Curso Practico Microbiologia

CURSO DE MICROBIOLOGA GENERAL
Ctedra de Microbiologa Facultad de Qumica
2009 v3
CURSO DE MICROBIOLOGA 2009. GUA DE PRCTICO PRIMER CICLO Durante el primer ciclo (4 clases) se realizar la identificacin primaria de bacterias y hongos a partir de cultivos puros y de muestras de ambiente. OBJETIVOS: Al finalizar el ciclo el estudiante debe ser capaz de: 1) Manejarse de acuerdo a las normas de bioseguridad. 2) Manejar y mantener el microscopio correctamente. 3) Trabajar aspticamente. 4) Preparar frotis y teirlos por Gram. 5) Reconocer morfologas microscpicas y coloracin Gram de bacterias. 6) Reconocer morfologas microscpicas caractersticas de hongos uni y pluricelulares. 7) Identificar bacterias (gnero/familia). 8) Preparar medios de cultivo. 9) Manejar el autoclave. 10) Preparar material para esterilizacin por calor seco. 11) Uso de Tablas de identificacin de bacterias. Al final del ciclo cada subgrupo (4 estudiantes) deber entregar un informe indicando: Grupo (n y horario), nombre de los estudiantes Resultados obtenidos: a) Muestra de ambiente: origen de la muestra, medio y condiciones de cultivo, descripcin macro y microscpica de las colonias obtenidas. b) Cultivos bacterianos problema: cdigo de la muestra, descripcin macro y microscpica de las colonias en el medio selectivo aportado, pruebas bioqumicas realizadas y datos obtenidos de cada una, gnero y/o Familia a la que pertenece el m.o. identificado.
Curso prctico Microbiologa General 2009
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Clase 1
Trabajo experimental
- Observacin macro y microscpica de cultivos puros de bacterias (medios slidos y lquidos). - Tcnica asptica. Frotis y tincin de Gram. - Siembra de una muestra: superficie, piel, tierra, aire en TSA a) Muestra sembrada en 1 clase: - Observacin macroscpica de colonias. - Observacin microscpica: frotis, tincin de Gram. b) Identificacin de bacterias. Cada subgrupo recibir un m.o. (microorganismo) sembrado en un medio selectivo: - Observacin macroscpica de colonias. - Observacin microscpica: frotis, tincin de Gram. - Reaislamiento en medio no selectivo (ALRF y TSA). - Eleccin de pruebas bioqumicas. Con los datos obtenidos de las observaciones macro y microscpicas y usando la tabla, cada subgrupo deber elegir las pruebas necesarias para la identificacin primaria del m.o. a) Continuacin de la muestra sembrada en 1 clase. - Observacin macro y microscpica. b) Identificacin de bacterias: - Verificacin del reaislamiento por observacin macro y microscpica. - Siembra de pruebas de identificacin primaria. c) Observacin macro y microscpica de hongos en cultivos puros. d) Preparacin de medios (mitad del grupo). a) Muestra de ambiente: observacin macro y microscpica. b) Cultivo bacteriano puro: lectura de pruebas bioqumicas. c) Observacin de hongos, continuacin. d) Preparacin de medios de cultivo, continuacin. e) Entrega de informe y discusin de los resultados.
Material a estudiar
Normas de bioseguridad. Utilizacin de microscopio. Citologa y morfologa de bacterias Siembra y aislamiento.
- Siembra y aislamiento: aislamiento por estras, cultivo puro. - Medios generalidades; Tabla "Caractersticas de algunos medios"; Composicin de medios (manuales comerciales): ALRF, Mac Conkey, MSA, TSA, TSB. - Identificacin de bacterias: pruebas bioqumicas primarias: oxidasa catalasa, OF, relacin con el oxgeno (crecimiento en anaerobiosis), fermentacin de glucosa.
- Identificacin de bacterias. - Siembra y aislamiento: preparacin de medios de cultivo y esterilizacin de material de vidrio. - Citologa y morfologa de hongos.
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SEGUNDO CICLO Durante el segundo ciclo (7 clases) se har el anlisis microbiolgico de una muestra para determinar si cumple con los requisitos exigidos segn una norma determinada. OBJETIVOS: Al finalizar el ciclo el estudiante deber ser capaz de: 1) Realizar el anlisis microbiolgico de una muestra de acuerdo a una tcnica dada. 2) Informar adecuadamente los resultados del anlisis microbiolgico de una muestra. 3) Calcular las diluciones adecuadas a sembrar para realizar un recuento (en placa, NMP). 4) Manejar tablas de identificacin de bacterias. 5) Comprender las bases bioqumicas de las pruebas utilizadas en la identificacin. 6) Comprender la funcin de cada uno de los componentes de un medio de cultivo. 7) Realizar un esquema simplificado de una tcnica microbiolgica. En la clase 6 del ciclo cada subgrupo deber entregar el informe final (solo los resultados obtenidos) de la muestra analizada. En la clase 7 se deber entregar 2 fotocopias del informe del trabajo asignado en clase 5.
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Clase 1
Trabajo experimental
Observaciones y material a estudiar
Anlisis microbiolgico de una muestra segn tcnica Tcnica microbiolgica para el anlisis de una aportada. Bsqueda de los 4 m.o. correspondientes y muestra recuentos de mesfilos, enterobacterias y hongos Muestreo para anlisis microbiolgico. Recuentos: Introduccin gral. y recuento en placa Continuacin con el anlisis microbiolgico. Aislamiento Discusin de medios de cultivo empleados: selectivo. Subcultivo a caldos selectivos. composicin y uso (manuales comerciales). Resultado preliminar del recuento de mesfilos y Test de esterilidad. enterobacterias. Recuento definitivo de mesfilos. Observacin de Informes de los resultados de recuento de colonias tpicas en medios selectivos. Aislamiento de mesfilos y enterobacterias los caldos selectivos de Salmonella. Clculo de diluciones a sembrar para recuentos Reaislamiento en medio no selectivo segn diferentes lmites. Gram de colonias tpicas. Pruebas primarias (catalasa, Recuentos: recuento por NMP. oxidasa). Uso de Tabla NMP. E. coli: IMViC. Lmites microbiolgicos para agua potable y Salmonella spp: Reaislamiento de colonias sospechosas agua de playa. en medio no selectivo. Identificacin de bacterias: pruebas Pseudomonas aeruginosa: crecimiento a 42 C, bioqumicas. pigmentos. Presentacin y discusin de pruebas S.aureus: catalasa, coagulasa o DNAsa bioqumicas. Recuentos: Siembra de agua potable o de playa por NMP. Recuento de hetertrofos en agua potable por filtracin. Leer recuento preliminar por NMP. Confirmacin de Discutir Farmacopeas. Ordenanza, normas UNIT, etc. coliformes totales y fecales. Siembra pruebas de tamizaje para Salmonella : TSI, Se entregarn diferentes trabajos de anlisis LIA Fenilalanina microbiolgico para presentar diseo de metodologa por escrito en forma de esuema (diluciones, medios, etc). Leer NMP. Leer bioqumicas de Salmonella. Leer Discutir resultados de NMP. resultado de recuento de hetertrofos por filtracin Discusin gral sobre el tema de identificacin y recuento de hongos. de una cepa bacteriana. Entregar resultados. Presentacin del trabajo de anlisis asignado en clase 5 por cada subgrupo.
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TCNICA GENERAL DE ANLSIS MICROBIOLOGICO DE UNA MUESTRA Especificaciones microbiolgicas para la muestra Recuento de mesfilos aerobios viables: menos de 1000 UFC/g Recuento de hongos y levaduras: menos de 100 UFC/g Recuento de Enterobacterias: menos de 100 UFC/g Ausencia de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli y Salmonella sp en 10 g. Preparar la muestra que se va a analizar mediante un tratamiento apropiado a sus caractersticas fsicas y que no altere el nmero y tipo de microorganismos originalmente presentes, a fin de obtener una solucin o suspensin adecuada para los procedimientos analticos que se van a efectuar. Es recomendable partir de una muestra no menor de 10 g (o mL) representativa del lote a analizar y preparar las diluciones en un solvente adecuado (suero fisiolgico, tampn fosfato o agua peptonada al 0,1%).
1 RECUENTOS 1 Preparacin previa de la muestra 1.1 Pesar aspticamente 10 g de la muestra y disolver o suspender en 90 mL de suero fisiolgico. Esta es la dilucin 1/10 o 10-1. 1.2 Pipetear 1mL de esta dilucin en cada una de tres placas de Petri estriles. Continuar el procedimiento en 2, 3 y 4. 2 Recuentos de mesfilos aerobios viables 2.1 Agregar inmediatamente a una placa 15 a 20 mL TSA (agar tripticasa soja), previamente fundido y termostatizado a 45 C. 2.2 Mezclar por rotacin y dejar solidificar a temperatura ambiente. 2.3 Incubar a 35 2 C durante 48 a 72 h. Examinar para verificar la presencia de colonias. 3 Recuento de Enterobacterias 3.1 Agregar inmediatamente a otra placa aproximadamente 15 mL de VRBGA (violet red bile glucose agar), previamente fundido y termostatizado a 45 C. 3.2 Mezclar por rotacin y dejar solidificar a temperatura ambiente. Luego cubrir con una sobrecapa del mismo agar de aproximadamente 5 mL. Dejar solidificar. 3.3 Incubar a 35 2 C durante no ms de 24 h. Examinar para verificar la presencia de colonias tpicas (colonias rojas, con dimetro mayor a 1 mm, habitualmente con halo de bilis precipitada). Reaislar un nmero representativo de colonias tpicas (no menos de cinco) a TSA. Confirmar mediante tincin de Gram y el ensayo de oxidasa. 4 Recuento de hongos y levaduras 4.1 Agregar inmediatamente a la placa restante 15 a 20 mL de SDA (agar glucosado de Sabouraud) con cloranfenicol, previamente fundido y termostatizado a 45 C. 4.2 Mezclar por rotacin cada placa y dejar solidificar a temperatura ambiente. 4.3 Incubar a 25 2 C durante 5 a 7 das. Examinar para verificar la presencia de colonias tpicas de hongos filamentosos y/o levaduriformes (realizar una coloracin simple).
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5 - BSQUEDAS. 5.1 - Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli 5.1.1 Pesar aspticamente 10 g de la muestra y agregar a 90 mL de medio TSB. Si fuera necesario homogeneizar mediante suave agitacin. 5.1.2 Incubar 18 a 24 h a 35 2 C. 5.1.3 Realizar el aislamiento a los siguientes medios slidos en placa: MSA (agar manitol sal) o agar Baird Parker para Staphylococcus aureus, agar cetrimida para Pseudomonas aeruginosa y agar Mac Conkey o EMB-Levine (agar eosina azul de metileno-Levine) para Escherichia coli. (Para la bsqueda de Salmonella continuar el procedimiento en 5.2). 5.1.4 Incubar las placas a 35 2 C durante 24 a 48 h y examinar el desarrollo de colonias tpicas. 5.1.5 Si no existen colonias tpicas en los respectivos medios, la muestra cumple la exigencia de ausencia de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli en 10 g de muestra. 5.1.6 Si aparecen colonias tpicas de Staphylococcus aureus en MSA o agar Baird Parker, realizar un reaislamiento de algunas colonias en TSA. Luego tomar colonias de este medio y hacer la coloracin de Gram, el ensayo de catalasa y el ensayo de coagulasa. 5.1.7 Si aparecen colonias tpicas de Pseudomonas aeruginosa en agar cetrimida, realizar un reaislamiento de algunas colonias en TSA. Tomar colonias de este medio y realizar la coloracin de Gram, el ensayo de oxidasa y el crecimiento a 42 0,5 C en TSB. Si fuese necesario confirmar la produccin de pigmento piocianina en agar King A (incubar no menos de 3 das a 35 2 C o a temperatura ambiente). 5.1.8 Si aparecen colonias tpicas de Escherichia coli en agar Mac Conkey o EMB-Levine, realizar un reaislamiento de algunas colonias en TSA. Tomar colonias de este medio y realizar una coloracin de Gram, el test de catalasa, oxidasa y realizar el ensayo de IMViC (indol, rojo de metilo-Voges Proskauer, citrato)
Descripcin de colonias tpicas de Staphylococcus aureus Medio Agar manitol sal Agar Baird-Parker Descripcin de colonias tpicas Colonias amarillas rodeadas de un halo amarillo Colonias negras, brillantes rodeadas de un halo claro
Descripcin de colonias tpicas de Pseudomonas aeruginosa Medio Agar cetrimida Descripcin de colonias tpicas Colonias castao claro con pigmento verde-azulado que fluoresce al UV y difunde al medio.
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Descripcin de colonias tpicas de Escherichia coli Medio agar Mac Conkey agar EMB (Levine) Descripcin de colonias tpicas Colonias rojas precipitada habitualmente con halo de bilis
Colonias negras habitualmente con brillo metlico verdoso bajo luz reflejada
Pruebas para Staphylococcus aureus Coloracin de Gram: cocos positivos en racimos Fermentacin de manitol: positiva Catalasa: positiva Coagulasa o DNAsa: positiva Pruebas para Pseudomonas aeruginosa Coloracin de Gram: bacilos negativos Oxidasa: positiva Catalasa: positiva Crecimiento a 42 C: positivo King A: pigmento azulado Pruebas para Escherichia coli Coloracin de Gram: bacilos negativos cortos o cocobacilos Oxidasa: negativa Catalasa: positiva OF glucosa: fermentativo Indol: Positivo o negativo Rojo metilo: positivo Voges Proskauer: negativo Citrato: negativo 5.2 - Salmonella spp. 5.2.1 Pipetear 0,1 mL del TSB previamente incubado durante 18 a 24 h a un tubo con 10 mL de caldo Rappaport-Vassiliadis y 1 mL a un tubo con 10 mL de caldo tetrationato. 5.2.2 Incubar ambos tubos a 35 1 C (el caldo Rappaport-Vassiliadis puede incubarse a 41,5 1 C) por no ms de 24 h. 5.2.3 De ambos tubos realizar aislamiento a XLD (agar xilosa lisina desoxicolato) y a por lo menos uno de los siguientes medios slidos en placa: VB (agar verde brillante) y SS (agar Salmonella Shigella). 5.2.4 Incubar las placas a 35 2 C durante 24 a 48 h y examinar el desarrollo de colonias tpicas. 5.2.5 Si no existen colonias tpicas, la muestra cumple la exigencia de ausencia de Salmonella spp. Si aparecen colonias tpicas en alguno de los medios, realizar un reaislamiento de algunas colonias en TSA. Tomar colonias de este medio y realizar luego la coloracin de Gram, el ensayo
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de oxidasa, catalasa, TSI, lisina de Meller (o LIA) y ureasa (o fenilalanina). Realizar una identificacin mas completa con sistemas de identificacin apropiados y confirmar con el uso de antisueros polivalentes de Salmonella.
Descripcin de colonias tpicas de Salmonella spp* Medio Agar xilosa lisina desoxicolato Agar verde brillante Agar Salmonella Shigella Descripcin de colonias Colonias rojas con o sin centro negro Colonias blancas o rosadas, pequeas, transparentes, con halo rojizo Colonias incoloras o castaas con o sin centro negro de lactosa pueden dar colonias con
*algunas cepas de Salmonella fermentadoras caractersticas diferentes a las descritas
Pruebas para Salmonella spp Coloracin de Gram: bacilos negativos cortos o cocobacilos Oxidasa: negativa Catalasa: positiva TSI: alcalino/cido con o sin produccin H2S, con o sin gas Ureasa y fenilalanina: negativa Lisina Meller: positiva. LIA: pico alcalino/fondo alcalino con o sin produccin de H2S
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ESQUEMA DE BUSQUEDA DE SALMONELLA
10 g muestra + TSB
35 C 24 h 0,1 mL 1 mL
PREENRIQUECIMIENTO
Caldo Rappaport
Caldo tetrationato 41,5 C 24 h
ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO
35 C 24 h
Agar VB 35 C 24 h 35 C 24 h
Agar XLD
AISLAMIENTO SELECTIVO
Colonias no tpicas
Colonias tpicas
AUSENCIA de Salmonella sp en 10 g
Reaislamiento de varias colonias

IDENTIFICACION Confirmacin con pruebas bioqumicas y serolgicas
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RECUENTO DE HETEROTRFICOS POR EL MTODO DE MEMBRANA FILTRANTE 1 - Definiciones 1.1 Bacterias heterotrficas. Se considera a las bacterias aerobias y anaerobias facultativas, mesfilas y psicrotrficas, capaces de crecer en un medio de agar nutritivo. 1.2 Filtro de membrana. Es un elemento de filtracin, delgado, no fibroso, para lquidos y gases, de acetato o nitrato de celulosa que tiene un tamao de poro medio de 0,45 micras de dimetro, en donde las partculas de mayor tamao que el del poro son retenidas sobre la superficie cuando se aplica succin o presin. No debe contener sustancias inhibitorios del crecimiento bacteriano.
2 - Procedimiento 2.1 Agitar vigorosamente la muestra con cuidado de no volcar. 2.2 Pipetear 1 mL de la muestra y diluir en 9,0 mL de suero fisiolgico (SF) u otro diluyente apropiado (dilucin 1/10 o 10-1). 2.3 Pipetear 1 mL de la dilucin resultante en un frasco con 10 a 50 mL de suero fisiolgico, de manera de mojar toda la superficie de la membrana. 2.4 Filtrar el total del volumen resultante (correspondiente a 0,1 mL de la muestra original) por embudo de filtracin equipado con filtro de membrana estril bajo vaco parcial. 2.5 Enjuagar el embudo con tres porciones de 50 mL de suero fisiolgico. 2.6 Colocar la membrana cuidadosamente sobre el medio slido en placa de Petri (PCA o TSA), evitando la formacin de burbujas. 2.7 Incubar a 35 2 C por 48 h. 2.8 Contar las colonias en los filtros de membrana. La densidad ptima de colonias por filtro es entre 20 y 200.
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RECUENTO DE COLIFORMES FECALES EN AGUA DE PLAYA POR NMP. 1 - Ensayo presuntivo de coliformes totales 1.1 Colocar en una gradilla nueve tubos con medio caldo lauril triptosa (CLT) simple concentracin con campana de Durham, para hacer la serie (3-3-3). 1.2 Agitar vigorosamente la muestra con cuidado de no volcar. 1.3 Pipetear 1 mL de la muestra y diluir en 9,0 mL de suero fisiolgico (SF) u otro diluyente apropiado (dilucin 1/10 o 10-1). 1.4 Con una pipeta de 1 2 mL sembrar 1 mL de la muestra en cada uno de tres tubos con medio de simple concentracin (primera serie), 0,1 mL de la muestra (o 1 mL de la dilucin 1/10) en otros tres tubos (segunda serie) y 0,1 mL de la dilucin 1/10 (equivalente a 0,01 mL de la muestra) en otros tres tubos (tercer serie). Rotular adecuadamente los tubos con la dilucin sembrada 1.5 Mezclar la muestra con el medio mediante agitacin suave. 1.6 Incubar los tubos a 35 0,5 C. Luego de 24 2 h agitar los tubos suavemente y observar. 1.7 Considerar tubos positivos presuntivos a los que presentan turbidez debida debido al crecimiento bacteriano y gas en la campana. 1.8 Reincubar aquellos tubos que no muestran esos cambios y reexaminar luego de otras 24 h.
2 - Ensayo de coliformes fecales 2.1 Subcultivar con un ansa de cada tubo positivo presuntivo de coliformes totales a un tubo con caldo EC con campana de Durham. Rotular adecuadamente los tubos de caldo EC. 2.2 Incubar en bao de agua a 44,5 0,2 C por 24 2 h. 2.3 Considerar tubos positivos a los que presentan crecimiento y produccin de gas a las 24 h. 2.4 Calcular el valor de NMP de coliformes fecales a partir del nmero de tubos positivos del medio EC.
RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES EN AGUA POTABLE POR NMP. 1 - Ensayo presuntivo de coliformes totales 1.1 Colocar en una gradilla tres tubos con medio CLT doble concentracin, y seis tubos con medio CLT simple concentracin, para hacer la serie (3-3-3). Todos los tubos deben tener campana de Durham. 1.2 Agitar vigorosamente la muestra con cuidado de no volcar. 1.3 Con una pipeta de 10 mL estril sembrar 10 mL de la muestra en cada uno de los tres tubos con medio de doble concentracin. 1.4 Con una pipeta de 1 2 mL sembrar 1 mL de la muestra en tres tubos con medio de simple concentracin y 0,1 mL de la muestra en los otros tres tubos. Rotular adecuadamente los tubos. 1.5 Mezclar la muestra con el medio mediante agitacin suave. 1.6 Incubar los tubos a 35 0,5 C. Luego de 24 2 h agitar los tubos suavemente y observar.
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1.7 Considerar tubos positivos presuntivos a los que presentan turbidez debida debido al crecimiento bacteriano y gas en la campana. 1.8 Reincubar aquellos tubos que no muestran esos cambios y reexaminar luego de otras 24 h. 2 - Ensayo confirmativo de coliformes totales 2.1 Someter a la prueba confirmativa todos los tubos que a las 24 48 h presenten reaccin positiva presuntiva. Si esta reaccin positiva aparece a las 24 h, es conveniente pasar a la confirmacin sin dejar transcurrir las 48 h. 2.2 Agitar suavemente los tubos. 2.3 Subcultivar por medio de un ansa de cada tubo con resultado positivo presuntivo a un tubo con medio caldo lactosa bilis verde brillante (CLBVB) con campana de Durham. Rotular todos los tubos adecuadamente. 2.4 Incubar los tubos de CLBVB por 48 3 h a 35 0,5 C. 2.5 La produccin de gas constituye un resultado positivo confirmado. 2.6 Calcular el valor de NMP de coliformes totales confirmados a partir del nmero de tubos positivos del medio CLBVB. 3 - Ensayo de coliformes fecales 3.1 Subcultivar con un ansa de cada tubo positivo presuntivo de coliformes totales a un tubo con caldo EC con campana de Durham. Rotular adecuadamente los tubos de caldo EC. 3.2 Incubar en bao de agua a 44,5 0,2 C por 24 2 h. 3.3 Considerar tubos positivos a los que presentan produccin de gas a las 24 h. 3.4 Calcular el valor de NMP de coliformes fecales a partir del nmero de tubos positivos del medio EC.
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COMPOSICIN DE MEDIOS A EMPLEAR

SUERO FISIOLGICO Cloruro de sodio Agua
8,5 g 1L
TSA (agar tripticasa soja) Digerido Pancretico de Casena Digerido Papanico de Harina de Soja Cloruro de Sodio Agar Agua
15,0 g 5,0 g 5,0 g 15,0 g 1L
TSB (caldo tripticasa soja) Digerido Pancretico de Casena Digerido Papanico de Harina de Soja Cloruro de Sodio Fosfato Dibsico de Potasio Glucosa Agua
17,0 g 3,0 g 5,0 g 2,5 g 2,5 g 1L
SDA (agar Sabouraud glucosado) Glucosa Digerido pptico de tejido animal Digerido pancretico de casena Agar Agua
40 g 5g 5g 15 g 1L
Agregar antes de esterilizar 50 mg de cloranfenicol por litro de medio pH despus de la esterilizacin: 5,6 0,2. ALRF (Agar Rojo Fenol Base + lactosa) Digerido pancretico de casena Cloruro de Sodio Agar Rojo Fenol Lactosa Agua pH final: 7,4 0,2
10 g 5,0 g 15 g 0,018 g 10 g 1L
VRBGA (violet red bile glucose agar) Peptona Extracto levadura Cloruro de sodio Sales biliares Glucosa Rojo neutro Cristal violeta Agar Agua
7,0 g 3,0 g 5,0 g 1,5 g 10,0 g 0,03 g 2 mg 15,0 g 1L
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AGAR BAIRD PARKER Digerido Pancretico de Casena Extracto de Carne Vacuna Extracto de Levadura Cloruro de Litio Agar Glicina Piruvato de Sodio Agua
10,0 g 5,0 g 1,0 g 5,0 g 20,0 g 12,0 g 10,0 g 1L
Esterilizar y dejar enfriar a una temperatura entre 45 y 50 C. Agregar 10 mL de solucin estril de telurito de potasio (1 en 100) y 50 mL de emulsin de yema de huevo. Mezclar
MSA (agar manitol sal) Digerido Pancretico de Casena Digerido Pptico de Tejido Animal Extracto de Carne Vacuna D-Manitol Rojo de Fenol Cloruro de Sodio Agar Agua
5,0 g 5,0 g 1,0 g 10,0 g 25 mg 75,0 g 15,0 g 1L
AGAR CETRIMIDA Digerido Pancretico de Gelatina Cloruro de Magnesio Sulfato de Potasio Bromuro de Cetiltrimetilamonio (Cetrimida) Glicerina Agar Agua
20,0 g 1,4 g 10,0 g 10 mL 13,6 g 1L 0,3 g
EMB LEVINE (agar eosina azul de metileno Levine) Digerido Pancretico de Gelatina 10,0 g Fosfato Dibsico de Potasio 2,0 g Lactosa 10,0 g Eosina Y 400 mg Azul de Metileno 65 mg Agar 15,0 g Agua 1L
AGAR MAC CONKEY Digerido Pancretico de Gelatina Digerido Pancretico de Casena Digerido Pptico de Tejido Animal Lactosa Rojo Neutro Mezcla de Sales Biliares Cloruro de Sodio Cristal Violeta Agar Agua
17,0 g 1,5 g 1,5 g 10,0 g 30 mg 1,5 g 5,0 g 1,0 mg 13,5 g 1L
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CALDO RAPPAPORT-VASSILIADIS Peptona de soja Cloruro de magnesio hexahidratado Cloruro de sodio Fosfato dibsico de potasio Fosfato monobsico de potasio Verde de malaquita Agua
4,5 g 29,0 g 8,0 g 0,4 g 0,6 g 0,036 g 1L
CALDO TETRATIONATO Digerido Pancretico de Casena Digerido Pptico de Tejido Animal Sales Biliares Carbonato de Calcio Tiosulfato de Sodio Agua
2,5 g 2,5 g 1,0 g 10,0 g 30,0 g 1L
Calentar la solucin de los slidos a ebullicin. En el da de su utilizacin, agregar una solucin de 5 g de yoduro de potasio y 6 g de yodo en 20 mL de agua. A continuacin, agregar 10 mL de una solucin de verde brillante (1 en 1000) y mezclar. No se debe calentar el medio despus de agregar la solucin de verde brillante. AGAR XLD (agar xilosa lisina desoxicolato) L-Lisina Xilosa Lactosa Sacarosa Rojo de Fenol Cloruro de Sodio Extracto de Levadura Desoxicolato de Sodio Tiosulfato de Sodio Citrato Frrico Amnico Agar Agua pH final: 7,6 0,2 AGAR SALMONELLA SHIGELLA Extracto de carne Peptona Lactosa Sales biliares Citrato de sodio Tiosulfato de sodio Citrato frrico Verde brillante Rojo neutro Agar Agua
5,0 g 3,5 g 7,5 g 7,5 g 80 mg 5,0 g 3,0 g 2,5 g 6,8 g 800 mg 13,5 g 1L
5,0 g 5,0 g 10,0 g 8,5 g 8,5 g 1,0 g 0,33 mg 25 mg 13,5 g 1L 8,5 g
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AGAR VERDE BRILLANTE Extracto de Levadura Digerido Pptico de Tejido Animal Digerido Pancre tico de Casena Lactosa Cloruro de Sodio Sacarosa Rojo de Fenol Agar Verde Brillante Agua CLT (caldo lauril sulfato triptosa) Triptosa Lactosa Fosfato dipotsico Fosfato monopotsico Cloruro de sodio Lauril sulfato de sodio Agua CLBVB (caldo lactosa bilis verde brillante) Peptona Bilis vacuna Lactosa Verde brillante Agua Caldo EC Triptosa Lactosa Fosfato dipotsico Fosfato monopotsico Cloruro de sodio Sales biliares Agua PCA (agar para recuento en placa) Triptona Extracto de levadura Glucosa Agar
3,0 g 5,0 g 5,0 g 10,0 g 5,0 g 10,0 g 80 mg 20 g 12,5 mg 1L
20,0 g 5,0 g 2,75 g 2,75 g 5,0 g 0,1 g 1L
10,0 g 20,0 g 10,0 g 13,3 mg 1L
20,0 g 5,0 g 4,0 g 1,5 g 5,0 g 1,5 g 1L
5,0 g 2,5 g 1,0 g 15,0 g
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TERCER CICLO Durante el tercer ciclo (2 clases) se har el estudio de agentes fsicos, qumicos y biolgicos sobre los m.o. OBJETIVOS: Al finalizar el ciclo el estudiante debe ser capaz de: 1) Disear un ensayo para evaluar la accin de un agente antimicrobiano 2) Comprender el uso de la escala de Mac Farland 3) Calcular el tiempo de reduccin decimal de un agente antimicrobiano 4) Calcular la CIM de un antibitico para una cepa dada Clase 1 2 Trabajo experimental
Curva de muerte de E. coli a 63 C. Clculo de D. Evaluacin de desinfectantes. Ensayo de difusin de antibiticos y extractos. Calcular la CIM para un antibitico y una cepa dadas Lectura y discusin de resultados
Material a estudiar
Recuentos: determinacin de la masa celular, turbidimetra, escala de Mac Farland. Control del crecimiento microbiano. Agentes fsicos, qumicos y biolgicos
ESTUDIO DE AGENTES Se evaluar el calor como agente fsico frente a una cepa de E. coli. Se realizar el clculo del tiempo de reduccin decimal en suero fisiolgico a 63 C. Se evaluar la accin del hipoclorito (250 ppm u otras) con y sin sustancias interferentes y del etanol 70% sobre una cepa de Staphylococcus aureus, segn la norma europea (modificada) EN 1276:1997: Antispticos y desinfectantes qumicos. Ensayo cuantitativo de suspensin para la evaluacin de la actividad bactericida de los antispticos y desinfectantes qumicos utilizados en productos alimenticios, en la industria, en el hogar y en colectividad. Mtodo de ensayo y requisitos (fase 2, etapa 1). Segn esta norma, un desinfectante debe ser capaz de reducir por lo menos en 5 rdenes la carga microbiana inicial, luego de 5 minutos de contacto a 20 C. Para realizar el recuento despus del contacto con el agente, es necesario eliminar todo efecto inhibidor del agente, ya que su presencia puede falsear el resultado. Para ello se pueden usar diferentes mtodos: dilucin, neutralizacin o filtracin. Para el caso del hipoclorito se usar tiosulfato de sodio al 10% como neutralizante, para el caso del etanol se utilizar filtracin por membrana para eliminar el agente.
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1 Agentes Fsicos: calor 1.1 Preparar una suspensin de Escherichia coli (ATCC 25922) en suero fisiolgico, equivalente al tubo Mac Farland N4, a partir de un cultivo en tubo inclinado en TSA. 1.2 Homogeneizar bien la suspensin en vortex. 1.3 Sacar una alcuota y realizar las diluciones necesarias en suero fisiolgico. 1.4 Realizar el recuento en superficie en placas de TSA secas sembrando tres diluciones sucesivas. Extender con rastrillo estril y dejar adsorber unos 15 min. 1.5 Incubar durante 24 h a 35 2 C. 1.6 Colocar el resto de la suspensin en bao de agua a 63 C. y comenzar a registrar el tiempo transcurrido. 1.7 Extraer a distintos tiempos alcuotas de 1,5 mL a un tubo vaco estril y enfriar inmediatamente en bao de hielo. 1.8 Realizar el recuento de viables de las alcuotas extradas a los distintos tiempos sembrando las diluciones necesarias en superficie en placas de TSA. Extender con rastrillo estril y dejar adsorber unos 15 min. 1.9 Incubar durante 24 h a 35 2 C. 2.0 Construir tabla de N de m.o. sobrevivientes en funcin del tiempo y la correspondiente grfica de log N de sobrevivientes en funcin del tiempo. 2.1 Calcular el valor D. Nota: sabiendo que el tiempo D a 63 C en TSB para E. coli ATCC 25922 es de 0,7 minutos, determinar los tiempos y las diluciones necesarias para construir la curva de muerte para el mismo m.o. en suero fisiolgico.
2 Evaluacin de Desinfectantes 2.1 Hipoclorito de sodio 2.1.1 Preparar una suspensin de Staphylococcus aureus (ATCC 6538) en suero fisiolgico, equivalente al tubo Mac Farland N4, a partir de un cultivo en tubo inclinado de TSA. 2.1.2 Homogeneizar bien en vortex. 2.1.3 Tomar 1 mL de la suspensin de S. aureus en suero fisiolgico y agregar a 9,0 mL de agua destilada estril. Esta suspensin es Ni. Realizar luego las diluciones necesarias en SF para obtener el recuento en placa en TSA (incorporado). El recuento de esta suspensin Ni representa el valor a tiempo cero. 2.1.4 Agregar 1,0 mL de agua destilada a un tubo con 8,0 mL de solucin de hipoclorito de sodio 250 ppm. Luego agregar 1 mL de la suspensin de S. aureus en suero fisiolgico. 2.1.5 Homogeneizar inmediatamente y dejar a una temperatura de 20 C (ambiente) durante 5 minutos. Esta suspensin es Nf. 2.1.6 Tomar luego 1 mL de esta suspensin y agregar a un tubo conteniendo 9 mL de solucin de neutralizante. 2.1.7 Dejar durante 10 minutos, homogeneizar y sembrar 1 mL de esta suspensin en una placa de Petri estril. 2.1.8 Agregar 20 mL de TSA fundido y termostatizado a 45 C. 2.1.8 Comparar el resultado del recuento obtenido para Ni y Nf (luego del contacto durante 5 minutos con el agente).
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2.2 Hipoclorito de sodio con sustancias interferentes 2.2.1 Agregar 1,0 mL de sustancia interferente (p. ej. leche descremada diluida) a un tubo con 8,0 mL de solucin de hipoclorito de sodio 250 ppm (u otra concentracin elegida). Homogeneizar bien. 2.2.2 Agregar 1 mL de la suspensin de S. aureus preparada en 2.1.2 en suero fisiolgico. Homogeneizar inmediatamente y dejar a una temperatura de 20 C (ambiente) durante 5 minutos. 2.2.3 Tomar luego 1 mL de esta suspensin y agregar a un tubo conteniendo 9 mL de solucin de neutralizante. 2.2.4 Dejar durante 10 minutos, homogeneizar y sembrar 1 mL de esta suspensin en una placa de Petri estril. 2.2.5 Agregar 20 mL de TSA fundido y termostatizado a 45 C. 2.2.6 Comparar el resultado del recuento obtenido para el Ni tiempo cero (2.1.3) y Nf, luego de 5 minutos con el agente y la sustancia interferente.
ESQUEMA PARA HIPOCLORITO DE SODIO

