Manual Bac 1 Parte (2) Ago-Dic2011

BACTERIOLOGA I
QUMICO FARMACETICO BILOGO I.B.Q.DIANA ERIKA VZQUEZ MOLINA
PRCTICA No. 1 PREPARACIN DEL MATERIAL PARA ESTERILIZAR
INTRODUCCIN
La esterilizacin es un proceso mediante el cul se eliminan por remocin o muerte todos los organismos viables de un objeto, superficie o medio. Un objeto libre de cualquier forma de vida se dice que est estril. El concepto de esterilidad es absoluto, es decir no existe un material casi, ms o menos, o 99% estril. En el trabajo cotidiano de un laboratorio de microbiologa es necesario que todo el material como pipetas, tubos de ensaye, cajas de Petri de vidrio o de plstico, medios de cultivo y soluciones estn estriles. Debe cuidarse que el material esterilizado se conserve estril. As, antes de esterilizarse, a los matraces, tubos y dems recipientes se les pone un tapn de algodn que evitar el acceso de microorganismos del ambiente al interior. Tambin es necesario proteger este tapn con papel para evitar que se humedezca con agua de condensacin despus de esterilizar con calor hmedo. Algunos laboratorios utilizan tapones de plstico o metlicos en lugar de algodn con la misma finalidad. Existen varios mtodos fsicos y qumicos de esterilizacin, la seleccin de uno o de otro depende de la naturaleza del material que se piensa esterilizar (tabla 1). Por ejemplo, la esterilizacin con calor hmedo, generalmente se realiza en un autoclave a 121 C durante 15 minutos, la temperatura se alcanza utilizando vapor de agua a una presin de15 lb/pulg2 (2 atm). Estas condiciones de esterilizacin con calor hmedo pueden variar de acuerdo con el volumen, tipo de la autoclave y naturaleza del material por esterilizar (Fig. 1) LOS RECIPIENTES QUE SE ESTERILIZAN EN LA ESTAR HERMTICAMENTE CERRADOS. AUTOCLAVE NO DEBEN
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Tabla 1. Mtodos de esterilizacin Hmedos Vapor a presin (autoclave) Aire caliente (horno) Calor seco flameado incineracin Mtodos fsicos Radiaciones ionizantes Filtracin No ionizantes Discos de membranas Rayos ultravioleta Rayos infrarrojos Rayos x Rayos (cobalto-60) Gases Mtodos qumicos lquidos xido de etileno Formaldehdo,-propiolactona
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Figura 2.Esquema del sistema de esterilizacin por filtracin
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Figura 3. Micropipeta de volumen variable
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La muerte de los organismos contaminantes ocurre principalmente por desnaturalizacin de las macromolculas (protenas, RNA y DNA) y coagulacin de protenas. La esterilizacin con calor seco se usa principalmente para material de vidrio y materiales slidos estables al calor, requiere mayor duracin e intensidad porque la conduccin del calor es menos rpida que en un ambiente hmedo. La temperatura que se utiliza es generalmente entre 160 y 180 C durante 1.5 horas. Las cajas de Petri de vidrio y las pipetas se colocan en cilindros de metal con aberturas que permiten el paso del aire caliente. La inactividad de los contaminantes ocurre por prdida de agua y oxidacin de todos sus componentes esenciales. La filtracin a travs de membranas se usa para estilizar soluciones de sustancias termolbiles en donde los microorganismos son retenidos en el filtro. El filtrado estril debe recibirse en un recipiente tambin estril (fig. 2). Los virus y algunos tipos de bacterias muy pequeas como Bdellovibrio, Ricketttsias, Clamidias y algunas espiroquetas atraviesan estos filtros de membranas. En las campanas de flujo laminar que se usan como reas estriles en el trabajo microbiolgico, el aire se esteriliza por filtracin a travs de mallas de fibras de diversos materiales (filtros absolutos). Para el control de la contaminacin proveniente del aire en espacios limitados, se ha usado la radiacin ultravioleta, pero por su escaso poder de penetracin, solo se le ha usado para la esterilizacin de superficies y lminas muy delgadas de agua transparente, incolora y sin excesos de sales de fierro. El gas xido de etileno y las radiaciones ionizantes son utilizados para esterilizar material de plstico sensible al calor, porque este gas difunde fcilmente a travs de polietileno, papel y cartn. Por esta razn se han usado radiaciones ionizantes como las del
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Co para esterilizar artculos de plstico ya envueltos, como las jeringas
hipodrmicas. Estos agentes no se recomiendan para esterilizar soluciones o medios de cultivo. Para determinar la eficiencia del proceso de esterilizacin se emplean los indicadores biolgicos de esterilizacin. Especficamente, cuando se esteriliza con calor hmedo se utilizan, junto al material que se esteriliza,
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ampollas que contienen esporas viables de Bacillus stearothermophilus que son inactivadas a 121 C durante 12 minutos. Despus de la esterilizacin, se incuban las esporas y se analiza si estas sobrevivieron o no al proceso de esterilizacin. Tambin existen cintas que con el cambio de un indicador qumico muestran si se alcanzaron las condiciones de la esterilizacin por calor o por xido de etileno.
