Catedrtica:

Dr.
Alumno:

[BIOLOGIA MOLECULAR]
Diagnostico del Virus del Papiloma Humano, utilizando tcnicas de Biologa Molecular: extraccin de DNA, cuantificacin en el espectrofotmetro y en electroforesis en gel, PCR

VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO

El virus del papiloma humano ('VPH o HPV del ingls human papilomavirus) son un grupo diverso de virus ADN perteneciente a la familia de los Papillomaviridae y representan una de las infecciones de transmisin sexual ms comn, por lo que es considerada dentro del grupo de enfermedades venreas, pudiendo cursar con un cuadro subclnico y por lo tanto sin sntomas, haciendo que el paciente no tenga conocimiento a menos que aparezcan alteraciones en la prueba de papanicolaou o en la colposcopia. La infeccin puede ser causada por una de las ms de cien cepas (tipos) diferentes de VPH que existen. El VPH se encuentra tan difundido que slo las personas que no han tenido relaciones sexuales no han estado expuestas a el. La enfermedad provocada por el VPH es una infeccin incurable, aunque es posible que la infeccin desaparezca de forma espontnea en los primeros seis meses evitando que cronifique, fenmeno que ocurre en casi todos los procesos. En casi todos los casos la infeccin es subclnica y de corta duracin. Los condones no previenen por completo de la transmisin del VPH porque se puede contagiar durante los juegos sexuales y otras actividades distintas al coito. Sin embargo, el riesgo se reduce con los condones. Los productos que se utilizan durante la menstruacin tambin pueden transportar al virus. La insercin de los tampones puede trasladar el virus desde los labios hacia la vagina. Las toallas femeninas pueden retener y transmitir al virus, y la humedad y la abrasin facilitan cualquier va de transmisin. El coito anal es una forma de transmisin frecuente porque la mucosa anal es frgil y muy susceptible a la infeccin por VPH. El virus puede producir la aparicin de bultos carnosos similares a una coliflor en reas hmedas ubicadas en y alrededor de los rganos sexuales. Generalmente no duelen y pueden ser sobresalientes, puntiagudos o planos. Las verrugas pueden aparecer solas o en grupos. En algunos casos las lesiones pueden desaparecer espontneamente, mientras que otros necesitan tratamiento.

DIAGNOSTICO DEL VPH

La presencia de papilomas o verrugas en los genitales externos o en la zona anal, son suficientes para diagnosticar la presencia de papilomavirus, sin embargo y como no siempre estas son visibles, es recomendable siempre confirmarlo mediante el examen del Papanicolaou en las mujeres que son sexualmente activas o que han cumplido los 18 aos de edad. Si en la prueba se detectan cambios anormales importantes, se recomienda la realizacin de una colposcopia y una biopsia de cualquier rea anormal. En los hombres es ms difcil el diagnstico. Para visualizar las lesiones se puede aplicar gasa con vinagre para visualizar las lesiones en el pene o realizar una peneoscopa o un cistoureterograma miccional para identificar lesiones intrauretrales. En algunos casos un examen de ADN, que ya est disponible en Mxico y cuyo nombre es PCR-VPH, ayuda no solamente a salir de dudas, sino tambin a conocer el tipo de virus existente.

DIAGNOSTICO MOLECULAR
Para realizar el Dx molecular que es la prueba de PCR, se tiene que realizar primero la extraccin del DNA, en nuestro caso se obtuvo de muestra sangunea y cepillado vaginal. El siguiente paso es el anlisis cuantitativo (espectrofotmetro) y cualitativo (electroforesis en gel) para saber si se cuenta con DNA en la muestra. Por ltimo pero no por eso menos importante PCR y la lectura en electroforesis.

ORIGEN DE LAS MUESTRA Y SUS PROCESAMIENTOS La toma de la muestra se realizo de dos maneras, con muestra sangunea, extrada del brazo del paciente y cepillado vaginal, tomada en el CESS

