la conglation et la dshydratation. La conglation, normalement ralise dans un appareil diffrente au lyophilisateur, joue un rle capital dans la lyophilisation, parce que la taille et distribution des cristaux de glace forms, influencent le procd de lyophilisation et la qualit du produit final. Lobjectif de

26 cette premire tape est de congeler leau libre du produit, laquelle constitue dans la plupart des cas 70 90% de leau total. En gnral, une conglation rapide proportionne un produit final de meilleure qualit, vu que lon favorise la formation de petits cristaux de glace, lesquels permettront de conserver mieux la structure du produit, prvenant son effondrement pendant ou aprs la lyophilisation (Mellor, 1978). Ltape de dshydratation recouvre deux principes physiques (Marin & Ren, 2000): la sublimation des cristaux de glace forms durant la conglation (appele dshydratation primaire), et la dsorption finale de leau non congelable (dnomme dshydratation secondaire). Le produit congel est plac dans la chambre de schage, do lair est vacu postrieurement laide dune pompe vide. La sublimation se produit en fournissant de lnergie au produit congel, et grce la diffrence de pression existant entre la pression de vapeur deau du front de sublimation (interphase entre la couche sche et la couche congele du produit) et la pression partielle de la vapeur deau dans la chambre de schage. Lnergie ncessaire pour atteindre la sublimation (chaleur latente de sublimation) est fournie au produit congel par conduction et/ou rayonnement, ou par lirradiation des molcules deau avec des micro-ondes (Barbosa-Cnovas & Vega-Mercado, 1996). La dsorption de leau contenue dans la surface interne du produit, commence quand il ny a plus de glace sublimer, et la teneur en eau du produit correspond leau partiellement lie (entre 10 et 30%). Dans cette tape qui peut prendre plus dun tiers de tout le cycle de schage, il est important de maintenir la temprature au-dessous de 30 50C, afin dviter leffondrement du produit (Barbosa-Cnovas & Vega-Mercado, 1996). En bref, les tapes comportant le procd de lyophilisation, peuvent se reprsenter tel quillustr la Figure 1.3. Les produits lyophiliss sont trs lgers et poreux, et prsentent une haute hygroscopicit et une trs faible teneur en eau. Ils peuvent tre stocks presque indfiniment la temprature ambiante, en vitant le contact avec loxygne, la lumire et la vapeur deau (Marin & Ren, 2000; Mellor, 1978).

27

Figure 1.3. tapes du procd de lyophilisation (Adapt de Barbosa-Cnovas & VegaMercado, 1996) En raison de ses particularits, la lyophilisation occupe une place important parmi les mthodes de schage. Elle permet dobtenir des produits finaux de haute qualit, lesquels conservent leurs proprits chimiques, physiques, biologiques et organoleptiques. La forme et texture originales sont aussi conserves, vu que la transition de ltat congel ltat dshydrat, en labsence dune forte proportion deau liquide, rduit les possibilits daltration (Marin & Ren, 2000). En plus, labsence dair et les faibles tempratures dopration, empchent la croissance des micro-organismes et prviennent la dnaturation des protines, les modifications chimiques et le rancissement d loxydation (Mellor, 1978). Or, les principaux dsavantages de la lyophilisation sont relis aux cots nergtiques et au temps de schage (Liapis & Marchello, 1984). Le mode de fonctionnement sous vide, et les faibles vitesses de dshydratation font de la lyophilisation une technique onreuse, et en consquence elle ne sapplique que pour des produits ayant une grande valeur ajoute.

1.2.1.1.3. Effets du schage sur les proprits des produits Outre la diminution de la teneur en eau, le schage cause divers changements physiques, chimiques et structuraux sur les produits. Daprs King (1971) et Aguilera & Stanley

28 (1999), les principaux inconvnients qui peuvent altrer les produits au cours du schage ou durant leur stockage sont: Loxydation de lipides : La prsence doxygne durant le schage lair favorise plus les ractions doxydation des lipides, par rapport la lyophilisation. Cependant, les produits lyophiliss possdant une grande surface spcifique et une trs faible teneur en eau, sont trs susceptibles ce type de dtrioration. Le stockage dans des emballages tanches loxygne ou sous atmosphres contrles (absence doxygne), permet de prvenir ce problme. Le brunissement non enzymatique : Les ractions de brunissement non enzymatique, communment appeles raction de Maillard, dsignent un ensemble complexe de ractions impliquant des composs carbonyls ou des sucres rducteurs et des composs amins libres (protines, acides amins). Elles sont influences par la temprature, et entranent gnralement une modification de lapparence, de la flaveur et de la qualit nutritionnelle des aliments. Contraire au schage lair, les faibles tempratures dopration et la transition relativement rapide dun tat compltement hydrat un tat de faible teneur en eau, permettent de minimiser la raction de Maillard au cours de la lyophilisation. Les ractions enzymatiques : Les ractions enzymatiques peuvent occasionner de diffrentes manires la dtrioration des produits alimentaires. Le brunissement enzymatique, la scission des molcules damidon entranant la production de sucres simples, lhydrolyse de pectines et de lipides sont quelques exemples. Ces ractions sont favorises par des teneurs en eau leves, malgr quelles puissent se prsenter aussi ltat congel. Des traitements de blanchiment sont usuellement utiliss afin de prvenir ce type de ractions. Dnaturation de protines : La dnaturation de protines est un problme qui se prsente durant le schage. Cet inconvnient, caus par les tempratures leves (40 80C, dpendant de la protine et du pH) et par des concentrations de sel leves, occasionne un faible taux de rhydratation, et des changements dans la texture du

29 produit. Par rapport la lyophilisation, le schage lair favorise plus la dnaturation de protines. Changements microstructuraux : La perte de lintgrit cellulaire et le rtrcissement (shrinkage) sont des problmes associes aux changements microstructuraux des produits durant le schage. Les effets du schage sur la microstructure des solides varient dune mthode lautre. Par exemple, il est bien connu que la qualit microstructurale des produits lyophiliss est nettement suprieure celle des produits dshydrats par dautres mthodes, et que le rtrcissement est habituellement beaucoup moins prononc dans la lyophilisation par rapport aux autres mthodes de schage (Mellor, 1978).

1.2.2. Influence de la mthode de dshydratation sur lextraction dhuiles

Le schage lair est la mthode de dshydratation la plus communment utilis pour ajuster la teneur en eau de graines et pulpes de fruits avant lextraction de leurs huiles. Malgr que dautres mthodes de dshydratation ont t values, linformation disponible ce sujet est vraiment limite, et la plupart des tudes sont des applications aux huiles essentielles. Oomah et al. (1998) ont tudi les effets des schages lair et par micro ondes sur le rendement et la qualit de lhuile de ppins de raisins. Ils ont trouv que le schage par micro ondes a fait augmenter significativement le rendement dextraction, par rapport au schage lair (15.4% vs. 14.2%, p<0.05). Lindice de peroxyde et la viscosit des huiles ont t plus levs quand les ppins furent schs par micro ondes. Or, pour ce qui concerne les tocophrols et tocotrinols, les huiles drives des ppins schs par micro ondes ont prsent des contenus en - et -tocophrol et en -tocotrinol plus levs que ceux trouvs dans les huiles issues des ppins schs lair. Cependant, les contenus en et -tocophrol, et en - et -tocotrinol furent plus leves chez les huiles issues des ppins schs lair. Lindice de saponification a t moins lev chez les huiles drives des ppins schs par micro ondes (192.4 vs. 195.9).

30 Dans une tude rcente, Daz-Maroto et al. (2004) prsentent les effets de trois mthodes de schage (schage au four 45C, schage lair la temprature de la pice et lyophilisation) sur les composants aromatiques et la structure des feuilles de basilic. Des pertes de composants volatiles de 28.6%, 27.4% et 13.6% ont t trouves aprs le schage au four, la lyophilisation et le schage lair, respectivement. Le schage a produit dimportants changements structuraux aux feuilles de basilic. La structure des feuilles a collapse aprs les schages au four et lair, tandis quaprs la lyophilisation ce phnomne na pas t observ. Dautres tudes ont aussi montr que la mthode de schage exerce des effets significatifs sur le rendement et la composition des huiles issues plantes aromatiques (Sefidkon et al., 2006; Omidbaigi, et al., 2004; Raghavan et al., 1997; Deans & Svoboda, 1992).

1.3 Extraction des huiles de largousier

Malgr le fait que lextraction et lutilisation des huiles de largousier soient des pratiques trs anciennes, linformation sur les mthodes dextraction des huiles, et linfluence des paramtres oprationnels nest pas couramment disponible. Quelques brevets ont t cits par Li & Beveridge (2003). Les extractions avec des fins analytiques utilisent principalement des mthodes traditionnelles. Quelques donnes rapportant des rendements typiques ont t prsentes prcdemment (Tableaux 1.2. et 1.3.). Cependant, trs peu des dtails concernant les conditions dopration ont t rapports, hormis quelques tudes rcentes sur la modlisation dextractions avec le CO2 supercritique.

1.3.1. Extraction des huiles de largousier par pressage

Trs peu dapplications du pressage pour lobtention des huiles de largousier sont disponibles dans la littrature. Lextraction par pression, daprs Yang & Kallio (2002a), nest pas une mthode approprie pour lobtention de lhuile des graines, compte tenu de son faible rendement par rapport aux cots levs des fruits. Cependant, la centrifugation et

31 dcantation du jus obtenu aprs le pressage des fruits, constituent des mthodes efficaces pour la sparation de lhuile de la pulpe. Arumughan et al. (2005) ont rapport des rendements levs dhuile de pulpe (2.6-3.0% par fruit frais), ainsi que du jus (75-80%), en utilisant le pressage suivi de centrifugation. En utilisant une presse vis, la majorit de la pulpe, et 80% du jus et de lhuile, ont t rcuprs dans la phase liquide. Le procd ainsi dvelopp pour ces auteurs, a permis la sparation denviron 70% de lhuile de pulpe, sans lemploi des solvants organiques, favorisant ainsi la conservation des molcules bioactives quy se trouvent. Lhuile des graines dargousier cv. Indian-Summer a t obtenue par pressage avec des rendements oscillant entre 3.3 et 3.8%w/w (Yakimishen, 2004). Des tempratures entre 63C et 70C, pour lhuile la sortie de la presse, furent utilises. Dans la mme tude, lextraction par pressage de flocons de pulpe (teneur en eau entre 6.2-7.5%) na pas permis la rcupration dhuile. Malgr lindisponibilit dinformation sur lextraction des huiles de largousier par pressage, quelques entreprises en Europe auraient produit des huiles issues de largousier par cette mthode. Par exemple, Vlase et al. (2006) rapportent lutilisation dhuile dargousier obtenue par pressage froid, produit par la compagnie franaise Archimex. Dautre part, diverses compagnies annoncent sur leurs sites Web, les huiles dargousier obtenues par pressage. Cest le cas par exemple de Mountain Rose Herbs (http://www.mountainroseherbs.com/learn/oilprofile/sea_buckthorn.php) Shokaty International Lte (www.shokaty.com) dans le Canada. et HR Laboratories LLC (http://www.hrlaboratories.com) dans les tats-Unis, ainsi que

1.3.2. Extraction des huiles de largousier par solvants

Les huiles des graines et de la pulpe de largousier ont t extraites il y a long temps, laide de diffrents solvants. Nanmoins, tant donn que les publications couramment

32 accessibles sont principalement relies des tudes de caractrisation des huiles ou de diffrentes espces et/ou cultivars, les effets des variables dopration nont pas t tudis. Dans ce contexte, les solvants les plus utiliss sont ceux employs normalement dans les mthodes standards, utilisant lther de ptrole, lhexane et des mlanges de chloroforme et mthanol comme solvants. Mironov et al. (1980), ont ralis des extractions selon la mthode de Soxhlet utilisant lhexane, lther de ptrole, et le chlorure de mthylne. Aprs 45 heures dextraction ils ont rapport des rendements entre 22-23% et 32-34% en poids sec, pour les fruits et la pulpe de largousier respectivement. Une tude de lactivit biologique de ces huiles, a montr que celles-ci avaient une grande capacit pour la rgnration intensive de lsions de la peau chez les lapins et les rats. Lther de ptrole a t utilis pour lextraction des huiles des graines et de la pulpe de fruits dargousier de diffrentes espces (Hippopha rhamnoides ssp. sinensis, Hippopha goniocarpa, et Hippopha neurocarpa) (Lu, 1999). La quantit dhuile obtenue oscillait entre 9.7714.15% et 29.0432.10% pour les graines et la pulpe respectivement. Lespce neurocarpa est celle qui a prsent les valeurs les plus leves en termes de rendement. Yakimishen (2004) a ralis lextraction de lhuile des graines et de la pulpe dargousier (cultivar Indian-Summer), avec lther de ptrole, selon la mthode 02-01A de lAmerican Association of Cereal Chemists. Les rendements des matriaux pralablement sches lair chaud (50C, 24 heures) furent de 8.2% et 11.9% (en poids frais) pour les huiles des graines et de la pulpe respectivement. Lther dithylique a t employ pour lobtention de lhuile de fruits dargousier schs 105C, durant 612 heures (Sabir et al., 2005). Dix grammes de fruits secs, furent soumis des extractions Soxhlet durant six heures, des tempratures entre (3040C). Les teneur en huile, pour les graines et la pulpe, ont vari entre 7.713.7% et 17.829.1% (en poids sec) respectivement.