OBJETIVO Preparar para esterilizar el material de vidrio ms usado en el laboratorio de Microbiologa. Conocer el material y equipo ms comn para la esterilizacin y el trabajo en condiciones de esterilidad.
MATERIAL 1 Matraz Erlenmeyer con 100 ml de agua destilada. 2 Tubos de ensaye de 16 x 150 mm. con tapn de rosca 2 Tubos de ensaye de 13 x 100 mm con tapn de rosca 3 Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 ml. Micropipetas automticas de 200 y 1000 l (Fig. 3) Puntas para micropipetas de 200 y 1000 l. Cajas esterilizables para puntas de micropipetas de 200 y 1000 l 10 Cajas de Petri de vidrio. Algodn, papel de envoltura, pinzas, tijeras, ligas, clips y canastillas metlicas.
Para la parte demostrativa: Equipo Millipore de esterilizacin por filtracin; filtros de 25 mm de dimetro y 0.22 m de poro para esterilizar soluciones; tapones de plsticos o metal para tubos de ensaye; pipeteros y recipientes metlicos para cajas de Petri. METODOS I. Preparacin de tubos de vidrio y matraces para esterilizar en la autoclave. 1. Colocar con una pipeta de 10ml de capacidad, de 9 ml de agua destilada en cada uno de los tubos de 16 x 150 mm
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2. Tanto a estos tubos con agua como a los de 13 x 100 mm vacos y matraces hacerles a cada uno un tapn de algodn con ayuda de las pinzas como lo indicar el profesor. 3. Colocar los tubos en una canastilla y cubrirlos con papel de envoltura. 4. Anotar en el material preparado: nombre, equipo, seccin y grupo.
II. Preparacin de pipetas para esterilizaren la autoclave. 1. Colocar en la boca de la pipeta un filtro de algodn con la ayuda de un clip desdoblado. EL ALGODN NO DEBE QUEDAR NI MUY APRETADO NI MUY FLOJO, DEBE PERMITIR EL PASO DEL AIRE PERO SIN MOVERSE. 2. Flamear con el mechero de algodn que sobresale de la boquilla de la pipeta. 3. Envolver con papel cada pipeta siguiendo las instrucciones del profesor. 4. Marcar en la envoltura el volumen, valor de las subdivisiones menores y si es Terminal o no.
III. Preparacin de cajas de Petri para esterilizar. Es preferible la esterilizacin de las cajas por medio de calor seco, aunque tambin es posible el uso del calor hmedo. 1. Colocar 10 cajas de Petri de vidrio en dos pilas de cinco. 2. Envolverlas con papel siguiendo las instrucciones del profesor. 3. Anotar los datos necesarios para su fcil identificacin.
La esterilizacin de los medios y materiales usados en Microbiologa y las buenas prcticas para mantenerlos estriles son muy importantes debido a que la mayora del trabajo se realiza con cultivos puros (que contienen una sola especie o cepa de microorganismo) cualquier microorganismo no deseado que por una mala esterilizacin o por descuido en las condiciones de trabajo, crezca en el cultivo o medios esterilizados se denominan contaminantes.
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IV. Ensamble del sistema Millipore de filtracin (demostrativo). 1. El profesor enseara el equipo Millipore de filtracin y explicar cmo funciona. Asimismo se mostraran algunos soportes para filtros y membranas para la esterilizacin de soluciones. V. Visita a las autoclaves del laboratorio de preparacin de medios de cultivo. 1. Acudir acompaados del profesor a conocer las autoclaves usadas para esterilizar el material nuevo o de desecho. Los alumnos conocern la campana de flujo laminar ya que es un equipo necesario e indispensable para trabajar de manera eficiente y con mayor seguridad en las prcticas de bacteriologa.
CUESTIONARIO 1. Cul es el mtodo ms apropiado para esterilizar el siguiente material?
MATERIAL Solucin de vitaminas Cajas de Petri de plstico de desecho Aceite mineral Sangre para transfusin Ropa contaminada Cajas de Petri de plstico limpias Talco Instrumental de ciruga Sangre de desecho Cadveres de animales de experimentacin de laboratorio
METODO
2. Con qu finalidad se les pone a las pipetas un filtro de algodn? 3. Cmo deben obtenerse los lquidos biolgicos (por ejemplo sangre) para preparar un medio de cultivo?
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4. Cul es el indicador biolgico utilizado en el mtodo de esterilizacin con xido de etileno? 5. Cul es el dimetro del poro en los filtros de steres de celulosa utilizados para esterilizar por filtracin? Cunto mide una bacteria de las ms pequeas que se conocen? 6.- Dibuje el autoclave del laboratorio con sus partes y su funcin.