Ensayo
8 mL desinf + 1 mL agua (o sust. interf.)
Susp Mac Farland N4 1 mL 1 mL
Ni t=0
9 mL de agua destilada 5 min. 1 mL
Nf t=5 min
1 mL Diluciones en SF
9 mL neutralizante
1 mL
Recuento en placa TSA
Calcular el efecto de reduccin decimal o efecto germicida EG: Log Ni Log Nf donde Ni es el resultado del recuento obtenido para el Ni a tiempo cero (1/10 del valor de la suspensin McFarland N4) y Nf es el resultado del recuento obtenido en la suspensin luego del contacto con el agente (calcular el recuento en contacto con el agente corrigiendo segn las diluciones sembradas).
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2.3 Etanol 2.3.1 Preparar una suspensin de Staphylococcus aureus (ATCC 6538) en suero fisiolgico, equivalente al tubo Mac Farland N4, a partir de un cultivo en tubo inclinado de TSA. 2.3.2 Homogeneizar bien en vortex. 2.3.3 Tomar 1 mL de la suspensin de S. aureus en suero fisiolgico y agregar a 9,0 mL de agua destilada estril. Esta suspensin es Ni. Realizar luego las diluciones necesarias en SF para obtener el recuento en placa en TSA (incorporado). El recuento de esta suspensin Ni representa el valor a tiempo cero. 2.3.4 Agregar 1,0 mL de agua destilada a un tubo con 8,0 mL de solucin de etanol al 70% (u otra concentracin). Luego agregar 1 mL de la suspensin de S. aureus en suero fisiolgico. 2.3.5 Homogeneizar inmediatamente y dejar a una temperatura de 20 C (ambiente) durante 5 minutos. Esta suspensin es Nf. 2.3.6 Tomar inmediatamente 1 mL de esta suspensin y agregar a 50 mL de suero fisiolgico 2.3.7 Homogeneizar y filtrar 5 mL mediante embudo con membrana aplicando vaco. 2.3.8 Enjuagar la membrana con dos porciones de 50 mL de suero fisiolgico 2.3.9 Colocar la membrana sobre placa de TSA. 2.3.10 Incubar a 35 2 C por 48 h. 2.3.11 Comparar el resultado del recuento obtenido para el Ni tiempo cero (2.3.3) y Nf, luego de 5 minutos en contacto con el agente.
ESQUEMA PARA ETANOL
Susp Mac Farland N4 1 mL 1 mL
Ensayo
9 mL etanol
Ni t=0
9 mL de agua destilada 5 min. 1 mL
Nf t=5 min
1 mL
Diluciones en SF
50 mL SF
FILTRAR Y ENJUAGAR Recuento en placa TSA
5 mL
Calcular el efecto de reduccin decimal o efecto germicida EG: Log Ni Log Nf
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Controles A) Efecto bactericida del neutralizante Tomar 1 mL de la suspensin Ni (preparada en 2.1.3) de S. aureus y agregar a 9,0 mL de solucin neutralizante. Dejar 10 minutos a temperatura ambiente. Realizar el recuento de esta suspensin en TSA incorporado (realizar las diluciones adecuadas en SF). Verificar que la solucin neutralizante no ejerce efecto bactericida sobre la cepa ensayada. B) Validacin de la neutralizacin Tomar 1 mL de agente desinfectante y agregar a 9 mL de solucin neutralizante, mezclar bien. Tomar luego 0,1 mL de una dilucin de la suspensin S. aureus (preparada en 2.1.1) de concentracin conocida (que contenga alrededor de 1000 clulas en el volumen a agregar) a esta solucin. Dejar 10 minutos a temperatura ambiente. Sembrar 1 mL de esta suspensin en una placa de Petri estril y agregar 20 mL de TSA fundido y termostatizado a 45 C. Comparar el resultado obtenido con el recuento de la suspensin conocida de S. aureus de alrededor de 1000 clulas. Verificar que el neutralizante es efectivo para neutralizar el antisptico a la concentracin ensayada.
3 Evaluacin de agentes biolgicos 3.1 Ensayos de difusin. 3.1.1 Prepara una suspensin del m.o. ajustada al 0.5 de la escala de Mc Farland. 3.1.2 Hisopar la superficie de dos placas de agar Mueller Hinton. 3.1.3 Colocar cuidadosamente sobre la superficie de una placa -a una distancia de 1,5 mm entre s y del borde de la placa- discos de antibiticos de concentracin conocida. 3.1.4 Colocar sobre la superficie de la otra placa 4 cilindros de metal. Cargar los cilindros con 100 L de las soluciones de antibiticos y extractos. 3.1.4 Incubar a 35 C durante 18 a 20 h. 3.1.5 Leer los halos de inhibicin. 3.2 Ensayo de dilucin en medio lquido. Determinacin de la concentracin inhibitoria mnima. 3.2.1 Preparar una suspensin del m.o. en un tubo conteniendo 4.5 mL de caldo Mueller Hinton, a partir de un cultivo de 18 h y ajustar la turbidez a 0,5 de Mac Farland. 3.2.2 Realizar dos diluciones seriadas de 1: 10 en caldo Mueller Hinton (para alcanzar una concentracin de 1 x 106 ufc/mL) (Inculo). 3.2.3 Transferir 1 mL de la suspensin bacteriana de 1x106 ufc/mL a cada uno de los tubos conteniendo 1mL de dilucin del antibitico y al tubo control. Rotular los tubos con la concentracin final de antibitico. 3.2.4 Incubar los tubos inoculados conteniendo las diferentes concentraciones de antibitico y el tubo control de crecimiento a 35 C, durante 16-20 h. 3.2.5 Determinar la C.I.M.
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NORMAS
BSICAS
DE
SEGURIDAD
EN
UN
LABORATORIO
DE
MICROBIOLOGA
1. Esta prohibido, comer, beber, fumar, tomar mate, almacenar alimentos, aplicarse cosmticos y cambiarse lentes de contacto en el rea de trabajo. Los lentes de contacto solo se deben utilizar cuando no se puedan usar otro tipo de lentes. 2. Est prohibido pipetear con la boca. 3. Se debe lavar las manos al finalizar el trabajo de laboratorio y cada vez que se sospeche contacto con material contaminado. 4. Se debe trabajar de manera tal de minimizar la creacin de aerosoles. 5. Se debe usar tnica y esta debe estar abrochada. 6. El pelo largo se debe usar atado. 7. Cuando sea necesario se debe usar lentes de seguridad para proteger la cara de salpicaduras, sustancias corrosivas, luz UV y otras radiaciones. 8. El laboratorio se debe mantener ordenado y limpio. Se debe minimizar el material que no sea pertinente al trabajo en las mesadas. 9. Todo material contaminado se debe descontaminar antes de desechar. 10. Las superficies de trabajo se deben limpiar y descontaminar con desinfectantes adecuados al final del trabajo y en caso de haberse volcado material contaminado. 11. Todos los accidentes o vuelcos de material deben ser comunicados al docente encargado de grupo.
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UTILIZACIN DEL MICROSCOPIO
1. Colocar una preparacin. 2. Abrir el diafragma de la fuente de luz al mximo. 3. Abrir el diafragma del condensador al mximo y llevar el condensador al mximo de su trayectoria. 4. Colocar el objetivo de menor aumento ej. 10x. 5. Prender la fuente de luz y ajustarla a una intensidad confortable. 6. Ajustar los binoculares a la distancia interpupilar y ajustar el foco de cada ocular si el microscopio lo permite. 7. Enfocar la preparacin. 8. Gradualmente cerrar el diafragma de la fuente de luz hasta ver una imagen poligonal. 9. Bajar el condensador hasta que los bordes del polgono se vean ntidos. 10. Ajustar el enfoque. 11. Si la imagen poligonal no est en el centro, centrarla utilizando los tornillos del condensador. 12. Abrir el diafragma de la fuente de luz hasta que la poligonal apenas salga del campo, no tocarlo ms. No tocar ms la altura del condensador. 13. Elegir el contraste ptimo ajustando el diafragma del condensador. 14. Verificar la iluminacin quitando los oculares y mirando por el tubo hacia los objetivos ajustar el diafragma a 2/3 abierto (2/3 del campo iluminado). 15. Para cambiar el contraste regular el diafragma del condensador y para ajustar el brillo modificar la intensidad de la fuente luminosa o colocar filtros. No cambiar la distancia del condensador. Al cambiar de objetivo solo modificar el diafragma de la fuente de luz y el diafragma del condensador a la apertura del objetivo.
MANTENIMIENTO DEL MICROSCOPIO DIARIO (cada vez que se usa) Limpiar el aceite de inmersin de lentes y otras superficies del microscopio con papel tissue. El aceite de inmersin debe conservarse cerrado. Apagar la fuente de luz del microscopio Cubrir el microscopio con su funda.
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CITOLOGA Y MORFOLOGA DE BACTERIAS
Las bacterias, junto con los protozoarios, algas microscpicas, hongos microscpicos (incluyendo levaduras) y virus, constituyen los llamados microorganismos (m.o.). El trmino microorganismo no tiene un significado taxonmico preciso sino que agrupa a todos los organismos de dimensiones microscpicas (< 0,1 mm) aunque presenten grandes diferencias entre s. Por ejemplo incluye organismos procariotas (bacterias), eucariotas (hongos, protozoarios, algas) y virus. Tambin difieren notablemente en el tamao aunque sean todos microscpicos. En una escala comparativa tenemos: Protozoarios > levaduras > bacterias > virus Aunque existen miles de especies de bacterias diferentes, los organismos individuales presentan una de las tres formas generales siguientes: elipsoidal o esfrica cilndrica o en forma de bastn espiral o helicoidal Las bacterias esfricas o elipsoidales se denominan COCOS. Muchas bacterias con esta forma presentan modelos de agrupacin que derivan de los diversos planos de divisin celular. As tenemos: cocos en pares (diplococos), ej. Neisseria cocos en cadena, ej. Streptococcus cocos en racimo, ej. Staphylococcus cocos en ttradas, ej. Pediococcus cocos en cubos, ej. Sarcina cocos sin distribucin especial Las clulas bacterianas cilndricas se denominan BACILOS o BASTONES (rod en ingls) y presentan otros modelos de agrupacin. As tenemos: bastones en cadena, ej. Bacillus bastones en letras chinas o empalizadas, ej. Corynebacterium bastones sin distribucin especial Las bacterias helicoidales se presentan en general como clulas individuales independientes; pero las clulas de las distintas especies presentan notables diferencias de longitud, nmero y amplitud de las espiras y rigidez de la pared.
OBSERVACIN Y EXAMEN MICROSCPICO La observacin y examen de las bacterias se puede realizar de dos maneras fundamentales: observando los microorganismos vivos sin teir observando las clulas fijadas, teidas con colorantes Las bacterias vivas en suspensin acuosa tienen propiedades pticas similares a las del agua y, por lo tanto, son difciles de observar con el microscopio de campo claro debido a la falta de contraste con el medio que las rodea. Este contraste aumenta cuando se las tien con un colorante adecuado. Sin embargo, para muchos fines es preferible evitar la coloracin debido a que puede alterar la forma y adems mata a las clulas. Si se quiere observar los m.o. vivos es conveniente usar un microscopio de campo de contraste de fases o en su defecto un microscopio de campo claro con iluminacin mnima. sta se logra bajando el condensador, minimizando la iluminacin.
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El movimiento de traslacin de algunas bacterias puede observarse en preparaciones hmedas del material, es decir con los m.o. vivos. Debe distinguirse claramente el movimiento independiente de las bacterias mviles del movimiento por arrastre por corrientes de conveccin y el movimiento browniano. Cuando el movimiento se realice por propulsin flagelar, el tipo de movimiento variar con la disposicin de los flagelos en el cuerpo celular. La coloracin de las bacterias tiene como fines: poder visualizarlas para determinar morfologa y tamao. diferenciar grupos bacterianos por su reaccin frente a determinados colorantes. revelar la presencia de distintas estructuras internas. Los colorantes utilizados son sales en las que el anin o el catin es el responsable del color; en el primer caso se trata de un colorante cido o aninico y en el segundo, bsico o catinico. Cuando el medio externo tiene un pH cercano a la neutralidad la clula bacteriana tiene una dbil carga negativa. Como la diferencia de carga elctrica es lo que determina la afinidad entre el colorante y la clula, las bacterias tendrn afinidad por los colorantes bsicos (ej.: cristal violeta y azul de metileno). Cuando se utiliza un solo colorante bsico, el mtodo se denomina coloracin simple, mientras que cuando se usan dos o ms se llama coloracin compuesta. La coloracin diferencial es un caso particular de coloracin compuesta. Cuando a una preparacin bacteriana se le aplica un colorante cido tal como eosina, ste no se une a las clulas cargadas negativamente, pero si se deposita alrededor de ellas, quedando as un fondo coloreado donde contrastan las clulas incoloras. No es, por lo tanto, una verdadera tincin y se denomina tincin negativa o indirecta. En algunas ocasiones es necesario utilizar un mordiente, es decir, alguna sustancia que contribuya a la fijacin del colorante a la clula, por ejemplo: cido tnico, sales de Al, Fe, etc.
PREPARACIN DE UN FROTIS Comprende las siguientes etapas: 1) extendido del material en un portaobjetos 2) secado 3) fijacin El propsito de la fijacin es matar los microorganismos, coagular el protoplasma de la clula y adherir la preparacin al portaobjetos. Sin el proceso previo de fijacin se lavara la capa de clulas durante el proceso de tincin. El agente fijador ideal preserva las estructuras de la clula con su forma y posicin sin que aparezcan estructuras que no existan en la clula original. El calor es en general el mtodo de fijacin mas utilizado para la observacin de la morfologa de clulas bacterianas. Cuando adems de los microorganismos interesa la observacin de clulas animales, se utiliza un mtodo qumico como la fijacin por metanol y por formol, que altera menos que el calor la morfologa de las clulas. Coloracin simple Consiste en la aplicacin de un colorante luego de fijada la preparacin. Pueden emplearse los siguientes colorantes bsicos: azul de metileno, cristal violeta o fucsina fenicada. Estos presentan diferente afinidad por las bacterias y por ello los tiempos de aplicacin sern distintos. Coloracin de Gram Los m.o. difieren fsica y qumicamente entre s y por eso reaccionan de una manera diferente frente a un determinado proceso de tincin. Esto constituye el fundamento de las tinciones diferenciales. La tincin de Gram, la ms empleada en bacteriologa, es una coloracin diferencial. Por este mtodo se clasifican las bacterias en dos grupos: Gram positivos (Gram +) y Gram negativos (Gram ), en funcin de su reaccin frente a la coloracin.
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Las clulas previamente fijadas se tien con solucin de cristal violeta, se lavan y se tratan con lugol. El yodo del lugol forma un complejo con el cristal violeta que sirve para fijar ste a la clula. Luego se agrega un agente decolorante (alcohol, acetona o mezclas de ambos) en el cual el complejo yodo-cristal violeta es soluble. Algunos microorganismos son decolorados (los Gram ) mientras que otros no (los Gram +). Luego de la decoloracin se aplica un colorante de contraste, generalmente safranina, que hace visibles las bacterias Gram que haban sido decoloradas. Las bacterias Gram + se ven de color azulvioleta y las Gram se ven rosadas. Las bacterias Gram + poseen paredes gruesas de peptidoglicano, que cuando se deshidratan por el alcohol provoca que se cierren los poros de la pared, impidiendo que el complejo yodo-cristal violeta se escape. En las bacterias Gram , la fina capa de peptidoglicano no evita el pasaje del solvente y el escape del complejo yodo-cristal violeta de la clula. Las levaduras, que poseen una pared celular gruesa pero de una composicin qumica totalmente diferente, generalmente se tien como Gram +. En este caso no son los constituyentes qumicos, sino la estructura fsica de la pared lo que le confiere su coloracin como Gram +. Coloracin de cido resistentes La tincin de cido-resistentes es una tincin diferencial que demuestra la resistencia de la clula a ser decolorada por los lcalis, cidos y alcohol. En algunos microorganismos de los gneros Mycobacterium y Actinomyces la propiedad cido resistente est relacionada con su alto contenido en lpidos.
Coloracin de estructuras Esporas Ciertas especies bacterianas, en particular de los gneros Bacillus y Clostridium, producen elementos de resistencia denominados esporas o endoesporas debido a que se forman dentro de la clula, a razn de una por clula. A diferencia de la clula vegetativa que la produce, la espora es muy resistente a condiciones adversas tales como alta temperatura, baja humedad, radiaciones y agentes qumicos. Es una forma de vida latente que puede permanecer largos perodos como tal y cuando desaparecen las condiciones adversas puede germinar. Tambin puede inducirse esa germinacin mediante, por ejemplo, un shock trmico, es decir un calentamiento a 80C. Las esporas son altamente impermeables a los colorantes, de manera que con las tcnicas de coloracin comunes aparecern como regiones sin teir dentro de las clulas coloreadas. Por lo tanto, para teir las esporas especficamente, deben usarse mtodos de coloracin especiales. Los datos importantes que se obtienen como resultado de esta coloracin son: presencia o ausencia de esporas deformacin o no del cuerpo celular posicin dentro del cuerpo celular
En base a la posicin de la espora dentro de la clula se las clasifica en: terminales, centrales y subterminales (posicin intermedia). Flagelos Muchas bacterias son mviles y su capacidad para moverse en forma independiente se debe generalmente a la presencia de estructuras especiales, los flagelos. Son apndices largos, delgados, de forma helicoidal, libres en un extremo y unidos a la clula por otro. Son tan delgados que solo se pueden ver al microscopio comn luego de una coloracin especial que hace uso de un mordiente. Este promueve la fijacin de las molculas de colorante al flagelo dando lugar a la formacin de un precipitado a lo largo del flagelo, hacindolo visible. La clula bacteriana puede tener uno o ms flagelos dispuestos en distinta manera y en base a eso se clasifican en: polar (flagelo en un extremo del cuerpo celular), anfitrica (flagelos en ambos
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extremos), lofotrica (penacho de flagelos en un extremo) y peritrica (flagelos alrededor de toda la clula sin distribucin). Cpsula Ciertas bacterias segregan en su superficie materiales gomosos compuestos por polisacridos, polipptidos o complejos glucoproteicos. Cuando este material se dispone de una manera compacta alrededor de la superficie celular se denomina cpsula. La mejor forma de observarla es con tincin negativa, aunque existen tcnicas especiales, para la coloracin especfica de la cpsula.
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TCNICAS
MANIPULACIN ASPTICA DE CULTIVOS Tomar el tubo de cultivo con la mano izquierda, de modo que el fondo del tubo toque la palma de la mano y probar (con la mano derecha) que el tapn est libre, girndolo sin destapar. Tomar el ansa con la mano derecha, con los dedos pulgar, ndice y mayor, dejando libres el anular y el meique. Quemar el ansa introduciendo la punta en el cono fro de la llama del mechero, en posicin vertical y luego ir levantndola hasta que quede toda al rojo. Pasar el ansa por la llama en un ngulo de 60 con la vertical, mantenindola siempre en posicin paralela al cuerpo. Flamear el metal adyacente al ansa. Trabajando cerca del mechero, tomar el tapn de algodn del tubo con los dedos anular y meique de la mano derecha y quitarlo girando el tubo; flamear la boca del tubo. Introducir el ansa tocando la pared fra dentro del tubo (sin soltar el tapn de algodn) para que se enfre el ansa y luego introducirla en el cultivo lquido o deslizarla sobre la superficie del cultivo slido de abajo hacia arriba, para tomar las clulas a transferir (inculo). Sacar el ansa as cargada del tubo, flamear la boca del tubo y taparlo. Transferir el inculo, ya sea a un portaobjetos para hacer un frotis o a otro medio de cultivo. Quemar nuevamente el ansa.
Siempre que se vaya a tomar una muestra de un cultivo con cualquier finalidad debe procederse segn tcnica asptica descrita, con el fin de no introducir contaminacin en el cultivo o en la muestra.
OBSERVACIN DE UN PREPARADO FRESCO (para observar movilidad, forma, etc) Mtodo de la gota pendiente Colocar una gota de muestra usando tcnica asptica en el centro de un cubreobjetos limpio. Invertirlo cuidadosamente y colocarlo sobre la depresin de una lmina excavada, de manera que no deslice la gota por el cubreobjeto. La gota no debe tocar el fondo de la depresin. Aplicar unas gotas de agua a los bordes del cubre para sellarlo y mantenerlo en su lugar. Observar con el lente seco de mayor aumento. Mtodo de lmina-laminilla Colocar una gota de la muestra usando tcnica asptica sobre un portaobjetos limpio y cubrir con un cubreobjetos. Para prevenir las corrientes de conveccin y el secado de la preparacin, se puede sellar poniendo en los bordes del cubreobjetos vaselina slida o esmalte de uas. Observar igual que el anterior. En caso de disponer de microscopio de contraste de fases la visin es mucho mejor.
PREPARACIN DE UN FROTIS 1) Colocar con un ansa una gota de muestra -si es lquida- sobre un portaobjetos limpio. Si la muestra proviene de un cultivo en medio slido, colocar primero una gota de agua sobre el porta, tomar la muestra con el ansa, tocar la gota, quemar el ansa y luego de enfriada, mezclar bien con el agua para lograr una suspensin homognea.
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2) Secar al aire. Puede acelerarse el secado, manteniendo la lmina encima de la llama del mechero a 15 cm o ms de distancia. 3) Fijar. Con el frotis seco, pasar el porta tres veces por la llama del mechero para fijar. Coloracin simple Preparar un frotis segn la tcnica habitual antes descrita. Colocar el porta sobre un soporte para tinciones. Cubrir la preparacin con 2 o 3 gotas de solucin de azul de metileno o de cristal violeta y dejar 1 minuto. Lavar con agua. Secar encima de la llama del mechero. Observar al microscopio con lente de inmersin (100x) y determinar forma, disposicin y relacin de tamaos de las distintas bacterias. Coloracin de Gram (Tcnica de Hucker) Preparar un frotis segn la tcnica antes descrita. Colocar el porta sobre un soporte para tinciones. Cubrir con solucin de cristal violeta y dejar actuar 1 min. Lavar suavemente con agua de la canilla. Cubrir con lugol y dejar actuar 1 min. Lavar de la misma manera. Cubrir con etanol 95% y dejar 30 seg. moviendo suavemente la lmina. Seguir lavando con etanol hasta que este no arrastre ms colorante. Lavar con agua. Cubrir con solucin de safranina y dejar 15 seg. Lavar y secar. Observar por inmersin. Las bacterias Gram + se vern de color azul-violeta y las Gram - rosadas. Coloracin de esporas Preparar un frotis pasando 10 veces por la llama para fijar. Colocar la lmina sobre una plancha para tinciones. Cubrir con pequeos trozos de papel de filtro, impregnar stos con solucin de verde de malaquita y calentar durante 5 min. con el mechero. Mantener el papel siempre saturado con verde de malaquita mediante agregado de solucin. Lavar suave pero abundantemente con agua. Dar contraste con solucin de safranina durante 30 s. Lavar con agua y secar. Observar por inmersin. Se vern las esporas verdes y los cuerpos celulares rosados. Si se dispone de un microscopio con contraste de fases, se puede observar la endospora sin teir como una estructura densa, blanca dentro de la clula. MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA La microscopa de fluorescencia se basa en los mismos principios de ptica que la microscopa comn, con diferencias en el manejo y el diseo relacionadas con la generacin y transmisin de longitudes de onda adecuadas a los fluorocromos que se quieren visualizar, ya sean propios de la muestra o de la coloracin utilizada. Los procesos de excitacin generalmente requieren longitudes de onda cortas, en el UV cercano (lmpara de halgeno-cuarzo, arcos de mercurio, etc.). Las lentes deben ser de algn material (generalmente fluorita) que transmita esas longitudes de onda y el aceite de inmersin de ser no fluorescente. Se encuentran diversos ejemplos de fluorocromos naturales tales como algunas vitaminas, esteroides, porfirinas, etc. Un ejemplo de estudio de bacterias por visualizacin directa de fluorocromos naturales es la observacin de bacterias metanognicas con luz UV. Estas fluorescen con luz UV en preparaciones sin coloracin debido al la presencia de coenzimas fluorescentes F 420 y F 350, relacionadas con el metabolismo del C y la metanognesis. Otros compuestos que fluorescen (rodamina, auramina, fluorescena, colorantes de acridina) se utilizan en distintas tcnicas de tincin; por ejemplo la tincin de microorganismos cido-resistentes con auramina-rodamina en muestras de tejido y esputo. Tambin se utilizan las tcnicas de inmunofluorescencia que consiste en la aplicacin a la muestra, de una solucin de un anticuerpo marcado con una sustancia fluorescente; si la muestra tiene el antgeno que se busca, este reaccionar y as se localizar. Tal es el caso, por ejemplo, de la deteccin de Salmonella con anticuerpos marcados con fluorescena.
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CITOLOGIA Y MORFOLOGIA DE HONGOS
INTRODUCCIN Los hongos constituyen un grupo muy heterogneo de organismos eucariotas, hetertrofos no fotosintticos y con pared celular. Basndose en la apariencia macroscpica de la colonia se pueden diferenciar dos tipos de hongos: si producen colonias opacas, cremosas o pastosas se denominan levaduras; si producen crecimientos areos, velludos, algodonosos o pulverulentos se llaman hongos filamentosos o mohos. Existe un tercer grupo que se desarrolla como levaduras cuando crece a 37C y como hongo filamentoso a 25C. Este fenmeno se denomina dimorfismo. El conjunto de elementos que constituyen un hongo se denomina talo. El talo puede ser unicelular (en levaduras). En hongos filamentosos el talo incluye una parte vegetativa, el micelio, compuesto por hifas y una parte reproductora. Las hifas son tubos que contienen ncleos y citoplasma. Pueden presentar septos (micelio tabicado) (fig.1) o no (micelio no tabicado) (fig.2). Los septos presentan poros que conectan los distintos segmentos de la hifa. A veces las levaduras constituyen cadenas de clulas denominadas pseudomicelio (fig.3). Pueden existir elementos de resistencia como los esclerotes que son masas endurecidas de micelio presentes en algunos gneros de Ascomycetes y Basidiomycetes. Los hongos se pueden reproducir asexuada y sexualmente. En algunas especies coexisten las dos formas de reproduccin en el mismo organismo que se denomina entonces holomorfo. El holomorfo tiene a la vez una forma de multiplicacin asexuada, el anamorfo o estado imperfecto y una sexuada, el teleomorfo o estado perfecto. La reproduccin asexuada puede ocurrir por propagacin vegetativa a partir de fragmentos de micelio, o por formacin de esporas de distinto tipo (conidios, esporangiosporas, etc.). La reproduccin sexuada se caracteriza por la unin de dos ncleos que dan lugar a esporas sexuadas (zigosporas, ascosporas, etc.). Los hongos pueden ser homotlicos si poseen en el mismo micelio ncleos complementarios que pueden conjugarse o heterotlicos cuando requieren ncleos provenientes de micelios diferentes. En general la reproduccin asexuada es ms importante para la propagacin de la especie. En muchos hongos la reproduccin sexuada se da solo una vez al ao. Hay un grupo de hongos a los que no se les conoce reproduccin sexuada. Existe otro grupo que no forma esporas de ningn tipo y solo se reproduce por fragmentacin del micelio. ZYGOMYCETES Estructura Hongos filamentosos con micelio no tabicado, cenoctico. Pueden presentar rganos de fijacin: rizoides, tpicos de Rhizopus. Reproduccin ASEXUADA: Clamidosporas: clulas vegetativas que se rodean de una pared gruesa constituyendo a la vez elementos de resistencia (fig.4) y que luego dan origen al micelio. Esporangiosporas: esporas producidas endgenamente dentro de un esporangio. A veces, como en Mucor sp., el esporangio puede presentar una columela (fig. 5). La columela es una vescula o parte central del esporangio que es continua con el esporangiforo (hifa que genera el esporangio). SEXUADA: Zigotes o zygosporas: cuerpos marrones o negros, con paredes gruesas que frecuentemente est cubierto por espinas, que son formados por la fusin de dos gametangios (fig. 6).