33 Dans une tude concernant la production dun ester concentr en acide palmitolique, Klaas & Meurer (2004) ont ralis des extractions des fruits dargousier du cultivar Leikora avec le cyclohexane. Un rendement en huile de 20.2% par rapport la peau du fruit fut rapporte. Lhexane a aussi t utilis dans plusieurs tudes. Cakir (2004) a extrait avec lhexane, lhuile du msocarpe et des graines de fruits dargousier, par la mthode de Soxhlet durant huit heures. Les extractions ont t protges contre la lumire et le solvant fut vapor pression et temprature rduites. Tsydendambaev & Vereshchagin (2003) ont utilis lhexane pour lextraction des huiles des graines de largousier, lors dune tude de la variation de la composition en triglycrides durant la maturation des fruits dargousier (cv. Dar Katuni). Yin et al. (2005), ont rapport une teneur en huile de 5.24% en poids sec, pour des graines dargousier extraites avec lhexane 343 K pendant 16 heures avec un ratio solut:solvant de 1:7 (m/v). Oomah et al. (2000) ont ralis lextraction de lhuile de la pulpe et des graines de largousier de diffrents cultivars avec lhexane. La pulpe, a t obtenue partir du jus par centrifugation diffrentes vitesses (2500 et 12000 rpm) Lhuile de la pulpe a t rcupre par homognisation avec lhexane (1:1 w/v). Les graines ont t soumises une extraction de trois heures (ratio 1:5 w/v). Ensuite, lhexane a t vapor et lhuile a t mesure par gravimtrie. Les rsultats ont montr qu une vitesse de centrifugation leve, le rendement dhuile de la pulpe peut atteindre jusqu 49%, et que les caractristiques et composition des huiles varient selon le cultivar et la mthode dobtention. Un rsum des conditions et rsultats doprations dextraction des huiles de largousier avec divers solvants, ainsi que leurs compositions en acides gras est prsent dans le Tableau 1.11. Les mthodes de Folch et al. (1957) et Christie (1982), lesquelles utilisent des mlanges de chloroforme mthanol comme solvant, ont t les plus utilises dans les tudes portant sur la caractrisation des huiles de fruits de largousier et leurs variations selon les diffrentes espces et origines (Ranjith et al., 2006; Tiitinen et al., 2005; Zadernowski et al., 2003;

34 Kallio et al., 2002; 2002a; Yang et Kallio, 2002; 2001; Pintea et al., 2005; 2001). Quelques rsultats obtenus par cette mthode, sont prsents dans le Tableau 1.12.

1.3.3. Extraction des huiles de largousier avec des fluides supercritiques

Lextraction des huiles de largousier avec des fluides supercritiques (CO2), a dj t tudie au niveau de laboratoire, et elle est aussi une technologie utilise pour leur production industrielle (Li & Beveridge, 2003) (Tableau 1.13.). Daprs Li & Beveridge (2003), le rapport de Stastova et al. (1996) constitue la seule source de donnes des premires extractions des huiles de largousier avec le CO2 supercritique. Ces donnes indiquent que lhuile dargousier a t extraite en Russie ds 1978 avec le CO2 en tat liquide. Lextraction contre courant 20C et 5.7 MPa, durant 33.5 heures, dun mlange de flocons de pulpe et des grains schs lair (45:55 en poids), a eu un rendement variant entre 48% en poids. Les mmes auteurs affirment, quen Allemagne, la compagnie FLAVEX a extrait lhuile de fruits dargousier dorigine lituanien, laide du CO2 40C et 35 MPa. Un rendement dextraction de 16.5% en poids a t rapport.

35

Tableau 1.11. Caractristiques des extractions des fruits de largousier avec divers solvants.
Conditions dopration Des graines
45.1 g/kg C16:0 (26.3%) C18:0 (3.2%) C14:0 (1.2%) C15:0 (0.7%) C16:0 (29.3%) C8:0 (1.3%) C10:0 (1.3%) C14:0 (1.4%) C18:0 (1.0%) C16:0 (8.26%) C8:0 (2.78%) C14:0 (0.15%)

Caractristiques de la matire premire Rendement

Saturs Insaturs

Composition des acides gras des huiles

C18:1n-9 (32.8%) C18:2n-6 (21.7%) C16:1n-7 (12.7%) C18:3n-3 (1.4%) C16:1n-7 (47.8%) C18:2n-6 (10.6%) C18:1n-9 (6.5%)

Rfrence
Cakir, (2004)

Les graines et les parties molles

Des fruits dargousier de la Turquie.

Des parties molles

6.4 g/kg

Solvant : n-hexane Temps dextraction : 8 heures. L'extraction : Soxhlet, protge contre la lumire. Aprs de saponifier avec des solutions mthanoliques de NaOH 0.5 M, et dacidifier avec HCl 2 M jusqu pH 4-5, les acides gras ont t extraits au moyen du chloroforme et le solvant vapor postrieurement.

Les graines
52.4 g/kg

Des graines
C18:2n-6 (40.8%) C18:3n-3 (25.7%) C18:1n-9 (22.3%) Non disponibles Solvant : n-hexane Temps dextraction : 16 heures. Temprature dextraction : 343 K Ratio solut/solvant : 1:7

Moulues et tamises, avec un contenu en eau de 13.1% en poids.

Yin et al. (2005)

La pulpe
Solvant : n-hexane Lhuile a t rcupre par homognisation avec hexane (1:1 w/v). Lhuile des graines a t obtenue par extraction durant trois heures (relation 1:5 w/v). Solvant : ther de ptrole Lextraction a t faite selon la mthode 0201A de l American Association of Cereal Chemists. 8.2 %1

De la pulpe
Jusqu 49% en poids, obtenu une vitesse de centrifugation leve.

Obtenue partir du jus par centrifugation (15 minutes 4C) diffrentes vitesses (2500 et 12000 rpm)

Oomah et al. (2000)

Les graines

Des graines
C16:0 (7.00%) C18:0(2.6%) C18:1n-9 (13.6%) C18:1n-7 (2.1%) C18:2n-6 (35.5%) C18:3n-3 (37.4%)

Spares mcaniquement du tourteau sch lair 50C durant 24 heures, et postrieurement nettoyes avec de lair comprim.

Yakimishen (2004) De la pulpe

11.9%1 C16:0 (35.2%) C18:0 (1.2%) C16:1 (35.0%) C18:1n-9 (3.3%) C18:1n-7 (6.9%) C18:2n-6 (12.8%) C18:3n-3 (1.5%)

La pulpe

Obtenue par pressage des fruits et sche lair 50C durant 24 heures.

36

Tableau 1.12. Caractristiques des extractions des fruits de largousier avec chloroforme mthanol.
Conditions dopration
Des graines 73 g/kg a Saturs C16:0 (8.7%) C18:0 (2.5%)

Caractristiques de la matire premire Rendement1 Composition des acides gras des huiles

Rfrence
(Yang et Kallio, 2001)

Les graines Spares mcaniquement du tourteau obtenu par pressage des fruits, et sches l'air la temprature ambiante. Temps dextraction : 3 minutes. Des extractions successives avec chloroforme-mthanol (2:1 v/v) avec postrieure filtr et sparation de la fraction lipidique par dcantation. 113 g/kg b C16:0 (7.4%) C18:0 (3.0%) Des parties molles 80 g/kg a C16:0(26.7%) C18:0 (1.3%)

Insaturs C18:2n-6 (40.9%) C18:3n-3 (26.6%) C18:1n-9 (19.4%) C18:1n-7 (2.2%) C18:2 n-6 (39.1%) C18:3 n-3 (30.6%) C18:1n-9 (17.1%) C18:1n-7 (2.8%)

(Yang et Kallio, 2001)

Les parties molles Obtenues par pressage des fruits, et sches l'air la temprature ambiante. 189 g/kg b

(Yang et Kallio, 2001)

C16:0(27.8%) C18:0 (0.8%)

C16:1n-7(27.2%) C18:1n-9 (17.1%) C18:2n-6 (12.7%) C18:1n-7 (8.1%) C18:3n-3 (7.1%) C16:1(32.8%) C18:1n-9 (17.3%) C18:2n-6 (9.0%) C18:1n-7 (9.1%) C18:3n-3 (3.3%) C16:0(22.9%) C18:0 (0.8%)

(Yang et Kallio, 2001)

Des baies entires Lyophilises jusqu 15-30% du poids original.

Des baies entires 79 g/kg a

(Yang et Kallio, 2001)

166 g/kg b

C16:0(23.6%) C18:0 (1.2%)

C16:1n-7 (21.5%) C18:2n-6 (18.6%) C18:1n-9 (17.6%) C18:3n-3 (11.2%) C18:1n-7 (6.7%) C16:1n-7 (26.0%) C18:2n-6 (15.3%) C18:1n-9 (17.2%) C18:3n-3 (8.8%) C18:1n-7 (7.8%)

(Yang et Kallio, 2001)

37

Dfini comme la masse dhuile obtenue par rapport la masse du matriau solide (bas en poids frais). ssp. sinensis, b ssp. rhamnoides.

Tableau 1.13. Caractristiques des extractions des fruits de largousier avec le CO2 supercritique.
Conditions dopration
Des graines 18-55 g/kg C14:0(0.17%) Des graines 50 g/kg Saturs C16:0(8.85%) C8:0(2.42%)

Caractristiques de la matire premire

Rendement

Composition des acides gras des huiles Insaturs C18:2 (n-6) (40.1%) C18:3 (n-3) (26.7%) C18:1 (n-9) (21.8%)
Non disponibles

Rfrence
Yin et al. (2004)

Les graines
cart de pressions : 20-30 MPa cart de tempratures : 35-40 C Dbit de CO2 : 0.15-0.3 m3/h Temps dextraction : 4-5 heures cart de pressions : 9.6-27 MPa cart de tempratures : 25-60C Dbit de CO2 : 0.1-0.2 L/min Les conditions optimales ont t trouves pour les particules les plus petites 27 MPa et 40C.

Moulues jusqu une taille de 18-36 mailles. Teneur en huile initial: 18.5% en poids. Teneur en eau: 13.1%

Les graines

Spares mcaniquement du tourteau sch lair, et moulues postrieurement trois tailles diffrentes, dont la plus petite contient 50% en poids de particules de 0.1 mm. Teneur en eau: 8-9%.

Stastova et al. (1996)

La pulpe

Obtenue par pressage des fruits et sche lair, et moulue postrieurement aux mmes tailles des graines. Teneur en eau: 4-5% cart de pressions : 8-60 MPa cart de tempratures : 35-65C Dbit de CO2 : 10.5-57 kgCO2/(kg solide*h) Les conditions optimales ont t trouves 27 MPa, 40C et 57 kg CO2/(kg solide*h). Pression dopration : 35 MPa Temprature dopration : 45C Temps dextraction : 6 heures

De la pulpe 85 g/kg

Non disponibles

Les graines

Moulues une taille entre 0.3-1.0 mm et sches lair durant 2 heures 50C. Teneur en huile initial : 9.3% en poids.

Des graines 91.7 g/kg

Non disponibles

Derevich et Shindyapkin (2004) Des graines 53.4 g/kg (30 s) 30.3 g/kg (10 s)

Les graines

Spares mcaniquement du tourteau sch lair 50C durant 24 heures. Postrieurement nettoyes avec lair comprim, et moulues durant 10 et 30 secondes.

C16:0 (7.2%) C18:0(2.4%)

C18:1n-9 (13.0%) C18:1n-7 (1.9%) C18:2n-6 (35.9%) C18:3n-3 (37.9%) De la pulpe 111.3 g/kg C16:0 (35.5%) C16:1 (36.3%)

Yakimishen (2004)

La pulpe

Obtenue par pressage des fruits, et sche lair

38

50C durant 24 heures, en couches de 20 mm dpaisseur.