LECTURAS RECOMENDADAS
1. Breach, M. R.1976. Esterilizacin: Mtodos de control. Ed. El manual moderno, S. A. 2.Gerhardt, P.(Ed). 1994. Manual of Methods for General and Molecular 3.Bacteriology. American Society for Microbiology. Washington, D. C. pp. 715734.
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PRCTICA No. 2 ESTERILIZACIN DEL MATERIAL
INTRODUCCION
El crecimiento de microorganismos est influenciado por factores ambientales como la temperatura, el pH, la disponibilidad de agua y la presencia o ausencia de oxgeno. Dichos factores no solamente afectarn el crecimiento de los microbios en su medio ambiente, sino que tambin pueden ser utilizados para controlar o eliminar su crecimiento en el laboratorio. La esterilizacin implica la muerte o remocin de todo organismo viviente, un requisito necesario para la preparacin de medios de cultivo. Los medios no estriles no son adecuados para el cultivo de microorganismos, dado que pueden contener organismos no deseados y que enmascaran el crecimiento de organismos diana. OBJETIVO Conocer la importancia de la esterilizacin durante los procesos y/o procedimientos microbiolgicos, a travs del empleo del calor hmedo. NORMAS DE SEGURIDAD Tipo de riesgo Quemadura por vapor de agua Como evitarlo Protegerse con la bata de manga larga No abrir la vlvula de escape de vapor abruptamente, sobre todo si hay personas cerca del autoclave Como proceder en caso de accidente Sumergir de inmediato en agua fra la parte afectada. Aplicar una crema con algn antibitico como sulfadiacina de plata y luego cubrir con una gasa para proteger del polvo y otras lesiones.
MATERIAL 2 matraces Erlenmeyer de 500 ml. 6 tubos de ensaye de 16 x 150 mm con tapn de rosca 2 pipetas graduadas de 10 ml. 1 vaso de precipitado de 600 ml 1 agitador de vidrio 2 vidrios de reloj 2 cajas Petri desechable estriles Tripie Tela de asbesto Probeta graduada de 500 ml 2 esptulas Balanza granataria
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Mechero Fisher 1 gradilla Agar nutritivo Caldo nutritivo Agua destilada Papel pH Incubadora Campana de flujo laminar Autoclave PROCEDIMIENTO SESIN 1: 1. Siguiendo las instrucciones del fabricante, realice los clculos necesarios para preparar 60 ml de agar nutritivo y 25 ml de caldo nutritivo. 2. Aada a los matraces Erlenmeyer el volumen de agua destilada necesaria y proceda a pesar en balanza granataria la cantidad de medio de cultivo deshidratado. Aada el polvo al matraz y agite ligeramente para favorecer la disolucin del medio. 3. Caliente los medios de cultivo hidratados hasta que note que empieza a hervir. Retire de inmediato de la llama del mechero para evitar proyecciones y vuelva a calentar hasta que vuelva a ebullir. 4. Agar nutritivo. Aadir 6 ml de agar a dos tubos de 16 x 150 mm. Inmediatamente deje uno de los tubos en forma inclinada hasta formar el pico de flauta. Esterilice el otro tubo en autoclave. Por otro lado aada ~20 ml a una caja Petri no estril y la misma cantidad a una caja Petri estril. 5. Someter todo el material a prueba de esterilidad en incubadora a 37oC durante 24 h. 6. Caldo nutritivo. Preparar 25 ml de caldo nutritivo, disolver y calentar hasta que hierva dos veces y distribuir de la manera siguiente: 7. Aadir 6 ml de caldo a 4 tubos de 16 x 150 mm. A dos tubos someterlos al autoclave y no introducir al autoclave los restantes. 8. Esterilizar el material correspondiente en autoclave durante 15 min. a 15 lb de presin y 121oC. 9. Luego de haber sacado el material que se introdujo en el autoclave, deje gelificar el tubo que contiene agar nutritivo en forma inclinada hasta formar el pico de flauta. Colocar todo el material a prueba de esterilidad en incubadora a 37oC durante 24 h. Sesin 2 1. Sacar todo el material de la incubadora y leer los resultados registrando si hubo o no desarrollo microbiano en cada uno de los tubos y cajas Petri. 2. Luego de anotar sus observaciones, esterilice el material sucio bajo las condiciones anteriores, lave perfectamente y entregue al encargado de laboratorio.
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NORMAS DE BIOSEGURIDAD
Tipo de desechos Cultivos microbianos Como descartarlos Esterilice en autoclave de acuerdo a las instrucciones del docente Tipo de contenedor El sealado por el tcnico del laboratorio
CUESTIONARIO 1. Describa otros mtodos fsicos que se emplean para esterilizar. 2. Explique la importancia de la tcnica asptica. 3. En qu consiste la Pasteurizacin? 4. De qu forma podemos evaluar la eficiencia de esterilizacin de una autoclave? 5. Cul es el modo de accin de los desinfectantes y antispticos?