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Ej.: zigote heterotlico: Absidia coerula, zigote homotlico: Mucor baciliformis
ASCOMYCETES Estructura Hongos filamentosos con micelio tabicado y levaduras. Reproduccin ASEXUADA: Gemacin (o fisin ) en levaduras (fig.7). Conidios formados en conidiforo SEXUADA: Ascosporas contenidas en un asco que se forma frecuentemente por kariogamia de 2 ncleos distintos. Generalmente se forman 8 aunque pueden formarse 2 o 4. Los ascos pueden estar includos o no dentro de un ascocarpo. GRUPO FORMAS DE REPRODUCCION Asexuada Hemiascomycetes gemacin Euascomycetes conidios Sexuada Ascos sin ascocarpo Ascos en ascocarpo cleistotecio peritecio apotecio Fig 8 9 10 11 Ejemplo Saccharomyces Emericella Sordaria Pyronema
BASIDIOMYCETES Estructura Hongos filamentosos con micelio tabicado y algunas levaduras. Reproduccin ASEXUADA: crecimiento vegetativo, rara vez forman esporas. SEXUADA: basidiosporas formadas sobre basidios.
DEUTEROMYCETES O FUNGI IMPERFECTI Estructura Hongos filamentosos con micelio tabicado y levaduras. Se agrupan aqu los hongos a los que no se les conoce forma de reproduccin sexuada. Se presume que stos son estados no sexuados o anamorfos de Ascomycetes (o ms raramente Basidiomycetes) cuyos estados sexuados o teleomorfos no han sido descubiertos. Si se observa el estado sexuado de una especie de Deuteromycetes, ambos estados se transfieren al grupo al que pertenece el teleomorfo. Reproduccin Conidios formados en clulas especializadas, las clulas conidigenas que pueden encontrarse en una hifa especializada: el conidiforo.
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La clasificacin dentro de este grupo se basa en la observacin del aparato conidigeno. La forma en que se produzca la conidiognesis dar lugar a la formacin de conidios solitarios, en racimos o en cadenas. En algunos gneros las clulas conidigenas no se diferencian del resto de la hifa, ej.: Aureobasidium (fig.12). En otros, las clulas conidigenas se alargan denominndose filides, ej.: Penicillium (fig.13), se ramifican, ej. Botrytis (fig.14), o el extremo se dilata, ej.: Aspergillus (fig.15). Algunos gneros forman artrosporas por fragmentacin de la hifa, ej.: Geotrichum (fig.16) y otros clamidosporas. Pueden ser unicelulares o contener dos o ms clulas: macroconidias, ej. Alternaria (fig.17) o Fusarium (fig. 18). Las clulas conidigenas pueden estar contenidas dentro de pycnidios, ej.: Phoma, (fig.19). Los pycnidios son cuerpos de fructificacin globosos, con forma de matraz y poseen una apertura apical llamada ostiolo
PARTE PRCTICA En la identificacin de hongos filamentosos juega un rol muy importante las caractersticas morfolgicas macro y microscpicas. Observacin microscpica El micelio se debe describir segn: su situacin: areo (razante a la superficie o elevado) o profundo su morfologa: velludo, glabro, rugoso, etc. su coloracin produzca o no pigmentos que difundan al medio Se debe tratar de observar las estructuras lo ms intacta posible. Puede observarse directamente la placa de Petri con bajo aumento. Las preparaciones se hacen entre lmina y laminilla. Se coloca en un portaobjeto una gota de solucin aclarante de KOH al 10 % o de una solucin colorante de azul de metileno. Se corta, con el ansa, una pequea porcin del material a estudiar. Para disminuir el dao, se puede utilizar un trocito de cinta adhesiva que se presiona suavemente sobre el cultivo. Se coloca el material o el trozo de cinta en la gota, se cubre con un cubreobjeto y se presiona suavemente. Se observa con bajo aumento. BIBLIOGRAFIA Samson, R.A and col.; "Introduction to Food-Borne Fungi",, 1995. Stanier and col.; The Microbial World, 5ta ed., Prentice-Hall, 1986, p.536-544. Lennette and col.; Manual of Clinical Microbiology, 4ta Ed., American Society for Microbiology, 1985, cap.46. Pelczar and Reid; Microbiology, McGraw-Hill Book Cy., 1972, caps.14 y 15. Guiraud, J. and Galzy, P.; L'analyze microbiologique dans les industries alimentaires, Editions de L'usine, 1981, cap.2. Alexopoulos,C.J. and Mims, W.; Introduccin a la Micologa, Ed. Universitaria de Buenos Aires, 1977. Moore-Landecker, E.; Fundamentals of The Fungi, 2nd ed., Prentice-Hall, 1982. Pitt, J. & Hocking, A., Fungi and food spoilage, Academic Press, London, 1985
FIGURAS DE HONGOS
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Fig. 1 Micelio no tabicado
Fig. 2 Micelio tabicado
Fig. 3 Pseudomicelio
Fig. 4 Clamidosporas
Fig. 6 Zygote
Fig. 5
Fig. 7 Gemacin
Fig. 8 Ascos desnudos Fig. 9 Cleistotecio
Fig. 10 Peritecio
Fig. 11 Apotecio
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Fig. 12 Aureobasidium Fig. 13 Penicillium
Fig. 14 Botrytis
Fig. 15 Aspergillus
Fig. 16 Geotrichum
Fig. 18 Fusarium Fig. 19 Phoma
Fig. 17 Alternaria
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SIEMBRA Y AISLAMIENTO - BSQUEDA
SIEMBRA Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porcin de muestra (inculo) en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano. Luego de sembrado el medio de cultivo debe incubarse a una temperatura adecuada para el crecimiento de los m.o. La siembra puede realizarse en medio lquido, slido o semislido, utilizando punta, ansa, hisopo o pipeta estril. Cultivo en medio lquido Habitualmente se realiza en tubos o en matraces. El crecimiento se puede manifestar por aparicin de turbidez, formacin de velo o pelcula o sedimento. Cultivo en medio slido Puede ser en tubos con medio slido o placas. Tubos con agar inclinado. Para sembrarlos, se mueve el ansa o la punta suavemente sobre la superficie del agar con un movimiento en zigzag desde el fondo hasta la parte superior, cuidando de no daar el agar. Tubos sin inclinar. Se siembran introduciendo una punta en el centro del agar. Tambin se llama siembra por picadura. Siembra en placas. Puede ser en superficie o incorporada. En superficie Se colocan 0,1 mL de la dilucin de la muestra con pipeta estril en el centro de la placa, y se distribuye con un rastrillo estril. Se siembra con un ansa para aislar, como se explica ms adelante. Se siembra con un hisopo. Incorporada Se coloca 1 mL de la muestra en una placa estril vaca, en el centro de la misma. Sobre ella se agregan 20 mL de medio de cultivo slido fundido y termostatizado a 45C; luego se mueve suavemente la placa para que la muestra se mezcle con el agar y se deja solidificar. En medio slido cada clula viable dar origen a una colonia y por lo tanto la siembra en placas se puede utilizar, no solo para cultivar microorganismos, sino adems para contar y aislar. Cuando se quieren tener colonias aisladas a partir de un material determinado, puede ser necesario diluir la muestra con un diluyente estril como suero fisiolgico.
AISLAMIENTO Aislar es separar un microorganismo a partir de una poblacin que los contiene de varios tipos. En ecosistemas naturales raramente encontramos a los microorganismos en cultivo puro o axnico (un solo tipo de microorganismo), por lo tanto es necesario hacer algn procedimiento de aislamiento para separar los distintos tipos de microorganismos presentes para luego as poder identificarlos. El aislamiento se puede lograr directamente a partir de una muestra cuando el o los microorganismos estn en una proporcin adecuada. Para aislar se utiliza alguno de los siguientes procedimientos: a) aislamiento por estras. b) aislamiento por dilucin
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Aislamiento en placa por estras Existen distintas tcnicas, el objeto es obtener colonias aisladas. Consiste en cargar el ansa con la muestra y hacer estras paralelas en la cuarta parte de la superficie de la placa; se quema el ansa, se enfra, se gira la placa 90 y se vuelve a estriar tocando 3 o 4 veces el rea sembrada inicialmente y cubriendo otro cuarto de placa. Por ltimo, sin quemar el ansa, se estra el resto de la superficie sin sembrar. Aislamiento por dilucin en medio slido Se emplean tanto el mtodo de siembra incorporada como el de siembra en superficie. Suele ser necesario diluir la muestra usando suero fisiolgico o algn otro diluyente. AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS ANAEROBIOS Para aislar microorganismos anaerobios que son rpidamente destruidos por exposicin al oxgeno, las placas pueden ser preparadas en la forma usual, y luego de sembradas, incubadas en recipientes cerrados en atmsfera sin oxgeno. Tambin se puede sembrar diluciones en tubos con agar fundido y termostatizado que luego se tapan con una capa de vaselina-parafina para evitar el acceso de aire. Con anaerobios ms sensibles al oxgeno, se trabaja en cmaras anaerbicas, o tambin usando la tcnica del "roll-tube", que es un tubo en el que el agar se deposita en las paredes al hacerlo girar mientras se enfra; se trabaja gaseando el tubo continuamente con gas libre de oxgeno mientras el tubo est destapado.
BSQUEDA Cuando el microorganismo que se desea aislar e identificar se encuentra en baja proporcin en una muestra, se lleva a cabo un procedimiento llamado bsqueda, que involucra una primera etapa de aumento del nmero del tipo de microorganismo que se desea aislar. Luego se asla por el mtodo de estras o por dilucin y se identifica. Una bsqueda generalmente implica los siguientes pasos: 1) enriquecimiento 2) aislamiento selectivo (medios selectivos y/o diferenciales) 3) reaislamiento (medio no selectivo) 4) identificacin El objetivo de la etapa de enriquecimiento es aumentar el nmero del microorganismo que se desea determinar y en algunas ocasiones puede subdividirse en dos: preenriquecimiento y enriquecimiento selectivo. El preenriquecimiento o enriquecimiento no selectivo suele hacerse solamente cuando los microorganismos buscados estn debilitados o daados y se usan siempre medios nutrientes lquidos no selectivos. El enriquecimiento selectivo se realiza incubando la muestra en medios lquidos selectivos, ya sea en presencia de agentes qumicos o biolgicos que suprimen el crecimiento de otros m.o. no deseados y permiten el desarrollo en particular del o de los microorganismos buscados. Luego de cumplida la etapa de enriquecimiento se lleva a cabo la etapa de aislamiento, empleando la tcnica de estras en superficie en medios slidos generalmente selectivos y diferenciales. En estos medios deben examinarse las colonias tpicas para el tipo de m.o. que estamos buscando. Las colonias deben describirse por examen macroscpico en funcin del tamao, la forma, el borde, la elevacin, la transparencia y el color. Esto resulta a veces muy til en la identificacin. En el caso de medios selectivos las colonias aisladas deben aislarse nuevamente en un medio no selectivo por el mtodo de estras. Esto se conoce como reaislamiento y es necesario para asegurar la obtencin de un CULTIVO PURO del microorganismo de inters, ya que en los medios
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de aislamiento selectivos puede ocurrir que una colonia caracterstica del m.o. que estamos buscando pueda contener como contaminantes en muy bajo nmero- otros microorganismos que no hayan crecido en este medio por estar inhibidos, pero al subcultivarlos en condiciones favorables puedan crecer. El examen microscpico de una colonia de un cultivo puro de un microorganismo debe mostrar clulas razonablemente semejantes respecto al Gram y a la morfologa. El informe de una bsqueda se hace siempre expresando PRESENCIA o AUSENCIA en los gramos o mL de muestra sembrados en la primera etapa del procedimiento (enriquecimiento). DESCRIPCIN DE COLONIAS DE BACTERIAS Y LEVADURAS Las colonias de muchos m.o. se pueden describir teniendo en cuenta el tamao, color, superficie, etc. Esta descripcin no incluye hongos filamentosos. Tamao: Grande: dimetro mayor a 1 mm Mediana: dimetro aproximadamente igual a 1 mm Pequea: dimetro menor a 1 mm Color Blanco, Crema, Amarillo limn, Negro, etc Superficie Brillante, Lisa, Granular, Rugosa Consistencia Viscosa, Mantecosa, Friable (se disgrega al tocarla) Densidad (con luz a travs de la colonia) Opaca, Transparente, Traslcida FORMA
Puntiforme ELEVACIN
Circular
Filamentosa
Irregular
Rizoide
Lanceolada
Chata MARGEN
Elevada
Convexa
Cpula
Umbonada
Umbilicada
Entero
Ondulado
Lobado
Ondeado
Filamentoso
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MEDIOS DE CULTIVO
GENERALIDADES Si se desea recuperar determinados m.o. de sus ecosistemas naturales (agua, tierra, alimentos, etc.) puede recrearse en el laboratorio un medio ambiente artificial que favorezca el crecimiento de ellos frente a otros m.o. que los acompaen en ese ecosistema. Se puede emplear un medio de cultivo y condiciones de incubacin (atmsfera, temperatura, pH) considerando las caractersticas fisiolgicas del m.o. buscado, para otorgarle ventajas frente al resto de m.o. de ese ecosistema. Pretendemos inhibir la mayor cantidad posible de m.o. no deseados, de manera que estos no interfieran durante el aislamiento de los que s interesan. Un esquema general para el enriquecimiento, aislamiento e identificacin de m.o. es el siguiente:
Fuente de inculo
Caldo de enriquecimiento
Aislamiento
Identificacin
Debemos realizar las siguientes consideraciones si deseamos detectar y aislar un determinado tipo de m.o. y simultneamente minimizar la interferencia de otros: Muestra Elegir la muestra adecuadamente. El m.o. que se est buscando debe ser factible de estar presente, ya sea si lo estamos buscando per se, o como contaminante. Debemos considerar si es til someter la muestra a un tratamiento previo. Cuanto mayor seleccin se realice en este paso inicial, menos selectivos debern ser los medios de cultivo a utilizar. Debemos comenzar con un enriquecimiento o aislar la muestra directamente? Si el m.o. que deseamos aislar est en un bajo nmero, se siembra la muestra en un caldo de cultivo que favorezca su multiplicacin (enriquecimiento). Cuando un enriquecimiento se realiza en un medio formulado para frenar el desarrollo de m.o. acompaantes no deseados, se denomina enriquecimiento selectivo. Cuando el m.o. deseado est en alto nmero, no se necesita realizar un enriquecimiento, y se puede sembrar la muestra en un medio slido adecuado directamente. Medio de cultivo Todo medio de cultivo debe contener los nutrientes esenciales para el crecimiento de una o varias especies microbianas y dar condiciones tales como pH, presin osmtica, oxgeno disuelto, etc. adecuados para el crecimiento. Debemos utilizar una formulacin de los medios de cultivo adecuados al tipo de m.o. a cultivar. En general en las primeras etapas se utilizan medios de cultivo selectivos (agregando un inhibidor de la flora acompaante), o utilizando un medio de cultivo restrictivo al incluir un nutriente que slo el m.o. deseado sea capaz de utilizar o utilizando condiciones de incubacin particulares. Debemos utilizar las condiciones de incubacin adecuadas: temperatura, luz, atmsfera (aerobia o anaerobia, atmsfera con concentracin de CO2, etc.). Los componentes del medio de cultivo que se pueden manejar son: Fuente de carbono. A modo de ejemplo, se podran quitar todos los compuestos orgnicos para permitir el crecimiento de m.o. auttrofos que son capaces de obtener su fuente de carbono del CO2 (que difunde de la atmsfera al medio o por agregado de bicarbonato). O incluir exclusivamente una fuente de carbono particular, por ej, fenol si queremos aislar degradadores de ese compuesto.
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Fuente de nitrgeno. Generalmente se agrega como sales de amonio o peptonas. Se puede omitir el agregado de fuente nitrogenada (orgnica u inorgnica) para permitir el crecimiento de fijadores libres de nitrgeno, que son capaces de obtener su fuente de nitrgeno del N2 atmosfrico. Fuente de energa. Si no se agrega ningn compuesto capaz de ser utilizado como fuente de energa y se incuba a la luz, slo crecern los m.o. fotosintticos que usan la luz como fuente de energa. Se pueden agregar o no compuestos que sean utilizados como factores de crecimiento (vitaminas, aminocidos, cidos nucleicos, cidos grasos, etc.) segn se necesiten o no.
Peptonas Las peptonas son uno de los constituyentes principales de los medios de cultivo en microbiologa. Se preparan por hidrlisis de protenas y por lo tanto estn constituidas por mezcla de polipptidos, pptidos de diverso peso molecular y aminocidos. Las peptonas de uso microbiolgico son mezcla de varios productos resultantes de la hidrlisis proteica: bases nitrogenadas, sales inorgnicas y trazas de minerales y compuestos varios. Algunas fuentes comunes de peptonas son: carne (fresca, deshidratada o congelada), pescado (fresco o deshidratado), casena, gelatina, protena de soja, microorganismos (levaduras, algas), sangre, albmina de huevo, etc. La hidrlisis puede ser en medio cido o alcalino o a presin superior a la atmosfrica para lograr ms altas temperaturas. Las peptonas resultantes en este proceso tienen en general bajo contenido de vitaminas y aminocidos porque son destruidos en el proceso. Sin embargo la hidrlisis tambin puede ser enzimtica (con papana, pancreatina, pepsina) y es realizada a mas bajas temperaturas, y por lo tanto las peptonas del proceso tienen ms elevado contenido de aminocidos y vitaminas que las de la hidrlisis cida o alcalina. Infusiones y extractos Las fracciones solubles en agua de materiales como hgado, clulas de levadura, extracto de malta y msculo tienen bajo contenido en pptidos pero contienen sustancias valiosas para un medio de cultivo como vitaminas, metales traza y carbohidratos complejos. Ejemplos de ellos son los extractos de carne (ricos en compuestos nitrogenados, vitaminas, aminocidos), levadura (ricos en vitaminas del complejo B, aminocidos y compuestos carbonados y nitrogenados), malta (rica en carbohidratos, especialmente maltosa y otros nutrientes) y corazn de buey. Segn la finalidad del medio de cultivo podemos encontrar distintos tipos: 1) Medios nutrientes (no selectivos) Son medios de propagacin que permiten el desarrollo de varios tipos de microorganismos. No contienen inhibidores. Como ejemplos de medios nutrientes comunes tenemos agar nutriente, agar tripticasa soja, caldo nutriente, etc. A veces estos medios se enriquecen con ciertos productos tales como sangre, yema de huevo, etc. para permitir el crecimiento de microorganismos exigentes: tendramos entonces un medio de cultivo rico o enriquecido; ej. agar sangre, agar chocolate (el medio contiene sangre hemolizada). Tambin pueden contener indicadores de pH u otros para diferenciar la reaccion de los m.o.; tales medios se llamaran medios diferenciales, por el. agar lactosa rojo fenol (indicador de pH rojo fenol), caldo tioglicolato (indicador de potencial redox resazurina). 2) Medios selectivos o inhibitorios Son medios que contienen adems de los nutrientes, ciertas sustancias que inhiben el desarrollo de algunos microorganismos permitiendo el crecimiento de otros, por ej. agar cetrimide. Estos medios tambin pueden contener indicadores para diferenciar los distintos tipos de microorganismos que puedan crecer en l; tal medio sera selectivo y diferencial, por ej. Mac Conkey, Baird Parker, EMB, etc. Los medios de enriquecimiento selectivo son medios selectivos
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lquidos que contienen inhibidores, ej., sales biliares, altas concentraciones de cloruro de sodio, etc. 3) Medios diferenciales Contienen sustancias que permiten diferenciar las distintos tipos de m.o. por ej por sus propiedades bioqumicas (produccin de cido de un carbohidrato, produccin de pigmentos, hidrlisis de un compuesto, etc) , ej: agar lactosa rojo fenol, agar Mac Conkey, agar Baird Parker (contiene yema de huevo que permite ver la produccin de lipasas). Pueden ser selectivos o no. Para referirse a otras generalidades de los medios de cultivo, sus constituyentes, preparacin en el laboratorio, control de calidad y almacenamiento se pueden consultar los manuales de medios de cultivo comerciales Preparacin de medios de cultivo Cuando el medio va a repartirse en placas, se esterilizan por separado el medio de cultivo (generalmente por autoclavado) y las placas de Petri (en horno); luego el medio termostatizado a 45 C se reparte en placas, usando tcnica asptica. Cuando el medio va a repartirse en tubos, se reparte antes de su esterilizacin, colocando en cada tubo un determinado volumen segn el tamao del tubo y si queremos o no que quede fondo. Cada tubo se tapa con algodn (o tambin con capuchn de metal, plstico o tapn de rosca). Cuando alguno de los constituyentes del medio de cultivo es termolbil se esteriliza por filtracin y se agrega al medio base luego de autoclavado. Esterilizacin de material de vidrio: Placas de Petri: se preparan en paquetes de 8 a 10 placas segn el tamao, envolvindolas con papel. Tubos: se tapa cada uno con un tapn de algodn y se envuelven con papel en paquetes Pipetas: se coloca un algodn en la parte superior de la pipeta y se envuelve con papel. Se esterilizan en horno a 160 (2 h) o a 180 C (1 h).
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CARACTERSTICAS DE ALGUNOS MEDIOS DE CULTIVO
Medio de cultivo ALRF (agar lactosa rojo fenol) Agar Cetrimide Agar Mac Conkey VRBA (violeta rojo bilis agar) Manitol Salt Agar (Chapman) XLD agar (xilosa lisina desoxicolato) Baird Parker agar TSB + 10% NaCl Caldo Tetrationato CLBVB (caldo lactosa bilis verde brillante)
Tipo de medio diferencial (no selectivo) selectivo selectivo y diferencial selectivo y diferencial selectivo y diferencial selectivo y diferencial selectivo y diferencial enriquecimiento selectivo enriquecimiento selectivo enriquecimiento selectivo
Agente bacteriosttico ----bromuro de cetiltrimetil amonio cristal violeta, sales biliares cristal violeta, sales biliares cloruro de sodio desoxicolato de sodio Cloruro de litio y telurito de potasio cloruro de sodio Tetrationato, sales biliares (verde brillante)
Azcar fermentable lactosa ----lactosa lactosa manitol lactosa, xilosa, sacarosa ----------------
Sistema Indicador rojo fenol ----rojo neutro rojo neutro rojo fenol rojo fenol, citrato frrico amnico y tiosulfato de sodio yema de huevo, telurito de potasio ----------produccin de gas
verde brillante, sales lactosa biliares
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TEST DE ESTERILIDAD
INTRODUCCION El test de esterilidad se aplica a productos que deben ser estriles y se realiza para verificar que efectivamente estn libres de contaminacin microbiana. Deben ser estriles la gran mayora de los productos suministrados por va parenteral (inyectables, sueros), los materiales que estn en contacto con el medio interno (apsitos, suturas, fluidos para irrigaciones, material quirrgico) y los productos oftlmicos. A medida que los avances tecnolgicos permiten obtener productos de mejor calidad, esta exigencia se va extendiendo a otros materiales tales como los de aplicacin tica o sobre algn tipo de mucosas. El test de esterilidad se encuentra descrito en las Farmacopeas donde debe ser estudiado como complemento de este trabajo. Por esterilidad se entiende ausencia de cualquier forma de vida. El trmino esterilidad es absoluto. El proceso mediante el cual se logra este estado se denomina "esterilizacin" y se define como "el proceso de eliminar toda forma de vida". Este proceso est diseado para minimizar la probabilidad de que haya microorganismos sobrevivientes. Por lo tanto, siempre existe una probabilidad finita de que quede algn microorganismo vivo.
LIMITACIONES DEL TEST DE ESTERILIDAD 1) El test de esterilidad es un procedimiento destructivo, por lo tanto slo se puede aplicar a una parte del lote del material a analizar. Por esta razn no puede asegurarse la esterilidad de todo el lote. Empleando conceptos estadsticos se recurre a un plan de muestreo que establece para un nivel de confianza dado, que el porcentaje de contaminacin del lote est por debajo de cierto lmite. Por ejemplo: para un resultado negativo (ausencia de crecimiento) en 20 muestras de un lote dado, se asegura con un nivel de confianza del 95%, que el nivel de contaminacin del lote est por debajo del 5%. Para asegurar que ese lote tiene un nivel de contaminacin menor que el 1%, con un nivel de confianza del 99%, sera necesario analizar 500 muestras, lo que resultara impracticable. Como se observa, tal como est diseado el mtodo slo permite detectar una contaminacin grosera. 2) El ensayo no garantiza la deteccin de todos los microorganismos conocidos. Es imposible disear un mtodo que permita recuperar todos los posibles m.o. contaminantes. Los medios de cultivo empleados y las condiciones de incubacin limitan el nmero de m.o. a recuperar, a un cierto grupo. Quedan excluidos por ejemplo los m.o. exigentes, los anaerobios muy estrictos y los virus. A ello se agrega el hecho de que si el material fue sometido a un proceso de esterilizacin, los m.o. sobrevivientes se encuentran "estresados" y aunque no se recuperen en las condiciones de realizacin del test, podran proliferar en medios ms ricos como el medio interno. 3) Para darle confiabilidad a un resultado positivo del test (desarrollo de m.o.) habra que asegurarse de que la contaminacin no fue introducida durante la realizacin del ensayo (falso positivo). Aunque se han mejorado las condiciones de realizacin del mismo, todava siguen siendo un factor importante de fuente de error. Esto se contrapone a la idea de que se debe aumentar el nmero de muestras para aumentar la confiabilidad del test, porque tambin aumenta la posibilidad de tener falsos positivos.
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MTODOS DE ENSAYO a) Inoculacin directa Consiste en la transferencia directa del producto a ensayar desde su recipiente de origen al medio de cultivo apropiado. b) Filtracin por membrana Consiste en la filtracin del producto a ensayar si es lquido o una solucin del mismo a travs de una membrana de porosidad adecuada (no mayor de 0,45 m). Los microorganismos quedan retenidos en la membrana. sta se coloca aspticamente en los medios de cultivo y se incuba. Se aplica a formas lquidas y a productos que puedan solubilizarse en disolventes apropiados (esterilizables e inocuos para los microorganismos). Permite ensayar un volumen mayor de muestra. Es particularmente apropiado para productos con propiedades bacteriostticas o fungistticas. Es el mtodo de eleccin siempre que sea posible.
DISEO EXPERIMENTAL 1) Muestreo Las Farmacopeas establecen el nmero de unidades a ensayar y la toma de cada unidad segn el contenido y tipo de producto. Para la seleccin de las muestras es conveniente conocer el proceso de esterilizacin, de manera de ensayar las unidades que tienen mayor riesgo de no haber quedado esterilizadas; por ejemplo, en una esterilizacin por calor hmedo se ensayan las unidades que estn en los "puntos fros" del autoclave. Obviamente, el producto esterilizado debe estar contenido en un envase que conserve su esterilidad, por lo tanto si esto no se cumple carece de sentido realizar el test de esterilidad.
CANTIDAD MINIMA DE MUESTRA A USAR PARA CADA MEDIO USP 30 Cantidad por envase
Lquidos (no antibiticos) Menos de 1 mL 1 40 mL Ms de 40 y no ms de 100 mL Ms de 100 mL Lquidos antibiticos Otras preparaciones solubles en agua o en miristato de isopropilo Slidos Menos de 50 mg 50 mg o ms pero menos de 300 mg 300 mg 5 g Ms de 5 g El contenido total de cada envase La mitad del contenido de cada envase pero no menos de 50 mg 150 mg 500 mg El contenido total de cada envase La mitad del contenido de cada envase pero no menos de 1 mL 20 mL 10% del contenido del envase pero no menos de 20 mL 1 mL El contenido total de cada envase para suministrar no menos de 200 mg
Cantidad mnima a tomar de cada unidad
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NUMERO MINIMO DE ARTICULOS A ENSAYAR EN RELACION CON EL NMERO DE ARTCULOS EN LA PARTIDA USP 30
Nmero de artculos en la partida