C18:0 (1.1%)

C18:1n-9 (3.5%) C18:1n-7 (6.9%) C18:2n-6 (12.4%) C18:3n-3 (1.2%)

39 Stastova et al. (1996) ont tudi leffet de diffrentes conditions dopration sur le rendement des extractions des huiles des graines et de la pulpe dargousier, utilisant le CO2 supercritique. Dans cette tude, les graines, spares mcaniquement du tourteau sch lair, ont t moulues et extraites dans un appareil extraction semi continu, en faisant varier les pressions entre 9.6 et 27 MPa, et les tempratures entre 25 et 60C. Des rendements dextraction denviron 50 g/kg et 85 g/kg ont t obtenus pour les graines et la pulpe respectivement, des conditions de 27 MPa et 40C, et avec un dbit de CO2 de 1 L/min. Lhuile de la pulpe a eu une solubilit dans le solvant plus leve que lhuile de graines, probablement d sa teneur en acides gras de chanes plus courts. Laugmentation de la temprature et de la pression a fait augmenter le taux dextraction de lhuile. Cependant, le paramtre qui a affect le plus la quantit dhuile extraite, a t la taille des particules. Les particules plus fines ont fourni les plus grands rendements. Les principaux composants des huiles furent les triglycrides (76-92%), tandis que la teneur en acides gras libres a oscill entre 1-4%. Dautres travaux dextraction des huiles de largousier avec le CO2 supercritique, incluent ceux de Derevich & Shindyapkin (2004), qui ont rapport une efficacit dextraction denviron 70% pour lextraction des graines dargousier 35C et 48 MPa. Yin et al. (2005; 2003) utilisant des conditions optimales (pression dopration entre 20 et 30 MPa, temprature dextraction entre 35-40C, dbit de CO2 entre 0.15-0.3 m3/h, et temps dextraction entre 4-5 heures) rapportrent un rendement dextraction de lhuile de graines denviron 90%. Une composition leve en acides linolique (40.1%), linolnique (26.7%) et olique (21.8%), semblable celle obtenue par Kallio et al. (2002; 2002a) et Yang et Kallio (2002; 2001) en utilisant un mlange de chloroforme mthanol comme solvant, a t rapporte. Yakimishen (2004) a ralis lextraction des huiles de largousier, cultivar Indian summer, avec le CO2 supercritique 45C et 35 MPa. Pour cette fin, les fruits ont t presss, et le tourteau plac en couches de 20 mm dpaisseur a t sch lair durant 24 heures 50C. Aprs le schage, les graines spares de la pulpe laide dun vibrateur et nettoyes avec de lair comprim, taient moulues durant 10 et 30 secondes avant lextraction. Aprs six

40 heures dopration, cette approche a permis lextraction du 37%, 65.1% et 86.3% des huiles des graines moulues durant 10 et 30 secondes, et de la pulpe, respectivement. Pour des temps dextraction plus courts (3 heures), lefficacit de lopration reprsentait 90% par rapport au rendement obtenu durant 6 heures. Cependant, une diminution de 50% du volume de CO2 fut observe.

1.3.4. Extraction enzymatique des huiles de largousier

Les travaux dextractions enzymatiques des huiles de largousier sont quasiment inexistants. Le seule tude, partiellement disponible, est celui de Nikolov & Heilscher (2002). Dans ce travail, les fruits ont t soumis des traitements de tamisage (0.6 mm) ou ultrafiltration (membrane de polysulfone de 100 kDa) et traits avec deux prparations enzymatiques (Novozyme AP ou Rohapect D5L) durant 24 h 20 et 50C. Lultrafiltration et le traitement enzymatique 50C ont donn les meilleurs rsultats, indpendamment du type d'enzymes. Ainsi, ce procd permis rcuprer 97-99% du jus et 1-3% dhuile.

1.3.5. Extraction aqueuse des huiles de largousier

Les tudes des extractions aqueuses des huiles dargousier ne sont pas trs nombreuses. Les travaux rcents de Yakimishen (2004) constituent la seule rfrence disponible pour le cultivar Indian-Summer. Les graines moulues furent soumises lextraction 70C avec lthanol au 40% (ratio 2.5:1 solvant/graines) durant deux heures. Cependant, aprs de centrifuger et sparer la phase liquide, aucune huile na t rcupre. Lhuile de la pulpe fut rcupre aprs deux tapes. Dans la premire, lhuile a t obtenue aprs la centrifugation des fruits macrs et chauffs 45C durant une heure. Dans la deuxime, le jus obtenu aprs la centrifugation de la premire tape, fut extrait avec lthanol (95-99%, 2/1 v/v) durant deux heures 70-80C. Avec ce procd, le rendement en huile de la pulpe a t 0.13%w/w. Dautres mthodes dextraction des huiles du fruit de largousier utilisent le mlangeage et chauffage (60C durant 48 heures) de la pulpe ou des fruits avec lhuile de tournesol, suivi

41 dune sparation par pressage (Mironov, 1980). Le Tableau 1.14. rsume quelques mthodes dextraction cits par Li & Beveridge (2003). Tableau 1.14. Dautres mthodes dextraction des huiles du fruit de largousier (Adapt de Li & Beveridge, 2003)
Mthode
Extraction par solvants avec Dichlore difluormthane Extraction par composants floculants et solvants organiques

Caractristiques
Schage des fruits jusqu une teneur en eau de 1.2 - 1.5%. Taille des particules : 500 m Pression dopration : 0.6 MPa Dure de lextraction : 2-2.5 heures Ajouter des composants floculants lhuile extraite de la pulpe, et enlever le prcipit. Dshydratation de lhuile avec sulfate de sodium anhydre. Rextraction de lhuile laide de benzne. Filtration. Conglation des fruits entre -22 et 27C durant 3-4 jours. Dconglation et fermentation prolonge durant 2-3 jours 60-65C, suivi de la sparation du jus. Schage de la pulpe avec agitation permanente. Sparation de lhuile de la masse sche par centrifugation. Mlange continu de la pulpe broye avec des huiles vgtales, et postrieure sparation de lextrait huileuse. Mouture des fruits et sparation des graines intactes. Les fruits sont mlangs l'huile vgtale prchauffe 50-60 C, et un traitement avec des ultrasons est appliqu, pour faciliter la sparation de l'huile dans les tapes postrieures.

Avantages Dsavantages
Teneur en carotnodes de 500 mg %. Rsidus de solvant inacceptables dans les aliments. Rsidus de solvant inacceptables dans les aliments.

Rfrence
Arkhipova et al. (1995)

Horvarth et al. (1994)

Extraction mchanique

Cot lev. Procd trs long. Rendement faible.

Nizhegorodtsev et Umanskii (1991)

Mlange avec huiles vgtales Mlange avec des huiles vgtales et traitement ultrason

Mlange dhuiles avec un contenu lev en carotnodes. Mlange dhuiles sans rsidus chimiques.

Bekaso (1992), Gavrishin et al. (1990) Gorunzhina et al. (1990). Kesariiski et al. (1990)

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Chapitre 2 Hypothses et objectifs de recherche

2.1. Hypothses
Lapplication de diffrentes mthodes de dshydratation, comme tape de prtraitement des fruits dargousier, aurait un effet sur le rendement de lextraction de leurs huiles. Labsence doxygne durant la lyophilisation serait un facteur qui contribuerait amliorer la qualit des extraits lipidiques des fruits dargousier.

2.2. Objectif gnral

Comparer les effets de la lyophilisation et du schage lair, comme des oprations de dshydratation des fruits dargousier, sur le rendement dextraction et la qualit de leurs huiles, en utilisant lhexane comme solvant.

2.3. Objectifs spcifiques

Dterminer les rendements dextraction des huiles des graines et de la pulpe de largousier schs lair chaud et lyophiliss, et analyser les diffrences causes par ces deux mthodes de dshydratation. tudier les effets de la temprature et du ratio solut/solvant, sur les rendements des extractions, utilisant lhexane comme solvant. Analyser les donnes et dterminer les conditions dextraction optimales. Analyser par chromatographie gazeuse les huiles issues des graines et de la pulpe de largousier schs lair et lyophiliss, pour dterminer leur composition en acides gras et leur contenu en triglycrides, et tablir les diffrences par rapport la mthode de dshydratation.

51 Fractionner les lipides laide de lextraction en phase solide, et dterminer la composition en acides gras de chacune des fractions obtenues. Dterminer les profils de fusion des huiles et leurs teneurs en gras solide (SFC) en fonction de la temprature, en utilisant la calorimtrie diffrentielle balayage (DSC). Estimer ltat doxydation des huiles, laide de lindice de peroxyde. Comparer les donnes obtenues avec ceux rapportes pour dautres espces et sousespces.

Chapitre 3 Effects of Drying Method on the Extraction Yields and Quality of Oils from Sea Buckthorn (Hippopha rhamnoides L.) Seeds and Pulp
Luis-Felipe Gutirrez, Cristina Ratti and Khaled Belkacemi* Soils and Agri-Food Engineering Department, Nutraceuticals and Functional Foods Institute (INAF), Universit Laval, Qubec, G1K 7P4, Canada *Corresponding author. Phone: 418-656-2131, ext. 6511. Fax: 418-656-3327. E-mail: khaled.belkacemi@sga.ulaval.ca Submitted to Food Chemistry Ce chapitre, rdig sous forme darticle dcrit les travaux raliss et les rsultats obtenus, concernant les effets de deux mthodes de schage (lyophilisation et schage lair chaud) sur les rendements dextraction et la qualit des huiles obtenues des fruits de largousier, utilisant lhexane comme solvant.

3.1 Rsum
Les huiles dargousier (Hippopha rhamnoides L.) ont t reconnues pour leurs proprits nutraceutiques. Les effets du schage lair et de la lyophilisation sur les rendements dextraction et la qualit des huiles des graines et de la pulpe dargousier (cv. IndianSummer) ont t tudis. Les extractions ont t effectues en utilisant lhexane. Les graines sches lair et celles lyophilises ont donn des rendements dextraction semblables (12% p/p), tandis que des diffrences significatives ont t trouves entre les rendements dextraction des pulpes sches lair et lyophilises (35.90.8 contre 17.10.6% p/p). Lanalyse des acides gras a rvl que les acides -linolnique (37.239.6%), linolique (32.4-34.2%) et olique (13.1%) furent les principaux acides gras trouvs dans les extraits des graines, alors que les extraits des pulpes furent riches principalement en acides palmitolique (39.9%), palmitique (35.4%) et linolique (10.6%). Le fractionnement des huiles brutes, fait par extraction en phase solide, a donn

53 principalement des lipides neutres (93.9-95.8%). Les indices de peroxyde des huiles des graines et des pulpes furent denviron 1.8 et entre 3.0 et 5.4 meq/kg, respectivement. Les profiles de fusion des huiles ont t caractris par calorimtrie diffrentielle balayage. Le protocole exprimental de ce projet sest divis en trois tapes, comme le montre la Figure 3.1.: Le prtraitement des fruits, lextraction des huiles, et finalement, leur caractrisation.
Conditionnement des chantillons avant l'extraction
Fruits d'argousier congels Broyage

Lyophilisation

Schage l'air chaud

Broyage

Broyage

Tamisage

Tamisage

Pulpe Broyage

Graines Broyage

Pulpe Broyage

Graines

Broyage

Extraction avec l'hexane

Extraction avec l'hexane

Extraction avec l'hexane

Extraction avec nl'hexane

Extraction des huiles

Pulpe lyophilise lixivie

Miscella de la pulpe lyophilise

Graines lyophilise s lixivies

Miscella des graines lyophilises

Pulpe sche l'air lixivie

Miscella de la pulpe sche l'air

Graines sches l'air lixivies

Miscella des graines sches l'air Opration de sparation du solvant Huile des graines sches l'air

Opration de sparation du solvant Huile de la pulpe lyophilise

Opration de sparation du solvant Huile des graines lyophilises

Opration de sparation du solvant Huile de la pulpe sche l'air

Solvant

Solvant

Solvant

Solvant

Caractrisation des huiles

Analyse des huiles

Indice de peroxyde

Fractionnement des lipides

Composition en acides gras

Composition en triglycrides

Proprits de fusion et SFC

Figure 3.1. Mthodologie suivie pour extraire et caractriser les huiles de largousier.

54

3.2 Abstract
The effects of air-drying and freeze-drying on extraction yields and quality of oils from sea buckthorn (cv. Indian-Summer) seeds and pulp were studied. Oil extractions were carried out using hexane. Air-dried (ADS) and freeze-dried (FDS) seeds, gave a similar extraction yields (12%w/w), whereas those of air-dried (ADP) and freeze-dried (FDP) pulps were significantly different (35.90.8 vs. 17.10.6%w/w). Fatty acid analysis revealed that linolenic (37.2-39.6%), linoleic (32.4-34.2%) and oleic (13.1%) acids were the main fatty acids in seed oils, while pulp oils were rich in palmitoleic (39.9%), palmitic (35.4%) and linoleic (10.6%) acids. Lipid fractionation of crude oils, obtained by solid phase extraction (SPE), yielded mainly neutral lipids (93.9-95.8%). The peroxide values of seed and pulp oils were circa 1.8 meq/kg and between 3.0-5.4 meq/kg respectively. The melting behavior of oils was characterized by differential scanning calorimetry (DSC). Keywords: Sea buckthorn, Hippopha rhamnoides, oil extraction, freeze-drying, airdrying, melting profiles, fatty acids, triglycerides, solid phase extraction.

3.3 Introduction
Sea buckthorn berries are rich in vitamins, carotenoids, flavonoids, proteins, antioxidants, amino acids, essential fatty acids, and phytosterols (Beveridge, Li, Oomah & Smith, 1999). The most valuable components of the berries are their oils. Both seeds and berry pulp have high total lipid content, including tocopherols, tocotrienols, carotenoids and two essential fatty acids: -3 and omega-6 (Yang & Kallio, 2002). The composition of the sea buckthorn seed and pulp oils vary according to the subspecies, origins, cultivation activities, harvesting time of the berries, and the extraction method (Yang & Kallio, 2002a). The seed oil is highly unsaturated, with proportions of linoleic (C18:2n-6) and -linolenic (C18:3n3) acids between 30-40% and 20-35% respectively, whereas the pulp oil is more saturated containing high amounts of palmitoleic (C16:1n-7, 16-54%) and palmitic acids (C16:0, 1747%) (Yang & Kallio, 2002).