REFERENCIAS DOCUMENTALES Forbes, B.A., Sahm, D.F., and A.S. Weissfeld. 2002. Bailey & Scotts Diagnostic microbiology. 11th ed. Mosby. U.S.A. 1069 pp. Koneman, E.W., Allen, S.D., Dowell, V.R., Janda, W.M., Sommers, H.M., and W.C. Winn. 1988. Diagnstico microbiolgico. 3ra. Ed. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. 909 pp. Lim, D. 1998. Microbiology. 2nd. Ed. WCB McGraw-Hill. U.S.A. 720 pp.
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PRCTICA No. 3 PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

INTRODUCCION Los tipos bsicos de medios de cultivo para el crecimiento de microorganismos incluyen a los medios complejos (no definidos) y sintticos (qumicamente definidos). En un medio complejo, la composicin qumica no est bien conocida, dado que contienen nutrientes como extractos animales (p. ej., extracto de levadura) que son ricos en vitaminas, aminocidos, minerales y otros constituyentes como las peptonas (digeridos proteicos). Estos medios por lo general se encuentran comercialmente de forma deshidratada y son reconstituidos con agua destilada para obtener caldos nutritivos que fomenten el crecimiento microbiano. Los medios sintticos son generalmente utilizados para estudiar los requerimientos nutricionales y caractersticas de una bacteria, dado que se conoce la composicin qumica exacta. OBJETIVO Que el alumno adquiera habilidad para la preparacin de medios de cultivo comerciales en fase lquida, semislida y slida, as como comprender las diferencias entre los medios complejos y sintticos para fomentar el crecimiento microbiano. MATERIAL 20 tubos de ensaye con tapn de rosca de 13 x 100 mm 4 cajas Petri desechables estriles 2 pipetas graduadas de 10 ml 1 probeta graduada de 100 ml 4 matraces Erlenmeyer de 500 ml 1 vaso de precipitado de 600 ml 2 vidrios de reloj Agitador de vidrio 2 esptulas Tripie Tela de asbesto Mechero Fisher Gradilla Caldo nutritivo Agar nutritivo Cinta indicadora de ph Agua destilada Autoclave Incubadora Campana de flujo laminar
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PROCEDIMIENTO Sesin 1. Preparacin de caldo nutritivo. 1. Siguiendo las instrucciones del fabricante, realice clculos para preparar 5 tubos con caldo nutritivo. Considere un volumen de 3 ml por tubo. Utilice tubos de ensaye con tapn de rosca. 2. Con una probeta, mida el volumen de agua destilada requerida para la preparacin del caldo. Decante en un matraz Erlenmeyer. 3. Agregue el medio deshidratado (en polvo) rpidamente al agua, por la higroscopa de los medios deshidratados. Disuelva con agitacin suave. 4. Someta el matraz a ebullicin (2 ebulliciones) calentando en un tripi y con mechero. 5. Inmediatamente despus de la ebullicin, distribuya con pipeta serolgica (utilizando una perilla) el volumen requerido de caldo para cada tubo. Tape sin apretar demasiado. 6. Someta a esterilizacin a 15 lb, 121 C durante 15 min. 7. Luego del ciclo de esterilizacin, permita que se enfren los tubos a temperatura ambiente y someta a prueba de esterilidad en incubadora a 37 C durante 24 h.
Preparacin de agar nutritivo. 1. Siguiendo las instrucciones del fabricante, realice clculos para preparar 5 tubos y 2 placas de Petri con agar nutritivo. Considere un volumen de 3 ml por tubo y de 20 ml para cada placa. Utilice tubos de ensaye con tapn de rosca. 2. Con una probeta, mida el volumen de agua destilada requerida para la preparacin del agar y decante en el matraz Erlenmeyer. 3. Aada el medio deshidratado al agua y disuelva con agitacin suave. 4. Someta el matraz a 2 ebulliciones con un tripi y mechero. 5. Inmediatamente despus de la ebullicin, distribuya con pipeta serolgica (utilizando una perilla) el volumen requerido de agar para cada tubo. Tape sin apretar demasiado. 6. Cubra el matraz Erlenmeyer (con el remanente de agar nutritivo) con un tapn de gasa-algodn o con papel aluminio. 7. Someta a esterilizacin a 15 lb, 121 C durante 15 min. 8. Luego del ciclo de esterilizacin, deje gelificar los tubos en posicin inclinada hasta formar un pico de flauta. Para vaciar el agar en las placas Petri, permita que se enfre el medio de cultivo hasta una temperatura aproximada de 40 C (soportable al tacto) y vace en campana de flujo laminar o en presencia de mechero. 9. Someta a prueba de esterilidad en incubadora a 37 C durante 24 h. Preparacin de medio semislido y slido a partir del caldo nutritivo.