Preparaciones parenterales No mas de 100 envases Ms de 100 pero no ms de 500 Ms de 500 envases Parenterales de gran volumen Antibiticos slidos Menos de 5 g Mayor o igual a 5 g Preparaciones oftlmicas y otras no inyectables No ms de 200 envases Ms de 200
Nmero mnimo de artculos a ensayar para cada medio*
10% o 4 envases lo que resulte mayor 10 envases 2% o 20 envases lo que resulte menor 2% o 10 envases lo que resulte menor
20 envases 10 envases
5% o 2 envases lo que resulte mayor 10 envases
* Si el contenido de un envase es suficiente para inocular dos medios esta columna da el nmeo de envases necesarios para los dos medios juntos.
2) Medios de cultivo Los medios de cultivo fueron seleccionados para favorecer el desarrollo del ms amplio espectro de microorganismos posible. Los recomendados actualmente son: Caldo Tripticasa Soja (TSB o Tryptic Soy Broth) y Caldo tioglicolato. El TSB se propone para recuperar bacterias aerobias, hongos y levaduras, y se incuba a 22,5 2,5C. El Tioglicolato favorece el crecimiento de microorganismos anaerobios por ser un medio de bajo potencial redox, aunque permite tambin el desarrollo de microorganismos aerobios. Se incuba a 32,5 2,5C. El bajo potencial redox se logra con el agregado de reductores (cistena y cido tiogliclico) y un bajo porcentaje de agar que disminuye la difusin del oxgeno. El medio incluye resazurina como indicador del potencial redox. Se considera que el medio est apto para el uso cuando no ms del tercio superior del volumen total est oxidado (rosado). Los medios deben ser sometidos a dos tipos de controles: a) confirmar su esterilidad, para ello se incuba un nmero representativo de cada partida (control negativo) en las mismas condiciones del ensayo durante 14 das. b) Test de promocin de crecimiento: se debe demostrar que el medio es capaz de promover el desarrollo de microorganismos aunque estn en bajo nmero. Para ello se inoculan en forma independie unidades de cada lote de medio con no ms de 100 ufc del tipo de m.o. establecido y se verifica el crecimiento de los mismos dentro de 3 das para bacterias y no ms de 5 das para hongos. Los medios son adecuados si se produce un crecimiento claramente visible de los m.o.
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3) Determinacin de la presencia o ausencia de inhibidor en el producto a analizar Antes de realizar el test de esterilidad se debe verificar que el producto a ensayar no ejerce propiedades bacteriostticas o fungistticas en las condiciones del ensayo. Para ello se compara el crecimiento desarrollado en el medio de cultivo, luego de inoculado con una cantidad conocida de microorganismos (no mas de 100 ufc), en ausencia y presencia del producto (mtodo de inoculacin directa) o de la membrana usada para filtrar el producto (mtodo por filtracin). El crecimiento debe ser similar en ambos ensayos. Si se comprueba presencia de inhibidor se debe agregar un agente neutralizante o ajustar la relacin toma de muestra/medio de cultivo hasta que se verifique que no existe inhibicin.
Cepas de microorganismos empleados para el test de promocin de crecimiento y validacin Bacterias aerobias Staphylococcus aureus ATCC 6538 Bacillus subtilis ATCC 6633 Micrococcus luteus (Kocuria rhizophila) ATCC 9341 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Bacterias anaerobias Clostridium sporogenes ATCC 11437 Bacteroides vulgatus ATCC 8482 Hongos Candida albicans ATCC 10231 Aspergillus niger ATCC 16404
4) Procedimiento a) Condiciones de realizacin. Cabe recordar que en este ensayo una contaminacin accidental sera crtica. Se debe extremar las precauciones en el manejo de la tcnica asptica y trabajar en una cabina de flujo laminar en un ambiente adecuado. La cabina de flujo laminar consiste en una cabina en la cual hay una corriente constante y de velocidad uniforme (en forma laminar) de aire filtrado a travs de filtros de alta eficiencia (HEPA = High Efficiency Particulate Air). Estos filtros tienen una eficiencia del 99,97% en remover todas las partculas mayores o iguales a 0.3 m. El flujo puede ser vertical (brinda mayor proteccin al operador) u horizontal. El personal que realiza el ensayo tambin puede ser fuente de contaminacin por s mismos, por su vestimenta o por las manipulaciones. Se recomienda utilizar vestimenta adecuada (tnica, tapabocas, cofia y guantes esterilizados) y realizar el menor nmero de movimientos posibles. Generalmente se controla la contaminacin durante la realizacin del test por exposicin de placas con medio nutriente que luego se incuban. b) Apertura de los envases y toma de muestra. Se limpia la superficie exterior de los envases con una solucin de un desinfectante adecuado y se extrae el contenido en forma asptica. Si se trata de viales o ampollas conteniendo un lquido se hace la toma con jeringa o pipeta estril y se transfiere a los medios de cultivo o directamente al vaso de filtracin de la unidad filtrante (si el volumen es muy pequeo o la solucin es viscosa, diluir la muestra con un disolvente adecuado antes de filtrar).
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Si se trata de productos oleosos solubles en miristato de isopropilo se puede aplicar el mtodo de filtracin. Para los slidos se busca un disolvente adecuado o se aplica el mtodo de inoculacin directa. En el caso de paquetes conteniendo artculos esterilizados (algodn, gasa, equipo quirrgico, etc) se debe abrir y extraer aspticamente parte de su contenido. En los dispositivos teraputicos que requieren la condicin de esterilidad slo para el interior del mismo (por ejemplo cnulas), se hace fluir los medios de cultivo a travs del lumen. c) Tcnica de filtracin por membrana. La unidad filtrante consta bsicamente de un vaso de filtracin un soporte para la membrana, un embudo y un kitasato. La filtracin se realiza por aspiracin con bomba de vaco. La membrana de filtracin est constituida generalmente por polmeros de steres de celulosa. Acta como filtro de superficie con un tamao de poro definido y limitado. En el test de esterilidad se emplean membranas de 0,45 m de dimetro de poro, lo que permite retener las bacterias en su superficie. Pueden adquirirse esterilizadas o pueden esterilizarse junto a la unidad de filtracin. Despus de filtrar el producto, especialmente si ste tiene propiedades bacteriostticas o fungistticas, se lava la membrana con lquido de enjuague. En este caso pueden emplearse tambin membranas con bordes hidrofbicos, que impiden que la parte de ms difcil acceso a las soluciones de enjuague (bordes de la membrana) quede embebida de agente inhibidor. Se desarma la unidad y aspticamente se retira la membrana, se corta a la mitad y se introduce cada una en los medios TSB y Tioglicolato. Se incuban durante 14 das. d) Tcnica de inoculacin directa. Se transfiere directamente y en forma asptica la toma desde cada unidad a un tubo conteniendo TSB y a un tubo conteniendo caldo Tioglicolato. Se incuba y se observa si hay evidencia de crecimiento microbiano a intervalos frecuentes. Si el producto por s mismo deja el medio turbio, subcultivar el da 14 no menos de 1 mL de cada uno de los medios a nuevos medios respectivos. Incubar los subcultivos no menos de 4 das para detectar crecimiento. e) Interpretacin e informe de resultados. Luego de concluido el perodo de incubacin se examina los medios de cultivo en bsqueda de evidencia macroscpica de crecimiento microbiano. Si no hay evidencias de crecimiento como desarrollo de turbidez y/o crecimiento superficial, se informa que el producto "cumple el test de esterilidad segn farmacopea ....." Si hay crecimiento en cualquiera de los caldos empleados se informa "no cumple el test de esterilidad segn farmacopea ....." a menos que pueda demostrarse claramente que la prueba result invlida por causas no relacionadas con el producto examinado La prueba puede considerarse invlida solo si se cumplen una o mas de las siguientes condiciones: a) Los datos del monitoreo microbiolgico de las instalaciones demuestran una falla. b) Una revisin del procedimiento analtico usado durante el test revela una falla. c) Se detecta crecimiento microbiano en los controles de esterilidad de los medios. d) Luego de determinar la identidad de los m.o. aislados del test puede atribuirse de manera inequvoca a falla con respecto al material o a la tcnica usados. Si el test se considera invlido se repetir con el mismo nmero de unidades del test original. Si no se detecta crecimiento microbiano el producto examinado cumple con el test de esterilidad. Si se detecta crecimiento microbiano en el test repetido el producto examinado no cumple el test de esterilidad. No se prescribe en forma oficial, pero se recomienda aislar y caracterizar l o los m.o. que crecieron en los medios de cultivo. El hecho de que los microorganismos aislados en cada ensayo sean iguales puede ser una evidencia de que provienen de la muestra y por lo tanto de que el producto no cumple con el test de esterilidad.
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EL TEST DE ESTERILIDAD Y OTROS CONTROLES DE ESTERILIZACION El control de un proceso de esterilizacin puede realizarse sobre el producto esterilizado (test de esterilidad) y sobre el proceso mismo. Los controles del proceso pueden ser fsicos (temperatura, presin, humedad), qumicos (viraje de algn indicador, concentracin del agente esterilizante) o biolgicos (bioindicadores). Actualmente, el criterio general es emplear una combinacin de stos ya que los ensayos en el producto final no aseguran, por s solos, la esterilidad del mismo. Se considera que la esterilidad, como parte de la calidad de un producto, debe ser proyectada y construida y no solo inspeccionada sobre el producto final.
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IDENTIFICACIN DE UNA CEPA BACTERIANA
Existen diferentes sistemas de clasificacin de bacterias, pero el ms comnmente utilizado es el Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. La identificacin de una bacteria es su asignacin a un taxn o grupo segn una clasificacin dada. Consiste en la determinacin de las caractersticas fenotpicas y/o genotpicas y la comparacin de estas caractersticas con los diferentes taxones de la clasificacin considerada. Las caractersticas a determinar y su nmero depende principalmente del tipo de bacteria y del fin que prosigue la identificacin. A continuacin se propone un esquema de trabajo para la identificacin de una cepa bacteriana desde el punto de vista bioqumico (biotipo): 1) Obtener un cultivo puro 2) Examen microscpico de clulas vivas y de frotis teido por coloracin Gram. Se determina as la forma y la tincin Gram del microorganismo en estudio. Tambin es importante determinar la agrupacin y la presencia de esporas u otras caractersticas morfolgicas de inters. 3) Determinar las caractersticas nutricionales (en general se desprenden de los mtodos empleados en el aislamiento y cultivo anteriores); fotoauttrofos, fotohetertrofos, quimioauttrofos, quimiohetertrofos. 4) Realizacin de pruebas primarias: en la tabla modificada del Cowan & Steel's Manual of Identification of Medical Bacteria, se utilizan un grupo de pruebas, que podramos denominar pruebas primarias, con las cuales se puede determinar el gnero, grupo de gneros o en algn caso familia a la que pertenece un aislamiento. Las pruebas primarias son: Gram, morfologa, catalasa, oxidasa, OF, fermentacin de glucosa, presencia de esporas, crecimiento en aerobiosis/anaerobiosis y movilidad. 5) Realizacin de pruebas secundarias y terciarias a efectos de llegar a especie. Estas dependern del gnero o familia determinado. (ej: produccin de pigmentos, produccin de indol a partir de triptofano, etc.) Serotipo A los efectos de realizar identificaciones ms rpidas, o cuando las pruebas bioqumicas no son concluyentes, se recurre al uso de antisueros especficos. Los antgenos bacterianos pueden ser capsulares, somticos (O) que corresponden al lipopolisacrido de la pared de los Gram negativos, flagelares (H), y los antisueros se identifican con esas letras y el nmero o letra del antgeno correspondiente. En una primera identificacin se usan sueros polivalentes y para la caracterizacin serolgica se usan sueros monovalentes dentro de cada tipo de antgeno. Existen en el comercio antisueros para caracterizacin de: Salmonella, Shigella, E.coli, Haemophilus, etc. Tambin se pueden utilizar mtodos de cromatografa gaseosa para identificar productos metablicos, en particular para la identificacin de bacterias anaerobias no esporuladas como: Bacteroides, Fusobacterium, etc. Se puede expresar el nombre de una cepa de la siguiente manera: Yersinia enterocoltica 4 03 gnero especie biotipo serotipo
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ENSAYOS BIOQUIMICOS
La identificacin de una cepa bacteriana proveniente de un aislamiento puede realizarse utilizando diferentes combinaciones de caractersticas y diferentes criterios en la evaluacin de similitudes. Los ensayos bioqumicos tradicionalmente utilizados, llamadas pruebas bioqumicas convencionales, generalmente determinan la actividad de una va metablica (conjunto de reacciones qumicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer lo metaboliza o no. Existen diferentes sistemas que facilitan la realizacin de tales ensayos, porque proponen el mejor conjunto de pruebas bioqumicas para la identificacin de un grupo bacteriano, porque simplifican la interpretacin de un resultado utilizando un valor numrico, porque proveen los reactivos prontos para su uso o porque son totalmente automatizables. Las pruebas o ensayos bioqumicos, son pruebas simples que se han desarrollado para demostrar en forma clara una determinada caracterstica bioqumica como presencia o ausencia de una determinada actividad enzimtica, grupo de enzimas o determinada va metablica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano. Para llevarlas a cabo, se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo (medio de cultivo, indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente an para el mismo ensayo si se trata de diferentes microorganismos. Por ejemplo se debe suplir con factores de crecimiento el medio de cultivo para estudiar la fermentacin de distintos azcares cuando se sabe que el microorganismo en estudio es exigente. A la determinacin de la especie se puede llegar segn diversos sistemas (manuales de identificacin, comerciales, etc.). a) Los comerciales utilizan modificaciones de las pruebas bioqumicas convencionales, ya sea sustratos deshidratados, tiras de papel de filtro impregnadas en reactivos o pequeos compartimentos con medios prontos para sembrar. En todos los casos se emplean cdigos numricos para la interpretacin de resultados. Los sistemas comerciales ms comnmente usados son: BBL, ENTEROTUBE II (Becton Dickinson). Es un sistema pronto para usar para la identificacin de Enterobacterias, definida como bastones Gram -, aerobios o anaerobios facultativos no esporulados, oxidasa (-). Consiste en un tubo de plstico con 12 medios de cultivo contenidos en compartimentos individuales que se inoculan simultneamente en una etapa y permiten la deteccin de 15 caractersticas bioqumicas. OXI/FERM TUBE II, (Becton Dickinson). Es un sistema listo para usar para la identificacin de bastones Gram -, aerobios o anaerobios facultativos, oxidasa (+). Consiste en un tubo de plstico de 12 medios de cultivo que permite la realizacin simultnea de 14 pruebas bioqumicas. API 20 E (BioMerieux) Es un sistema estandarizado para la identificacin de Bacterias Gram negativas. Consiste en una plantilla con microtubos conteniendo medios de cultivo deshidratados que se reconstituyen al agregar una suspensin bacteriana. Permite la realizacin de 23 pruebas bioqumicas a partir de una nica colonia bacteriana. Existen tambin sistemas de identificacin comerciales para levaduras. b) En la Ctedra se desarroll un sistema para la identificacin de Enterobacterias que consta de nueve pruebas bioqumicas convencionales (SYS 9E). Este sistema identifica las 23 especies ms frecuentemente aisladas de muestras clnicas. Est integrado por las siguientes pruebas: produccin de H2S (TSI), fenilalanina desaminasa, produccin de indol, descarboxilacin de lisina y ornitina, crecimiento en citrato, fermentacin de arabinosa, fermentacin de sorbitol y produccin de acetona.
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En esquema, la realizacin de una prueba bioqumica implica: Cultivar el microorganismo en un medio que contiene un determinado sustrato y luego de la incubacin visualizar el crecimiento y la degradacin de un sustrato, ya sea por viraje de un indicador o por agregado de un reactivo revelador de la presencia del sustrato, o de algn producto de su degradacin. La prueba bioqumica tambin puede consistir en demostrar el crecimiento en presencia de determinado inhibidor. Cultivar el microorganismo en un medio de propagacin que contenga el sustrato de una enzima inducible y luego de la incubacin demostrar la actividad enzimtica.
En todos los casos se debe tener un cultivo fresco (18-24 h. de incubacin) en un medio en que el microorganismo se desarrolla en forma ptima, a pH, fuerza inica, atmsfera y temperatura adecuados. Siempre que se prepara un nuevo lote de medio de cultivo para una prueba, deben llevarse a cabo los correspondientes controles de calidad, sembrando en dicho medio una cepa positiva y otra negativa para esa prueba. Si bien existen una gran variedad de pruebas bioqumicas empleadas con fines de identificacin, se enumerarn a continuacin solo las que se utilizan ms frecuentemente, agrupadas segn el tipo de ensayo y se denominan segn su nombre corriente. 1) Enzimas vinculadas con la respiracin oxidasa catalasa 2) Requerimientos de oxgeno OF Caldo tioglicolato 3) Descomposicin de azcares simples, cidos orgnicos y otros Produccin de cido, o cido y gas Deteccin de enzimas y vas metablicas (RM-VP, nitrofenilgalactopiranosido. 4) Fuente nica de carbono citrato malonato 5) Utilizacin de compuestos nitrogenados asimilacin de nitrato (reduccin a amonio) desnitrificacin (utilizacin de nitrato como aceptor de electrones) descomposicin de carbohidratos, aminocidos y otros (indol, fenilalanina, urea, descarboxilacin de lisina, etc) 6) Ensayos combinados TSI (Triple azcar hierro) LIA (Agar hierro lisina) 7) Deteccin de exoenzimas (lecitinasa, proteasas, coagulasa, celulasas, etc) 8) Test de crecimiento o inhibicin (temperatura, cloruro de sodio en alta concentracin, antibiticos) 9) Otros (solubilidad en bilis, produccin de pigmentos).
esculina,
ONPG
orto-
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PRUEBAS BIOQUMICAS
CATALASA Introduccin La catalasa es una enzima que descompone el perxido de hidrgeno en oxgeno y agua. La catalasa es una hemoprotena de estructura similar a la de la hemoglobina, excepto que los 4 tomos de hierro de la molcula estn en estado oxidado (Fe+++) en lugar de reducido (Fe++). Excluyendo los estreptococos, la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas poseen actividad catalasa. Principio El perxido de hidrgeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo oxidativo aerbico de los carbohidratos. Si se deja acumular, el perxido de hidrgeno es letal para las clulas bacterianas. La catalasa transforma el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno de acuerdo a la siguiente reaccin: H2O2 H2O + O2 (burbujas de gas) La prueba de la catalasa, llevada a cabo en portaobjetos o en tubos, es comnmente utilizada para diferenciar Streptococcus (catalasa negativa) de Staphylococcus (catalasa positiva). Medios y reactivos 1. Cultivo de 24 horas del microorganismo en un medio no selectivo y que no contenga sangre. 2. Perxido de hidrgeno al 3% (diluir la solucin de 30% con agua destilada). Procedimiento Transferir una ansada de clulas del centro de una colonia bien aislada a la superficie de un portaobjetos en el que se coloco una pequea gota de perxido de hidrgeno al 3%. Emulsionar bien. Se recomienda probar previamente las ansas que contengan hierro, ya que se pueden producir falsos positivos. Interpretacin La rpida aparicin y produccin sostenida de burbujas de gas o efervescencia, indica una prueba positiva. Dado que algunas bacterias pueden poseer enzimas distintas de la catalasa, capaces de descomponer el perxido de hidrgeno, unas pocas burbujas diminutas, formadas a los 20 a 30 segundos no se consideran una prueba positiva. Controles Staplylococcus aureus: positivo Streptococcus spp.: negativo
PRUEBA DE XIDO-FERMENTACIN (OF) Introduccin La prueba de xido-fermentacin es importante en las primeras etapas de identificacin de un cultivo. Permite diferenciar las bacterias segn el rol del oxgeno atmosfrico en la utilizacin de carbohidratos. Principio El medio ms comnmente utilizado es el de Hugh-Leifson que -a diferencia de otros medios de cultivo- contiene una baja concentracin de peptonas (0,2 %). A las concentraciones de peptona habitualmente usadas en otros medios (1 al 2%), no es posible detectar la baja concentracin de
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cidos que se produce por metabolismo oxidativo de azcares, ya que las aminas generadas por el uso aerobio de las peptonas alcalinizan el medio. La baja concentracin de peptona del medio Hugh-Leifson permite diferenciar los microorganismos oxidativos de los inactivos frente a la glucosa. En ausencia de otros aceptores externos de electrones (ej. NO3-), la oxidacin de carbohidratos es un proceso estrictamente aerobio, en tanto que la fermentacin es un proceso que no requiere oxgeno. El medio de cultivo es semislido. Medios y reactivos Medio de Hugh-Leifson de glucosa Peptona 2g Glucosa 10 g Azul de bromotimol 0,03 g NaCl 5g K2HPO4 0,30 g Agar 3g Agua destilada c.s.p. 1 L Se dispensa en tubos profundos (7 - 8cm). pH (luego de la esterilizacin): 7,1 0,2. Procedimiento Se inocula por picadura (con punta en vez de ansa) un solo tubo que tiene por lo menos 7 cm de altura de medio de cultivo y se incuba a 35C durante 48 horas o ms. Interpretacin La produccin de cido se detecta en el medio por la aparicin de color amarillo. En el caso de microorganismos oxidativos, este aparece en la superficie. Cuando el microorganismo es fermentador se observa el viraje en todo el tubo. Si el medio no cambia de color o vira al color azul (pH bsico) con respecto a un tubo del mismo lote sin sembrar, se considera que el microorganismo es inactivo frente a la glucosa. Controles Fermentador de glucosa: Escherichia coli Oxidativo de glucosa: Pseudomonas aeruginosa No reacciona: Micrococcus spp.
FERMENTACIN DE GLUCOSA Introduccin La determinacin de la capacidad de fermentacin de la glucosa es importante en las primeras etapas de identificacin de bacterias quimitrofas. Principio Se utiliza un caldo que contiene glucosa (azcar del cual la mayora de las bacterias quimiotrofas pueden obtener energa, ya sea por fermentacin o respiracin), peptona y un indicador de pH que permite detectar la produccin de cidos (caracterstica de la fermentacin de la glucosa). Adems en la fermentacin se produce gas, ya sea CO2 solo o una mezcla de H2 y CO2. El H2 es insoluble y se detecta por la formacin de una burbuja en una campana de Durham presente en el medio. Medios y reactivos Medio caldo de fermentacin de glucosa Proteasa peptona 10 g Glucosa 10 g Prpura de bromocresol 0,015 g Cloruro de sodio 5g Agua destilada c.s.p. 1L
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Se dispensa por 9 mL en tubos y se agrega una campanita de Durham invertida. pH (luego de la esterilizacin): 6,8 0,2. Procedimiento Se inocula con ansa y se incuba a 35 C durante 48 horas. Interpretacin Las bacterias fermentadoras de glucosa producen un viraje del indicador al cido (color amarillo). Si se produce gas puede observarse en la campanita invertida. Las bacterias no fermentadoras no producen viraje o producen un viraje hacia el pH alcalino (prpura a violeta). Pueden ensayarse otros carbohidratos adems de glucosa.
OXIDASA Introduccin El sistema citocromo oxidasa est constituido por hemoprotenas capaces de catalizar la oxidacin de un citocromo reducido por el oxgeno molecular. Las bacterias que obtienen su energa por respiracin y utilizacin del oxgeno molecular como aceptor final de electrones contienen diferentes sistemas citocromo oxidasa, en tanto que las bacterias anaerobias obligadas no contienen tales sistemas. Principio El ensayo de citocromo c oxidasa permite detectar la presencia en el microorganismo de ciertas enzimas del sistema citocromo oxidasa, capaces de oxidar rpidamente al colorante redox . Este ensayo es til para sospechar la presencia de los gneros de bacterias que dan el ensayo positivo como Neisseria, Aeromonas, Vibrio, Camplylobacter y Pseudomonas y para excluir las Enterobacterias que dan reacciones negativas. Medios y reactivos 1. Cultivo fresco del m.o. en un medio no selectivo y libre de colorantes que puedan interferir en el ensayo. 2. Solucin al 1% de diclorhidrato de dimetil-p-fenilendiamina (producto de color rosado), o clorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (producto de color azul), recin preparada. Procedimiento Aadir unas gotas de reactivo a una tira o disco de papel de filtro (colocada en una placa de Petri limpia) y extender luego una ansada (bien cargada) de la colonia a estudiar. Se debe realizar un control negativo del ansa ya que sta puede producir falsos positivos. Interpretacin Cuando se utiliza el reactivo tetrametil-p-fenilendiamina: Se considera el ensayo como positivo cuando aparece un color azul profundo en un tiempo menor a 10 seg. Se considera positivo lento a confirmar cuando el color aparece entre 10 y 60 seg. y se considera negativo cuando no hay desarrollo de color o cuando se produce en un tiempo mayor a 60 seg. Cuando se utiliza el reactivo dimetil-p-fenilendiamina: Se considera el ensayo como positivo cuando aparece un rosado a fucsia en un tiempo de aproximadamente 2 minutos. Controles Positivo: Pseudomonas aeruginosa Negativo: Escherichia coli
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CALDO TIOGLICOLATO CRECIMIENTO AEROBIO-ANAEROBIO Introduccin Los microorganismos pueden ser clasificados de acuerdo a su crecimiento en presencia de oxgeno de la siguiente manera: 1) aerobios estrictos: son los que necesitan O2, 2) anaerobios estrictos: aquellos que solo pueden crecer en ausencia de O2, y 3) anaerobios facultativos: aquellos que pueden crecer en presencia o ausencia de oxgeno. El Manual Bergeys aplica las relaciones con el oxgeno a las bacterias hetertrofas y define: aerobio: organismo capaz de utilizar el oxgeno como aceptor final de electrones, pueden tolerar un nivel de oxgeno equivalente o mayor al presente en el aire (21%) y tiene un metabolismo respirador. Algunos aerobios pueden ser capaces de crecer con otros aceptores de electrones distintos al oxgeno (ej. respiracin anaerobia con nitrato). anaerobio facultativo: organismo capaz de crecer bien tanto en ausencia como en presencia de una concentracin de oxgeno similar a la del aire. Algunos crecen en aerobiosis respirando con oxgeno y en anaerobiosis por fermentacin. Otros tienen un metabolismo estrictamente fermentativo y no respiran el oxgeno. microaeroflico: organismo capaz de crecer dependiente de oxgeno pero no tolera las concentraciones de oxgeno del aire. La respiracin aerobia se da en concentraciones bajas de oxgeno (5%). Algunos microaeroflicos pueden respirar anaerbicamente utilizando otros aceptores de electrones distintos al oxgeno. anaerobio: organismo incapaz de crecer en presencia de oxgeno a niveles atmosfricos o bajos. Algunos tienen metabolismo fermentativo y otros respiran anaerbicamente. Principio Para determinar las relaciones con el oxgeno se utiliza el caldo tioglicolato. Este medio permite el crecimiento de muchas de las bacterias hetertrofas no exigentes, pero no de todas, y de acuerdo al tipo de crecimiento se determinar si el microorganismo puede respirar y/o fermentar. No se puede determinar si el microorganismo puede crecer anaerbicamente con aceptores electrnicos alternativos (NO3-) o con luz. El tioglicolato de sodio, baja el potencial redox del medio y la resazurina es un indicador de oxidacin (aerobiosis) del tubo. Medios y reactivos Medio Caldo tioglicolato Extracto de levadura Casitona Glucosa NaCl L-Cistina Tioglicolato de Na Agar Resazurina Agua destilada
5g 15 g 5,5 g 2,5 g 0,5 g 0,5 g 0,75 g 0,001 g 1L
pH luego de la esterilizacin: 7,1 0,2 Procedimiento Inocular los tubos por picadura (con punta). Incubar a 35C durante 48 horas. Interpretacin Aquellos microorganismos que son indiferentes al oxgeno y tienen un metabolismo estrictamente fermentativo, crecern a lo largo de todo el tubo. Los anaerobios facultativos crecern a lo largo de todo el tubo pero habr mayor crecimiento en la superficie del tubo. Los aerobios estrictos crecern slo en la superficie del tubo (no fermentan). Los microaeroflicos no crecern en la superficie pero s en la zona aerobia (rosada) donde haya una concentracin de oxgeno inferior a la atmosfrica. Los anaerobios estrictos -que puedan crecer en este medio- solo se desarrollarn en el fondo del tubo.
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PRUEBAS BIOQUMICAS SECUNDARIAS
INDOL Introduccin El indol es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido triptofano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con produccin de indol, cido pirvico y amonaco. La produccin de indol es una caracterstica importante para la identificacin de muchas especies de m.o. Principio La prueba de indol est basada en la formacin de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo del p-dimetilaminobenzaldehdo. Este es el principio activo del reactivo de Kovacs descrito ms adelante. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano. Medios y reactivos Caldo triptofano Peptona o digerido pancretico de casena Cloruro de sodio Agua destilada Reactivo de Kovacs Alcohol amlico o isoamlico p-dimetilaminobenzaldehdo HCl conc. 150 ml 10 g 50 ml
2g 0,5 g 100 ml
Procedimiento Inocular el caldo triptofano con el m.o. en estudio e incubar a 35C durante 18 a 24 horas. Al finalizar este perodo, aadir 5 gotas de reactivo por la pared del tubo. Interpretacin El desarrollo de un color rojo intenso en la interfase del reactivo y el caldo, segundos despus de aadir el reactivo indica la presencia de indol y un resultado positivo de la prueba. Controles Escherichia coli: positivo Klebsiella pneumoniae: negativo (mayora de las cepas)
ROJO DE METILO - VOGES-PROSKAUER (RM VP) Principio Una de las caractersticas taxonmicas que se utilizan para identificar los diferentes gneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporcin de productos de fermentacin que se originan por la fermentacin de la glucosa. Se conocen dos tipos generales: la fermentacin cido-mixta y la fermentacin del 2,3 butanodiol. En la fermentacin cido mixta se forman fundamentalmente lctico, actico y succnico, adems de etanol, H2 y CO2. En la va del butanodiol se forman cantidades menores de cido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2. El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo de viraje entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), que se utiliza para visualizar la produccin de cidos por la va de fermentacin cido mixta.
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El acetil-metil-carbinol (o acetona) es un producto intermediario en la produccin de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxgeno la acetona es oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa-naftol dando un color rojo-fucsia Medios y reactivos Caldo RM/VP Peptona Glucosa Fosfato dipotsico Agua destilada pH = 6,9 0,1 Indicador de pH rojo de metilo Rojo de metilo 0,1 g en 300 mL de etanol 95 Agua destilada 200 ml Revelador VP alfa-naftol (solucin al 5% en etanol 95) Solucin de KOH al 40% en agua destilada Procedimiento Inocular el caldo RMVP con un cultivo puro de no ms de 24 horas del m.o. en estudio. Incubar a 35C durante 48 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubacin transferir 1 mL del caldo a un tubo limpio para VP. Para revelar VP agregar 0,6 ml (10 gotas) de alfa-naftol al 5% y 1 gota de KOH al 40%. Agitar cuidadosamente para exponer el medio al oxgeno atmosfrico y dejarlo reposar durante 10 a 15 minutos. En el otro tubo con el caldo restante revelar RM agregando unas 4 - 8 gotas del indicador rojo de metilo. Interpretacin La prueba VP es positiva si se desarrolla un color rojo-fucsia luego de 15 minutos, que indica la presencia de diacetilo, producto de oxidacin de la acetona. La prueba RM es positiva si se desarrolla un color rojo estable. Esto indica que la produccin de cido es suficiente para producir el viraje del indicador y el m.o. ferment la glucosa por la va de cido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es considerado como positivo. Controles RM positivo, VP negativo: Escherichia coli RM negativo, VP positivo: Enterobacter aerogenes
7g 5g 5g 1L
UTILIZACIN DE CITRATO Introduccin La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono es una prueba til en la identificacin de enterobacterias. Principio La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como nica fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinizacin del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6.
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Medios y reactivos Medio de Simmons Fosfato dicido de amonio Fosfato dipotsico Cloruro de sodio Citrato de sodio Sulfato de magnesio Agar Azul de bromotimol Agua destilada c.s.p. pH = 6,9
1g 1g 5g 2g 0,2 g 15 g 0,08 g 1L
Procedimiento Se inocula la superficie del agar inclinado con una sola estra en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en un medio slido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inculo. Incubar a 35C de 24 h. a 4 das. Interpretacin El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estra, acompaado o no de un viraje del indicador al azul. Controles Positivo: Klebsiella spp. Negativo: E.coli
DESCARBOXILACIN DE LISINA Y ORNITINA Introduccin La descarboxilacin de aminocidos es llevada a cabo por descarboxilasas y se forman aminas y CO2. Cada descarboxilasa es especfica para un aminocido y la reaccin es completa e irreversible. Los aminocidos ensayados habitualmente para la identificacin son lisina, ornitina y arginina. Principio El caldo descarboxilasa de Moller es el medio base ms comnmente usado para la determinacin de las descarboxilasas en enterobacterias. Se prepara un tubo con el medio conteniendo el aminocido a ensayar y un tubo control con medio base sin aminocido. Se cubren con una capa de aceite mineral (vaselina lquida) para hacer el medio anaerobio de manera que ocurra la fermentacin de la glucosa que contiene. Durante las primeras etapas de la incubacin en ambos tubos se observar viraje del indicador de pH del medio al cido por la fermentacin de la glucosa. Luego, si el aminocido es descarboxilado, se forman aminas que provocan un retorno al color original del medio o un viraje al alcalino. Medios y reactivos Base de Moeller Peptona Extracto de carne Glucosa Piridoxal Prpura de Bromocresol Rojo de cresol Agua destilada c.s.p.
5g 5g 0,5 g 0,005 g 0,01 g 0,005 g 1L
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pH final = 6,0 Caldo Lisina o Ornitina de Moeller: Preparar igual al medio base y agregar 10 g del aminocido (1% de concentracin final de la forma levo, utilizar el doble si se usa la forma dl del aminocido ya que slo la levo es activa). Agregar aceite mineral para formar una capa de 1 cm de espesor. Procedimiento Inocular con un cultivo puro de 24 horas un tubo de base de Moller con el aminocido a estudiar (lisina u ornitina) y un tubo de la base (control sin aminocido). Incubar a 35C durante 18 a 24 horas. Interpretacin El ensayo puede ser ledo si en el tubo control se observa crecimiento y viraje del indicador al amarillo indicando que se dio la fermentacin de la glucosa y un descenso de pH que permite la activacin de las descarboxilasas. La presencia de crecimiento y el retorno al color azul-violeta en el tubo que contiene el aminocido indica una reaccin positiva debida a la liberacin de aminas por descarboxilacin. Controles Descarboxilacin de lisina positiva: Enterobacter aerogenes Descarboxilacin de lisina negativa: Enterobacter cloacae Descarboxilacin de ornitina positiva: Serratia spp Descarboxilacin de ornitina negativa: Klebsiella spp.
FENILALANINA DESAMINASA Introduccin La fenilalanina es un aminocido que por desaminacin oxidativa forma un cetocido, el cido fenilpirvico. Para los gneros Proteus y Providencia que poseen la fenilalanina desaminasa, esta prueba permite diferenciarlas del resto de las Enterobacterias. Principio La prueba de la fenilalanina se basa en la deteccin del cido fenilpirvico luego del desarrollo del m.o. en un medio que contiene fenilalanina. Para eso se agrega cloruro frrico que forma un complejo de color verde con el cido fenilpirvico. El medio de cultivo no puede contener extractos de carne o peptonas por su contenido variable en fenilalanina. Medios y reactivos Agar fenilalanina DL fenilalanina Extracto de levadura Cloruro de sodio Fosfato de sodio Agar Agua destilada c.s.p. pH = 7,3 Cloruro frrico Cloruro frrico HCl concetrado Agua destilada c.s.p. 10 g 2,5 g 100 ml
2g 3g 5g 1g 12 g 1L
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Procedimiento Inocular el agar en pico de flauta con un cultivo puro de 24 horas e incubar a 35C durante 18-24 horas. Luego de transcurrido el perodo de incubacin, agregar 4 o 5 gotas de reactivo de cloruro frrico, directamente sobre la superficie del agar. Interpretacin La aparicin inmediata de un color verde intenso indica la presencia de cido fenilpirvico y una prueba positiva. Controles Positivo: Proteus Negativo: Escherichia coli
TSI (TRIPLE SUGAR IRON) Introduccin El agar triple azcar hierro es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de produccin de cido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un nico medio. Tambin permite la deteccin de la produccin de H2S. Es una prueba bioqumica til en la identificacin de enterobacterias. Principio El agar se prepara en forma de pico de flauta. Esto determina que existan dos cmaras de reaccin en el tubo. La porcin inclinada (pico) expuesta en toda su superficie al oxgeno es aerobia y la porcin inferior (fondo) est protegida del aire y es relativamente anaerobia. La glucosa en el TSI est en una proporcin 10 veces menor que la lactosa y la sacarosa. Si el TSI es inoculado con una bacteria fermentadora de glucosa pero no de lactosa ni de sacarosa, como la cantidad de glucosa es baja, la cantidad de cido producida por la fermentacin ser baja. En las primeras horas (10 a 16 h) de incubacin se producir viraje del indicador al amarillo en todo el tubo (pico y fondo), pero al continuar la incubacin, el pico del tubo retornar al rojo por la degradacin aerobia de las peptonas que produce aminas (que viran el pH al medio bsico). Si el m.o. fermenta la lactosa y/o la sacarosa, como las concentraciones de estos azcares son 10 veces mayores a la glucosa, se producir gran cantidad de cido que no puede ser neutralizado por la produccin de aminas que se da en la superficie. En este caso todo el tubo (pico y fondo) virar al color amarillo (cido). Si se inoculan m.o. no fermentadores, no se formarn cidos y el m.o. no crecer en el fondo del tubo, pero por la produccin de aminas en el pico, todo el medio quedar rojo. La produccin de H2S a partir de tiosulfato se pone en evidencia por precipitacin del sulfuro ferroso (negro). Como esta reaccin se da preferencialmente en medio cido, un ennegrecimiento del fondo del tubo (que puede cubrir todo el fondo del tubo y enmascarar el color amarillo) se lee como fermentacin de algunos de los azcares del medio. Adems puede observarse la produccin de gas (H2 y CO2), ya sea como burbujas en el fondo del tubo, por ruptura del agar o hasta por su desprendimiento del fondo del tubo.
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Medios y reactivos TSI Extracto de carne Extracto de levadura Peptona Proteosa peptona Lactosa Sacarosa Glucosa Cloruro de sodio Sulfato ferroso Tiosulfato de sodio Agar Rojo fenol Agua destilada pH = 7,4 0,2
3g 3g 15 g 5g 10 g 10 g 1g 5g 0,2 g 0,3 g 12 g 0,024 g 1L
Procedimiento Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm del fondo del tubo. Tras retirar la punta del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y otro lado. Incubar a 35 C durante 18-24 hs, pero no ms de 24 hs.. Interpretacin y Controles Para el TSI siempre se informa el resultado en el siguiente orden: pico, fondo, produccin de gas y H2S. Pico alcalino/fondo alcalino (Alc/Alc/gas-/H2S-) No hay fermentacin de azcares. Caracterstica de bacterias no fermentadoras como Ej. Pseudomonas sp Pico alcalino/fondo cido (Alc/A/gas-/ H2S-) Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas. No hay produccin de gas ni de H2S. Ej. Shigella spp. Pico alcalino/fondo cido (Alc/A/gas-/ H2S+) Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas. No hay produccin de gas, si de H2S. Ej. Salmmonella typhi. Pico alcalino/fondo negro (Alc/A/gas+/H2S+) Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, produccin de gas y produccin de cido sulfhdrico. Ej. Salmonella spp. (la mayora de las especies de Salmonella). Pico cido/fondo cido (A/A) Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse H2S o no. E.coli (A/A/H2S -) A estos resultados se les agrega el resultado de la produccin de gas. Ej. A/A/gas+/H2S-.
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LIA (LYSINE IRON AGAR) Introduccin Este ensayo permite diferenciar los microorganismos que producen descarboxilacin o desaminacin de la lisina. Se puede detectar adems la produccin de H2S. Es muy utilizado en las tcnicas de bsqueda de Salmonella, principalmente para descartar otras bacterias que dan colonias de aspecto similar en los medios diferenciales utilizados durante el aislamiento selectivo. Principio Durante las primeras etapas de la incubacin el fondo virar el indicador de pH del medio al cido (amarillo) por la fermentacin de glucosa. Luego, si el aminocido es descarboxilado se formarn aminas que provocan un retorno al color original del medio o hacia un viraje al bsico (color violeta). En la desaminacin se produce un cido carboxlico y NH3 y se visualiza en la superficie la aparicin de un color rojo intenso. La produccin de H2S a partir de tiosulfato se visualiza por la precipitacin de sulfuro ferroso de color negro. Medios y reactivos Peptona Extracto de levadura Glucosa L-lisina HCl Citrato frrico amnico Tiosulfato de sodio Prpura de bromocresol Agar Agua destilida pH = 6,7 0,2 Procedimiento Inocular los tubos de LIA con punta (alambre recto). Para eso introducir la punta con el inculo, hasta 3 a 5 mm del fondo del tubo. Tras retirar la punta del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y otro lado. Incubar a 35C durante 24 horas. Interpretacin y controles Para el LIA siempre se informa el resultado generalmente en el siguiente orden: pico, fondo, produccin de H2S. Pico alcalino/fondo alcalino (lisina descarboxilada) Pico alcalino/fondo cido (lisina no descarboxilada) Pico rojo/ fondo cido (lisina desaminada) Salmonella typhimurium: pico alcalino/ fondo alcalino/H2S + Proteus mirabilis: pico rojo/ fondo cido/H2S Salmonella arizonae: pico alcalino/ fondo alcalino/H2S 5g 3g 1g 10 g 0,5 g 0,04 g 0,02 g 15 g 1L
PRODUCCIN DE PIGMENTOS PARA PSEUDOMONAS sp. Introduccin La capacidad para producir pigmentos como pioverdina (fluorescena) y piocianina es una caracterstica importante para la identificacin de especies de Pseudomonas. Algunas de ellas elaboran slo fluorescena (ej. Ps. fluorescens) y otras ambos pigmentos (ej. Ps. aeruginosa). La piocianina solamente es producida por Ps. aeruginosa aunque no todas las cepas de esta especie