55 Solvent extraction using hexane and supercritical CO2 extraction are among the main methods used for sea buckthorn oil extraction, although aqueous extraction and pressing are also used. Recently, Yakimishen, Cenkowski, & Muir (2005) reported for sea buckthorn berries cv. Indian-summer, seed oil recoveries of 7.2% and 4.5% using supercritical CO2 extraction and screw pressing respectively, and a pulp-flake oil recovery of 17% for supercritical CO2 extraction. Moreover, low recovery of pulp oil (1.2%) was obtained by aqueous extraction. Oil extraction involves various preliminary operations, such as cleaning, dehulling, drying and grinding. However, the total amount of extracted oil depends mainly on the extraction time and temperature, moisture content and particle size of the oil-bearing materials. The greatest amount of oil is extracted during the first 20 minutes of extraction, and as moisture content decreases, oil recovery increases (Bernardini, 1982). Drying methods have different effects on microstructure and quality of dehydrated products. Freeze-dried food materials remain a benchmark quality because of the structure preservation during removing water (Aguilera, Chiralt & Fito, 2003), contrary to the significant structural changes caused by air-drying. Oomah, Liang, Godfrey, & Mazza (1998) studied the effects of microwave-drying and air-drying on the physical and chemical properties of oil from grape seeds. They found that microwave drying increased oil yield, viscosity, peroxide value and conjugated dienes, whereas p-anisidine and saponification values were reduced. Other studies have showed that drying methods have significant effects on oil extraction efficiency, physical properties and chemical compositions of aromatic plants (Raghavan, Rao, Singh & Abraham, 1997; Omidbaigi, Sefidkon & Kazemi, 2004; Hsu, Chen, Weng, & Tseng, 2003). The effects of dehydration method, as a pretreatment operation to oil extraction, on extraction yields and quality from sea buckthorn berries have hardly been investigated. Therefore, this research aimed to evaluate these effects for two drying methods: air-drying and freeze-drying.

56

3.4 Materials and methods

3.4.1 Berries
Sea buckthorn berries (Hippopha rhamnoides L. cv. Indian-Summer) from Sainte-Annede-Beaupr (Qubec, Canada) were hand-cleaned and stored at -30C in sealed plastic bags until the beginning of the experiments. Before drying, batches of 400 g of frozen berries were ground only for 60 s to avoid possible seed damage, using a blender (model PR200B, General Electric, USA).

3.4.2 Air-drying experiments

Frozen ground berries were placed in a perforated drying tray. Starting with approximately 900 g berries, air-drying experiments were conducted at 50C and 1.0 m/s air velocity for 24 h, using a laboratory tray drier (Model UOP8-G, Armfield, Hampshire England). The dried product was crushed in a mortar to facilitate the separation of seeds from the pulp. Special caution was kept to avoid seeds damage. A 10 mesh (2 mm) sieve (Canadian Standard Sieve Series, W.S. Tyler, St Catharines, ON, Canada) was used to separate most seeds from dried pulp. Pulp residues adhered to seeds, were hand-separated and crushed in a mortar. Air-dried seeds were cleaned and subsequently milled using a disc-grinder (Type C/11/1, GlenMills Inc., Clifton, New Jersey, USA). Particle size distribution was measured using a sieve shaker (model 41314, Retsch Inc., Newtown, PA, United States). Both airdried pulp (ADP) and seeds (ADS) were stored at -20C in plastic containers until oil extraction.

3.4.3 Freeze-drying experiments

Frozen ground berries were laid in layers of approximately 2-cm thickness in aluminum trays covered with perforated aluminium paper. Freeze-drying experiments were carried out in a freeze-drier (model Ultra 25 LE, Virtis, Gardiner, NY, USA) at constant temperature of 50C for 24 h, under vacuum pressure of 0.0145 kPa and a condenser temperature of -48C.

57 After freeze-drying, the samples were immediately stored under vacuum in plastic bags, using a vacuum apparatus (Model 350, SIPROMAC Inc., St-Germain, QC, Canada), until sieving under an anhydrous atmosphere in an Atmos-bag (model Z106089-1EA, Aldrich Atmosbag, Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada). Freeze-dried samples were sieved using a 10 mesh screen allowing the separation of seeds from the pulp and obtaining uniform size pulp particles. Freeze-dried seeds were cleaned manually and subsequently milled, sieved and stored as described above for air-dried seeds.

3.4.4 Total lipid content of starting materials

Total lipids were extracted from ground materials using the chloroform-methanol extraction procedure adapted from Christie (1982). Dried samples were homogenized for 5 min with chloroform/methanol (1:1 v/v) in proportion 1/10 m/v. The mixture was filtered, and the obtained solid residue homogenized with chloroform in proportion 1/5 m/v for 5 min. The filtrate was transfered into a separatory funnel and the solid was extracted once again under the same conditions and filtered. Distilled water was added to the combined filtrates and the resulted mixture was thoroughly shaken and settled overnight. The lower layer containing the lipids was removed from the funnel, and subsequently, the solvent was evaporated on a rotary film evaporator (Bchi R-205, Cole-Parmer, Vernon Hills, Illinois USA). The obtained crude lipid extracts were collected, evaporated under nitrogen, weighed, and stored in sealed amber glass vials at -20C until lipid analysis.

3.4.5 Oil extraction with solvent

Oil extraction was conducted at 30, 40, 50 and 68C using hexane as solvent and three solid to solvent ratios (R): 1/4, 1/7 and 1/14 m/v. A Soxhlet extractor was used for the extractions carried out at 68C, whereas extractions at 30, 40 and 50C were achieved in sealed erlenmeyer flasks under continuous agitation (400 rpm) for 24 h, using a thermoregulated bath. After the extraction process, the flask contents were filtered under vacuum, and the liquid fraction containing lipid extract and solvent was poured into a 500mL flask of a rotary film evaporator to remove the solvent. The extracts were treated as

58 described above for total lipid content. For each dried product, the oil extraction yield (%w/w) and the extraction efficiency were calculated using Eq. 1 and 2 respectively. Oil extraction yield (% ) = Mass of extracted oil ( g ) 100 Mass of oil bearing material ( g ) Oil extraction yield Total lipid content (Eq. 1)

Extraction efficiency =

(Eq. 2)

3.4.6 Analytical methods

3.4.6.1 Melting profiles Melting profiles of the seed and pulp oils were determined using a differential scanning calorimeter (Pyris 1 DSC, Perkin Elmer, Norwalk, CT, USA) equipped with an intracooler II (Perkin Elmer, Norwalk, CT, USA). The system was purged during analysis with nitrogen at 30 mL/min. DSC melting curves were performed within the temperature ranges of -60 to 30C and -50 to 50C for seed and pulp oils respectively. Samples (10-20 mg) were cooled and held at the lowest temperatures for 5 min and then heated at 4C/min. An empty pan was used as inert reference to balance the heat capacity of the sample pan. Calibration of DSC was carried out using indium (mp=156.6C, Hf =28.71 J/g). Data were analyzed using thermal analysis software (Pyris 1 Version 3.5, Perkin Elmer). The solid fat index (SFI) was determined from the DSC melting curves by sequential integration of peak areas (Deroanne, 1977; Lambelet, 1983).

3.4.6.2 Lipid fractionation Separation of individual lipid fractions was achieved using solid-phase extraction (SPE) cartridges (Bakerbond SPE amino [NH2] disposable extraction columns,J.T. Baker Inc., Phillipsburg, NJ, USA) as described by Oomah, Ladet, Godfrey, Liang, & Girard (2000). The cartridges were preconditioned with 2-mL methanol, 2-mL chloroform, and 4-mL hexane before use. Lipid fractions were recovered by sequential elution under vacuum with

59 4-mL each of chloroform/isopropanol (2/1, v/v), diethyl ether/acetic acid (95/5, v/v), and methanol, to separate neutral lipids, free fatty acids and phospholipids, respectively. The collected eluted fractions were evaporated under nitrogen, weighed, and stored at -20C for subsequent fatty acid analysis.

3.4.6.3 Fatty acid composition The fatty acid composition of the oil extracts was determined by GC. Seed and pulp oils were converted into their methyl esters (FAME) and analyzed on a 5890 series II gas chromatograph (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA). The oven temperature was programmed as follows: from 60C (isothermal for 1 min) to 190C at 20C/min, and isothermal period of 30 min at 190C. The injector and detector temperatures were set at 250C. Hydrogen was used as carrier gas. GC separation peaks was performed on a BPX-70 capillary column (60 m0.25 mm i.d.0.25 m film thickness; SGE, Melbourne, Australia). Fatty acids were identified by comparing their retention times with those of the FAME standards purchased from Nu Chek Prep (Elysian, MN, USA) under the same conditions. Peaks were integrated using Hewlett-Packard ChemStation software.

3.4.6.4 Triglyceride composition A gas chromatography (GC) method was used for the determination of the triglyceride composition (TAG) of the oil extracts. Seed and pulp oils were dissolved in octane and analyzed on a 5890 gas chromatograph (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA). The oven temperature was programmed as follows: from 250C to 350C at 1.5C/min, from 350C to 360C at 0.5C/min, and isothermal period of 90 min at 360C. Injector and detector temperatures were set at 400C. Hydrogen was used as carrier gas. The GC separation method was performed on a RTX-65TG capillary column (30 m0.25 mm i.d.0.1 m film thickness; Resteck, Bellefonte, PA, USA). The identification of the peaks was achieved by comparing their retention times with those of the standards purchased from Nu Chek Prep (Elysian, MN, USA) and Sigma-Aldrich (Sigma, St. Louis, MO, USA) under the same conditions. Peaks were integrated using Hewlett-Packard ChemStation software.

60 3.4.6.5 Peroxide value Peroxide values of the extracted oils were determined according to Official methods of the AOCS (1993) (AOCS Recommended Practice Cd 8b-90).

3.4.6.6 Scanning electron micrographs Microstructure observations of ADP and FDP were carried out using scanning electron microscopy (JEOL, Model JSM-6360LV, Tokyo, Japan) operated under vacuum at an accelerating voltage of 30 kV.

3.4.7 Statistical analysis

All assays were carried out at least in duplicate. Analysis of variance by the general linear models (GLM) procedure and mean comparisons by the least significant difference (LSD) test were performed using the Statistical Analysis System (SAS Institute, 2000).

3.5 Results and discussion

3.5.1 Moisture content of the sea buckthorn materials.
Moisture content of fresh pulp and seeds were 87.60.0% and 5.50.2% respectively. After drying operations the average values of moisture content were 2.60.2% and 1.50.3% for ADP and FDP respectively, while no significant effects were found on the moisture content of seeds, in comparison to their initial value.

3.5.2 Total lipid of the sea buckthorn materials

Chloroform-methanol extraction was used to determine the total lipid content of the starting materials. Significant differences were found between the total lipid content of ADP and FDP (35.80.8 vs. 16.40.5%w/w, p<0.001), whereas no significant differences were

61 observed for ADS and FDS (11.10.0 vs. 13.10.8%w/w). Results of lipid content of seeds are in agreement with those reported by Yakimishen (2004) for the cultivar Indian-summer, and by Kallio, Yang, Peippo, Tahvonen, & Pan (2002) and Yang & Kallio (2001) for the subspecies mongolica and rhamnoides. The lipid content of FDP was at the lower end of the expected range reported previously by Yang & Kallio (2002) for different subspecies of Hippopha rhamnoides, whereas lipid yields from ADP were at the higher up of these reported values (Table 3.1). Table 3.1. Lipid content in sea buckthorn dry pulp of different subspecies of Hippopha rhamnoides Subspecies Indian-summer Caucasica Turkestanica Mongolica Sinensis Rhamnoides
a

Lipid content (%) 16.40.5a, 35.80.8b 19.72.3 23-34 18-34 16-28 4-20 16.6-18.9

Ref. This work

(Yakimishen, Cenkowski, & Muir, 2005) (Yang & Kallio, 2002) (Yang & Kallio, 2002) (Yang & Kallio, 2002) (Yang & Kallio, 2002) (Yang & Kallio, 2001)

FDP, b ADP.

Differences in the lipid content of sea buckthorn berries may be attributed to the different subspecies, geographical and climate conditions, harvesting time of the berries, as well as the extraction method (Yang & Kallio 2002a). Nevertheless, the marked difference between oil recovery from ADP and FDP found in this work could be due to the drying effects on pulp cellular microstructure. Figures 3.2a and 3.2b show the scanning electron micrographs of air- and freeze-dried sea buckthorn pulps, respectively. As evidenced, air-drying (Figure 3.2a) caused significant structural changes on pulp cells, contrary to freeze-drying (Figure 3.2b). It can be observed that the size and shape of air-dried pulp cells were irregular while freeze-dried pulp cells exhibited a regular shape and size. Moreover, the diameter and perimeter of ADP cells were larger than FDP cells. Air-drying caused breakage and

62 destruction of cell walls, and consequently large cavities and intercellular spaces were formed. On the other hand, no broken cell walls were observed in freeze-dried pulp. Since mass-transfer through the solid matrix is usually the rate-controlling step in food extractions (Aguilera & Stanley, 1999), and because of the almost negligible cellular damage of FDP, the resistance to oil diffusion is bigger than in ADP. This behavior could explain the differences found in oil recoveries from ADP and FDP.