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1. Siguiendo las instrucciones del fabricante, realice clculos para preparar 10 tubos con caldo nutritivo comercial. Considere un volumen de 3 ml por tubo. Utilice tubos de ensaye con tapn de rosca. 2. Divida el sendos matraces 5 ml del caldo nutritivo. 3. Para preparar medio semislido, a uno de los matraces aada agar bacteriolgico al 0.7 % 4. Para preparar medio slido, agregue al otro matraz agar bacteriolgico a una concentracin del 1.5% 5. Someta ambos matraces a ebullicin (2 ocasiones) e inmediatamente distribuya con pipeta 3 ml por tubo. No apriete demasiado los tapones. 6. Someta el material a la autoclave a 15 lb, 121 C durante 15 min. 7. Luego del ciclo de esterilizacin, deje melificar en posicin vertical. 8. Someta el material a prueba de esterilidad incubando a 37 C durante 24 h. CUESTIONARIO 1. Investigue cmo surgi la placa de Petri en la microbiologa. 2. Cul es el agente que favorece la solidificacin en los medios de cultivo y de donde se obtiene? 3. Cul es la utilidad de preparar medios de cultivo en forma de pico de flauta? 4. Por qu es importante dejar un espacio considerable entre el caldo y la superficie del recipiente que lo contiene? 5. Qu implicaciones habran si se vierte el medio de cultivo muy caliente en las placas de Petri? 6. Qu es un medio de cultivo; de qu estn compuestos principalmente; cmo se clasifican segn su proporcin de Agar y segn su suministro de nutrientes? 7. Cul es la utilidad de los medios de cultivo y qu diferencia un caldo de un medio slido?
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PRCTICA No. 4 SIEMBRA DE MICROORGANISMOS EN MEDIO SOLIDO Y LQUIDO

INTRODUCCION
Todos los organismos requieren de nutrientes (fuentes de carbono y energa) para su crecimiento y reproduccin. Dichas sustancias qumicas pueden ser orgnicas e inorgnicas y se encuentran en el medio ambiente de varias formas. Los microorganismos los utilizan al tomarlos del medio ambiente y transportndolos al interior de la clula. Bajo condiciones in vitro, los nutrientes y factores fsicos (temperatura, pH, oxgeno) se combinan con el propsito de proveer un ambiente adecuado para el crecimiento de organismos. Los medios de cultivo varan en su composicin, dependiendo del tipo de bacteria cultivada as como el ambiente a partir del cual dicho organismo fue obtenido. OBJETIVO Que el alumno aprenda a sembrar o inocular microorganismos en medios de cultivo complejos. MATERIAL Placas con agar nutritivo estril Tubos de ensayo estriles con caldo nutritivo Mechero Fisher Asas bacteriolgicas Muestra de agua encharcada Cepa pura de microorganismo Incubadora Autoclave PROCEDIMIENTO Sesin 1. 1. Con tcnica asptica, esterilice un asa bacteriolgica, permita que se enfre y tome dos gotas de una muestra de agua encharcada. 2. Inocule el agua encharcada en un caldo nutritivo. 3. Con el asa bacteriolgica, tome dos gotas de la muestra de agua encharcada y deposite sobre la superficie de un agar nutritivo en forma de zigzag. 4. Con una aguja bacteriolgica (previamente esterilizada a la llama del mechero), moje la punta de sta con la muestra de agua encharcada e inocule tubos con medio semislido y slido. La inoculacin para ambos medios se
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realice introduciendo la aguja en el medio sin tocar el fondo del tubo, retirando la aguja por el mismo sitio por donde se introdujo. 5. Incube todo el material a 37 C durante 24 h. Sesin 2. 1. Examine el caldo nutritivo en bsqueda de crecimiento microbiano, lo cual se pondr de manifiesto mediante la aparicin de turbidez del mismo, o presencia de flculos en el fondo del caldo. 2. Examine las placas Petri con agar nutritivo en bsqueda de crecimiento microbiano. ste se registrar como tal si aparecen colonias microbianas sobre la superficie del agar. 3. Examine los medios semislido y slido en bsqueda de crecimiento microbiano (efectuar la inspeccin con luz natural). Si existe, los medios adquieren una turbidez apreciable a la examinacin con la luz solar. 4. Esterilice todo el material en autoclave a 15 lb, 121 C durante 15 min. 5. Luego del ciclo de esterilizacin, permita que se enfra el material, lave con jabn y entregue el material al responsable del laboratorio. Proceda en la misma forma que en la siembra anterior pero con el asa de argolla. Si la siembra es en tubo recuerde hacer puncin y estra. Si es en caja puede utilizar diferentes sistemas como estra, agotamiento, rejilla con el fin de lograr un cultivo puro. Siembra de medio slido a slido Proceda de la misma forma que en la siembra anterior pero utilizando el asa recta. Los medios slidos contienen agar en proporcin de 1.5 a 2.0% y se emplean para obtener colonias aisladas. Las placas de agar se pueden inocular mediante varios mtodos: como estras, agotamiento y rejilla con el fin de lograr un cultivo puro. Siembra en rejilla Realice una estra que atraviese el centro del agar. Luego realice estras en ngulo recto con respecto a la estra inicial. Voltee el agar en ngulo de 90 grados y realice estra hasta cubrir todo el agar. Siembra por agotamiento Tome una placa de agar, marque la base de la caja de petri con los nmeros 1, 2 y 3. Coloque la muestra a sembrar en el numero 1, realice estras hasta la mitad de la caja. Esterilice el asa y gire la caja hasta el numero 2, tome las dos ltimas estras y siga estriando hasta el numero 3. Gire la caja y termine de estriar, tenga cuidado de no tocar las estras ya hechas.