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la producen. Se han diseado medios de cultivo que potencian la elaboracin de uno de los pigmentos e inhiben la formacin del otro. Principio El medio King A (o Pseudomonas Agar P) potencia la elaboracin de piocianina mientras que el King B (o Pseudomonas Agar F) potencia la elaboracin de fluorescena e inhibe parcialmente la de piocianina. Estos pigmentos son solubles en agua y difunden al medio. La piocianina es un pigmento azul-verde mientras que la fluorescena es amarillo-verdoso y fluoresce cuando es expuesto a la luz UV (=254 nm). Existen pigmentos amarillo-verdosos producidos por algunas especies de Pseudomonas que no fluorescen.
Medios y reactivos King A Peptona 20 g Glicerol 10 g K2SO4 10 g MgCl2 1,4 g Agar 15 g Agua c.s.p. 1 L
King B Proteosa Peptona Glicerol K2HPO4 MgSO4.7H2O Agar Agua c.s.p.
20 g 10 g 1,5 g 1,5 g 15 g 1L
Los medios se reparten en tubos, se esterilizan a 121C durante 15 minutos y se dejan solidificar inclinados.
Procedimiento Inocular los tubos por estras. Incubar a 35C durante 24 hs. Interpretacin Observacin de pigmento azul-verdoso en el medio King A: produccin de piocianina (King A +) Observacin al UV de pigmento fluorescente amarillo-verdoso en el medio King B: produccin de fluorescena (King B +) Controles Pseudomonas aeruginosa: King A + P. fluorescens: King A P. fluorescens: King B + P. stutzeri: King B -
COAGULASA Y FACTOR DE AGLUTINACION Introduccin La coagulasa es una enzima extracelular capaz de unirse a la protrombina para formar un complejo capaz de transformar el fibringeno en fibrina, provocando la formacin de un cogulo visible. Se cree que la coagulasa funciona in vivo, produciendo una barrera en el sitio de infeccin estafilocccica. En el laboratorio, la prueba de coagulasa se utiliza ms comnmente para diferenciar al Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) de otros Staphylococcus. Principio Para determinar la actividad de esta enzima extracelular se realiza una prueba en tubo comnmente llamada Coagulasa Libre en la que una suspensin de bacterias productoras de coagulasa al ser mezclada en partes iguales con plasma en un tubo de ensayo, origina un cogulo visible de manera similar a cuando se aade trombina.
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Existe un ensayo ms sencillo cuyos resultados tienen un alto porcentaje de concordancia (96%) con la determinacin de la coagulasa libre. Este ensayo se basa la determinacin del factor de aglutinacin, un determinante que se encuentra sobre la superficie celular y que es capaz de unirse al fibringeno. Por lo tanto si a una suspensin de bacterias que poseen este determinante en su superficie se las mezcla con fibringeno se observar un agregado de las bacterias. A este ensayo se le llama Test de Factor de Aglutinacin o Test de Coagulasa Fija, a pesar de que no se basa en la deteccin de esta enzima.
Medios y reactivos Liofilizado de Plasma citratado o plasma con EDTA para ensayo de coagulasa (Difco, o BBL) Agua estril o diluyente apropiado para reconstituir el reactivo de Plasma liofilizado Cultivo de Staphylococcus sp. de 24 h en un agar nutriente. Procedimientos Test de Factor de Aglutinacin (Prueba en un portabjetos): Colocar una gota de agua sobre un portaobjetos Emulsionar suavemente el organismo en estudio en la gota de agua de manera de obtener una suspensin cargada y homognea. En caso de que exista autoaglutinacin (se formen grumos que no se disgregan) NO puede usarse esta tcnica. Agregar una gota de plasma previamente reconstituido segn indicaciones del proveedor junto a la gota de la suspensin del m.o. Mezclar bien con el ansa. Inclinar el portaobjetos hacia uno y otro lado y observar la aparicin de grumos antes de los 10 segundos. Test de Coagulasa Libre (Prueba en tubo) Inocular una colonia en un tubo estril conteniendo 0.5mL de plasma de conejo Los tubos pueden mantenerse refrigerados durante 10 das o congelados por varios meses. Incubar los tubos a 35oC - 37oC hasta completar 24 horas. Examinar luego de 4 horas de incubacin, buscando la presencia de un cogulo que no puede suspenderse por agitacin. Si es negativo a las cuatro horas, volver a incubar hasta las 24 horas.
Interpretacin 1+: pequeos cogulos no organizados. 2+: pequeos cogulos organizados. 3+: gran cogulo organizado. 4+: todo el contenido aparece coagulado y se mantiene cuando se invierte el tubo. Se consideran positivos los grados 3+ y 4+ Controles Positivo: S.aureus Negativo: S.epidermidis:
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DNASA - DESOXIRRIBONUCLEASA Introduccin La actividad desoxirribonucleasa (DNAsa) se ha demostrado fundamentalmente en los gneros Staphylococcus y Serratia y consiste en la propiedad de degradar el ADN a fracciones de menor peso molecular. Esta caracterstica se ha utilizado para identificar las especies de Serratia marcescens y Staphylococcus aureus. Weckman y Catlin (Weckman B.G. y Catlin B.W., 1957, Journal of Bacteriology, 73: 747-753) demostraron la estrecha correlacin entre la produccin de DNAsa de los cultivos de Staphylococcus aureus con la produccin de coagulasa. Principio Los m.o. DNAsa positivos degradan el DNA cuando son incubados en un medio que lo contiene. Esto puede ser visualizado de diferentes maneras: ya sea inundando las placas crecidas con HCl 0,1 N y observando zonas transparentes alrededor de las estras o incorporando al medio indicadores como azul de toluidina o verde de metilo (viran a rosado cuando el test es positivo). Medios y reactivos DNAsa agar Triptosa ADN NaCl Agar Azul de toluidina* Agua c.s.p. * o verde de metilo
20 g 2g 5g 15 g 0,1 g 1L
Procedimiento Estriar la superficie de la placa e incubar a 35C durante 18-24 horas. Observar el viraje del indicador a rosado alrededor de las estras. Interpretacin Un resultado positivo est dado por el viraje del indicador en la zona de la estra a rosado. Controles Positivo: S.aureus y Serratia marcescens Negativo: S.epidermidis:
PRUEBA DE LA BILIS ESCULINA Introduccin La prueba de la bilis-esculina est basada en la capacidad de ciertas bacterias, particularmente los enterococos, de hidrolizar la esculina en presencia de bilis al 4%. La esculina es, qumicamente, un derivado de la cumarina (6-b-glucsido-7-hidroxicumarina), que por su estructura pertenece a los glucsidos. Por definicin, stos estn constitudos por dos restos unidos por un puente de oxgeno. En el caso de la esculina, uno de los restos es una glucosa y el otro la 7-hidroxicumarina (que no es un hidrato de carbono, y es denominado aglucona).
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Principio Las bacterias capaces de crecer en presencia de bilis a esa concentracin y tambin de hidrolizar esculina, producen glucosa y esculetina (7,7 dihidroxicumarina) y sta puede visualizarse en un medio con una sal de hierro, por formacin de un complejo marrn oscuro o negro. Algunos medios bilis-esculina incluyen tambin azida sdica para inhibir el desarrollo de organismos Gram negativos. Medios y reactivos Medio bilis-esculina Peptona Extracto de carne Bilis de buey Esculina Citrato frrico Agar Agua destilada
5g 3g 40 g 1g 0,5 g 15 g 1L
Procedimiento Se estra el organismo en estudio en placas o tubos en pico de flauta del medio bilis-esculina. Se incuba a 37C durante 24 horas. Interpretacin La esculetina difunde hacia el medio de agar por ser hidrosoluble. La reaccin es positiva si se observa un ennegrecimiento difuso del tubo o un halo marrn oscuro o negro alrededor de las colonias en placa. Controles Positivo: Enterococcus sp. Negativo: Streptococcus sp.
UREASA Introduccin La urea es una diamida del cido carbnico que puede ser hidrolizada con liberacin de amonaco y dixido de carbono.
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Principio La ureasa es una enzima que poseen muchas especies de m.o. que pueden hidrolizar urea de acuerdo a la siguiente reaccin qumica producindose alcalinizacin y aumento de pH del medio Urea + 2H2O CO2 + H2O + 2NH3
Medios y reactivos El caldo urea y agar urea de Christensen son los dos medios mas comnmente usados en los laboratorios para la deteccin de la ureasa de m.o. Caldo de Stuart Extracto de levadura Fosfato monopotsico Fosfato disdico Urea Rojo fenol Agua pH = 6,8 Agar urea de Christensen Peptona 1g Glucosa 1g Cloruro de sodio 5g Fosfato monopotsico 2 g Urea 20 g Rojo fenol 0,012 g Agar 15 g Agua 1L pH = 6,8 Procedimiento Inocular el caldo con una ansada cargada con el cultivo puro del m.o. o estriar la superficie del agar. Incubar a 35C durante 24 hs. Interpretacin Los m.o. que hidrolizan urea rpidamente pueden producir reacciones positivas en 1 a 3 hs. Las especies mas lentas pueden requerir 3 o mas das. Caldo: una coloracin rojiza indica alcalinazacin e hidrlisis de urea Agar: una coloracin rojiza en el medio indica hidrlisis de urea positiva. Los degradadores lentos producen coloracin parcial (generalmente el pico), los rpidos producen coloracin en todo el tubo. Si no hay hidrlisis el medio permanece con el colo original (amarillo) y se observa crecimiento. Controles Positivo: Proteus sp Negativo: Escherichia coli 0,1 g 9,1 g 9,5 g 20 g 0,01 g 1L
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PROBLEMAS DE DISCUSIN GENERALIDADES La identificacin de una cepa bacteriana requiere comparar las caractersticas de esa cepa con las caractersticas de las especies conocidas descritas. Esta descripcin se encuentra en el Bergeys Manual of Determinative Bacteriology. Las propiedades que usa para clasificar los procariotas en grandes grupos (secciones del Manual de Bergey) son las morfolgicas, el tipo de pared y la tolerancia al oxgeno. Esas son generalmente las caractersticas por donde se comienza la identificacin de una bacteria. Puede ocurrir que esta sea una nueva bacteria, en ese caso comparando con las ya descritas slo podremos decir que se parece mucho a una especie ya descrita pero que no pertenece a la misma. En la mayora de los anlisis de rutina en un laboratorio de microbiologa el problema que se presenta no es identificar una bacteria an no descrita, sino determinar si una cepa aislada pertenece o no a una especie de inters. El conocimiento de las propiedades de esa especie de inters se utiliza en el proceso de aislamiento para seleccionar especies con determinadas caractersticas. Por ej. si se quiere determinar si en una muestra de agua estn presentes estreptococos fecales (cocos Gram positivos anaerobios facultativos) utilizar medios y condiciones de incubacin tales que excluyan a otros grandes grupos de bacterias como los cocos Gram positivos anaerobios estrictos y durante su anlisis incubar aerbicamente. La informacin de la ecologa del m.o. aislado, es decir la muestra de la cual proviene, as como el proceso de aislamiento del mismo reducen considerablemente el espectro de especies posibles. Por ello, en el proceso de identificacin es posible que no necesite analizar todas las caractersticas que indica el Manual de Bergey. Otra razn por la cual el nmero de caractersticas a analizar puede reducirse es que en la mayora de los anlisis microbiolgicos se busca confirmar o descartar que la cepa aislada pertenece a una especie dada. Si la cepa no pertenece a la especie de inters, no es necesario identificarla. Por ej. si en una muestra dada para la cual se exige ausencia de Pseudomonas aeruginosa se aisla una bacteria que pertenece al gnero Pseudomonas pero no es de la especie P. aeruginosa, no es necesario determinar a que especie del gnero pertenece. Problema I (E.coli) Antecedentes Las bacterias de la especie Escherichia coli son bastones Gram negativos que no reducen sulfato cuyo hbitat natural es el intestino humano y de animales de sangre caliente. Las cepas de E. coli generalmente no son patgenas, sino indicadores de contaminacin fecal. Su presencia en una muestra implica que otros m.o. de origen fecal, incluyendo patgenos, pueden estar presentes en la misma. Slo algunas cepas de E.coli son agentes etiolgicos de infecciones gastrointestinales. Estas cepas patgenas entricas se diferencian entre si y de las no patgenas por su biotipo, generalmente asociado a la presencia de plsmidos. En los procedimientos de rutina de anlisis de especialidades farmacuticas y de alimentos se determina la presencia o el nmero de bacterias de la especie E.coli pero no se determina si esas cepas son potenciales patgenos entricos. Cuando hay sospecha de presencia de E.coli patgena se realiza una serotipificacin de un nmero determinado de cepas aisladas y/o se envan a Centros de referencia. La contaminacin fecal puede originarse en las materias primas utilizadas en la elaboracin de un producto o por contaminacin durante o posteriormente al proceso de elaboracin. El nmero de bacterias generalmente depende del tipo de producto y proceso y determina el procedimiento que se realizar para aislar bacterias que pertenezcan a la especie E.coli. El otro factor que determina el procedimiento de aislamiento es la flora acompaante: la proporcin relativa de E.coli a las dems bacterias presentes y las propiedades fisiolgicas de esas otras bacterias. En muestras que se preparan a partir de materias primas que no deben tener contaminacin fecal (como medicamentos preparados a partir de materias primas sintticas) o en muestras en las cuales despus de su preparacin se ha realizado un proceso para disminuir la carga bacteriana (alimentos pasteurizados) se podra esperar un nmero muy bajo de E.coli. En esas muestras se
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realiza un procedimiento de bsqueda, en el cual por siembra en medios de enriquecimiento se aumenta el nmero de bacterias para despus realizar su aislamiento e identificacin. En muestras de origen natural (generalmente materias primas de origen natural como leche no pasteurizada, aguas presumiblemente contaminadas) se podra esperar un nmero mas alto de estas bacterias. En ese caso no se realiza la etapa de enriquecimiento sino que directamente se cuenta el nmero de estas bacterias empleando un mtodo de recuento de bacterias viables en un medio selectivo para E.coli. En ambos casos la etapa siguiente es determinar si las colonias aisladas pertenecen o no a la especie E.coli. Los procedimientos oficiales para su deteccin en alimentos y medicamentos generalmente llegan a esta etapa despus del aislamiento en medios selectivos y diferenciales. Los medios selectivos mas comunes utilizan inhibidores para las bacterias de origen fecal que acompaan a E.coli (como enterococos) o para bacterias que no son de origen fecal. Los medios slidos generalmente contienen sales biliares y cristal violeta y los medios lquidos que se emplean para el recuento por nmero ms probable de coliformes en alimentos y agua (Caldo Lauril Sulfato, Caldo Lactosa Bilis Verde Brillante y caldo Escherichia coli) contienen lauril sulfato de sodio o sales biliares y verde brillante. Estos medios son generalmente diferenciales porque tienen adems lactosa - E.coli fermenta lactosa y glucosa- y un modo para detectar su fermentacin (indicadores de cambio de pH) o la produccin de gas en medio lquido (campanas de Durham). Las colonias aisladas en medios selectivos no necesariamente son cultivos puros debido a que el inhibidor del medio puede detener el crecimiento de los otros m.o. contaminantes sin eliminarlos. Se debe reaislar en un medio no selectivo para asegurarse de obtener un cultivo puro. En el reaislamiento se debe observar si hay colonias con una o varias morfologas y se debe proseguir el anlisis slo con las colonias con morfologa macro y microscpica caractersticas de la especie que se busca aislar. Problema En jarabes preparados a partir de extractos naturales de plantas la Farmacopea Europea exige ausencia de E.coli en 1 mL de jarabe. Para realizar dicho anlisis se realiza un enriquecimiento en caldo lactosa, se aislan colonias de dos tipos en medio Mac Conkey incubado entre 43-45C: 1) colonias rojas con halo de precipitacin alrededor, 2) colonias incoloras sin halo de precipitacin. Cules son las colonias que podran pertenecer a la especie E. coli? Ud. recibir un reaislamiento de una colonia sospechosa en medio Agar Lactosa Rojo Fenol. Cmo crecera una cepa de E. coli en ese medio? Que ensayos adicionales a la observacin de la colonia y de sus caractersticas en el medio de cultivo debe realizar en el momento para determinar si dicha colonia puede ser E. coli? Que otras propiedades puede deducir a partir de este crecimiento? De acuerdo a ellas, la cepa que tiene en ese reaislamiento podra pertenecer a la seccin en la cual el Manual de Bergey ubica a E.coli? En que Familia se ubica a E. coli? Que propiedades debera determinar para distinguir esa Familia de las otras de la misma seccin? En que caso puede afirmar que tiene un cultivo puro? Puede continuar con las etapas de identificacin? Si no puede, que procedimiento realizara? De acuerdo a la Farmacopea Europea, la cepa sospechosa que Ud. tiene hasta ahora (colonias tpicas en el medio selectivo) indica la presencia probable de E.coli. Para la confirmacin se recomienda el test para la produccin de indol y otras pruebas bioqumicas. En qu consiste la prueba de indol? Qu resultado espera para esta prueba si fuese E.coli? Utilice la tabla de pruebas bioqumicas para Enterobacterias resumida del Manual de Bergey. (recuerde que el nmero que aparece en la tabla es el % de cepas que dan un resultado positivo para ese test en el total de cepas analizadas) Podra perderse alguna cepa de E.coli si realizara slo esta prueba? Es decir una cepa que, siendo E.coli, no la puede identificar como tal porque la cepa da un resultado atpico en la produccin de indol.
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La recomendacin de la American Public Health Association (APHA) para el anlisis de alimentos incluye tres pruebas adems del indol: Rojo de Metilo, Voges Proskauer y Citrato. Las 4 pruebas se resumen en la sigla IMViC (Indol, Metilo, Voges, Citrato). Qu cree que se logra incluyendo mas pruebas bioqumicas? En qu consisten estas pruebas? Qu resultados espera para E.coli? Los manuales de mtodos del APHA dan por identificada una cepa como Ecoli si el resultado de las pruebas IMViC es ++-- (Indol y Rojo de Metilo positivos, VP y Citrato negativos) o si es -+--. Podra perderse una cepa de E.coli en este caso? Podra darse el caso al revs, es decir que identifique como E.coli una cepa que no es?
Problema II (Salmonella) Antecedentes Las bacterias del gnero Salmonella son bastones Gram negativos que no reducen sulfato cuyo habitat es el intestino humano y de animales. Aunque no todas las especies de Salmonella son igualmente patgenas, todas son importantes para la salud pblica, y por tanto el procedimiento de anlisis debe estar dirigido a recuperar cualquier especie que pertenezca a este gnero. En especialidades farmacuticas y alimentos a diferencia de muestras clnicas- se espera un nmero bajo de estas bacterias, que adems pueden estar fisiolgicamente daadas debido al procesamiento y almacenamiento de la muestra. Debido a ello en el anlisis de estas muestras se incluyen siempre etapas de enriquecimiento. El aislamiento generalmente se realiza en mas de un medio de cultivo (no todas las especies de Salmonella crecen en un solo tipo de medio slido). Los medios selectivos ms comunes utilizan inhibidores como el colorante verde brillante (inhibe Gram positivos) o sales biliares para bacterias que no son de origen fecal. Varios de estos medios son diferenciales porque tienen adems lactosa o xilosa y un modo para detectar su fermentacin (indicadores de cambio de pH) o lisina y la deteccin de la decarboxilacin. La etapa siguiente es determinar si las colonias aisladas pertenecen o no al gnero Salmonella. Las pruebas bioqumicas y la serologa se usan de rutina para la identificacin presuntiva en laboratorios de anlisis microbiolgico. La identificacin definitiva se realiza en centros de referencia por serologa. Recuerde que las colonias aisladas en medios selectivos no necesariamente son cultivos puros debido a que el inhibidor del medio no elimina los otros m.o. contaminantes. Se debe reaislar en un medio no selectivo para asegurarse de obtener un cultivo puro. En el reaislamiento se debe observar si hay colonias con una o varias morfologas y se debe proseguir el anlisis slo con las colonias con morfologa macro y microscpica caractersticas de la especie que se busca aislar. Problema En preparaciones farmacuticas que contienen plantas medicinales la Farmacopea Europea exige ausencia de Salmonella en 10 g de la preparacin. Para realizar dicho anlisis se realizan dos etapas de enriquecimiento: una en caldo lactosa y la siguiente en un caldo selectivo con tetrationato, bilis y verde brillante. A partir de all se aislan colonias en mas de un tipo de medio de cultivo selectivo: en uno de ellos, el Agar Verde Brillante (que tiene adems lactosa, sacarosa y rojo fenol), crecen dos tipos de colonias: 1) colonias que viran el medio a amarillo, 2) colonias incoloras que no viran el medio a su alrededor. Cules colonias podran pertenecer al gnero Salmonella? Ud. recibir un reaislamiento de una colonia sospechosa en medio Agar Lactosa Rojo Fenol. Cmo crecera una cepa de Salmonella en ese medio? Qu ensayos adicionales a la observacin de la colonia y de sus caractersticas en el medio de cultivo debe realizar en el momento para determinar si dicha colonia puede ser una especie de Salmonella? Qu otras propiedades puede deducir a partir de este crecimiento? De acuerdo a ellas, la cepa que tiene en ese reaislamiento podra pertenecer al grupo de bacterias en el cual el Manual de Bergey ubica a las especies de Salmonella? En qu Familia se ubica a las especies de Salmonella? Que propiedades debera determinar para distinguir esa Familia de las otras de la misma seccin?
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En qu caso puede afirmar que tiene un cultivo puro? Puede continuar con las etapas de identificacin? Si no puede, que procedimiento realizara? De acuerdo a la Farmacopea Europea, la cepa sospechosa que Ud. tiene hasta ahora (colonias tpicas en los medios selectivos) indica la presencia probable de bacterias del gnero Salmonella. La identificacin presuntiva se realiza con la prueba bioqumica llamada Tripe Sugar Iron (TSI). En que consiste esta prueba? Que resultados espera para las distintas especies del gnero Salmonella? Utilice la tabla de pruebas bioqumicas para Enterobacterias resumida. Podra perderse alguna cepa de Salmonella? Es decir una cepa que, siendo Salmonella sp., no la puede identificar como tal porque la cepa da un resultado atpico en esta prueba. La Farmacopea Europea recomienda la realizacin de otras pruebas bioqumicas y pruebas serolgicas para la identificacin definitiva. La recomendacin de la American Public Health Association (APHA) para el anlisis de alimentos sigue un procedimiento similar para enriquecimiento y aislamiento pero usa otras pruebas bioqumicas como la produccin de indol, y la descarboxilacin de lisina entre otras. Recuerde adems que, durante el aislamiento, se eligieron para la identificacin las cepas no fermentadoras de lactosa. Que cree que se logra incluyendo mas pruebas bioqumicas? En que consisten estas pruebas? Que resultados espera para las especies de Salmonella? Podra perderse alguna cepa de Salmonella en este caso? Podra darse el caso al revs, es decir que identifique como una especie del gnero Salmonella a una cepa que no lo es? Problema III (P. aeruginosa) Antecedentes En el curso de una investigacin epidemiolgica de varios casos de infeccin por Pseudomonas aeruginosa en una sala de atencin de quemados, se realizaron cultivos de los posibles fuentes o reservorios de la bacteria en el ambiente. Ud. recibir una placa de Agar Cetrimide sembrada con uno de los antispticos analizados, cultivada durante 24 horas a 37C, en aerobiosis. Se solicita que determine si el antisptico pudo ser el reservorio o fuente de la cepa de Pseudomonas aeruginosa que provoc los casos de infeccin. Qu tipo de medio de cultivo es el Agar Cetrimide? Las bacterias que crecen en l requieren factores de crecimiento? Requiere altas concentraciones de NaCl? A cul seccin del Manual Bergey corresponde la o las bacterias en estudio? Podra tratarse de una bacteria aerobia estricta? Como hara para confirmar que se trata de una bacteria aerobia estricta? Cul es el fundamento de los ensayos King A y King B? Si una cepa creciera en Agar Cetrimide con produccin de un pigmento difusible de color azul, realizara ambos ensayos? Es el antisptico analizado un posible reservorio de la cepa que caus las infecciones en los pacientes? El antisptico del cual se obtuvo este aislamiento fue una solucin de un compuesto de amonio cuaternario. Es posible suponer que fuera un reservorio para P. aeruginosa? Problema IV (S. aureus) Antecedentes Las bacterias pertenecientes a la especie Staphylococcus aureus son cocos Gram positivos, que pueden ser patgenos para el hombre. Las principales afecciones que producen son intoxicacin
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alimentaria, por produccin de una toxina termoresistente en alimentos, e infecciones de piel. Existen seres humanos que son portadores sanos de S. aureus, el cual se aloja en narinas y piel. A partir de esas fuentes, puede llegar a los alimentos donde su proliferacin constituye un riesgo potencial para la salud pblica por la posible produccin de enterotoxinas. Las siguientes situaciones llevan a analizar los alimentos para determinar la presencia o el nmero de clulas de S. aureus: A) confirmar si es el agente causal de una enfermedad alimentaria. B) determinar si un alimento o ingrediente es una fuente potencial de estafilococos enterotoxignicos C) demostrar contaminacin post-proceso, que generalmente se debe a contacto humano con alimentos procesados. Los alimentos que se sospecha fueron vectores de una toxiinfeccin alimentaria debida a S. aureus frecuentemente presentan altos nmeros de clulas del m.o.. En cambio, si se sospecha una contaminacin post proceso, puede esperarse una poblacin menor. En general S. aureus no es el nico m.o. presente en el alimento, por lo cual debe emplearse medios selectivos para su aislamiento y recuento. Las especialidades farmacuticas tambin se analizan para detectar S. aureus, debido a la posibilidad de causar infecciones en piel y mucosas. En este tipo de muestras, por lo general se exige ausencia de S. aureus en 1 g de producto. Los medios selectivos contienen inhibidores de otros m.o., de modo de impedir el desarrollo de otras especies. Los agentes selectivos ms comnmente usados en medios para S. aureus son NaCl (S. aureus puede crecer en presencia de concentraciones entre 5.5% y 10%) y telurito de potasio (K2TeO3, S. aureus reduce el telurito de potasio, produciendo colonias negras), y otros cloruro de litio, polimixina, azida de sodio y neomicina. Debe considerarse que el uso de los agentes selectivos no garantiza la completa inhibicin de otros m.o., como por ejemplo miembros de los gneros Bacillus, Micrococcus, Streptococcus y an levaduras. Por esta razn, la aparicin de colonias tpicas no es suficiente y debe confirmarse si dichas colonias tpicas desarrolladas en placas de medio selectivo verdaderamente pertenecen a la especie S. aureus. Problema Una familia presenta sntomas de toxiinfeccin alimentaria 2 a 4 horas despus de comer, con nusea, vmitos, diarrea y dolor abdominal. Esta sintomatologa puede deberse al desarrollo de elevados nmeros de S. aureus y formacin de toxina en el alimento ingerido. Se decide analizar una muestra remanente de queso artesanal que form parte de la comida, de modo de determinar si el m.o. responsable fue S. aureus. Qu mtodo puede usarse para aislar S. aureus de dicha muestra si el m.o. estuviera presente en nmeros altos? A Ud. se le entregar una placa de MSA proveniente de esta muestra. Considerando que las bacterias del genero Staphylococcus son fermentadoras de glucosa y manitol. Es posible afirmar que en la muestra haba S. aureus? Por qu? En caso de que haya que continuar el anlisis: cmo determinara si las colonias tpicas corresponden a S aureus o no? Qu morfologa y reaccin al Gram presenta el gnero Staphylococcus? Cmo se clasifican las bacterias de este gnero segn sus relaciones con el oxgeno? Cmo puede diferenciarse el gnero Staphylococcus de otros relacionados? (Deber recurrir a Tablas del Manual de Bergey que tendr para consulta en clase) Cmo puede diferenciarse S. aureus de otras especies del gnero Staphylococcus?
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DETERMINACIONES CUANTITATIVAS DE BIOMASA - RECUENTOS
Se propone la siguiente clasificacin:
1. Determinacin del nmero de microorganismos o recuentos Recuento en placa ya sea en superficie o incorporado Mtodo de las diluciones mltiples o del Nmero Ms Probable Filtracin por membrana e incubacin de sta sobre medio de cultivo slido Recuento microscpico directo de los microorganismos, ya sea en frotis o en cmaras Filtracin por membrana, coloracin del filtro, y conteo al microscopio. Conteo electrnico, usando contadores de partculas. 2. Determinacin de la masa celular Medida de la masa Medida del volumen Determinacin del contenido de N Turbidimetra Nefelometra 3. Determinacin de la actividad celular Determinacin de una actividad enzimtica Determinacin de un metabolito Medida del consumo de oxgeno Medida de ATP Calorimetra Medida de impedancia Radiometra (de CO2) Al momento de elegir la tcnica a emplear, se debe tener en cuenta el tipo de muestra sobre la que se va a trabajar, porque es posible que algunos de los mtodos no sean aplicables. Cuando es necesario llevar a cabo diluciones, la toma y preparacin de la muestra se realiza de la manera descrita en muestreo.
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DETERMINACIN DEL NMERO DE MICROORGANISMOS RECUENTO EN PLACA Permite determinar el nmero de m.o. presentes en una muestra en base a que se desarrollen en medio de cultivo, en placa, formando colonias. Por lo tanto se determinan por este mtodo slo las clulas microbianas VIABLES en las condiciones de trabajo (nutrientes, atmsfera, temperatura). Como las colonias pueden originarse tanto de una clula como de un grupo de clulas, se utiliza el trmino: UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (ufc) para expresar el resultado. Adems, a los efectos de que todas las clulas que estn en una placa tengan una adecuada disponibilidad de nutrientes, y que la incertidumbre del mtodo sea menor, se establece que las condiciones ptimas de recuento se dan cuando desarrollan entre 25 y 250 colonias por placa en medios no selectivos (otros autores indican 30 a 300) para recuento de bacterias y levaduras. Para hongos filamentosos se considera generalmente que el rango adecuado de colonias a contar est entre 5 a 50 ufc por placa dado que el tamao de una colonia filamentosa es muy superior al de la mayora de colonias de bacterias y levaduras. Si fuera posible y necesario se puede repetir el recuento para obtener placas con un nmero de colonias ptimas. Procedimiento La preparacin de la muestra se realiza como para cualquier mtodo utilizando diluyentes adecuados. Se preparan diluciones decimales sucesivas (relacin muestra/volumen de dilucin 1 en 10), partiendo en general de 10 g o mL de muestra en 90 mL de diluyente para la primera dilucin (1/10 o 10-1 o -1). Para la segunda dilucin (1/100 o 10-2 o-2) se toma 1 mL de la dilucin 10-1 y se descarga en 9 mL de diluyente y as sucesivamente. Se descarta la pipeta luego de cada descarga y se toma una nueva para preparar la siguiente dilucin. Cada vez que se prepara una dilucin en necesario homogeneizarla adecuadamente para lograr una distribucin de los m.o. en todo el volumen de dilucin. Esto se logra por agitacin (si es un frasco con tapn hermtico se realiza con agitacin formando un arco de aprox. 30 cm mediante un movimiento de inversin durante 25 veces, si es un tubo puede emplearse con Vortex). Tambin puede cargarse y descargarse un determinado volumen de la dilucin con una nueva pipeta (al menos tres veces), y finalmente tomar el volumen deseado. Segn la carga esperada, o permitida, se eligen las diluciones a sembrar. Cuando se esperan cargas altas, se siembran no menos de tres diluciones consecutivas Ej.: 1:10 (10-1 o -1), 1:100 (10-2 o -2), 1:1000 (10-3 o -3). Una vez preparadas las diluciones, se siembra dentro de los 15 minutos siguientes. ANTES DE PROCEDER A LA SIEMBRA SE ROTULAN LAS PLACAS CON LOS SIGUIENTES DATOS: Identificacin de la muestra: Nombre y/o cdigo Dilucin, Volumen sembrado Superficie o incorporado Fecha Operador Siembra incorporada Se procede de la dilucin mayor a la menor, y se deposita 1 mL de cada dilucin en placas estriles, vacas, por duplicado. Posteriormente, se agrega a cada placa 15 a 20 mL del medio de cultivo a emplear, previamente fundido y termostatizado a 45C en bao o estufa cuidando de no volcar agar fuera de la placa o sobre la tapa de la misma. Se agita suavemente moviendo la placa tapada sobre la superficie de la mesa con movimiento circular, horario y antihorario y hacia delante y atrs.
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En algunas situaciones puede sembrarse un volumen diferente, en general no ms de 3 mL por placa.
Siembra en superficie Se deposita en la superficie de las placas que ya contienen el medio de cultivo, 0.1 mL de cada dilucin. Se realiza duplicado para cada dilucin. Se puede emplear la misma pipeta para todas las diluciones si se comienza por la ms diluida. Luego de realizada la descarga de la muestra, se procede a extenderla sobre toda la superficie de las placas para que se absorba, usando rastrillo estril. 10 mL g 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
MUESTRA
10-1
10-2 9 mL
10-3 9 mL
10-4 9 mL 0,1 mL
10-5 9 mL 0,1 mL
90 mL
0,1 mL
10-4
10-5
10-6
Medio de cultivo Se elige segn el tipo de microorganismo que se quiere contar pudiendo emplearse medios selectivos o no selectivos. Incubacin Una vez enfriado el agar en el caso del recuento incorporado, y absorbida la muestra en el caso de recuento en superficie, las placas se invierten, y se ponen en la estufa que corresponde segn los microorganismos a contar, durante el tiempo propuesto en la tcnica correspondiente.
Interpretacin Finalizado el perodo de incubacin se observa con buena luz a efectos de visualizar las colonias puntiformes y diferenciar cualquier partcula de muestra que pueda haber. Si molesta borrar la escritura. Contar las colonias desarrolladas por placa. Se cuentan como colonias individuales, todas aquellas que disten de las colonias prximas una distancia al menos igual al dimetro de la colonia ms pequea. Cuando se utilizan medios NO SELECTIVOS se procede de la siguiente forma (para otros casos se sugiere consultar Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 1992, 3rd Ed): 1) Placas que tengan entre 25 y 250 colonias Se hace el clculo multiplicando por la inversa de la dilucin y por la inversa del volumen sembrado y luego se promedian si corresponde- los valores de las distintas placas y
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diluciones. Si slo una de las placas de los duplicados contiene 25 a 250 colonias contar igualmente ambas placas y promediar SI ES POSIBLE CONSIDERAR SOLAMENTE ESTAS PLACAS PARA INFORMAR EL RECUENTO. 2) Ninguna placa con 25 a 250 colonias Sin ninguna de las placas contienen 25 a 250 colonias seleccionar las placas que contengan el nmero de colonias mas cercano a 250, contar, hacer el clculo e informar el resultado como ESTIMADO 3) Todas las placas con menos de 25 colonias Se hace el clculo multiplicando por la inversa de la dilucin y por la inversa del volumen sembrado y se informa igualmente el resultado como ESTIMADO.. Si no hubiera colonias en ninguna de las placas, se informa como: Menor que 1 o 10 (segn sea incorporado en superficie) por la inversa de la dilucin menor. 4) Todas las placas con ms de 250 colonias Si no es posible distinguir colonias individuales (crecimiento confluente) se puede informar el resultado como mayor de 250 por la inversa de la dilucin mayor y del volumen sembrado. Si es posible distinguir colonias individuales se cuentan las colonias en una superficie conocida de la placa y luego se extrapola a la superficie total de la placa: 65 cm2 para las de vidrio comunes, o 57 cm2 para las de plstico y se informa el resultado como ESTIMADO. Se siguen las siguientes reglas: Si hay menos de 10 colonias por cm2, se cuentan 12 cuadrados de 1 cm de lado: 6 consecutivos horizontales y 6 consecutivos verticales. Se promedia el nmero de colonias contadas y segn el tipo de placa se multiplica por 65 o 56 para el resultado de toda la placa. Si hay ms de 10 colonias por cm2, se cuentan 4 cuadrados de 1 cm de lado, y el promedio se multiplica por 65 o 56 segn el tipo de placa. Si hay ms de 100 colonias en 1 cm2, no se cuentan sino que se estima el resultado como mayor de 6500 o 5600 por placa. Una vez estimado el nmero de colonias por placa, se aplica el factor de conversin para expresar el resultado por gramo o mL de muestra, de acuerdo al mtodo (incorporado o superficie), y a las diluciones sembradas. SPREADERS O COLONIAS EXTENDIDAS Hay tres tipo de spreaders: a) cadena de colonias que no pueden distinguirse separadamente y que pueden haberse originado a partir de la desintegracin de un acumulo de bacterias, b) los que se desarrollan en un film de agua que se forma entre el fondo de la placa y el agar y c) los que se desarrollan en el film de agua que se forma en el borde o sobre la superficie del agar. Estos dos ltimos tipos se originan debido a la humedad acumulada en el lugar donde se origin la colonia y probablemente representa el crecimiento a partir de una sola clula. Cuando el spreader cubre ms del 50% de la placa, sta no debe contarse. Cuando el spreader cubre una superficie menor del 50%, se cuentan las colonias en el resto de la placa, SOLO si estn uniformemente distribuidas, se calcula el recuento por cm2, luego se extrapola al resto de la placa multiplicando por 65 o 56 y se expresa el resultado como ESTIMADO. Si en todas las placas hay spreaders se informa: Spreaders Todas las situaciones en las que no se pueda informar el recuento por no caer en los casos anteriores, (ej.: contaminacin, mal funcionamiento del medio), se informa como: "Accidente de laboratorio" Cuando se emplean medios SELECTIVOS, el nmero de colonias que se considera ptimo para contar, suele ser menor de 250, es necesario referirse a la tcnica correspondiente (de referencia) a los efectos de la interpretacin de los resultados.
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Expresin de los resultados: Se informan los resultados de recuento con slo DOS CIFRAS SIGNIFICATIVAS, redondeando los valores cuando corresponda. Redondear la segunda cifra significativa a la inmediata superior si la tercera cifra es 6 ,7, 8 o 9. Redondear la segunda cifra significativa a la inmediata inferior si la tercera cifra es 1, 2, 3 y 4. Si la tercera cifra es 5 redondear hacia arriba si la segunda cifra es impar y hacia abajo si es par Ej.: 137 se informa 140 1,4 x 102 145000 se informa 1,4 x 105 En el informe de un recuento en placa se expresa: Recuento de ..............(tipo de microorganismo) = X u.f.c. /g o mL o Recuento estimado de ..............(tipo de microorganismo )= X u.f.c. /g o mL.
Ejemplos de clculo de resultados de recuento cuando se siembran dos placas por dilucin en placas de 9 cm.
N de colonias Muestra 10-2 228a 240 175 208 275 280 18 16 0 0 >250 >250 287 263 >250 >250 >250 >250 dilucin 10-3 28 26 16 17 25 35 2 0 0 0 >250 >250 23 19 7150b spreader 870c 830c Recuento (ufc/g o mL) Regla
A B C D E F G H I
a b c
2,5 x 104 1,9 x 104 3,0 x 104 1,7 x 103 estimado <100 > 2,5 x 105 estimado 2,8 x 104 estimado > 6,5 x 106 estimado 8,5 x 105 estimado
1 1 1 3 3 4 2 4 4
se indican subrayados los datos que se utilizaron para informar el recuento. estimado por el mtodo de los cuadrados; se contaron ms de 100 colonias por cm . estimado por el mtodo de los cuadrados (entre 10 y 100 colonias por cm ).
2 2
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VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE AMBOS MTODOS Incorporado Mayor cantidad de muestra. Menor error Mejor aprovechamiento de nutrientes Dificultades al subcultivar colonias Visualizacin de colonias dificultosa Superficie Menor cantidad de muestra Mayor error Peor aprovechamiento de nutrientes Facilidad para subcultivar colonias Fcil visualizacin de colonias
Temperatura del agar puede afectar la No se afectan los m.o. termosensibles viabilidad de algunos m.o. Se desarrollan m.o. microaerofilicos En aerobiosis slo crecen aerobios y anaerobios facultativos
NUMERO MAS PROBABLE (NMP) O METODO DE LOS TUBOS MULTIPLES Es un mtodo de recuento de microorganismos viables. El fundamento de este mtodo es inocular tubos de medios lquidos apropiados con diluciones seriadas de la muestra tales que para alguna de esas diluciones en los inculos no se lleven clulas viables. De esta forma una vez incubados los tubos se obtendr crecimiento para alguna de las diluciones mientras que no lo habr para otras. Ese patrn de crecimiento y no crecimiento permite estimar la poblacin microbiana presente en la muestra. Los resultados son interpretados en base a una distribucin de Poisson y se emplean tablas ya preparadas. Las tablas estn construdas para ciertas condiciones (siembras por triplicado o quintuplicado de cada una de tres diluciones seriadas al dcimo) y dan para cada conjunto de resultados positivos un ndice de NMP as como los valores para los intervalos de confianza del 95%. As, por ejemplo si se quiere usar la tabla III para series de tres tubos por dilucin sern necesarios un total de nueve tubos. Los medios lquidos a usarse dependen del tipo de m.o que se desea contar pudiendo ser selectivos o nutrientes. En funcin de sto se pueden considerar como positivos aquellos tubos en los que: 1) Haya crecimiento, que se detecta como aparicin de turbidez (siempre que la muestra sembrada no enturbie el medio). 2) Se detecten productos del metabolismo del m.o.: a) produccin de gas, que se observa en un pequeo tubo invertido (campana de Durham) en el tubo. c) viraje de indicador (de pH, de potencial redox, etc). d) produccin de pigmento. e) otros (reduccin de NO3-, produccin de indol, hidrlisis de una protena, etc) Ocasionalmente, es necesario subcultivar cada uno de los tubos positivos, o presuntamente positivos a otro tubo (con el mismo u otro medio) o a una placa a efectos de confirmar el resultado. Los resultados se expresan como NMP de ....... (tipo de m.o.) / cantidad (g mL) Este mtodo es especialmente til para determinar cargas microbianas bajas, el lmite de deteccin en las condiciones de la Tabla IV es <2/100 mL, pero puede igualmente emplearse para cargas mayores utilizando diluciones apropiadas. Ejemplo de siembra: Se quiere hacer un recuento de microorganismos mesfilos por tcnica de NMP con series de tres tubos. La muestra es lquida y se supone tiene una carga de 100 m.o..
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mesfilos/ml. El medio a usar es TSB y las condiciones de incubacin sern a 35C durante 24 a 48 horas. La siembra se puede realizar de la siguiente forma: - opcin 1: 10 mL de la dilucin 10 -2 en la primer serie de tubos (medio formulado al doble de concentracin), 1 mL de la dilucin 10 dilucin 10 -2 en la tercer serie de tubos. -2
en la segunda serie de tubos y 0,1 mL de la