(a)

(a)

(b)

(b)

Figure 3.2. Scanning electron micrographs of: (a) air-dried (ADP) and (b) freeze-dried (FDP) sea buckthorn pulps.

3.5.3 Oil extraction using solvents

Sea buckthorn seed and pulp oils were bright yellow and dark red respectively. Both oils were liquid at room temperature. The pulp oil was more viscous than seed oil. This could be ascribed to its more saturated nature, as it will be shown later. Extraction yields of oils

63 from ground seeds and pulps were primarily monitored over time at 68C, using the Soxhlet extractor with a solid to solvent ratio R of 1/4. The Figure 3.3 depicts the oil extraction kinetics from air- and freeze-dried sea buckthorn seeds and pulps. Once again, the oil recovery from ADS and FDS was similar, whereas the oil extraction yield obtained from air-dried pulp was more than two folds of that attained from freeze-dried pulp. The airdrying process introduced some structural changes in the shape of cells, and even destroyed them, allowing to the cellular substances, including lipids to be easily extracted. In contrast, the regular structure of FDP cells exerted a transfer resistance to an adequate diffusion of the solvent through the cell membrane.

40 35

Extraction yield (% w/w)

30 25 20 15 10 5 0 0 50 100 150 200

FDP ADP ADS FDS

250

Extraction time (min)

Figure 3.3. Oil extraction kinetics from air-dried and freeze-dried sea buckthorn seeds and pulps using the Soxhlet extractor with hexane (R=0.25 g/mL).

64 As depicted in Figure 3.3, extractions reached equilibrium at about 4 hours. This extraction time was then chosen to evaluate the effect of solid to solvent ratio on oil extraction yields from air- and freeze-dried materials using the Soxhlet extractor (Table 3.2). There was a slight increase in the extraction yield from ADS as the R ratio decreased from 1/4 to 1/14 g/mL (11.20.1 vs. 12.40.1 %w/w, p<0.05), whereas this ratio did not show significant differences on oil extraction yields from FDS, FDP and ADP, where their average values were 13.10.9, 17.10.6 and 35.90.8 %w/w, respectively. These results did not differ significantly from those obtained with chloroform-methanol, indicating a low content of polar lipids, such as phospholipids, in the investigated sea buckthorn materials. Table 3.2. Oil recoveries from air- and freeze-dried sea buckthorn seeds and pulp using the Soxhlet extractor with hexane during 4 hours, over various solid to solvent ratios a R (g/ml) 1/4 1/7 1/14
a

Oil recovery (% w/w) FDS 12.10.6a 13.70.2a 13.50.4a ADS 11.20.1a 11.90.3b 12.40.1b FDP 16.40.7a 17.20.1a 17.60.0a ADP 35.93.9a 35.21.7a 36.72.9a

Means in a column followed by the same letter are not significantly different by LSD test at the 5% level.

To investigate the temperature effect on the extraction efficiency of oils, equilibrium data were obtained at 30, 40 and 50C, after extraction times of c.a. 24 h. For each temperature, the dried sea buckthorn materials were mixed continuously with hexane in sealed erlenmeyer flasks, using 3 levels of R (1/4, 1/7 and 1/14 g/mL). The results indicated that extraction efficiency of oils increased with the increase of temperature and with the decrease of R, as illustrated in Figure 3.4 for FDP. However, the effect of R was more marked than the effect of temperature. When R values decreased, the effect of temperature became less important. Table 3.3 presents the effects of variation of temperature and solidto-solvent ratio on the extraction efficiency of oils from air- and freeze-dried sea buckthorn seeds and pulps. As seen in this Table, there was only an average 4%-increase in the oil

65 extraction efficiency from ADP when the temperature increased from 30 to 50C, while this increase was about 15% (p<0.05) when R decreased from 1/4 to 1/14 g/mL. Thus, contrary to Soxhlet extraction, where the oil recoveries were practically not affected by R ratio because of the occurrence of better mass transfer features during the extraction process, extractions carried out in erlenmeyer flasks were more dependent on R ratio than the temperature. Thus, to obtain high yields (greater than 90% of extraction efficiency), and prevent the negative effects of high temperatures on lipids and other valuable components, oil extractions from sea buckthorn seeds and pulp could be carried out at low temperatures, using low R ratios.

1,0 T = 30C T = 40C T = 50C

0,9

Extraction efficiency

0,8

0,7

0,6

0,5 0,0 0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

R (g/mL)
Figure 3.4. Extraction efficiency of oils from freeze-dried pulp, over various ratios of solid to solvent (g/mL), using hexane for 24 hours at three different temperatures.

66 Table 3.3. Effects of variation of temperature (T) and solid to solvent ratio (R), on the extraction efficiency of oils from air- and freeze-dried sea buckthorn seeds and pulpsa. T (C) 30 40 50
a

Extraction efficiency (%)b FDS 74.7a 87.9b 87.8b ADS 80.2a 80.4a 91.0b FDP 71.4a 76.3b 82.1c ADP 81.6a 84.1a 85.3a

R (g/mL) 1/4 1/7 1/14

Extraction efficiency (%)c FDS 73.1a 84.0b 93.4c ADS 74.5a 85.8b 91.4c FDP 65.2a 76.1b 88.5c ADP 76.6a 83.2b 91.2c

Means in the same column followed by the same letter are not significantly different by LSD test at the 5% level. b Data represent the average of the extraction efficiency values obtained using the three solid to solvent ratios (R): 1/4, 1/7 and 1/14 g/mL. c Data represent the average of the extraction efficiency values obtained at T=30, 40 and 50C.

3.5.4 Fatty acid composition

The fatty acid composition of oils from air- and freeze-dried sea buckthorn seeds and pulps is summarized in Table 3.4. No significant differences were found in the fatty acid composition of pulp oils when comparing the two drying methods, where their main components are palmitoleic (Po), palmitic (P) and linoleic (L) acids (40%, 35% and 10%, respectively). Similar values were recently reported for sea buckthorn (cv. Indiansummer) pulp oil (Cenkowski, Yakimishen, Przybylski & Muir, 2006), whereas Yang & Kallio (2001) reported lower concentrations of palmitic (27%) and palmitoleic acids (27.2-32.8%), and higher proportions of oleic acid (17%), in pulp oils from subspecies sinensis and rhamnoides. Linolenic and -linolenic acids were the major fatty acids in the sea buckthorn seed oils. Except for stearic and oleic acids, oils from ADS and FDS exhibited quasi-similar composition of fatty acid profiles (See Table 3.4). Oils from FDS were richer in -linolenic and linoleic acids (39.6% vs. 37.2%, p<0.05 and 34.2% vs. 32.4% p<0.05, respectively), and poorer in palmitic and palmitoleic acids (6.5% vs. 8.0%, p<0.05 and 0.7% vs. 2.8%, p<0.05, respectively) than oils from ADS. Oleic and stearic acids were 13% and 3%, respectively, in both oils from ADS and FDS. These values were corresponds to those reported by Cenkowski, Yakimishen, Przybylski & Muir (2006) with

67 slightly lower linoleic acid content for similar cultivar. However, compared to those of seed oils from subspecies sinensis and rhamnoides (Yang & Kallio, 2001), a lower content of oleic (O) and linoleic (L) acids (13% vs. 18% and 33% vs. 39% respectively) and a higher amount of -linolenic (Ln) acid (38% vs. 29%) were obtained in our results. Table 3.4. Fatty acid composition (percent of total) of oils from air- and freeze-dried sea buckthorn seeds and pulps, extracted with hexane (30-68C). PULP ADP 35.31.6 40.11.2 1.80.2 0.80.04 3.20.2 6.50.5 10.60.6 0.90.1 FDP 35.50.5 39.71.2 2.00.3 0.90.1 3.00.4 6.30.1 10.60.7 1.10.2 ADS 8.00.5a 2.80.5a nd 3.10.5 13.10.6 2.20.1a 32.41.0a 37.21.4a SEEDS FDS 6.50.2 0.70.2 nd 2.90.03 13.10.2 1.90.04 34.20.3 39.60.4

Fatty acid C16:0 (Palmitic) C16:1 (Palmitoleic) C17:0 (Margaric) C18:0 (Stearic) C18:1n-9 (Oleic) C18:1n-7 (Vaccenic) C18:2n-6 (linoleic) C:18:3n-3 (-linolenic)

nd: Not detected. a p<0.05 between the two drying methods.

Polyunsaturated fatty acids (PUFA) of the seed oils amounted between 70-75% of the total fatty acids, while the monounsaturated (MUFA) and saturated (SFA) fatty acids were about 18% and 11% respectively. These oils, characterized by high ratios of PUFA/MUFA and PUFA/SFA, are prone to the oxidation because of their high content in -linolenic acid.

3.5.5 Triglyceride composition

Figure 3.5a shows the triglyceride (TAG) composition of oils from ADP and FDP. Significant differences were found in the TAG profiles of pulp oils when comparing the two drying methods. These differences were probably due to the more severe conditions of

68 air-drying introducing some changes in the TAG molecules of ADP. However, pulp oils contain mainly TAG with acyl carbon numbers of 48 and 50, with 1-3 double bonds (C48:2, C48:1, C50:3, C50:2 and C48:3), representing approximately 85% of the total TAGs. Taking into account the fatty acid composition of pulp oils (Table 3.4), C48 molecules (representing more than 50% of the total TAGs) should largely correspond to TAG of three 16-carbon fatty acids. Most of these TAG molecules could mainly be PoPoP, PPPo and PoPoPo. Similarly, C50 molecules (representing about 40% of the total TAGs) would correspond to TAGs with two 16-carbon fatty acids and one 18-carbon fatty acid. In view of these results, the majority of TAGs could correspond principally to PPoL and PPL. The TAG distribution of oils from ADS and FDS is showed in Figure 3.5b. As can be seen in this Figure, seed oils were mainly constituted by TAGs with acyl carbon numbers of 54 and 52, and minor amounts of C48 and C50 molecules, which comprise predominantly 18and 16-carbon fatty acids. As showed in Table 3.4, oils from ADS were richer in palmitic and palmitoleic acids, and poorer in linoleic and -linolenic acids than oils from FDS. These differences made that the proportions of C54 and C52 TAGs were higher in oils from FDS than in oils from ADS (66% vs. 56%, p<0.01 and 30% vs. 28%, p<0.01 respectively), whereas concentrations of C48 and C50 molecules were higher in oils from ADS than in oils from FDS (8% vs. 1%, p<0.01 and 7% vs. 2%, p<0.01 respectively). Regarding the fatty acid composition of seed oils, C54 and C52 TAGs would be mainly, LLL, LnLnO, OLLn, LLLn, LLO, LLP and PLLn. In general, the TAG compositions of seed and pulp oils obtained in this work were in accordance with those reported by Yang & Kallio (2006) for seeds and berries of sea buckthorn of different subspecies and origins.

69
35 30 25
FDP ADP

(a)

Content (%)

20 15 10 5 0
1 2 3 1 2 3 2 4 3 4 8: 8: 8: 0: 0: 0: 0: 2: 2: 2: C4 C4 C4 C5 C5 C5 C5 C5 C5 C5

25
FDS ADS

20

(b)

Content (%)

15

10

0
1 2 3 1 2 3 2 3 4 5 6 3 4 5 6 7 8 8: 8: 8: 0: 0: 0: 2: 2: 2: 2: 2: 4: 4: 4: 4: 4: 4: C4 C4 C4 C5 C5 C5 C5 C5 C5 C5 C5 C5 C5 C5 C5 C5 C5

Figure 3.5. Triglyceride composition of oils from: (a) air- and freeze-dried sea buckthorn pulps, and (b) air- and freeze-dried sea buckthorn seeds.

70

3.5.6 Lipid fractions extracted by SPE

Sea buckthorn seed and pulp oils consisted mainly of neutral lipids (NL) (95%), with minor amounts of free fatty acids (FFA) (2-4%) and phospholipids (PL) (1-2%) (Tables 3.5 and 3.6). High levels of neutral lipids (92%) have been reported for sea buckthorn seed oil by Zadernowski, NowakPolakowska, Lossow, & Nesterowicz (1997), while similar values for FFA and PL fractions in oils from pumpkin seeds were recently reported (Yoshida, Shougaki, Hirakawa, Tomiyama & Mizushina, 2004). The fatty acid profiles of the NL fractions were very close to the corresponding crude seed and pulp oils, because of the quantitative primacy of this fraction in the oils. However, when comparing the two drying methods, slight differences were found between the fatty acid compositions of oils from ADP and FDP. On the other hand, similar differences observed in the fatty acid profiles of crude seed oils were found in the NL fractions of ADS and FDS. The PL fractions of pulp oils were poorer in palmitic and palmitoleic acids (11% and 4%, respectively), but much richer in linoleic and -linolenic acids (8% and 5%, respectively) than in crude oils (Table 3.5). Significant differences, that could be attributed to the alterations of the cell membrane during air drying, were found in the proportions of linoleic (18.4% vs. 20.5%, p<0.05) and palmitic (25% vs. 22.7%, p<0.05) acids, when comparing the PL fractions of oils from ADP and FDP, respectively. The PL fractions of seed oils were in general richer in linoleic (13%), palmitic (4%) and stearic (3%) acids, and poorer in -linolenic acid (20%), than in crude oils (Table 3.6). Except for linoleic acid, which amounted 45% of the total fatty acids in both oils from ADS and FDS, significant differences in the proportions of the other fatty acids were found in PL fractions when comparing air- and freeze drying methods.