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Siembra por estras Marque la caja en 6 puntos. Coloque la muestra en el punto nmero uno, realice estras hasta el numero 2. Esterilice el asa, tome las dos ltimas estras y extindalas hasta el numero 3, tome las dos ltimas estras y extindalas hasta el numero 4 y as sucesivamente hasta llegar al nmero 6. Siembra masiva Tome un hisopo estril e introdzcalo en el tubo que contiene la muestra a sembrar, luego frote toda la superficie del agar. Le evaluacin del crecimiento en las placas de agar se hace a travs de la observacin de colonias en la superficie . Siembra en agar inclinado Esta se realiza por puncin y por estra. Por puncin: Introduzca el inoculo con el asa recta hasta el fondo del medio con un solo movimiento y teniendo cuidado de hacer el mismo trayecto de entrada que de salida. Por estra: Extienda el inoculo sobre el agar inclinado deslizando suavemente el asa por la superficie en forma de zigzag. No olvide flamear la boca del tubo antes y despus de la siembra. Evalu la presencia de crecimiento en el agar por la formacin de una pelcula o por el crecimiento de colonias en la superficie. Siembra en profundidad Marque la caja de Petri estril con el nmero de grupo, la fecha y siembra en profundidad. Abra ligeramente la caja de Petri cerca del mechero. Abra un tubo con cultivo de bacterias y con ayuda de una pipeta de Pasteur plstica, transfiera 1 ml de ste cultivo a la base de la caja de Petri estril. Descarte la pipeta en el frasco de boca ancha con clorox. Vierta un poco de agar nutritivo en la caja de Petri, tape la caja y luego realice movimientos suaves sobre el mesn, en el sentido de las agujas del reloj, luego al contrario, en forma de L y L invertida, y por ltimo en forma de 8. Esto garantiza una distribucin homognea de las bacterias en todo el agar para facilitar su posterior recuento. Envuelva las cajas de Petri y los tubos con cinta de enmascarar, mrquelos con el nmero de grupo, la fecha. Luego incube 37 c por 48 horas.
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NORMAS DE SEGURIDAD
Tipo de desechos Cultivos microbianos
Como descartarlos Esterilice en autoclave de acuerdo a las instrucciones del docente
Tipo de contenedor El sealado por el tcnico del laboratorio
CUESTIONARIO 1. Cul es la utilidad de sembrar a los microorganismos? 2. Con qu mtodos pueden estudiarse a microorganismos viables no cultivables? 3. se cumple para todos los microorganismos el postulado de Koch que se refiere a poder cultivarlos de forma pura? En qu casos no se cumple? 4. Cmo se sembraban los microorganismos antes de que surgiera la placa de Petri? 5. Qu sustancias se empleaban en los medios de cultivo antes de utilizar el agar?
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PRCTICA No. 5 AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

INTRODUCCION Los microorganismos generalmente se encuentran en la naturaleza en forma de poblaciones mixtas, incluso, algunos microorganismos no pueden ser cultivados en el laboratorio por su dependencia para coextistir en su ambiente natural con otros organismos. Los medios de cultivo proporcionan nutrientes bsicos con la finalidad de recuperar a los organismos a partir de diversos nichos (biolgicos o no) para poder estudiarlos y caracterizarlos. OBJETIVO Que el alumno aprenda diferentes tcnicas de aislamiento para caracterizar e identificar diferentes microorganismos que coexisten en diversos nichos biolgicos. MATERIAL 3 tubos de ensaye con tapon de rosca de 13 x 100 mm 2 cajas Petri desechable estriles 2 pipetas graduadas de 10 ml 1 probeta graduada de 100 ml 4 matraces Erlenmeyer de 600 ml 1 agitador de vidrio 1 tripie 1 tela de asbesto 1vidrio de reloj 1 mechero Fisher 1gradilla Caldo nutritivo Agar nutritivo Agua destilada Incubadora Campana de flujo laminar Autoclave Varilla acodada PROCEDIMIENTO Sesin 1. Preparar 3 tubos de 13 x 100 mm con 2 ml de caldo nutritivo, 6 placas con agar nutritivo y 3 placas con agar de sal y manitol. Esterilizar 4 pipetas Pasteur.