-2
opcin 2: 1 mL de la dilucin 10 -1 en la primer serie de tubos, 1 mL de la dilucin 10 en la segunda serie de tubos y 1 mL de la dilucin 10 -3 en la tercer serie de tubos. Con cualquiera de estas opciones se estn colocando 10 mo en la primer serie de tubos, 1 mo en la segunda y probablemente ninguno en la tercera. Nota: los volmenes posibles de ser usados en esta tcnica para inocular los tubos son 10, 1 0,1 ml. En el caso de usarse 10 ml los medios deben ser de doble concentracin.
Ejemplos de interpretacin y expresin de resultados Ejemplo 1: N de tubos sembrados: Volumen por tubo (mL) Dilucin de la muestra: N Tubos positivos 3 1 10-2 3 3 1 10-3 1 3 1 10-4 0
El resultado 3-1-0 se busca en tabla y se obtiene un valor de 43/100 mL. Como la Tabla III est construda inoculando con 10 mL la primer serie de tubos, 1mL para la segunda y 0,1 mL para la tercera se debe corregir el valor ya que no estamos en las mismas condiciones. En este caso estamos sembrando mil veces menos en la primera serie de tubos (1 mL de 10 -2 , equivalente a 10 mL de la dilucin 10 -3), por lo tanto el factor a utilizar es 1000 y se debe multiplicar el valor obtenido de la tabla. El resultado a informar es entonces: NMP de (tipo de m.o) = 430/mL. 10 mL g
1 mL
1 mL
1 mL
MUESTRA
10
-1
10
-2
10
-3
10
-4
9 mL 1 mL
9 mL
9 mL 1 mL 1 mL
90 mL
EQUIVALENTE A:
0,01mL muestra + + +
0,001mL muestra +
0,0001mL muestra
Lectura de los tubos:
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Una manera general de calcular el resultado es multiplicar el valor de tablas por el inverso de la dilucin sembrada en la serie del medio si con ella se us 1mL para inocular los tubos. Ej:
3 1 0 en Tabla III
43/ 100 mL
NMP de tipo de m.o/ 100 mL = 43 x 1/dilucin de la serie del medio = 43 x 1/10-3 = 430/mL 4,3 x 102/mL 100 100
Ejemplo 2: N de tubos sembrados: 5 5 5 Volumen de muestra en c/u (mL): 10 1 0,1 Dilucin de la muestra: 10-1 10-1 10-1 N Nmero de tubos positivos: 2 0 0 (dos tubos positivos para la primera dilucin, ninguno en las siguientes) De la tabla IV surge el valor: 5/100 mL. Como la siembra no esta realizada en las condiciones de la tabla debe aplicarse un factor de correccin. El resultado final se informa: NMP de ...... (tipo de m.o):= 5 x 1/10-1= 50/100 mL 0,5/mL 100 Si la muestra es agua es habitual informar el resultado por 100 mL. Es de fundamental importancia antes de leer la tabla, asegurarse que est construida para condiciones similares a las de trabajo, que sea para igual nmero de tubos por serie, y para cantidades de muestra que sean mltiplo o submltiplo ya que hay variedad de tablas segn el nmero de tubos y diluciones a sembrar. La correccin se hace utilizando proporcionalidad inversa. Dado que la distribucin de las clulas obedece una distribucin de Poisson puede calcularse el nmero de clulas promedio de la dilucin sembrada cuando no se trabaja en las condiciones ms comunes para las que existen tablas, usando la siguiente ecuacin: NMP/g o mL = ___________N de tubos positivos____________________ (mL o g de muestra en tubos negativos X mL o g de muestra) en todos los tubos
VENTAJAS Y DESVENTAJAS DEL MTODO: Este mtodo es especialmente til para determinar cargas microbianas bajas, el lmite de deteccin en las condiciones de la Tabla IV es <2/100 mL, pero puede igualmente emplearse para cargas mayores utilizando las diluciones apropiadas... Para slidos como no puede ponerse 10 g en la primer serie de tubos y se deben colocar 10 mL de la -1, el lmite de deteccin resulta 10 veces mayor que para los liquidos. (<20/ 100g) Asimismo, es el nico mtodo a utilizar en el caso de muestras como por ejemplo polvos insolubles, en los que no es aplicable el mtodo de filtracin ni es recomendable el recuento en placa debido a la presencia de partculas.
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Se prefiere tambin este mtodo cuando los m.o. son de lento crecimiento, cuando han sido sometidos a condiciones adversas (temperatura alta, desecacin, etc.) o para los que no crecen en medio slido. Es posible enumerar tambin por este mtodo m.o. anaerobios utilizando en los tubos medio prerreducido, que se tapan con vaselina-parafina luego de inocular, e incuban en condiciones aerobias. Desventajas: Debido a que este mtodo es menos preciso (se obtiene una estimacin de la carga microbiana) no es el de eleccin en caso de poder emplearse recuento en placa o filtracin por membrana.
FILTRACION POR MEMBRANA Este mtodo consiste en hacer pasar un volumen determinado de muestra lquida, o disuelta en agua o en un solvente apropiado (miristato de isopropilo) a travs de un filtro de membrana estril (dimetro 50 mm, poro 0.45 m), colocado en un equipo de filtracin. Luego de enjuagar con soluciones estriles apropiadas se retira el filtro, y se lo coloca sobre la superficie de un medio de cultivo slido dispensado en una placa de Petri y se incuba. Los filtros pueden ser de distintos materiales; en microbiologa generalmente se emplean filtros de nitrato o acetato de celulosa, y pueden tener bordes hidrofbicos, que minimizan la adsorcin de conservadores y antimicrobianos. Luego de transcurrido el tiempo de incubacin, se cuentan las colonias desarrolladas en el filtro. Se considera que las condiciones ptimas del mtodo se dan cuando desarrollan entre 20 y 200 colonias en el filtro. Se utilizan filtros reticulados, y existen reglas para el conteo: 1) Si hay 1 o 2 colonias por cuadrado del retculo, o menos, se cuentan todas. 2) Si hay entre 3 y 10 por cuadradito, se cuentan 10 cuadrados, y se promedia, multiplicando por 100 para obtener el nmero de colonias en el filtro (se multiplica por 100 porque el arrea del cuadrado representa la centsima parte del rea total del filtro). 3) Si hay entre 10 y 20 se cuentan 5 cuadrados y promedia, multiplicando luego por 100. 4) Si hay ms de 20 se considera >2000 por filtro Toda vez que se utilice el promedio por cuadrado, el recuento se informa como ESTIMADO. Ventajas y desventajas: Sirve para determinar cargas muy bajas, pues se puede filtrar volmenes de hasta 500 mL por vez. Es adems el mtodo de eleccin para muestras lquidas o solubles que contienen agentes antimicrobianos ya que no es necesario neutralizarlos. Expresin de los resultados: Una vez conocido el nmero de colonias por filtro, se expresa el valor en u.f.c. al igual que en el recuento en placa expresndolo por gramo, o mililitro de muestra.
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RECUENTO MICROSCOPICO DIRECTO Este mtodo permite determinar el nmero de clulas microbianas, por observacin a travs del microscopio. La muestra puede utilizarse tal cual, (leche, o cultivos puros en medio lquido), o puede prepararse una dilucin tal como se realiza para otros mtodos de recuento. Se basa en contar microorganismos en una cantidad conocida de muestra utilizando frotis coloreados, cmaras del tipo de las de contar glbulos, o las especialmente diseadas para contar hongos en alimentos como la cmara de Howard. Se determina el nmero TOTAL de clulas presentes (VIABLES Y NO VIABLES) Ocasionalmente se pueden utilizar colorantes que indiquen diferentes estados metablicos de las clulas. Por ejemplo en un recuento en cmara de un cultivo de levaduras con azul de metileno, se pueden distinguir las clulas VIABLES (no absorben el colorante, se vern transparentes) de las NO VIABLES (absorben el colorante y se vern azules). Recuento sobre frotis coloreado Se marca sobre un portaobjetos limpio y desengrasado, un cuadrado de 1 cm de lado. Sobre la superficie opuesta del portaobjetos, se deposita en el centro 0,01 mL de muestra ya sea con ansa calibrada o con pipeta. Se extiende por todo el cuadrado con ansa. Se deja secar en posicin horizontal. Se fija y colorea, ya sea por Gram o con azul de metileno 1 minuto (mtodo de Breed para leche). Se observa por inmersin, contando los microorganismos en cada uno de varios campos. El nmero de campos a contar depende del nmero de microorganismos por campo y del factor del microscopio. Se transcribe la tabla que se propone para el recuento directo en leche (Standard Methods for the Examination of Dairy Products APHA)
Nmero de campos a contar segn el factor del microscopio y el nmero de microorganismos:
Microorganismos por campo Menos de 1 1 a 10 Ms de 10
Factor del microscopio 300000 30 20 10 400000 40 20 10 500000 50 20 10 600000 60 30 20
Clculo del factor del microscopio Con objetivo de 40 x, o 100 x, se mide el radio del campo utilizando un portaobjetos calibrado, o el retculo de una cmara cuenta glbulos. Si se utiliza el de 40 x, luego debe hacerse la correccin utilizando el factor 40/100 para llevarlo al aumento de trabajo. Se calcula el rea del campo: r2 El nmero de campos por cm2 es: 1 / r2
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Si se extendi en 1 centmetro cuadrado 0,01 mL de muestra, el nmero de campos por mililitro, llamado Factor del Microscopio (FM), se calcula de la siguiente forma: FM = 100 / r2 donde r se expresa en cm, o FM = 10000/ r2 con r en mm. Expresin de resultados Una vez contado el nmero de microorganismos en los campos que corresponde, se promedia, y multiplica por el Factor del microscopio; de esa forma se obtiene el resultado que se expresa en trminos de: Recuento microscpico directo = N microorganismos por mL Recuento en cmara de Neubauer Es una cmara que se utiliza para contar glbulos (En E se cuentan eritrocitos y en L los leucocitos) y est diseada de manera de contener una cantidad fija de lquido. Consta de un cuadrado central de 1 mm de lado dividido en 25 cuadraditos. Cada uno de ellos est, a su vez, dividido en 16 cuadrados. Se coloca un cubreobjetos sobre la zona cuadriculada, apoyado sobre dos hombros laterales de manera que cuando hay un buen contacto entre ellos, queda una distancia de 0.1 mm entre el cubreobjetos y la cmara. Esto determina que el lquido quede contenido en un volumen de 0.1 mm3. Ventajas del mtodo: Es rpido Los frotis se pueden guardar Las exigencias de equipo son mnimas Se pueden observar las diferentes morfologas de los microorganismos. Se observan tanto los microorganismos viables como los no viables Desventajas del mtodo: La cantidad de muestra analizada es poca Provoca cansancio del operador Slo sirve para muestras con cargas superiores a 10.000 por mL. Es difcil distinguir los microorganismos de las partculas de muestra Una inadecuada distribucin de la muestra sobre la superficie del portaobjetos puede ocasionar serios errores.
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DETERMINACIN DE LA MASA CELULAR TURBIDIMETRA Este mtodo da informacin sobre el contenido de macromolculas, y no sobre el nmero de clulas. En el laboratorio de microbiologa se usa un colormetro, o un espectrofotmetro y se mide la absorbancia de la suspensin de microorganismos en comparacin con un blanco que es el medio esterilizado, y sin sembrar. Cuanto mayor es el nmero de clulas en suspensin, tanto menor es el porcentaje de luz que atraviesa el medio. Se cumple una ley similar a la de Lambert-Beer y expresando la relacin en trminos de masa microbiana y absorbancia, la ecuacin es la siguiente: A= k x W donde: Absorbancia k: constante W: masa celular La grfica correspondiente construida con valores reales muestra una desviacin a medida que aumenta la masa microbiana. A
Para utilizar la medida de la absorbancia como mtodo de recuento, es necesario hacer para cada microorganismo una curva de calibracin, midiendo el nmero de microorganismos por otro mtodo de recuento. El mtodo se emplea fundamentalmente para preparar inculos, cuando se trabaja con cultivos puros.
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Escala de Mac Farland Existe la posibilidad de estimar cargas altas de microorganismos, comparando a simple vista con una escala formada por tubos numerados de 1 a 10 y elaborada con diferentes cantidades de sulfato de bario. Se conoce la cantidad aproximada de clulas bacterianas a que corresponde cada tubo, y de esa forma se puede estimar la cantidad de microorganismos presentes. Este mtodo slo da una estimacin del nmero de m.o. (viables y no viables) y sirve slo para cargas altas. Por otra parte, es muy rpido. Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Millones de bacterias/ mL 300 600 900 1.200 1.500 1.800 2.100 2.400 2.700 3.000
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ALGUNAS APLICACIONES DE RECUENTOS
Microorganismos indicadores Los mtodos usados para el aislamiento y el recuento de los microorganismos patgenos en agua, alimentos, etc. pueden no ser eficaces debido a que dichos microorganismos se encuentran en muy baja cantidad, sobre todo en presencia de nmeros altos de otros microorganismos, o que tengan una distribucin irregular en el producto. An cuando se cuenta con mtodos sensibles, en general son largos y costosos; adems, hay patgenos que no pueden determinarse en laboratorios no especializados, como, por ejemplo, el virus de la hepatitis A. Estas dificultades han hecho que se utilicen grupos de microorganismos de deteccin y enumeracin ms fciles y cuya presencia en cierto nmero se considera como una indicacin de que la muestra estuvo expuesta a condiciones que pudieron determinar la llegada a la misma de microorganismos peligrosos y/o permitir la proliferacin de especies patgenas. Estos grupos de microorganismos se denominan indicadores. Se usan como microorganismos indicadores aquellos cuya relacin con los patgenos ha sido estudiada. Los indicadores ms frecuentes son: - mesfilos aerobios totales o hetertrofos - Enterobacterias - Coliformes totales y fecales - Estreptococos fecales - Enterococos - Clostridios sulfito-reductores
AGUA El anlisis microbiolgico de muestras de agua tiende a determinar la calidad sanitaria de stas y su aptitud para distintos usos. En general, los mtodos utilizados estn diseados de modo de detectar el grado de contaminacin del agua con desechos de origen humano y/o animal. Tradicionalmente se han usado ensayos para la determinacin de microorganismos indicadores ms que para la determinacin de patgenos. El grupo de bacterias coliformes ha sido siempre el principal indicador de calidad de los distintos tipos de agua; el nmero de coliformes en una muestra se usa como criterio de contaminacin y por lo tanto, de calidad sanitaria de la misma. Los coliformes son bastones Gram (-), aerobios o anaerobios facultativos que fermentan la lactosa con formacin de gas cuando se incuban 48 horas a 35C. Incluye los gneros Escherichia, Enterobacter, Klebsiella y especies lactosa positivas de otros gneros. Tambin interesa la determinacin de coliformes fecales que representan la fraccin de coliformes, en general, de intestinos y materias fecales de hombre y animales de sangre caliente (coliformes termotolerantes). Esto provee informacin importante sobre la fuente y el tipo de contaminacin presente. Un mtodo muy utilizado para el recuento de coliformes en agua ha sido siempre el NMP, pero han ido variando los medios de cultivo, las condiciones y las tcnicas de manera de obtener cada vez mayor sensibilidad y precisin hasta hacerlo aceptable como mtodo standard. Los distintos mtodos de NMP para coliformes totales se basan, en primera instancia, en una seleccin de los microorganismos que producen cido y gas de lactosa a 35C. Por ello, el primer paso es siempre
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la siembra en tubos de algn caldo lactosado, con o sin inhibidores, con tubo de fermentacin para recoger el gas que pueda producirse. A esto sigue una confirmacin en un medio lquido selectivo y/o una determinacin de los coliformes fecales cuya diferenciacin se realiza en base al hecho de que pueda producir gas de lactosa en un medio apropiado cuando se incuba a 44,5C mientras que los dems coliformes no. Tambin es muy utilizado el mtodo de filtracin por membrana para el recuento de bacterias coliformes totales y fecales. Es un mtodo altamente reproducible, puede usarse para analizar volmenes de muestra relativamente grandes y se obtienen resultados en menor tiempo que con el NMP. Sin embargo, no puede aplicarse a cualquier tipo de muestra y tiene sus limitaciones. Tambin se encuentra entre los mtodos standard. A los efectos de la filtracin por membrana debe replantearse la definicin de coliformes: bastones Gram (-), aerobios o anaerobios facultativos, que dan colonias oscuras con brillo metlico en medio Endo, luego de 24 hs. de incubacin a 35C. La determinacin de coliformes fecales por filtracin puede hacerse a partir de las colonias desarrolladas en Endo o directamente incubando la membrana en medio m-FC e incubando a 44,5C. Para la deteccin simultnea de coliformes totales y Escherichia coli se puede utilizar la prueba de sustrato enzimtico. En este caso el grupo de coliformes totales se define incluyendo todas las bacterias que presentan la enzima beta-D-galactosidasa, que hidroliza el sustrato cromognico (por ejemplo, ONPG) liberando el cromgeno. Como E. coli se incluyen todas las bacterias que dan positiva la reaccin de coliformes totales y que tienen actividad beta-glucuronidasa, que rompe el sustrato fluorognico (por ejemplo, MUG) que se revela al UV. Este mtodo permite llevar a cabo tanto recuentos como ensayos de ausencia/presencia. Tambin se usa como indicador de contaminacin fecal el grupo Estreptococos fecales que incluyen especies de Estreptococos grupo D de Lancefield (Enterococcus faecalis, E. faecium, Streptococcus equinus, S. bovis) y algunas subespecies y una especie del grupo Q (Streptococcus avium). El grupo Enterococos estara includo dentro de estreptococos fecales y comprende las especies Enterococcus faecalis y E. faecium y sus subespecies (origen humano) y tambin se usa como indicador de contaminacin fecal en agua. El hbitat normal de los estreptococos fecales es el intestino del hombre y los animales de sangre caliente, por lo tanto son indicadores de contaminacin fecal, sobre todo en muestras de lagos, estuarios, ros, etc. La identificacin de las especies puede proporcionar informacin sobre la fuente de contaminacin debido a que algunas especies son especficas de sus huspedes; por ejemplo, una predominancia de S. bovis o S.equinum indicara una contaminacin por heces no humanas. La informacin de los estreptococos fecales es til si se acompaa del ndice de coliformes fecales. Existen distintos mtodos estndar para su estimacin: - NMP - Filtracin por membrana El recuento de hetertrofos totales consiste en un mtodo estandarizado para determinar la densidad de bacterias hetertrofas, mesfilas aerobias y anaerobias facultativas en el agua. As se obtiene informacin til que se estudia junto con el ndice de coliformes; tambin se le usa para controlar un proceso de tratamiento de agua o para verificar la calidad del agua tratada, luego de recorrer toda la red de distribucin. Tambin interesa estudiar la presencia o el recuento de Pseudomonas aeruginosa en distintos tipos de agua (potables, recreacionales, de industrias, etc.)
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Otro grupo de indicadores que ha comenzado a utilizarse en aguas lo constituyen los colifagos. Los colifagos son bacterifagos de coliformes que se encuentran siempre que haya coliformes totales y fecales. De acuerdo a estudios de correlacin entre nmero de colifagos y coliformes en agua, se podra utilizar el ndice de colifagos como ndice de calidad sanitaria de agua. Adems, como son ms resistentes a la cloracin que los coliformes, pueden ser mejores indicadores de desinfeccin que stos ltimos. El mtodo de enumeracin se basa en la formacin de playas de lisis. Los colifagos (bacterifagos) infectan y se multiplican en bacterias sensibles a ellos. Esto provoca la lisis celular de esas bacterias y liberacin de partculas virales que infectarn a las clulas bacterianas adyacentes. A medida que stas bacterias se vayan lisando, se formarn zonas claras, conocidas como playas de lisis, entre el crecimiento confluente de la bacteria utilizada. La cepa utilizada en los ensayos es una cepa de E. coli sensible a la infeccin por colifagos (ATCC 13706). La metodologa empleada est descripta en el Standards Methods for the examination of water and wastewater". BIBLIOGRAFA Los mtodos de referencia para los anlisis antedichos se pueden encontrar en: - "Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater", APHA-AWWA-WPCF, 20th Ed. Normas UNIT: 856-91, 857-91, 858-91, 893-91, 894-91, 942-93, 943-93. Normas ISO (varias) Las normas vigentes en nuestro pas respecto a la calidad microbiolgica de los diversos tipos de agua se pueden encontrar en: - Normas de calidad de agua potable... OSE - Reglamento Bromatolgico Nacional Ordenanza P.E. 315/94 - Ordenanza Bromatolgica Municipal ...................I.M.M (Decreto 27235) - Norma 833/90.......................UNIT - Decreto 253/79 (12/89)................Poder Ejecutivo - Decreto 16235 (1974)..................Junta de Vecinos de Montevideo
Para el anlisis de diferentes tipos de muestras, y los lmites aconsejados se puede consultar: -"Standard Methods for the examination of Dairy Products", APHA, 16 th Ed., 1992. -"Bacteriological Manual", Food and Drug Administration, 7thEd., 1992
-"Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists, 16th Ed., 1995. -"Microorganisms in foods 1 & 2" ICMSF. - USP 30. - Reglamento Bromatolgico Nacional - Normas UNIT (varias) - Ordenanza Bromatolgica Municipal (IMM) - Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 1992, 3rd Ed. - Farmacopea Europea (11111997) y suplementos - Normas ISO (varias)
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EJERCICIOS DE RECUENTOS 1) Se realiza un recuento en placa de una muestra slida por siembra incorporada de 0,5 mL en cada placa en VRBA de las diluciones que se indican. Se incuba 24 hs a 35 C. Se cuentan las colonias rojas desarrolladas. Informe claramente los recuentos para los siguientes resultados:
Muestra 1 2 3 4
Dilucin sembrada y nmero de ufc 10-2 0 190 > 250 5 10-3 0 28 114 0 10-4 0 0 9 0
2) Se realizaron recuentos por NMP en dos muestras de gelatina en caldo lauril triptosa. Se sembraron tres tubos por dilucin, (1 mL de dilucin por tubo) y se incub a 35C durante 48 horas. Cmo informara los recuentos si obtuvo los siguientes resultados?:
Muestra A B
Dilucin sembrada y tubos positivos 10-2 3/3 3/3 10-3 1/3 3/3 10-4 0/3 3/3
3) Disear un mtodo de recuento para cada uno de los siguientes casos: a) Determinar la aceptacin o rechazo de una muestra de carne a la que se le acepta un lmite de S aureus de 104 /g. b) Determinar la aceptacin o rechazo de una muestra de harina a la que se le exige menos de 100 microrganismos aerobios mesfilos por gramo.
4) En una muestra de almidn se exige una carga bacteriana menor de 105 /g. Cul de los siguientes mtodos utilizara para el anlisis y cules no? Fundamente su eleccin y disee el o los experimentos (diluciones a sembrar, medios, temperatura y tiempo de incubacin). Recuento en placa Recuento microscpico directo NMP Turbidimetra 5) Explique que mtodo (volmenes a sembrar, medios, temperatura y tiempo de incubacin) utilizara para hacer el recuento de coliformes en agua potable si la exigencia es de 0/100 mL.
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6) Se realiz el recuento en una muestra de agua de pozo por filtracin. Se filtraron 10mL de la dilucin 1/10 (-1), se coloc la membrana en una placa de TSA y se incub por 48hs, se contaron 30 colonias en la placa. Cmo se expresa el resultado?
7) Cmo informara el recuento por NMP de las siguientes muestras de agua con los siguientes resultados? Muestra 1. (se sembr 1 mL de cada dilucin se incubaron los tubos a 35C por 48 hs.) Medio CLT CLBVB (subcultivo) Dilucin sembrada y tubos positivos -1 3/3 1/3 -2 3/3 0/3 -3 2/3 0/3
Muestra 2. (se sembr 1 mL de cada dilucin se incubaron los tubos de CLT a 35C por 48 hs. y EC a 44,5 C por 24 hs.) Medio CLT EC (subcultivo) Dilucin sembrada y tubos positivos -2 2/3 0/3 -3 1/3 0/3 -4 0/3 0/3
8) Las normas vigentes para la calidad microbiolgica del pescado fresco indican: n= 5, c=3, m=106 M=107 Hetertrofos mesfilos. n= 5, c=3, m=104 M=106 Hetertrofos psicrfilos. n= 5, c=3, m=103 M=2x103 Staphylococcus aureus. n= 5, c=3, m=4 M=400 Coliformes fecales. Cmo hara cada recuento? Especificar el mtodo, las diluciones, medios de cultivo y temperatura de incubacin.
9) Las normas de calidad microbiolgica de un producto farmacutico lquido de uso oral indican: un lmite de 500 ufc/mL para bacterias hetertrofas. Se realiza el recuento del producto en TSA de dicho producto (que contiene parabenos) sembrando 1 mL (incorporado) de las diluciones que se indican y se obtienen los siguientes resultados: Dilucin sembrada y nmero de ufc 0 3 -1 40 -2 5
De acuerdo a estos resultados qu puede concluir?
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Se realiza la validacin del procedimiento expuesto en el ejercicio anterior. Para ello se prepara una suspensin de un cultivo de E. coli . Se realiza el recuento de esta suspensin de E. coli y se obtiene: Recuento en placa (TSA) en superficie (0,1mL) Dilucin sembrada y nmero de ufc -5 358 -6 70 -7 6
Para realizar la validacin, se inocula 1 mL de la dilucin 7 de la suspensin de E. coli preparada anteriormente y se agrega a cada una de las placas sembradas con las diluciones del producto lquido (0, -1 y -2) y se obtiene el siguiente resultado: Dilucin sembrada de producto (+ suspensin) y nmero de ufc 0 -1 -2 55 113 75
Se considera el mtodo validado? Qu recomendaciones hara para analizar esta muestra? Podra utilizar otro mtodo?.
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MUESTREO PARA ANALISIS MICROBIOLOGICO
La primera etapa del anlisis microbiolgico es la extraccin de la o las muestras de un lote y cualquier resultado carece de significado si la muestra no ha sido apropiadamente tomada. Es responsabilidad del laboratorio de control constatar que la muestra que se analizar es representativa del lote y rechazarla antes de realizar el anlisis si se tiene indicios de que no lo es. Generalmente en los textos especializados se describen los protocolos para el muestreo en las reas clnicas, de alimentos, de aguas y de medicamentos y es necesario referirse a ellos en primera instancia. Aqu sealaremos algunas consideraciones generales aplicables a las tres ltimas reas. El lote es el nmero de unidades o la cantidad de un producto que ha sido sometido a las mismas condiciones durante un proceso determinado. Esta es una consideracin terica puesto que es difcil asegurar la uniformidad durante la mayora de los procesos conocidos. Por ej. en una esterilizacin por vapor no todas las zonas del autoclave alcanzan la misma temperatura, sin embargo se considera que todos los recipientes sometidos a ese proceso en esa instancia constituyen un lote. Se considera que una muestra o un conjunto de muestras son representativas de un lote cuando reflejan, tanto como sea posible, la totalidad del lote. El resultado de la o las muestras luego de analizadas va a ser empleado -con cierto criterio- para adoptar una decisin respecto a si todo el lote va a ser rechazado o aceptado. La eleccin particular del procedimiento de muestreo, el numero de muestras a analizar de un lote y el criterio de decisin se denomina PLAN DE MUESTREO. Un plan de muestreo por atributos adecuado para alimentos puede ser de dos clases (la decisin de aceptar o rechazar el lote se basa en dos nmeros n y c) tres clases (se acepta o rechaza el lote en base a una decisin secuencial y se clasifica la calidad del lote en tres clases basados en dos niveles m y M: aceptable, marginal y no aceptable). En el Cuadro I figuran las definiciones para los Planes de Muestreo por Atributos. Cuadro I: Definiciones para los Planes de Muestreo por atributos n = nmero de unidades de muestra a analizar c = mximo nmero permitido de muestras que dan un resultado insatisfactorio m = lmite inferior M = lmite superior
Por ej. en un plan de dos clases, si para la bsqueda de Salmonella n = 10 y c = 0, significa que se deben analizar individualmente 10 muestras y ninguna de ellas puede dar como resultado presencia de Salmonella sp. En cambio si para un alimento se exige NMP de coliformes < 100/g, con n = 10 y c = 2, significa que el lote solo puede aceptarse si 2 o menos muestras dan un resultado < 100/g. En cambio en un plan de tres clases para un alimento, el recuento de S. aureus indica n = 5, c =2, m = 102/g y M =104/g, significa que ninguna de las muestras puede tener un recuento > 104/g y que como mximo dos muestras de las cinco analizadas pueden tener un recuento > 102/g.
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Para determinar que la muestra es representativa y que no se ha alterado despus de la extraccin deben tenerse en cuenta las etapas de: recoleccin, transporte y preparacin para el anlisis propiamente dicho. 1) Recoleccin. Los planes de muestreo determinan el nmero, tamao y zonas de recoleccin de la muestra. Se disean por criterios estadsticos teniendo en cuenta adems algunas caractersticas del producto tales como: - riesgo potencial para el consumidor, si el riesgo es alto se aumentar el nmero de muestras para disminuir la probabilidad de que llegue al consumidor una muestra contaminada - facilidad de homogeneizar el lote. Si la produccin es en batch y el producto es fcilmente mezclable, como un lquido, se requiere menor nmero de muestras que si no lo es; si el lote es un conjunto de unidades y se presume que no es de calidad uniforme entonces se extraern muestras de los puntos donde se supone que la calidad es inferior los cuales se denominan puntos crticos (en el ejemplo del autoclave stos seran las zonas donde se alcanza menor temperatura). A su vez deber considerarse la homogeneidad dentro de la unidad o envase, p.ej. en un alimento congelado hay un gradiente de temperatura durante el proceso de enfriamiento de tal manera que la zona central es la que tarda mas tiempo en alcanzar la temperatura de congelamiento. - posibilidad de controlar y registrar el tratamiento al cual ha sido sometido el producto; cuanto mayor sea la seguridad de que el tratamiento ha sido correcto para la totalidad del lote, se requiere menor nmero de muestras. Debe tenerse en cuenta que el aumento del nmero de muestras est restringido por el costo del anlisis y porque existe un lmite por encima del cual no hay un aumento significativo de los intervalos de confianza. La muestra se extrae de unidades cuyo envase externo est inalterado. La extraccin se realiza en forma asptica para evitar la contaminacin de la muestra y del resto del contenido del envase. La muestra debe identificarse con un nmero, fecha, origen, contenido e iniciales del extractor. 2) Transporte Para un producto almacenado en batch la muestra se toma y transporta en recipientes previamente esterilizados y hermticos. El transporte se realiza de acuerdo a las condiciones de almacenamiento. Si es un producto alterable debe transportarse refrigerado (0-4C) por no mas de 24hs. Si se trata de un alimento congelado debe conservarse a la temperatura de congelamiento. El recipiente de transporte no debe llenarse completamente (hasta un 75% de su capacidad) para permitir homogenizar. 3) Preparacin para el anlisis Se debe realizar la observacin macroscpica de la muestra y del envase de transporte y registrar cualquier particularidad. Se procede a la homogeneizacin de la muestra mediante manipulacin asptica. Si es un slido o una pasta se diluye en buffer o agua peptonada estriles y se mezcla en una licuadora o en bolsas de plstico previamente esterilizados. Si es un producto oleoso (p.ej. una pomada) se termostatiza en el diluyente a 35C para lograr una emulsin.
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Si el anlisis se realizar por filtracin es necesario disolver el producto en un solvente orgnico inocuo para los microorganismos (p.ej.miristato de isopropilo). Para alimentos se recomienda que la toma no sea inferior a 10 g y que la relacin con el diluyente sea 1:10. Esta dilucin debe prepararse inmediatamente antes del anlisis.
APLICACIONES. I) Muestreo de equipos y utensilios. Se puede realizar por varios mtodos: a) Enjuagado: consiste en enjuagar el equipo con un volumen medido de medio de cultivo o de buffer, el cual es sometido al anlisis microbiolgico. b) Contacto de superficie: consiste en deslizar un hisopo embebido en buffer por un rea determinada del equipo y posteriormente descargar el hisopo en un volumen medido de diluyente el cual es analizado. Este mtodo es recomendado para zonas de difcil acceso, en cambio para reas planas se recomienda el contacto directo de la superficie a analizar con una placa RODAC con agar nutriente (RODAC Replicate Organism Direct Agar Contact Plates) y se expresa el resultado por rea total muestreada. Tambin pueden emplearse esponjas estriles (humedecidas en suero fisiolgico u otro diluyente) que se pasan por la superficie y luego la esponja es inoculada en un caldo (si se realiza una bsqueda) o se diluye en un volumen medido de suero fisiolgico y se realiza el recuento de esta solucin para expresar finalmente el resultado por unidad de superficie muestreada. c) Inmersin: los utensilios se sumergen en un volumen determinado de diluyente y se determina el nmero de microorganismos por unidad. II) Muestreo de aire. a) Sedimentacin: se exponen placas de agar durante 15 min a 2h dependiendo de la contaminacin del rea a analizar. Se detectan slo los microorganismos que estn adheridos a partculas sedimentables. b) Impacto: se hace pasar un volumen determinado de aire mediante aplicacin de vaco y el aire impacta sobre la superficie de un agar nutriente adecuado. Tambin existen equipos que permiten el pasaje del aire a travs de una serie de tamices que retienen distinto tamao de partcula. Los tamices son incubados sobre agar y se puede determinar el nmero de microorganismos asociados a partculas de distinto tamao. c) Impregnacin de lquidos: consiste en hacer burbujear un volmen determinado de aire a travs de un diluyente estril el cual retiene los microorganismos presentes. Bibliografa - Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. APHA (American Public Health Association), 1976. Ed.Spceck,M. - Microorganismos in Foods 2: Sampling for microbiological analysis, Principles and specific applications. ICMSF (International commision on Microbiological Specifications for Foods), 1974. Ed. Ingram,M. - Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater APHA, 1976. 14th. ed. Ed.Rand,M.