71

Table 3.5. Fatty acid composition (percent of total) in individual lipid fractions of oils from air- and freezedried sea buckthorn pulps, extracted with hexane using the Soxhlet extractor during 4 hours. Oil from ADP NL 95.81.3 35.80.1a 28.71.0 38.20.5 2.90.0 nd 2.40.1 7.60.2 13.60.3 6.61.0 2.40.9 8.90.3 18.40.9a 5.80.2 1.60.3 3.20.3a 34.80.7 39.20.1 2.00.0a 0.90.0 3.00.0a 6.40.0 11.00.0a 0.90.0a
a

Oil from FDP PL 2.20.3 25.01.1a 35.20.1 39.90.1 2.20.0 0.90.0 2.70.0 6.30.0 10.80.0 1.00.0 94.30.1 NL FFA 4.00.5 27.62.2 39.40.8 3.10.3 nd 2.10.1 7.30.3 12.70.5 6.91.8 PL 1.50.4 22.70.4 35.20.7 3.90.1 1.20.0 1.40.1 8.90.3 20.51.0 5.30.2

FFA 1.70.8a

Composition (mass%)

C16:0 (Palmitic)

C16:1 (Palmitoleic)

C17:0 (Margaric)

C18:0 (Stearic)

C18:1n-9 (Oleic)

C18:1n-7 (Vaccenic)

C18:2n-6 (linoleic)

C:18:3n-3 (-linolenic)

nd: Not detected. a p<0.05 between the two drying methods.

72

Table 3.6. Fatty acid composition (percent of total) in individual lipid fractions of oils from air- and freeze-dried sea buckthorn seeds, extracted with hexane using the Soxhlet extractor during 4 hours. Oil from ADS NL 94.31.1 8.20.06a 2.90.1a 2.90.0 12.70.2 2.20.0 31.90.4a 37.70.4 35.81.5a 30.90.9a
a

Oil from FDS PL 1.20.1 12.20.7b 1.90.6a 6.50.2a 12.60.2c 4.90.1

a

FFA 2.90.2 9.10.7b 3.10.1c 3.20.2a 12.20.4b 2.30.1

a

NL 93.90.6 6.90.1 1.40.2 3.00.1 13.00.2 2.00.0 33.10.5

FFA 2.71.9 6.80.0 1.40.0 3.00.0 13.00.1 2.00.0 32.90.3

PL 0.80.2 10.00.2 0.60.2 5.90.2 14.20.2 4.50.1 45.90.9

Composition (mass%)

C16:0 (Palmitic)

C16:1 (Palmitoleic)

C18:0 (Stearic)

C18:1n-9 (Oleic)

C18:1n-7 (Vaccenic)

C18:2n-3 (linoleic)

44.41.7 15.20.1a

C:18:3n-3 (-linolenic)

38.70.7

38.50.4

17.41.4

p<0.05, b p<0.01, c p<0.001 between the two drying methods.

73 In general, for both seed and pulp oils, the fatty acid profiles of PL fractions obtained in this work, are within the range reported for others subspecies of sea buckthorn (Kallio, Yang, Peippo, Tahvonen & Pan 2002; Yang, & Kallio, 2001). Nevertheless, the sea buckthorn (cv. Indian-summer) pulp oils would have a higher content in palmitoleic and palmitic acids, but a lower content in linoleic and -linolenic acids, compared with subspecies mongolica, sinensis and rhamnoides. Genetic differences among subspecies, as well as geographical conditions, cultivating activities and lipid extraction processes, could explain these differences (Yang & Kallio 2002a). The fatty acid profiles of the FFA fractions of seed and pulp oils were relatively similar to those of crude oils (Tables 3.5 and 3.6). However, lower proportions of palmitic acid (7%) and higher amounts of -linolenic acid (6%), were observed in pulp oils. In the case of seed oils, once again the same differences found in the fatty acid compositions of crude oils were observed in the FFA fractions, when comparing the two investigated drying methods. As observed in Tables 3.5 and 3.6, the different conditions of the drying methods used in this work introduced some changes in the fatty acid profiles of individual lipid fractions of the oils. Consequently, their TAG compositions were also affected, as showed in Figures 3.5a and 3.5b.

3.5.7 Peroxide values of the oils

Fresh oils from air- and freeze-dried sea buckthorn seeds and pulps had a peroxide value (PV) of 1.8 and 4 meq/kg, respectively, which are lower than those generally found in commercial vegetable oils (10 meq/kg). However, the PV of oils from ADP was higher than those from FDP (5.40.3 vs. 3.01.9 meq/kg). The absence of oxygen during freezedrying of pulp and the effects of the more severe conditions of air-drying could explain these results.

74

3.5.8 Melting profiles

The melting curves of seed oils showed 4 overlapping peaks as depicted in Figure 3.6a. This figure shows one minor low-temperature endothermic transition below -40C, followed by one prominent endothermic transition, and two high-temperature endothermic minor peaks at about -24C and -15C respectively. The main endothermic transition, most likely corresponded to melting of the major TAG groups, C54 TAGs, such as LLL, LnLnO, OLLn, LLLn and LLO. As can be seen in Figure 3.6a, oils from ADS did not show the two higher-temperature peaks as exhibited by FDS oils. Only, a single peak at about -21C was depicted. Moreover, the lower-temperature endotherm was broader for oils from ADS than those from FDS. The slight differences between the melting curves could be attributed mainly to the difference in the TAG composition of the oils obtained from air- and freezedried seeds. The melting enthalpies found for oils from ADS and FDS (70.35.8 J/g and 64.74.7 J/g, respectively) are in agreement with those reported by Tan & Che Man (2002) for various vegetable oils. In Figure 3.6b, the DSC melting curves of oils from ADP and FDP indicate the presence of three major groups of triglycerides melting independently between -30C and 20C. The more saturated nature of sea buckthorn pulp oils is highlighted in these thermograms. The first low-temperature endotherm (LTE), between -30C and -6C, could mainly correspond to the melting of unsaturated TAGs such as PPoL, PPL and PoPoPo, whereas the other two middle- and high-temperature endotherms (MTE and HTE), would represent the melting of more saturated TAGs, such as PoPoP and PPPo, representing about 50% of the total TAG in sea buckthorn pulp oils. As depicted in Figure 5b, the main peak of the middletemperature endotherm was followed by two minor transitions prior to the melting of the third group of TAG. Nevertheless, the melting temperature selected for this endotherm corresponded to the main peak. A similar criterion was used for the temperature attribution for the first low-temperature endotherm. Therefore, the melting enthalpies and temperatures of each endotherm are given in Table 3.7. When comparing the two drying methods, there were no significant differences between the melting temperatures of endotherms, being their average values -22.5C, -4C and 10C for the low-, middle- and high-temperature

75 endotherms respectively. The melting enthalpy of the low-temperature endotherm was lower in oils from ADP than in those from FDP (19.4 J/g vs. 25.6 J/g, p<0.01), whereas melting enthalpies for the middle- and high-temperature endotherms were about 10 J/g and 40 J/g. The different TAG profiles observed in oils from ADP and FDP could explain the differences found between the melting enthalpies of the low-temperature endotherms. On the other hand, according to Timms (1980), the large area of the highest melting peak would partly due to the higher heat of melting of the TAG groups corresponding to this endotherm. Another reason which could explain this situation is connected to the presence of high melting triglycerides crystallizing together with lower melting triglycerides in a quasi-stable mixture. Table 3.7. Thermal characteristics of sea buckthorn pulp oils ADP LTE Tm (C) Hm (J/g)
a

FDP HTE 9.91.5 40.48.9 LTE -22.40.6 25.62.4 MTE -3.40.4 10.21.7 HTE 10.90.4 40.61.9

MTE -4.40.9 9.52.9

-23.00.6 19.42.8a

p<0.01 between the two drying methods. Tm: Melting temperature. Hm : Melting enthalpie.

The solid fat indices (SFI) of the sea buckthorn seeds and pulp oils, calculated from their corresponding thermograms by sequential peak integration areas, indicated that SFI decreased as temperature increased (Figures 3.7a and 3.7b). Once again, it can be noticed in these curves the differences found in the TAG profiles of both seed and pulp oils. Seed oils melted completely at temperatures around 0C, because of their high unsaturated nature, whereas complete melting of TAGs is achieved above 20C for pulp oils, confirming their more saturated nature.

76
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 -60 -50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30

FDS ADS

(a)

H t fl d d
H t fl d d

Temperature (C)
0 1 2 3 4 5 6 -50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50

FDP ADP

(b)

Temperature (C)

Figure 3.6. DSC melting curves of oils from: (a) air- and freeze-dried sea buckthorn seeds, and (b) air- and freeze-dried sea buckthorn pulps.

77

100

SFI oils from FDS SFI oils from ADS

80

60

(a)

40

SFI (%) SFI (%)

20

0 -60 -50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30

Temperature (C)
100

SFI oils from FDP SFI oils from ADP

80

60

(b)

40

20

0 -50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50

Temperature (C)

Figure 3.7. SFI of oils from: (a) air- and freeze-dried sea buckthorn seeds, and (b) air- and freeze-dried sea buckthorn pulps.

78

3.6 Conclusions
Air-dried (ADS) and freeze-dried (FDS) sea buckthorn seeds, gave a similar extraction yield around 12%w/w, whereas significant differences were found between extraction yields of air-dried (ADP) and freeze-dried (FDP) sea buckthorn pulps (35.90.8 vs 17.10.6%w/w). Fatty acid analysis revealed that -linolenic (37.2-39.6%), linoleic (32.434.2%) and oleic (13.1%) acids were the main fatty acids in seed oil extracts, while pulp extracts were rich in palmitoleic (39.9%), palmitic (35.4%) and linoleic (10.6%) acids. Lipid fractionation of crude seed and pulp oils, obtained by SPE, yielded mainly neutral lipids (93.9-95.8%). Sea buckthorn seed oils exhibited four thermal structural transitions between -50C and 0C, whereas multiple transitions were observed in melting profiles of pulp extracts. The seed oils were characterized with peroxide values of 1.8 meq/kg, while those of pulp oils were between 3.0-5.4 meq/kg. Drying method did not have a marked effect on oil quality. However, it is worth mention that oils from freeze-dried pulps had a much lower peroxide value bearing out their enhanced quality.

3.6 References
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Conclusions gnrales
Afin de vrifier les hypothses de ce projet, une valuation des effets de deux mthodes de dshydratation (la lyophilisation et le schage lair chaud) sur les rendements dextraction et la qualit des huiles des graines et de la pulpe du fruit dargousier (cv. Indian-Summer) a t ralise. Les extractions ont t effectues diffrentes tempratures (30, 40, 50 et 68C) en utilisant lhexane comme solvant. Trois ratios solut - solvant (1/4, 1/7 et 1/14) furent tudis. La quantit de lipides totaux des produits secs, dtermine en utilisant le chloroforme mthanol comme solvant, a t semblable pour les graines sches lair chaud et lyophilises (12% w/w), contrairement ce qui a t observ pour la pulpe (35.8% w/w pour la pulpe sche lair chaud vs. 16.4% w/w pour la pulpe lyophilise). La diffrence trouve entre les quantits de lipides totaux issues des pulpes, a t attribue principalement aux effets du schage sur leurs structures cellulaires. Des micrographies obtenues par microscopie lectronique balayage ont montr que le schage lair chaud a caus des grands changements et dommages la structure cellulaire de la pulpe, permettant aux substances cellulaires, y compris les lipides, dtre facilement extraites. Par contre, la structure rgulire des cellules de la pulpe lyophilise aurait exerc une rsistance plus leve la diffusion du solvant et des lipides, travers de la membrane cellulaire. Les rendements dextraction des huiles obtenus 68C en utilisant la mthode Soxhlet avec lhexane comme solvant, ont t similaires ceux trouvs avec le chloroforme mthanol, et ce pour les trois ratios solut solvant tudis. Les rendements dextraction des graines sches lair chaud et lyophilises furent semblables (12% w/w), tandis que la quantit dhuile obtenue de la pulpe sche lair chaud a t plus du double de celle extraite de la pulpe lyophilise (36%w/w vs. 17%w/w, respectivement). Aprs 4 heures, les extractions effectues par la mthode Soxhlet ont atteint lquilibre. Contrairement ce qui a t observ pour les extractions ralises dans des erlenmeyers 30, 40 et 50C durant 24 heures, les rendements dextraction nont pas t affectes par le ratio solut solvant en raison dun meilleur transfert de masse pendant le processus dextraction. Dailleurs, les extractions effectues dans des erlenmeyers furent plus dpendantes du ratio solut