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Sesin 2. Aislamiento por estra cruzada. El propsito es que la mayora de microorganismos que estn adheridos en el asa se depositen durante las estras procurando que stas no se crucen. Las colonias mejor aisladas quedan en las ltimas lneas del trazado (Fig. 1). Sembrar mediante esta tcnica las cepas de E. coli en agar nutritivo y la de S. aureus en agar de sal y manitol. Sembrar el cultivo mixto (E. coli + K. pneumoniae) en una placa de agar nutritivo. 1. Depositar en un rea de la placa de medio de cultivo slido una asada de la muestra o cultivo mixto proporcionado en caldo. 2. Extender el inculo con el asa haciendo varios trazos en forma de secante cada vez mayor de la orilla hacia el centro, pero solamente a una distancia de 1-2 cm de la orilla. 3. Esterilizar el asa y dejar enfriar. Rotar la placa ligeramente y realizar nuevamente una serie de estras que deben extender una pequea porcin de la primera serie en forma similar con trazos que vayan de la orilla al centro. 4. Repetir la operacin dos o tres veces ms y en la ltima se hace una serie de estras abiertas que termine en o cerca del centro, procurando que no se toquen las estras anteriores. Finalmente realizar incisiones en el agar a fin de estudiar reacciones hemolticas. 5. Incube las cajas en posicin invertida a 37oC durante 24-48 h. Tcnica de diseminacin (recuento semicuantitativo) Sembrar la cepa de E. coli en agar nutritivo, la de S. aureus en agar de sal y manitol y el cultivo mixto (E. coli + K. pneumoniae) en agar nutritivo. 1. Emplear asas de inoculacin calibradas para contener 0.01 y 0.001 ml de lquido. 2. Esterilizar a la flama el asa bacteriolgica, permita que se enfre e introduzca una sola vez y en forma recta en la muestra lquida a estudiar. 3. Retirar con cuidado el asa y transfiera todo el volumen en el centro de la placa de agar, haciendo una sola estra a travs del centro. 4. Diseminar el inculo en ngulos rectos respecto de la estra primaria (Fig. 2). 5. Si se quiere obtener un crecimiento en enrejado, gire la placa 90o y disemine el inculo hasta cubrir toda la superficie (Fig. 2). 6. Incubar a 37oC durante 24-48 h. Aislamiento mediante varilla de vidrio acodada. 1. Doble una tercera parte de la varilla de vidrio hueca que le proporcionaron con la flama del mechero, de tal manera que forme un ngulo de aproximadamente 90. Permita que la varilla se enfre y mantenga el brazo corto de la varilla en alcohol. 2. Efectuar diluciones cualitativas de todas las cepas proporcionadas (E. coli, E. coli + K. pneumoniae y S. aureus) tomando con la pipeta Pasteur cierta cantidad del cultivo lquido. 3. Aada de 3-4 gotas al tubo que contiene 2 ml de caldo nutritivo.
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BACTERIOLOGA I
4. Siembre con la tcnica de varilla acodada la cepa de E. coli en una placa de agar nutritivo, el cultivo mixto en otra placa de agar nutritivo y la cepa de S. aureus en la placa de agar de sal y manitol. 5. Esterilice a la flama el asa bacteriolgica, tome el inculo del caldo y deposite la gota en el centro del agar. Si se dispone de pipeta automtica y puntas estriles, aadir 50-100 ml del inculo y depositarlo en el centro del agar. 6. Introduzca el brazo ms corto de la varilla acodada en alcohol al 70% y exponga a la llama del mechero durante unos segundos (Fig. 3). 7. Permita que la varilla se enfre unos segundos y luego utilice el brazo corto de la varilla para dispersar uniformemente la gota sobre la superficie completa del agar. 8. Invierta la caja Petri, etiquete correctamente e incube a 37oC durante 24-48 hr.
Fig. 1. Aislamiento de colonias por estra cruzada. 1) el material se deposita en un extremo del agar; 2) luego del inculo primario, se esteriliza el asa y se vuelven a realizar estras casi en ngulo recto con respecto a las estras anteriores; 3) se vuelve a repetir la misma operacin anterior, aunque procurando que las estras estn cada vez ms separadas entre s; y 4) se finalizan las estras casi en el centro del agar (Tomado de Koneman et al. 1992. Diagnstico microbiolgico. 3ra. Ed. Panamericana, Buenos Aires, Argentina).
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BACTERIOLOGA I
Fig. 2. Tcnica de diseminacin. 1) inoculacin primaria. 2) estras en ngulo recto, y 3) estra en ngulo recto para producir una estera de desarrollo (Tomado de Koneman et al. 1992. Diagnstico microbiolgico. 3ra. ed. Panamericana, Buenos Aires, Argentina).
Fig. 3. Tcnica de la varilla acodada. 1) se introduce la parte acodada en etanol; 2) Se lleva a la flama del mechero; 3) la parte acodada se esteriliza con fuego y 4) se permite que se enfre para luego poder distribuir el inculo previamente depositado en el centro del agar.
Sesin 3. Realizar observaciones. Estra cruzada. Observe los resultados y trate de identificar colonias aisladas de cada una de las cepas. Tcnica de diseminacin.