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VALIDACIN
CONCEPTOS Validar un proceso cualquiera significa verificar que el procedimiento seguido es el adecuado para obtener el fin propuesto. Ejemplos: Para validar un proceso de llenado asptico de ampollas inyectables se prepara un lote en el que se sustituye el producto con medio de cultivo. Se incuba entonces las ampollas y se observa si hay o no crecimiento, lo que validar o no, el procedimiento de llenado. Para validar un proceso de esterilizacin de un producto en un envase dado, se prepara un lote de envases llenos con medio de cultivo inoculado con una cepa adecuada. Luego del ciclo de esterilizacin se incuba y se observa el crecimiento. Este concepto se puede aplicar a un proceso analtico. Por ejemplo, si se busca iodo en una sal de mesa, se ensaya la tcnica de anlisis en una muestra adicionada de determinada cantidad de iodo demostrando as que con la tcnica empleada se puede detectar el iodo en la concentracin buscada. El concepto de validacin es de especial inters en el anlisis microbiolgico. Validar la bsqueda de un microorganismo en determinada cantidad de una muestra dada, significa demostrar que si hubiera estado presente dicho microorganismo en determinada concentracin, se hubiera encontrado con la tcnica empleada. Validar el recuento de microorganismos en una muestra determinada, significa demostrar que si hubieran estado presentes en determinado nmero, se hubiera determinado ese nmero por el mtodo en cuestin.
PROCEDIMIENTO DE VALIDACION Para validar los procedimientos en si mismos, se parte del medio de cultivo de enriquecimiento (en el caso de una bsqueda) o del disolvente inicial (si se trata de un recuento) inoculado con el microorganismo adecuado. Para validar la aplicabilidad de dicho procedimiento a una muestra dada se parte de la muestra en cuestin inoculada con el microorganismo que se desee. Tericamente, se debe validar para cada microorganismo que se busque o se quiera contar. Como no siempre esto resulta prctico, se pueden seleccionar uno o dos m.o. que se consideren representativos de los distintos grupos fisiolgicos. Por ejemplo, se recomienda validar con un Gram positivo y uno Gram negativo para bacterias y una levadura y un hongo filamentoso en el caso de hongos. Qu nmero de microorganismos se agrega? Depender de la sensibilidad exigida al mtodo que a su vez es funcin de la muestra. En general debemos pensar que si las muestras fueron sometidas a alguna condicin drstica, por ejemplo calor, si los microorganismos estn presentes lo estarn en bajo nmero. Por lo tanto, se debe demostrar que el procedimiento empleado es capaz de recuperar microorganismos aun si se encuentran en bajo nmero. Al validar un procedimiento de bsqueda habitual (con 10 g de muestra en 90 mL de caldo de enriquecimiento) se suele agregar de 10 a 100 clulas del microorganismo adecuado.
INTERPRETACION DE RESULTADOS a) Se considerar que el procedimiento de bsqueda est validado si se detecta el microorganismo inoculado. Para el caso de validacin de recuento se espera que el valor de ufc obtenido en presencia del producto no difiera en un factor de 2 respecto al valor obtenido en el control (en ausencia de producto).
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b) Si se detecta o se determina el nmero de m.o. empleando la tcnica sobre la muestra inoculada se concluye que el procedimiento en cuestin es aplicable a dicho tipo de muestra. En caso de obtener resultados negativos en a) hay que analizar cada paso del procedimiento seguido, medios de cultivo empleados, condiciones de incubacin, etc. En general, estos factores estn bajo control en un laboratorio de rutina, y se emplean procedimientos ya descriptos. Es ms frecuente el caso de que no valide b), o sea que un procedimiento ya descripto en la bibliografa y vlido en si mismo no resulta adecuado para determinado tipo de muestra. La causa ms frecuente de no validacin es la presencia de poder inhibitorio en la muestra analizada. Es decir la muestra presenta la propiedad de inhibir el desarrollo de microorganismos, ya sea por contener agentes conservadores, declarados o no, por su pH u otros motivos. Se debe estudiar entonces, hasta donde sea posible, la composicin de la muestra. Si se conoce la presencia de conservadores se debe eliminar su accin. Esto se puede conseguir de tres maneras fundamentales: a) Por neutralizacin qumica, esto es, agregando una sustancia capaz de anular la accin del agente antimicrobiano. Por ejemplo la accin de penicilinas puede neutralizarse empleando lactamasas.
Agente inhibidor Hipoclorito, yodo, mercuriales Fenoles, alcoholes, aldehdos Parabenos Comp. amonio cuaternario y mercuriales, parabenos Glutaraldehdo Mercuriales EDTA
Neutralizante Tiosulfato de sodio Dilucin Polisorbato Lecitina Sulfito cido de sodio Tioglicolato Iones de Ca o Mg
b) Por dilucin, llevndolos a concentraciones subinhibitorias. Esto se consigue disminuyendo la toma de muestra o aumentando el volumen del medio inicial. c) Por filtracin, removiendo mecnicamente el conservador. Se efecta la filtracin por membranas con un tamao de poro definido que retendrn los microorganismos. Su uso se limita a muestras lquidas o solubles. BIBLIOGRAFIA - USP 30, <61>Microbial Limit Tests, <71>Sterility Tests. - European Pharmacopeia.1997.pag 84 - British Pharmacopeia, 1988. Test for Microbial Contamination. Validity of the test for specified microorganisms and Validity of the counting methods, Apendix XVI B - Microbial Applications of the Inactivation of Antimicrobial Agents, A.D. Russell and col., review of the Journal of Applied Bacteriology, 1978.
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CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
INTRODUCCIN Para controlar el crecimiento de los m.o. se pueden emplear dos estrategias: a) eliminar los m.o. presentes, b) impedir su multiplicacin. Para dicho fin se emplean mtodos que involucran agentes fsicos, qumicos o biolgicos. El efecto sobre los m.o. puede ser CIDA (provoca la muerte de los m.o.) o STASIS (inhibe el crecimiento de los m.o.). As el trmino bactericida significa que en el proceso se destruyen bacterias mientras que bacteriosttico implica que el proceso impide la proliferacin bacteriana. De la misma forma fungicida y fungisttico son los trminos empleados cuando los m.o. afectados son los hongos. Los procesos por los cuales se eliminan los m.o. pueden buscar la reduccin parcial o total (esterilizacin) de la carga microbiana. Se define as Esterilizacin como la completa destruccin o eliminacin de toda forma de vida. No hay grados de esterilizacin: algo est estril o no lo est. La accin de los agentes de control depende a grandes rasgos de los siguientes factores: el tipo de m.o. que se quiere controlar y la carga inicial del mismo. la dosis del agente, que involucra la concentracin o intensidad aplicada durante un determinado tiempo. el medio en el cual se encuentran los m.o.
AGENTES FSICOS 1) TEMPERATURA Los m.o. tienen una temperatura mnima, ptima y mxima de crecimiento. Las temperaturas por debajo de la mnima usualmente tiene una accin de "stasis" o sea detienen el crecimiento microbiano, pero no provocan la muerte celular. Las temperaturas por encima de la mxima usualmente tienen una accin "Cida" o sea provocan la muerte del m.o. por desnaturalizacin de enzimas y otras protenas. El uso de altas y bajas temperaturas est muy difundido y resulta muy efectivo para controlar el crecimiento microbiano. La sensibilidad de los m.o. a las altas temperaturas vara con la especie y con el estado en que se encuentren. Las esporas bacterianas son las estructuras vivas ms termorresistentes. Ya que resisten tratamientos trmicos ms drsticos que las formas vegetativas. Por ejemplo esporas de m.o. mesfilos en suspensin son capaces de resistir 30 minutos a 80 C, lo cual es letal para las formas vegetativas. Existen tambin ascosporas de hongos filamentosos que son ms termorresistentes que la correspondiente forma micelial (ej. ascosporas de Byssochlamys fulva) ALTAS TEMPERATURAS (CALOR) El calor en presencia o ausencia de humedad puede ser utilizado para desinfectar o esterilizar. La ventaja de los tratamientos en presencia de humedad (calor hmedo) es que se requiere menor temperatura para el mismo efecto. Esto se debe a la capacidad de penetrar en las clulas, desnaturalizando protenas y afectando todos los componentes celulares. Calor hmedo a) Pasteurizacin La pasteurizacin es un mtodo empleado para reducir la carga microbiana. No se destruyen por este mtodo las esporas bacterianas. No es un mtodo esterilizante. Se ha utilizado durante mucho tiempo para reducir la carga microbiana en la leche. Las condiciones de pasteurizacin en este caso son las siguientes: a) calentamiento a 71,6 C por al menos 15 segundos o b) calentamiento por 30 minutos a 62,9 C. b) Calentamiento a ebullicin El agua a ebullicin generalmente mata clulas vegetativas en menos de 10 minutos. Sin embargo ciertos virus, como el virus de la hepatitis, puede sobrevivir hasta 30
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minutos, mientras que las esporas de ciertas especies de los gneros Clostridium y Bacillus soportan tratamientos de ms de una hora. c) Calor hmedo a presin superior a la atmosfrica. El tratamiento en autoclave emplea este tipo de tratamiento. El agua a presin atmosfrica hierve a 100 C, pero a presiones superiores, la temperatura de ebullicin aumenta, por lo que se pueden realizar tratamientos con calor hmedo a temperaturas ms altas de 100 C. Este tipo de tratamiento puede ser esterilizante. En el laboratorio para esterilizar material con baja carga microbiana se emplea un ciclo de 15 minutos a 121 C en autoclave. Se pueden emplear otras condiciones, variando la temperatura y/o el tiempo para lograr la esterilizacin. Por ejemplo, en el caso que la carga microbiana inicial sea mayor, se debe realizar un tratamiento de mayor tiempo a 121 C. En caso de que el material a esterilizar no resista la temperatura de 121, se puede utilizar una menor temperatura durante mayor tiempo. Calor seco La accin letal del calor seco se debe a la oxidacin de las protenas. a) Tratamiento con aire caliente Para este tipo de tratamiento se emplean hornos que alcancen temperaturas mayores de 150 C. Estos tratamientos pueden ser esterilizantes. Las condiciones de esterilizacin de material con baja carga pueden ser: a) 180 C una hora o b) 160 C durante dos horas. Si se empleara calor seco a 121 C se debera realizar un tratamiento de 16 horas. Este tipo de tratamiento se usa para esterilizar material de vidrio, instrumentos de metal o aceites y polvos que soporten esas altas temperaturas b) Incineracin Los incineradores se utilizan en caso de materiales descartables. Tambin se usa la incineracin para esterilizar las ansas antes o despus de utilizarlas. BAJAS TEMPERATURAS Las bajas temperaturas inhiben el crecimiento microbiano por enlentecimiento o suspensin del metabolismo celular. Como ejemplos se puede mencionar la refrigeracin en heladera (5 C 8 C) y el almacenamiento en freezer a temperaturas ms bajas de 0 C. Para el mantenimiento de cepas microbianas se utiliza el almacenamiento a 20 C. A esta temperatura se suspende el crecimiento microbiano pero en general no hay muerte celular. 2) PRESIN OSMTICA Los m.o. en su ambiente natural estn sometidos a constantes cambios de presin osmtica. El agua tiende a fluir a travs de las membranas semipermeables como lo son las membranas celulares, hacia el lugar de mayor concentracin de solutos. Cuando la concentracin de solutos es mayor en el interior que en el exterior de las clulas, se est en presencia de un medio hipotnico y el agua tiende a fluir hacia el interior celular. Las rgidas paredes de las bacterias y los hongos impiden la explosin celular. Si la concentracin de solutos es mayor afuera de la clula, el agua fluye hacia el exterior. En estas condiciones la clula se deshidrata y su crecimiento se inhibe. El aumento de la presin osmtica es una forma de conservacin muy utilizada. Ejemplos de ello son el uso de altas concentraciones de azcar (mermeladas, dulces) y de sal. 3) RADIACIN Radiacin ultravioleta La radiacin ultravioleta incluye longitudes de onda entre 100 y 400 nm. La actividad microbicida de la luz ultravioleta depende entre otros factores de la longitud de onda utilizada y del tiempo de exposicin. Las longitudes de onda con mayor actividad microbicida estn entre 260-270 nm, longitudes de onda donde absorben los cidos nucleicos. Una caracterstica de la luz UV es su bajo poder de penetracin. Slo los m.o. que se encuentran en la superficie de los materiales expuestos a la luz UV pueden ser afectados. Por lo tanto se utiliza este tipo de tratamiento especialmente para desinfectar superficies. Es usado tambin en la desinfeccin de agua. En este caso se hace pasar el agua por un dispositivo de cuarzo (material penetrable por la luz UV) sobre el cual impacta la radiacin ultravioleta.
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Radiacin ionizante La radiacin ionizante como los rayos gamma y rayos X tiene mucha ms energa y poder de penetracin que la radiacin ultravioleta. Su accin consiste en ionizar el agua y otras molculas para formar radicales que pueden romper las hebras de ADN. Se utiliza para esterilizar guantes, suturas, catteres, jeringas e incluso placas de Petri. Tambin est aceptado su uso para disminuir la carga microbiana en alimentos. 4) FILTRACIN Los filtros retienen los m.o. impidiendo el pasaje a travs de los mismos. Los filtros de membrana retiene a los m.o. en la superficie por poseer poros de tamao pequeo (0,2 micras) a travs de los cuales los m.o. no pueden pasar. Los filtros de profundidad retienen a los m.o. atrapndolos en su matriz. Un ejemplo de filtros de profundidad es el tapn de algodn que se utiliza para tapar los tubos de medio de cultivo. Los filtros de membrana se utilizan para esterilizar soluciones, especialmente en aquellos casos en que no se pueda realizar esterilizacin por calor.
AGENTES QUMICOS Los agentes qumicos son compuestos que matan o inhiben el crecimiento de los m.o. Incluyen sustancias usados como conservadores y antispticos as como las usadas para el tratamiento de enfermedades infecciosas de plantas y animales. Tipo de agente qumico antimicrobiano: Antispticos Agentes microbicidas que pueden aplicarse sobre la piel y mucosas pero no pueden ser utilizados internamente. Ejemplos: mercuriales, nitrato de plata, solucin de yodo, alcoholes, detergentes. Desinfectantes Agentes que matan m.o. pero no necesariamente sus esporas y no deben aplicarse sobre tejidos sino sobre objetos inanimados como mesas, pisos, utensilios, etc. Ejemplos: cloro, hipoclorito, compuestos clorados, soda, sulfato de cobre, compuestos de amonio cuaternario, etc. Nota: Los desinfectantes y antispticos se distinguen en base a si pueden o no ser usados de forma segura sobre membranas mucosas. Muchas veces esta seguridad depende de la concentracin del agente. Por ejemplo, el cloro es agregado en concentraciones seguras en el agua potable. Conservadores Agentes usados frecuentemente en alimentos pero tambin en productos farmacuticos para inhibir el crecimiento de m.o. Por consiguiente al ser ingeridos no deben ser txicos. Ej: propionato de calcio, benzoato de sodio, formaldehdo, nitrato, dixido de azufre. La accin de desinfectantes y antispticos depende de varios factores, entre ellos: La concentracin del agente qumico La temperatura a la cual el agente es usado. La clase de m.o. presente. El nmero de m.o. presentes. La naturaleza de material que acompaa a los m.o. (materia orgnica, etc)
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El mejor resultado se obtiene cuando el nmero inicial de m.o. es bajo y la superficie a ser desinfectada es limpia y libre de sustancias que interfieran. Los dos modos de accin ms comunes de antispticos y desinfectantes son: Dao a los lpidos y/o protenas de la membrana citoplasmtica resultando en su ruptura y en la salida del material celular. Desnaturalizacin de enzimas y otras protenas generalmente por ruptura de puentes de hidrgeno y disulfuro. Bloquean el metabolismo.
Tabla V. Desinfectantes y antispticos ms comunes. Agente qumico Etanol (50-70%) Isopropanol (50-70%) Formaldehdo (8%) Tintura de yodo(2% I2 en 70% alcohol) Cloro (Cl2) gas Nitrato de plata (AgNO3) Accin Desnaturaliza protenas y solubiliza lpidos Desnaturaliza protenas y solubiliza lpidos Reacciona con grupos-NH2, SH y -COOH Inactiva protenas Forma cido hipocloroso (HClO), un fuerte agente oxidante Precipita protenas Usos Antisptico usado en piel Antisptico usado en piel Desinfectante, mata endosporas Antisptico usado en piel Desinfeccin en general y en particular para agua potable
Antisptico general y usado en ojos de recin nacidos Desinfectante. En ocasiones Inactiva protenas por reaccin Cloruro de mercurio usado como componente en con los grupos sulfuro antispticos para piel Detergentes (ej. amonios Ruptura de membranas Desinfectantes y antisptico cuaternarios) celulares de piel Antispticos a bajas Desnaturalizan protenas y Compuestos fenlicos (ej. concentraciones, rompen las membranas hexilresorcinol, hexaclorofenol) desinfectantes a altas celulares concentraciones Desinfectante usado para esterilizar objetos sensibles Oxido de etileno (gas) Agente alquilante al calor como goma y plsticos
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Tabla VI. Lista de los conservadores ms comunes usados en alimentos, productos farmacuticos y cosmticos.
Conservador Alcoholes
Concentracin efectiva variable
cido propinico y propionatos 0,32% Acido srbico y sorbatos 0,2%
Usos Cosmtica Agente antifngico en panes, tortas, queso Agente antifngico en quesos, mermeladas, jugos y tortas Industria farmacutica, cosmtica, alimentaria Cosmtica: productos de enjuague como shampoo Agente antifngico en margarina, sidra, bebidas gaseosas. Agente antifngico en panes Agente antimicrobiano en queso, manteca, yogur y pickles. Agente antimicrobiano en frutas secas, uvas, melazas Agente antimicrobiano en alimentos curados, pescado Previene el deterioro microbiano en carnes, pescado, etc Previene el deterioro microbiano en mermeladas, jugos, jaleas,etc Previene el deterioro microbiano en carnes, pescado, etc
Esteres del cido phidroxibenzoico: metil, etil, variable propil, butil y heptil steres (parabenos o steres del PHB) Formaldehdo Acido benzoico y benzoatos Diacetato de sodio Acido lctico Dixido de azufre, sulfitos Nitrito de sodio Cloruro de sodio 0,1% 0,32% variable 200-300 ppm 200 ppm variable
Azcar
variable
Ahumados
variable
AGENTES BIOLGICOS Los agentes antimicrobianos biolgicos son sustancias sintticas, semisintticas o producidas por m.o. capaces de matar o inhibir el desarrollo de otros m.o. Los agentes antivirales, antibacterianos y antifngicos, se definen como aquellos agentes biolgicos capaces de inactivar virus, bacterias y hongos, respectivamente. Los agentes antimicrobianos pueden variar segn la toxicidad selectiva que presenten. A diferencia de los antispticos y desinfectantes, los antibiticos no actan de manera similar en todos los tipos celulares -por el contrario- presentan una toxicidad selectiva y segn se trate de una agente antifngico o uno antibacteriano, inactivar clulas fngicas o bacterianas. Para el control de las enfermedades infecciosas en plantas, animales y humanos es indispensable el uso de antibiticos con la capacidad para inhibir las bacterias u otros m.o. sin
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causar dao al husped. El agente biolgico deber entonces actuar contra alguna funcin o estructura microbiana que no est presente en el husped o que de lo contrario sea sustancialmente diferente. A diferencia de los m.o. procariotas, los m.o. eucariotas presentan estructuras y funciones muy relacionadas con las encontradas en el husped. Este es el motivo por el cual existe una variedad reducida de agentes biolgicos contra hongos en comparacin con la amplia variedad dirigida hacia m.o. procariotas. Los antibiticos son sustancias producidas por ciertos m.o. que a bajas concentraciones son capaces de matar o inhibir el crecimiento de otros m.o. Los antibiticos constituyen una clase especial de agentes quimioteraputicos que se distinguen por el hecho de que se trata de sustancias naturales (producto de la actividad microbiana) ms que de sustancias obtenidas por sntesis qumica. Debido a que al presente varios antibiticos han sido modificados qumicamente e incluso sintetizados totalmente de novo en el laboratorio, varios autores consideran indistinto los trminos antibitico y agente quimioteraputico. Los agentes antimicrobianos quimioterpicos se pueden clasificar en base a su estructura qumica y a su modo de accin. A continuacin se muestran los mecanismos de accin que presentan los diferentes grupos qumicos de antibiticos. 1- Inhibicin de la sntesis de peptidoglicano a- Antibiticos beta-lactmicos naturales y semisintticos (penicilinas, cefalosporinas, carbapenems, monobactam) b- Vancomicina (natural) c- Bacitracina (natural) 2- Alteracin de la membrana citoplasmtica a- Polimixina B (natural) b- Anfotericina B (natural) c- Nistatina (natural) d- Imidazoles (natural) 3- Inhibicin de la sntesis proteica Bloqueo de la transcripcin (prevencin de la sntesis de ARN) a- Rifampicina (natural) b- Etambutol (no natural) Bloqueo de la traduccin (alteracin de ribosomas bacterianos) a- aminoglicsidos (natural) b- tetraciclinas (natural) c- Lincosamina y clindamicina (natural) d- macrlidos (naturales y semisntticos) 4- Interferencia con la sntesis de ADN a- Fluoroquinolonas (no natural, Ej: ciprofloxacina) b- Sulfonamidas y trimetroprim (no naturales)
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EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA
EVALUACIN DE AGENTES FSICOS Y QUMICOS 1) Clculo de tiempo D Para conocer el efecto que determinado tratamiento (un determinado agente, a una determinada concentracin) frente a un determinado tipo y nmero de m.o. en un determinado sustrato, se determina el valor D o tiempo de reduccin decimal. El valor D se define como el tiempo necesario para disminuir en un orden la carga de m.o. presentes en una muestra. Este valor se puede determinar a partir de la curva de muerte. Dicha curva se construye determinando el nmero de m.o. sobrevivientes al tratamiento a lo largo del tiempo. En general la curva de muerte es una exponencial negativa, por lo cual se puede linealizar graficando el ln del nmero de sobrevivientes en funcin del tiempo. La inversa (con signo cambiado) de la pendiente de dicha grfica es el valor D. Como se ve el valor D no depende de la carga microbiana inicial. Pero se debe tener en cuenta la carga microbiana de que se parte para poder estimar el nmero de tiempos D que se debe aplicar a la muestra para bajar su carga un determinado nmero de rdenes decimales. De esta forma conociendo el valor D y la carga inicial se puede determinar el tiempo de exposicin necesario para lograr una determinada disminucin de la carga microbiana luego del tratamiento. Por ejemplo si el valor D para Salmonella sp. en huevo lquido es de 1,1 minutos a 61 C, por lo tanto se necesitan 3,3 minutos (3D) en esas condiciones, para llegar a una carga microbiana de 10 ufc/ml habiendo partido de una carga inicial de 104 ufc/mL. 2) Otros mtodos Es posible evaluar la eficacia de los desinfectantes y antispticos por medio de ensayos in vitro o de ensayos in use. Los ensayos in vitro se realizan en condiciones de laboratorio artificiales y controladas mientras los ensayos in use se realizan en las condiciones de uso. Existen muchos y variados mtodos para la evaluacin de un agente qumico. Estos mtodos se clasifican segn el tipo de m.o. ensayado, segn su accin (bactericida, bacteriosttico, etc), de acuerdo al objetivo (ensayos preliminares, de screening, determinacin de la concentracin ptima para un dado uso etc.), ensayos cuantitativos, etc. Tambin existen normas en distintos pases: EN (comunidad europea), AFNOR (Francia), AOAC (USA), DGHM (Alemania), etc. cuyos ensayos tienen validez siempre que se sigan estrictamente las condiciones especificadas. EVALUACIN DE AGENTES BIOLGICOS En general la susceptibilidad de un m.o. a un determinado antibitico no se puede predecir conociendo la identidad del m.o., ya que cepas diferentes de la misma especie pueden presentar distinta sensibilidad frente a los mismos antibiticos. Generalmente las bacterias gram positivas son ms sensibles que las gram negativas, aunque algunos antibiticos acten solamente sobre las bacterias gram negativas. Un antibitico que acta sobre ambos grupos de bacterias, gram positivas y gram negativas se denomina antibitico de amplio espectro. Existen dos mtodos ampliamente utilizados en el laboratorio para medir la actividad antimicrobiana de un antibitico, los cuales estn rigurosamente estandarizados en la Norma National Committee Clinical Laboratory Standards (NCCLS): el ensayo de dilucin en tubo y el ensayo de difusin en agar (Ensayo de Kirby-Bauer) Ensayo de dilucin en tubo 1- El ensayo de dilucin en tubo nos permite conocer un valor llamado concentracin inhibitoria mnima (C.I.M.). Se prepara una serie de tubos conteniendo un medio lquido nutriente y concentraciones seriadas al medio del antibitico. Los tubos son inoculados con una suspensin estandarizada del m.o. en estudio e incubados a la temperatura adecuada durante 16-20 horas. Luego de la incubacin los tubos son examinados en base a la aparicin o no de evidencia macroscpica de crecimiento visualizada por la presencia de turbidez, velo o sedimento. La C.I.M.
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se define como la mnima concentracin del agente capaz de prevenir el desarrollo microbiano, es decir, la concentracin en la cual no hubo evidencia macroscpica de crecimiento. La C.I.M. no es una constante absoluta para un antibitico dado, puesto que est afectada por varios factores como son la naturaleza del m.o. utilizado, el tamao del inculo, la composicin del caldo de cultivo, el tiempo y condiciones de incubacin. Por lo tanto para comparar diferentes antibiticos con el fin de determinar cual es el ms efectivo contra un determinado m.o. o para evaluar la susceptibilidad de varios m.o. ante a un determinado antibitico, es indispensable estandarizar estrictamente las condiciones del ensayo. Ensayo de difusin en agar Es un mtodo comnmente utilizado para determinar la susceptibilidad de un m.o. frente a un antibitico. Se prepara una placa de Petri conteniendo un medio de cultivo adecuado para el desarrollo del m.o. en estudio. Luego se prepara un inculo estandarizado del m.o. equivalente al tubo 0.5 de la escala Mac Farland y se inocula el medio de cultivo hisopando la superficie entera de la placa. Se sumerge un disco de papel de filtro en cada una de las diferentes concentraciones conocidas del antibitico y se colocan en la superficie del agar a una distancia de 1,5 cm entre s y del borde de la placa. Luego se incuban las placas a temperatura adecuada durante 18-20 horas. Durante la incubacin el antibitico difunde desde el papel de filtro hacia el agar. Cuanto mayor es la distancia de difusin menor es la concentracin del agente en ese punto. A una determinada distancia desde el disco ocurrir una inhibicin del crecimiento del m.o., visualizndose una zona o halo de inhibicin, cuyo dimetro ser proporcional a la cantidad de antibitico agregado al disco de papel de filtro y que se podr medir con una regla o calibre. En los laboratorios de Microbiologa Clnica se utilizan discos de papel adquiridos comercialmente que contienen una concentracin estandarizada del antibitico. La reproducibilidad de este mtodo est afectada por los mismos factores que afectan al mtodo de dilucin en tubo sumado a otros factores como la constante de difusin del agente, la velocidad de crecimiento del m.o. y el espesor del medio de cultivo. Se pueden realizar ensayos de difusin utilizando otros mtodos de inoculacin (siembra incorporada) y otro tipo de reservorio para los antimicrobianos (cilindros de vidrio, de metal, etc.). Fotografa de un ensayo de difusin de actividad antimicrobiana de extractos vegetales sobre el hongo Aspergillus niger. Inoculacin: incorporada. Reservorios utilizados: cilindros metlicos
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EJERCICIOS DE AGENTES QUMICOS 1. Una resina para purificacin de agua est contaminada con 1012 ufc/ml de E.coli. Se agrega formaldehdo de forma de lograr una concentracin final del 8%. Cmo hara para determinar el tiempo de contacto necesario entre el agua y el agente para lograr bajar la carga a 102 ufc/mL? D qu factores depende dicho proceso? 2. Se quiere descontaminar un matraz de 100 mL que contiene un cultivo puro de S.aureus en TSB, con una carga de 109 ufc/mL. Para ello se emplea hipoclorito de sodio concentrado. Cmo hara para determinar el tiempo de contacto necesario para que la concentracin microbiana sea <1 ufc/100 mL? 3. Conociendo que el D de S. aureus determinado con hipoclorito al 4% en TSB es de 0,2 min, Cul sera el tiempo mnimo de contacto de una suspensin de 5 x 109 ufc/mL de S. aureus (en TSB con hipoclorito al 4%) para bajar la carga a 1000 ufc/mL? Explique como se determin ese tiempo D.
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TABLA MODIFICADA DE COWANS & STEEL PARA IDENTIFICACION DE BACTERIAS HETERTROFAS
tincin gram (cultivo fresco) forma agrupacin crecimiento aerobio crecimiento anaerobio esporas movilidad catalasa oxidasa fermentacin de glucosa a cido o a cido + gas
+
coco
+
coco
+
coco
+
coco
pares
bastn bastn bastn bastn bastn bastn bastn bastn coco
racimos racimos cadenas ttradas + + + + + + + + + + + + + +o + + + +o + + + +o + + +o + + + + + + +o + X X X X X X X X X X X X X X X X X X + +o + + O + + +o+ + F + + + + + + F
+ + + O
O/F Micrococcus Staphylococcus Streptococcus Lactococcus Enterococcus Leuconostoc Pediococcus Aerococcus Lactobacillus Clostridium Bacillus Alcaligenes Pseudomonas Enterobacterias Aeromonas Chromobacterium Neisseria
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Tabla extrada del artculo: Biochemical Identification of New Species and Biogroups of Enterobacteriaceae Isolated from Clinical Specimens. Journal of Clinical Microbiology, Jan. 1985, p. 46-76 Vol. 21, No. 1. J. J. Farmer et al.
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Tabla III, ndice de NMP y lmite de confianza del 95% para varias combinaciones de resultados positivos para una serie de 3 tubos cada uno con 10, 1 y 0,1 g mL de muestra. Combinacin de tubos positivos 0-0-0 0-0-1 0-1-0 1-0-0 1-0-1 1-1-0 1-1-1 1-2-0 2-0-0 2-0-1 2-1-0 2-1-1 2-2-0 2-2-1 Lmites de confianza del 95% Inferior Superior < 0,5 9 < 0,5 13 < 0,5 20 1 21 1 23 3 36 3 36 1 36 3 37 3 44 7 89 4 47 10 150 Combinacin de tubos positivos 3-0-0 3-0-1 3-0-2 3-1-0 3-1-1 3-1-2 3-2-0 3-2-1 3-2-2 3-3-0 3-3-1 3-3-2 3-3-3 Lmites de confianza del 95% Inferior Superior 4 120 7 130 15 380 7 210 14 230 30 380 15 380 30 440 35 470 36 1300 71 2400 150 4800 -
NMP/100 g mL <3 3 3 4 7 7 11 11 9 14 15 20 21 28
NMP/100 g mL 23 39 64 43 75 120 93 150 210 240 460 1100 >2400
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Tabla IV. ndice de NMP y lmite de confianza del 95% para varias combinaciones de resultados positivos para una serie de 5 tubos cada uno con 10, 1 y 0,1 g mL de muestra. Lmites de confianza del 95% Combinacin de tubos positivos 0-0-0 0-0-1 0-1-0 0-2-0 1-0-0 1-0-1 1-1-0 1-1-1 1-2-0 2-0-0 2-0-1 2-1-0 2-1-1 2-2-0 2-3-0 3-0-0 3-0-1 3-1-0 3-1-1 3-2-0 3-2-1 4-0-0 4-0-1 4-1-0 4-1-1 4-1-2 4-2-0 4-2-1 NMP/100 g mL <2 2 2 4 2 4 4 6 6 5 7 7 9 9 12 8 11 11 14 14 17 13 17 17 21 26 22 26 Inferior -<0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 1 1 2 2 3 1 2 2 4 4 5 3 5 5 7 9 7 9 Superior 7 7 11 7 11 11 15 15 13 17 17 21 21 28 19 25 25 34 34 46 31 46 46 63 78 67 78 Combinacin de tubos positivos 4-3-0 4-3-1 4-4-0 5-0-0 5-0-1 5-0-2 5-1-0 5-1-1 5-1-2 5-2-0 5-2-1 5-2-2 5-3-0 5-3-1 5-3-2 5-3-3 5-4-0 5-4-1 5-4-2 5-4-3 5-4-4 5-5-0 5-5-1 5-5-2 5-5-3 5-5-4 5-5-5 NMP/100 g mL 27 33 34 23 31 43 33 46 63 49 70 94 79 110 140 180 130 170 220 280 350 240 350 540 920 1600 >2400 Lmite de confianza del 95% Inferior 9 11 12 7 11 15 11 16 21 17 22 28 25 31 37 44 35 43 57 90 120 68 120 180 300 640 Superior 80 93 93 70 89 110 93 120 150 130 170 220 190 250 340 500 300 490 700 850 1000 750 1000 1400 3200 5800 --
Pg. 108 de 110
NDICE
Gua de Prctico
Primer Ciclo: Identificacin primaria de bacterias y hongos..... 1 Calendario..... 2 Segundo Ciclo: Bsqueda y Recuento Anlisis microbiolgico de muestras. 3 Calendario..... 4 Tcnica general de anlisis microbiolgico de una muestra . 5 Recuentos...... 5 Bsquedas..... 6 Recuento de heterotrficos por el mtodo de membrana filtrante 10 Recuento de coliformes fecales en agua de playa por NMP. .11 Recuento de coliformes totales y fecales en agua potable por NMP. 11 Composicin de medios a emplear..13 Tercer Ciclo: Agentes fsicos, qumicos y biolgicos17 Calendario....17 Agentes Fsicos: calor..18 Evaluacin de Desinfectantes..18 Evaluacin de agentes biolgicos21 Fundamentacin terica Normas bsicas de seguridad 22 Utilizacin y mantenimiento del microscopio 23 Citologa y morfologa de bacterias 24 Tcnicas. 28 Citologa y morfologa de hongos.. 30 Figuras de hongos.. 33 Siembra y aislamiento Bsqueda 35 Medios de cultivo... 38 Tabla: Caractersticas de algunos medios de cultivo 41 Test de esterilidad.. 42 Identificacin de una cepa bacteriana 48 Pruebas bioqumica primarias.. 51 Pruebas bioqumica secundarias.. 55 Problemas tericos 67 Determinaciones cuantitativas de biomasa - Recuentos.72 Escala de Mac Farland..84 Algunas aplicaciones de recuentos...85 Ejercicios de recuentos..88 Muestreo para anlisis microbiolgico91 Validacin 94
Pg. 109 de 110
Control del crecimiento microbiano. 96 Tabla: Desinfectantes y antispticos ms comunes. 99 Tabla: Conservadores ms comunes. 100 Evaluacin de la actividad antimicrobiana... 102 Ejercicios de agentes qumicos... 104 Tablas: Identificacin de bacterias hetertrofas.. 105 Identificacin de enterobacterias.. 106 ndice de NMP serie de 3 tubos.107 ndice de NMP serie de 5 tubos.108
Pg. 110 de 110