82 solvant que de la temprature. Pour ces extractions, il a t trouv une efficacit dextraction des huiles des graines et de la pulpe de largousier situe entre 64-99% et 5991%, respectivement, lorsquon a fait varier le ratio solut solvant entre 1/4 et 1/14, et la temprature entre 30 et 50C. Lhuile des graines est caractrise par une faible proportion dacides gras saturs, et par une teneur leve en acides gras insaturs. Les huiles issues des graines lyophilises furent plus riches en acides -linolnique (39.6% vs. 37.2%) et linolique (34.2% vs. 32.4%), et moins riches dans les acides palmitolique (0.7% vs. 2.8%) et palmitique (6.5% vs. 8.0%), par rapport aux huiles extraites des graines sches lair chaud. Par contre, la mthode de dshydratation na pas caus des diffrences significatives dans la composition dacides gras des huiles de la pulpe, lesquelles ont t caractrises pour un haut degr de saturation. Elles contiennent environ 35% dacide palmitique et une proportion dacides gras insaturs constitue surtout par les acides palmitolique (40%) et linolique (10%). Des diffrences significatives ont t prsentes dans les compositions des triglycrides des huiles des graines et de la pulpe dargousier, par rapport la mthode de dshydratation. Cependant, comme pour dautres espces et sous-espces de largousier, les triglycrides des huiles des graines furent constitus principalement par des molcules comportant 54 et 52 atomes de carbone, tandis que ceux des huiles de la pulpe ont t composs surtout par des molcules comprenant 48 et 50 atomes de carbone. Or, les diffrences dans les compositions des triglycrides des huiles des graines et de la pulpe par rapport la mthode de schage, ont caus des lgres dissimilitudes dans leurs profils de fusion et dans leurs indices de gras solide, tel quillustr dans les Figures 3.6 et 3.7. Le fractionnement des huiles brutes des graines et des pulpes, fait laide de lextraction en phase solide, a donn principalement des lipides neutres (95%), et des faibles quantits dacides gras libres (2-4%) et de phospholipides (1-2%). La composition massique de ces fractions na pas t amplement influence par la mthode de schage. Cependant, des diffrences significatives dans leurs profils dacides gras furent trouves par rapport la mthode de dshydratation.

83 Ltat doxydation des huiles des graines, valu laide de lindice de peroxyde, na pas t influenc par la mthode de dshydratation. Ceci pourrait tre attribu au fait que les graines sont enrobes pour la paroi membranaire de la graine, ce qui, dans les conditions tudies, empcherait un peu loxydation des lipides durant la priode de schage. Dautre part, les huiles de la pulpe lyophilise ont prsent un indice de peroxyde moins lev que celui obtenu des huiles issues de la pulpe sche lair chaud (3.0 vs 5.4 meq/kg), ce qui pourrait tre d labsence doxygne durant la lyophilisation. Ainsi, dans le contexte des paramtres tudis dans ce projet, la lyophilisation ne serait pas une mthode indique comme opration prliminaire lextraction des huiles de largousier, compte tenu du rendement dextraction plus faible quelle donne, et parce que les diffrences trouves dans les paramtres de qualit ne justifient pas ses cots plus levs par rapport au schage lair chaud. Cependant, vu lnorme potentiel nutritionnel de largousier, et les caractristiques excellentes des produits lyophiliss, cette technique pourrait tre la mthode de choix pour la production dune poudre dargousier de haute valeur ajoute.

Perspectives de recherche
Pour que la production et lindustrialisation de largousier au Qubec soient rentables, il est fondamental de rduire les cots de rcolte (estims entre $8-10/kg). Pour cela, la recherche concernant la cueillette mcanique des fruits devrait tre faite. Grce aux proprits physico chimiques des huiles dargousier, ces fruits deviennent une source importante de lipides pour lindustrie cosmtique et pharmaceutique. Nanmoins, il est possible que des rsidus dhexane ne soient pas accepts. Par consquent, dautres solvants ou mthodes dextraction devraient tre tudies. Commercialement, les huiles dargousier sont extraites laide du CO2 supercritique. Cependant, les cots levs de cette technologie sont un grand inconvnient, tant donn que les prix des huiles des graines et de la pulpe ont t estims $300/kg et $160/kg, respectivement. Malgr que lutilisation denzymes a dmontr une grande performance dans les procds dextraction dhuiles, elle est pratiquement non tudie dans le cas du fruit de largousier. Ceci nous a amen raliser une tude prliminaire concernant lextraction enzymatique de lhuile de la pulpe dargousier, en utilisant trois enzymes commerciales. Les rsultats de cette tude sont prsents dans lAnnexe 3. Dautre part, les rcents intrts et applications des acides gras monoinsaturs donnent lhuile de la pulpe dargousier une grande importance, compte tenu que ce fruit est la source naturelle la plus riche en acide palmitolique, suivi de la noix de macadamia. Lapplication dune technologie qui permette la production de fractions riches en acide palmitolique partir de largousier valoriserait encore plus ce fruit, et lui donnerait dautres opportunits commerciales.

Annexe 1 Matriaux et produits exprimentaux

1. Fruits dargousier entiers. 2. Graines entires de fruits dargousier. 3. Graines moulues de fruits dargousier. 4. Pulpe dargousier sche lair chaud. 5. Pulpe dargousier lyophilise. 6. Huiles de la pulpe ( gauche) et des graines ( droite).

Annexe 2 Divers espces et sous-espces de lHippopha

subsp. turkestanica Rousi

H.tibetana Schlechtend

H. salicifolia D. Don

subsp. yannanensis Rousi

H. goniocarpa Lian,X.L.Chen et K.Sun

H. gyantsensis (Rousi)Lian

subsp. goniocarpa

H. rhamnoides cv. Indian-Summer

Annexe 3 Enzymatic Oil Extraction of Sea Buckthorn (Hippopha rhamnoides L.) Pulp: A Preliminary Study
Luis-Felipe Gutirrez, Cristina Ratti and Khaled Belkacemi* Soils and Agri-Food Engineering Department, Nutraceuticals and Functional Foods Institute (INAF), Universit Laval, Qubec, G1K 7P4, Canada *Corresponding author. Phone: 418-656-2131, ext. 6511. Fax: 418-656-3327. E-mail: khaled.belkacemi@sga.ulaval.ca Cet annexe, rdig sous forme darticle, prsente les rsultats obtenus lors dune tude prliminaire de lextraction enzymatique de la pulpe de largousier. Les effets de trois enzymes commerciales, ainsi que de cinq concentrations enzyme/substrat, furent valus.

Rsum
Trois enzymes commerciales (Pectinex Ultra SP-L, Celluclast 1.5 L and Viscozyme L) furent values pour lextraction dhuile de la pulpe dargousier (Hippopha rhamnoides L.) obtenue aprs la sparation du jus. Les extractions furent ralises durant 24 h pH 5.0 et 50C, utilisant cinq concentrations enzymatiques diffrentes. Les huiles brutes obtenues furent analyses dans leurs compositions dacides gras, et fractionnes laide de lextraction en phase solide. Les profils de fusion des diffrentes huiles ont t caractriss par calorimtrie diffrentielle balayage. Les rendements dextraction moyens obtenus avec Viscozyme L (2.8%w/w) et Pectinex Ultra SP-L (2.6%w/w) furent significativement plus levs que ceux obtenus avec Celluclast 1.5L (2.1%w/w). Pour toutes les enzymes, les profils en acides gras des huiles, furent caractriss par des teneurs leves en acides palmitolique (39.5%) et palmitique (36.1%), et de faibles quantits en acides linolique (10.8%) et vaccnique (6.2%). Le fractionnement des huiles brutes a donn environ 97% de lipides neutres. Les courbes de fusion des huiles ont montr la prsence de trois endothermes fondant sparment entre -30C et 20C, pour lesquels les tempratures de fusion furent -24C, -4C et 10C.

88

Abstract
Three commercial enzymes (Pectinex Ultra SP-L, Celluclast 1.5 L and Viscozyme L) were evaluated for oil extraction from the sea buckthorn (Hippopha rhamnoides L.) pulp obtained after juice separation. Extractions were carried out for 24 h at pH 5.0 and 50C, using five different enzyme concentrations. The obtained crude oils were analyzed for their fatty acid compositions, and fractionated using solid-phase extraction. The melting profiles of different oil samples were characterized by differential scanning calorimetry. The average oil yields obtained with Viscozyme L (2.8%w/w) and Pectinex Ultra SP-L (2.6%w/w) were significantly higher than those obtained with Celluclast 1.5L (2.1%w/w). For all enzymes, the fatty acid profiles of oils were characterized by high concentrations of palmitoleic (39.5%) and palmitic (36.1%) acids, with minor proportions of linoleic (10.8%) and vaccenic (6.2%) acids. Lipid fractionation of crude oils yielded about 97% of neutral lipids. The melting curves of the oils showed the presence of three major endotherms melting separately between -30C and 20C, for which the melting temperatures were 24C, -4C and 10C.

Introduction
Canadian production of sea buckthorn berries (Hippopha rhamnoides L.) is estimated at more than 1.6 103 t/year (1). These berries are of great interest because of their nutraceutical properties, and since a few years, the sea buckthorn products are among the most popular functional foods in various European countries and North America (2). Consequently, the berries become a crop with economic potential for Canada (3). Sea buckthorn berries have a high lipid content, including tocopherols, tocotrienols, carotenoids and two essential fatty acids: omega-3 and omega-6 (4). The oil contents of seeds and pulp range commonly between 10-15% and 30-35%, respectively (4-5). The pulp oil contains high amounts of palmitoleic (C16:1n-7, 16-54%) and palmitic acids (C16:0, 17-47%), whereas the seed oil is highly unsaturated, containing mainly linoleic (C18:2n-6,

89 30-40%) and -linolenic (C18:3n-3, 20-35%) acids (4). Both seed and pulp oils have shown beneficial effects on human health (4, 6-12). The most used techniques to obtain commercial seed and pulp sea buckthorn oils are solvent extraction and supercritical fluid extraction (4). Aqueous extraction and pressing have been also reported recently (13). Other methods comprise the use of additional vegetable oils to extract oils from seeds and pulp, to obtain oils of mixed composition (14). Enzymes have been used in oil extraction of various fruits and seeds, and the results in both laboratory and industrial scale have been excellent (15). Enzymatic oil extraction of sea buckthorn berries is a field practically not studied. Only one study (16) partially available indicates the use of enzymes to obtain sea buckthorn oils and food-grade sea buckthorn juice. Given the increasing interest and applications of the sea buckthorn pulp oil, and with the aim to avoid the use of toxic organic solvents, the objective of this work was to investigate the extraction yields and composition of oils from sea buckthorn pulp, using three commercial enzymes (Pectinex Ultra SP-L, Celluclast 1.5 L and Viscozyme L).

Materials and methods

Sea buckthorn berries (Hippopha rhamnoides L cv. Indian-Summer) from Sainte-Annede-Beaupr (Qubec, Canada) were washed with boiling water at short time periods, to inactivate deteriorative enzymes, and then rinsed with cold water. The fresh extracted juice was allowed to stand 48 h in the refrigerator at 4C. The upper pulp phase was treated enzymatically for 24 h at 50C, after adjusting the pH to 5.0 with NaOH, with three commercial enzyme preparations (Celluclast 1.5 L from Trichoderma reesei, Pectinex Ultra SP-L from Aspergillus aculeatus and Viscozyme L from a group of Aspergillus) purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Five different concentrations enzyme/substrate (0.25, 0.5, 1.0, 2.0 and 4.0% v/v) were tested and compared with a control sample (without enzymes). Extractions were carried out in Erlenmeyer flasks under permanent agitation (400 rpm) using a thermoregulated bath. After centrifugation at 10000 rpm during 60 min

90 at 25C (Refrigerated Multipurpose Centrifuge 5804 R Eppendorf, Germany), the supernatant oils were collected, weighted, and stored under nitrogen in sealed amber glass vials at -20C until analysis. Oil extraction yields (%w/w) were calculated as the mass ratio percentage of extracted oil (g) to pulp material (g).

Fatty acid composition

The fatty acid composition of the oils was determined by GC. Oils were converted into their methyl esters (FAME) and analyzed on a 5890 series II gas chromatograph (HewlettPackard, Palo Alto, CA) equipped with a flame ionization detector and a split-splitless capillary inlet. The oven temperature was programmed as follows: from 60C (isothermal for 1 min) to 190C at 20C/min, and isothermal period of 30 min at 190C. The injector and detector temperatures were set at 250C. Hydrogen was used as carrier gas. Gas chromatography separation was performed on a BPX-70 capillary column (60 m0.25 mm i.d.0.25 m film thickness; SGE, Melbourne, Australia). Fatty acids were identified by comparing their retention times with those of the FAME standards purchased from Nu Chek Prep (Elysian, MN, USA) under the same conditions. Peak areas were measured with a Hewlett-Packard ChemStation software. Fatty acid composition was expressed as percentage of the total amount of fatty acids.