Inmediatamente se prosigui a prosigui de lleno a lo que es extraccin de DNA, por el mtodo de TTS Los pasos necesarios para una correcta extraccin y purificacin del ADN mediante un procedimiento qumico son: 1. Lisis de las clulas o virus. Las sales cao trpicas ayudan a romper la estructura tridimensional de macromolculas como las protenas o los cidos nucleicos consiguiendo su desnaturalizacin. La adicin de un detergente como el SDS es necesaria a menudo para eliminar las membranas. 2. Degradacin de la fraccin proteica asociada al ADN. Se consigue mediante la adicin de una proteasa. La fraccin proteica puede precipitarse mejor con la ayuda de sales como el acetato de amonio o el acetato sdico. 3. Purificacin. Consta de 3 fases: Precipitacin del ADN. El ADN es insoluble en alcohol, por lo que se puede precipitar etanol fro o isopropanol, recuperar mediante una centrifugacin. El alcohol del sobrenadante se llevar las sales aadidas previamente. 4. Recuperacin. El sedimento se puede re-suspender en agua o tampn Tris tras ser secado completamente. El paso 3 puede realizarse con la ayuda de mini columnas equipadas con una membrana de slica que retiene especficamente el ADN permitiendo el paso de las molculas y sales que acompaan la reaccin de lisis. Finalmente se lava con alcohol y se diluye el contenido.

En el caso de la extraccin de las muestras vaginales el procedimiento es el siguiente. 1. Agitar la solucin TD1, y se adiciona 700 l de solucin TD1 2. Adicionar el tejido, centrifugar los tubos PVS 10 min. Se decanta el sobrenadante y el tejido que se obtiene ser el botn. 3. se agita en el bortex a mxima velocidad durante 10 min. 4. Se centrifuga 1min a 10000 rpm, se transfiere el sobrenadante a una columna de separacin, y de nuevo se centrifuga a 10000rpm por 30 segundos 5. . Se decanta el liquido y se le adiciona 400 l de solucin TD2 6. Centrifugar a 10000 rpm por 30 segundos 7. Decantar el liquido, y de nuevo se centrifuga 10000 rpm por 1 minuto 8. Cuidadosamente se coloca en un tubo nuevo. 9. Adicionar 50 l de solucin TD3 en el centro de la membrana, se centrifuga a 10000 rpm por 30 segundos. Se quita la columna y se rotula el tubo.

CUANTIFICACION EN EL ESPECTOFOTOMETRO
Para corroborar que al final de la extraccin haiga DNA, se lee la muestra en el espectrofotmetro El funcionamiento de un

espectrofotmetro

consiste

bsicamente en iluminar la muestra con luz blanca y calcular la cantidad de luz que refleja dicha muestra en una serie de intervalos de longitudes de onda. Lo ms usual es que los datos se recojan en 31 intrvalos de longitudes de onda (los cortes van de 400 nm, 410 nm, 420 nm 700 nm). Esto se consigue haciendo pasar la luz a travs de un dispositivo monocromtico que fracciona la luz en distintos intrvalos de

longitudes de onda. El instrumento se calibra con una muestra o loseta blanca cuya reflectancia en cada segmento de longitudes de onda se conoce en comparacin con una superficie de reflexin difusa perfecta. La reflectancia de una muestra se expresa como una fraccin entre 0 y 1, o como un porcentaje entre 0 y 100. Es importante darse cuenta de que los valores de reflectancia obtenidos son valores relativos y, para muestras no fluorescentes, son independientes de la calidad y cantidad de la luz usada para iluminar la muestra. As, aunque los factores de reflectancia se midan usando una fuente de luz concreta, es perfectamente correcto calcular los valores colorimtricos para cualquier iluminante conocido.

CUANTIFICACION EN ELECTROFORESIS EN GEL

La electroforesis es una tcnica habitual en el laboratorio clnico. Permite separar especies qumicas (cidos nucleicos o protenas) a lo largo de un campo elctrico en funcin de su tamao y de su carga elctrica. Los cidos nucleicos, ADN y ARN, tienen por naturaleza carga negativa. Si ponemos fragmentos del ADN extrado de una muestra biolgica sobre un soporte poroso (gel) y aplicamos un campo elctrico, se producir la migracin diferencial de los fragmentos a travs de los poros de la matriz. La tincin del gel con bromuro de etidio, que es una sustancia fluorescente que se intercala en la molcula de ADN, y la exposicin con luz ultravioleta, permite observar el resultado de sta migracin. El tamao de los fragmentos de ADN se puede estimar comparndolos con el patrn de bandas que se obtiene de marcadores comerciales de peso molecular conocido. La electroforesis de ADN es til para comparar patrones de bandas de diferentes muestras biolgicas. As por ejemplo se puede usar para comparar muestras de individuo sano frente a individuo enfermo, para la identificacin de cidos nucleicos de agentes infecciosos o para la obtencin de un fragmento determinado de ADN que, una vez localizado en el gel, puede ser extrado para anlisis posteriores. Los pasos son los siguientes. 1. Colocar en un tubo 5 l de la muestra y 5 l de azul de mercaptoeptanol.