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COMPOSICIN DE MEDIOS A EMPLEAR

15,0 g 5,0 g 5,0 g 15,0 g 1L

17,0 g 3,0 g 5,0 g 2,5 g 2,5 g 1L

7,0 g 3,0 g 5,0 g 1,5 g 10,0 g 0,03 g 2 mg 15,0 g 1L

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10,0 g 5,0 g 1,0 g 5,0 g 20,0 g 12,0 g 10,0 g 1L

5,0 g 5,0 g 1,0 g 10,0 g 25 mg 75,0 g 15,0 g 1L

20,0 g 1,4 g 10,0 g 10 mL 13,6 g 1L 0,3 g

17,0 g 1,5 g 1,5 g 10,0 g 30 mg 1,5 g 5,0 g 1,0 mg 13,5 g 1L

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4,5 g 29,0 g 8,0 g 0,4 g 0,6 g 0,036 g 1L

2,5 g 2,5 g 1,0 g 10,0 g 30,0 g 1L

5,0 g 5,0 g 10,0 g 8,5 g 8,5 g 1,0 g 0,33 mg 25 mg 13,5 g 1L 8,5 g

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3,0 g 5,0 g 5,0 g 10,0 g 5,0 g 10,0 g 80 mg 20 g 12,5 mg 1L

20,0 g 5,0 g 2,75 g 2,75 g 5,0 g 0,1 g 1L

10,0 g 20,0 g 10,0 g 13,3 mg 1L

20,0 g 5,0 g 4,0 g 1,5 g 5,0 g 1,5 g 1L

5,0 g 2,5 g 1,0 g 15,0 g

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