Lipid fractionation
Separation of individual lipid fractions was achieved using solid-phase extraction (SPE) cartridges (Bakerbond SPE amino [NH2] disposable extraction columns, 1000 mg, J.T. Baker Inc., Phillipsburg, NJ, USA), as described by Oomah et al. (17). The cartridges were preconditioned with 2 mL methanol, 2 mL chloroform, and 4 mL hexane. A micropipet was used to inject oil samples (100 mg) dissolved in chloroform. Lipid fractions were recovered by sequential elution under vacuum with 4 mL each of chloroform/isopropanol (2/1, v/v), diethyl ether/acetic acid (95/5, v/v), and methanol to separate neutral lipids, free fatty acids and phospholipids, respectively. The collected eluted fractions, were evaporated under nitrogen, weighed, and stored at -20C for subsequent fatty acid analysis.

91

Melting profiles
Melting profiles of the oils were determined using a differential scanning calorimeter (Pyris 1 DSC, Perkin Elmer, Norwalk, CT, USA) equipped with an intracooler II (Perkin Elmer, Norwalk, CT, USA). The system was purged during analysis with nitrogen at 30 mL/min. Oil samples (10-20 mg) were poured into aluminium pans, weighted and then hermetically sealed. DSC melting curves were performed within the temperature range of -50 to 50C. Samples were cooled and held at the lowest temperature for 5 min and then heated at 4C/min. An empty pan was used as an inert reference to balance the heat capacity of the sample pan. Calibration of DSC was carried out using indium (mp = 156.6C, Hf = 28.71 J/g). Data were analyzed using a thermal analysis software (Pyris 1 Version 3.5, Perkin Elmer). The solid fat index (SFI) was determined from the DSC melting curves by sequential integration of peak areas (18).

Experimental design and statistical analysis

The experimental units were grouped in three blocs, and the treatment structure adopted was a 35 factorial design (three enzymesfive concentrations). Results were analyzed using the analysis of variance by the general linear models (GLM) procedure. To analyze the effects of the independent variables on the oil extraction yields, qualitative contrasts and means comparisons by the least significant difference (LSD) test were performed according to the Statistical Analysis System (19). Probability of p<0.05 was considered statistically significant.

Results and discussion

After settling, sea buckthorn juice separates into an emulsion pulp layer on the top, an aqueous phase in the middle, and some solids on the bottom. Later than removing the solids and the aqueous phase, the moisture content of the cream pulp layer was 84.40.1%. The effects of the enzymatic treatments on oil extraction yields from this material are shown in Figure A.3.1. When comparing with the control sample (oil yield 1.80.1%), it is clear that

92 enzyme concentrations greater or equal than 0.5% v/v improve the oil extraction yields of the cream pulp phase. It was also observed that the higher oil yields were obtained with Viscozyme L (a multienzyme complex containing a wide range of carbohydrases, including arabanase, cellulose, -glucanase, hemicellulase and xylanase) and Pectinex Ultra SP-L (an enzyme preparation that contains pectolytic and a range of hemicellulolytic activities). In contrast, Celluclast 1.5 L (a liquid cellulose preparation), produced the lowest oil yields, reaching its maximum performance at a concentration of 1.0 % v/v.
4,0 Pectinex Ultra SP-L Celluclast 1,5 L Viscozyme L Control

Oil yield (%w/w)

3,0

2,0

1,0

0,0 0,25 0,50 1,00 2,00 4,00

Enzyme concentration (%v/v)

Figure A.3.1. Oil extraction yields obtained from sea buckthorn pulp using three commercial enzymes at different concentrations. No significant differences were found between the oil yields obtained with Viscozyme L and Pectinex Ultra SP-L, and their average values (2.8% and 2.6% respectively) were significantly higher (p<0.01) than those obtained with Celluclast 1.5L (2.1%). On the other hand, as showed in Figure A.3.1, the oil yields increase as the enzyme concentration increases. However, from concentrations higher than 1.0%v/v, the oil extraction yields were not significantly different. Our results are in according with those reported by Nokolov & Heilscher (16), who using enzymes containing pectolytic and acid proteinase activity (Novozyme AP and Rohapect D5L) for about 24 h at 20C and 50C, obtained 1-3% of sea buckthorn oil. In addition, as

93 shown in other studies (20-21), the use of the multienzyme complex resulted more effective than used enzymes individually.

Fatty acid composition

The fatty acid composition of the obtained oils is summarized in Table A.3.1. As shown, the fatty acids profiles of the oils were similar, and independent of the type of enzymes. The major fatty acids were palmitoleic (39.5%), palmitic (36.1%) and linoleic (10.8%) acids. Similar values were recently reported for sea buckthorn (cv. Indian-summer) pulp oil from (22), while Yang & Kallio (15) reported lower concentrations of palmitic (26.7% and 27.8%) and palmitoleic (27.2% and 32.8%) acids, and higher proportions of oleic acid (17%), in pulp oils from subspecies sinensis and rhamnoides respectively. Table A.3.1. Fatty acid composition (percent of total) of oils from sea buckthorn pulp, extracted with three different commercial enzymes during 24 h at pH 5.0 and 50C Fatty acid C14:0 (Myristic) C16:0 (Palmitic) C16:1 (Palmitoleic) C17:0 (Margaric) C18:0 (Stearic) C18:1n-9 (Oleic) C18:1n-7 (Vaccenic) C18:2n-6 (Linoleic) C:18:3n-3 (-linolenic) Pectinex Ultra SP-L 0.40.0 36.10.3 39.40.3 2.10.1 0.80.0 2.80.0 6.20.2 10.80.3 0.90.0 Celluclast 1.5 L 0.40.0 36.10.4 39.50.3 2.10.1 0.80.0 2.80.1 6.20.2 10.80.3 0.80.0 Viscoayme L 0.40.0 36.20.3 39.50.3 2.10.1 0.80.0 2.80.0 6.20.2 10.80.3 0.90.1

Polyunsaturated fatty acids (PUFA) of the oils amounted between 12% of the total fatty acids, while the monounsaturated (MUFA) and saturated (SFA) fatty acids were 48.5% and 37.3% respectively. The increasing interest and applications of the MUFA, give to the sea

94 buckthorn pulp oil an interesting economic potential, because of its high content in palmitoleic acid. This fatty acid is present in the majority of fish oils (10% w/w), and is found at low levels in plant and animal tissues (23). Other than sea buckthorn, the most available source of palmitoleic acid is macadamia nut, which contains 1734% (24-25). Associations have been reported between high-monounsaturated fat diets and cardiovascular diseases. Curb et al. (26) reported that a based diet high in monounsaturated oils had potentially beneficial effects on cholesterol and LDL cholesterol levels. However, studies carried out by Nestel et al. (27), showed that palmitoleic acid behaves like a saturated and not a MUFA in its effect on LDL cholesterol. Others beneficial effects of palmitoleic acid on cancer, hypertension, hyperlipemia and diabetes have been also reported (23, 28-29).

Lipid fractions
Enzyme extracted sea buckthorn pulp oils consisted mainly of neutral lipids (NL) (97%), with minor amounts of free fatty acids (FFA) (2%) and phospholipids (PL) (1%) (Table A.3.2). The fatty acids profiles of the NL fractions were very close to the corresponding crude oils, because of the quantitative dominance of this fraction in the oils. In FFA fractions, palmitoleic acid was slightly lower than in crude oils, whereas the proportions of myristic, palmitic, stearic and -linolenic acids were higher than in crude oils. On the other hand, significant differences were found in the contents of palmitic and vaccenic acids in PL fractions, when comparing the type of enzymes. As showed in Table A.3.2., palmitic acid was higher in oils extracted with Viscozyme and Celluclast than in oils extracted with Pectinex, whereas vaccenic acid was slightly lower in oils treated with Viscozyme and Celluclast than in oils treated with Pectinex. The PL fractions were poorer in palmitic and palmitoleic acids, but richer in stearic, vaccenic, linoleic and -linolenic acids, than in crude oils. Linoleic and -linolenic acids reached 12% and 8%, respectively, whereas palmitoleic was about 33%. Kallio et al. (2) and Yang & Kallio (5) reported contents of

95 linoleic (32%, 22% and 24%), palmitoleic (22%, 15% and 19%), palmitic (21%, 16% and 17%) and -linolenic (10%, 15% and 13%) acids in the PL fractions of the sea buckthorn pulp oils from subspecies mongolica, sinensis and rhamnoides, respectively. Genetic differences among subspecies, as well as climate, soil conditions, cultivating activities and lipid extraction processes, could explain the differences (30).

96

Table A.3.2. Fatty acid composition (percent of total) in individual lipid fractions of oils from sea buckthorn pulp, extracted with three different commercial enzymes during 24 h at pH 5.0 and 50C a Pectinex Ultra SP-L NL 96.81.6 0.40.0 36.40.1 39.60.2 2.10.0 0.80.0 2.80.1 6.00.0 10.50.1 0.90.0 1.60.2 8.10.1 9.90.2 12.50.6 5.60.2 9.00.4
a

Celluclast 1.5 L NL 97.80.3 0.40.0

a

Viscozyme L PL 0.90.1 2.10.6 29.70.8 2.20.3 2.60.5 2.40.1

b

FFA 2.20.6 2.20.3 38.31.1 36.01.7 1.80.2 1.70.4 3.00.3 6.00.0 10.50.0 0.90.0 2.50.5 2.80.0 3.60.5 0.80.0 2.10.3 2.10.0 2.00.4 1.60.7 2.80.1 5.60.3 10.30.3 1.60.4 32.60.4 39.60.1 36.22.8 27.50.4 36.50.1 37.91.1 2.10.3 1.91.0 0.90.2 1.50.5

PL

FFA

NL 97.90.5 0.40.0 36.40.0 39.80.1 2.10.0 0.80.0 2.70.0

FFA 1.50.7 2.60.6 38.61.5 34.90.6 1.90.2 1.80.3 2.80.1

PL 0.90.2 2.00.9 31.91.3b 33.32.3 2.30.5 3.30.6 2.10.4

Composition (mass%)

C14:0 (Myristic)

C16:0 (Palmitic)

C16:1 (Palmitoleic)

34.40.6

C17:0 (Margaric)

C18:0 (Stearic)

C18:1n-9 (Oleic)

C18:1n-7 (Vaccenic)

7.90.3

6.00.0 12.30.4 6.30.9 10.50.1 0.90.0

5.50.1 9.90.0 2.00.7

7.50.8b 11.50.5 6.82.0

C18:2n-6 (Linoleic)

C:18:3n-3 (-linolenic)

Different letters in rows, indicate significant differences (p<0.05) between enzymes.

97

Melting profiles
The melting curves of the extracted oils are shown in Figure A.3.2. As it can be observed, no significant differences were found between the melting profiles of the oils extracted with different enzymes, indicating resemblances in their triglyceride compositions. These melting curves indicate the presence of three major groups of triglycerides melting separately between -30C and 20C. The melting profiles showed that there is one major peak at 10C, and two minor peaks at -4C and -24C. The low melting endotherm (LME), representing the melting transition of the more unstable crystals of the low melting triglycerides, had a melting enthalpy of about 20 J/g. The melting enthalpies of both medium (MME) and high melting endotherms (HME), corresponding to medium and high melting triglycerides are given in Table A.3.3. There were no significant differences between the melting temperatures and enthalpies of individual endotherms. According to Timms (31), the large area of the highest melting peak would partly due to the higher heat of melting of the triglyceride groups conforming this endotherm, and also because the high melting triglycerides crystallizes together with lower melting triglycerides in a semi-stable mixture. Table A.3.3. Thermal characteristics of enzyme extracted sea buckthorn pulp oils a
LME Hm (J/g)
20.60.4 20.53.2 21.61.5

Enzyme
Pectinex Ultra SP-L Celluclast 1.5 L Viscozyme L
a

MME Tm (C) Hm (J/g)

11.30.5 12.01.3 12.10.4

HME Hm (J/g)
43.60.4 40.64.0 43.31.2

Tm (C)
-4.60.6 -3.90.9 -4.10.3

Tm (C)
10.40.3 10.70.5 10.70.3

-24.40.4 -24.31.0 -24.10.5

n=3. Tm: Melting temperature. Hm : Melting enthalpie.

The solid fat indices (SFI) of the oils, calculated from their corresponding thermograms by sequential peak areas integration, indicate that SFI decreases as temperature increases (Figure A.3.3). As can be observed, complete melting of the oils is achieved above 20C.

98

Heat flow endo down (mW)

Pectinex Ultra SP-L Celluclast 1.5L Viscozyme L

6 -50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50

Temperature (C)

Figure A.3.2. Melting profiles of sea buckthorn pulp oils extracted with three different commercial enzymes during 24 h at pH 5.0 and 50C (4C/min scan rate)

100 90 80 Pectinex Ultra SP-L Celluclast 1.5L Viscozyme L

Solid Fat Content (%)

70 60 50 40 30 20 10 0 -50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50

Temperature (C)

Figure A.3.3. Solid fat content of sea buckthorn pulp oils extracted with three different commercial enzymes during 24 h at pH 5.0 and 50C

References
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