2. Cargar las muestras en los pozos del gel (10 l), con una micro pipeta y puntas largas descartables para geles. Se utiliza la misma punta para cargar todas las muestras haciendo varios lavados de la misma con agua bidestilada entre cada muestra. Es fundamental realizar este paso sin que haya contaminaciones cruzadas entre los distintos pozos. Esto se evita depositando las muestras despacio pero de forma continua en los pozos. Tambin se debe incluir el marcador de PM en uno de los carriles laterales, como referencia. 3. Llenar la cmara con el amortiguador de corrida: 180 ml en el tanque inferior y 120 ml en el superior. Colocar el gel en la cmara y correr las muestras a 200 V (voltaje constante) hasta que el azul de bromo fenol llegue casi al borde inferior del gel (aproximadamente 60 min). 4. Separar los vidrios que contienen el gel con cuidado. Sacar el gel y eliminar la parte del gel. 5. Observar el corrimiento del gel y la apreciacin del ADN.

PCR (REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA)

Permite la amplificacin directa de segmentos especficos y puede utilizarse en fragmentos de DNA que estn presentes inicialmente en cantidades pequeas. Se basa en la amplificacin de un segmento de DNA utilizando ADN polimerasa y cebadores, oligonucletidos que hibridan con la cadena complementaria de la secuencia a amplificar. Procedimiento Existen 3 pasos fundamentales en la reaccin de PCR y la cantidad de DNA amplificado: 1. El DNA que se quiere amplificar se desnaturaliza en cadenas sencillas. Este DNA no necesita estar purificado ni clonado, y puede provenir de distintas fuentes, el DNA de doble cadena se desnaturaliza por calor (a unos 90 C) hasta que se disocia en cadenas sencillas. 2. Los cebadores hibridan al DNA de cadena sencilla. Estos cebadores son oligonucletidos sintticos que hibridan con las secuencias flanqueantes del segmento a amplificar. Generalmente se utilizan 2 cebadores diferente cada uno de ellos tiene la secuencia complementaria a una de las cadenas de DNA. Los cebadores se alinean con sus extremos 3` complementarios ya que hibridan en cadenas opuestas.. utilizacin de cebadores sintticos significa que se debe tener alguna informacin de la secuencia de DNA a amplificar 3. A la mezcla de reaccin se le aade una DNA polimerasa resistente al calor (polimerasa Taq). La polimerasa extiende los cebadores en direccin 5 ` a 3 , utilizando como molde al DNA de cadena sencilla unido al cebador , el producto es un molcula de DNA de doble cadena con los cebadores incorporados en el producto final.

RESULTADOS Cuantificacin en el espectrofotmetro

# muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Tipo muestra Sangre Sangre Sangre Sangre Sangre Sangre Sangre Sangre Vaginal Vaginal 260nm 280nm Relacin ADN 0.929 1.008 1.038 1.073 0.932 0.893 0.956 1.065 0.705 6.000 DNA g/ml 2.536 3.560 4.601 7.310 2.644 2.464 3.308 3.839 0.366 -1.024 Protena g/ml 95.86 102.6 120.2 171.5 99.04 106.8 113.4 92.48 44.81 8.975

0.105 0.131 0.163 0.249 0.109 0.109 0.131 0.132 0.031 -0.018

0.113 0.130 0.157 0.232 0.117 0.122 0.137 0.124 0.044 -0.003

Resultados de PCR en electroforesis en gel.

Describe que actividad realiza un especialista en Biologa o gentica Molecular :

otros 4% Vida y Salud 16% Moleculas y atomas 30%

DNA y Genes 50%

Que es el Dx molecular?
Con una idea 17%

Ni idea 83%

10

Consideras que el Dx molecular es til en el Dx clnico?

No 3%

Si 97%

No Indeciso 6% 5%

Te someteras a una prueba de Dx molecular?

Cmo visualizas el uso de pruebas basadas en tecnicas de B.M.?
NUNCA VA A CAMBIAR 25% VEN UN FUTURO OPTIMISTA 45%

Si 89%

IGUAL QUE EN LA ACTUALIDAD 30%

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