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BACTERIOLOGA I
Estimar el nmero de bacterias en la muestra contando el nmero de colonias que aparecen en la superficie del medio. Si se us el asa de 0.01 multiplicar por 100; si se emple la de 0.001 ml multiplicar por 1000. De esta forma se obtiene el nmero de unidades formadoras de colonia por mililitro (UFC/ml). Varilla acodada. Describir la forma de distribucin de las colonias. Esterilizar todo el material sucio y entregar al laboratorio. NORMAS DE BIOSEGURIDAD Tipo de desechos Cultivos microbianos Como descartarlos Tipo de contenedor Esterilice en autoclave de El sealado por el tcnico acuerdo a las instrucciones del laboratorio del docente
CUESTIONARIO: 1. Defina los conceptos de cepa y colonia bacteriana. 2. Investigue otras tcnicas que permiten estimar la poblacin microbiana en una muestra 3. Qu sucedera si durante la tcnica de estra cruzada no se quema el asa? 4. En qu casos es til la tcnica de siembra con varilla acodada? 5. Cul es la utilidad del mtodo por diseminacin para la siembra de muestras biolgicas como la orina humana?
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BACTERIOLOGA I
PRCTICA No. 6 MORFOLOGA COLONIAL
INTRODUCCION:
Algunos medios de cultivo son de uso especial en microbiologa. Dichos medios especiales son tiles paran el aislamiento de organismos nutricionalmente exigentes que no pueden crecer tan rpidamente como otros, o bien se favorece el desarrollo de organismos especficos en tanto se inhibe el crecimiento de otros. Los medios diferenciales ayudan a distinguir entre diferentes organismos por sus rasgos metablicos y los medios selectivos contienen inhibidores para prevenir el crecimiento de organismos no deseados sin afectar la recuperacin del organismo diana. Paralelamente, el tamao, la forma, la pigmentacin y an el aroma de las colonias bacterianas que crecen sobre medios de cultivo slido, son elementos clave para la identificacin microbiana. OBJETIVO Que el alumno aprenda a reconocer las variedades de forma y agrupacin de bacterias, as como la utilidad de los indicadores qumicos presentes en algunos medios de cultivo para clasificar e identificar a los microorganismos. MATERIAL Asas bacteriolgicas Mechero bunsen Placas de cajas petri estriles Agar macConkey Agar eosina y azul de metileno Agar Salmonella-Shigella Agar sal y manitol Agar nutritivo Incubadora Autoclave Muestra de materia fecal de ave fresca Cepas PROCEDIMIENTO Sesin 1. 1. Preparar placas con agar de MacConkey, agar de eosina y azul de metileno (E.M.B.), agar Salmonella-Shigella (SS), agar de sal y manitol y agar nutritivo. Sesin 2.
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BACTERIOLOGA I
1. Sembrar por estra cruzada los microorganismos tipo proporcionados en los medios de cultivo. Adems de las cepas puras, incluir una muestra de materia fecal de ave fresca. 2. Incubar las placas con el medio hacia arriba a 37oC durante 24-48 h. Sesin 3. 1. Observar el tipo de crecimiento, y describir la morfologa colonial con base los criterios de la Fig. 4. 2. Esterilizar el material contaminado, lavar y entregar al laboratorista.
FORMA
ELEVACIN FORMA
MARGEN (Extremo de la colonia)
Fig. 4. Aspectos de la morfologa colonial para estudiar a los microorganismos.
NORMAS DE BIOSEGURIDAD Tipo de desechos Cultivos microbianos Como descartarlos Esterilice en autoclave de acuerdo a las instrucciones del docente Tipo de contenedor El sealado por el tcnico del laboratorio
CUESTIONARIO 1. Cmo funciona el opern lac en un microorganismo lactosa positivo y en un lactosa negativo? 2. Por medio de qu mecanismo los microorganismos haloflicos pueden soportar altas concentaciones de soluto? 3. En el caso de los medios de cultivo que emple en la presente prctica Qu ingredientes de la formulacin funcionan como inhibidores para determinado grupo de microorganismos? De qu manera estos inhibidores afectan a algunos microorganismos?
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BACTERIOLOGA I
4. Investigue algunos tipos de bacterias que elaboran pigmentos naturalmente. Cul es la utilidad de stos para dichos organismos? 5. A qu se le denomina swarming, qu bacterias pueden efectuarla y con qu finalidad?
REFERENCIAS DOCUMENTALES Forbes, B.A., Sahm, D.F., and A.S. Weissfeld. 2002. Bailey & Scotts Diagnostic microbiology. 11th ed. Mosby. U.S.A. 1069 pp. Lim, D. 1998. Microbiology. 2nd. Ed. WCB McGraw-Hill. U.S.A. 720 pp. Colonialmorphologyrev en www.microbelilibrary.org
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BACTERIOLOGA I
PRCTICA No. 7 TINCIN SIMPLE.
INTRODUCCIN
A lo largo de la historia se han usado muchas substancias naturales para dar color a diversos objetos, en especial a las telas. Hacia finales del siglo XVIII y durante el siglo XIX la produccin textil aument grandemente y como consecuencia tambin la demanda por materiales para teir. Para cubrir la necesidades de la industria se recurri a derivados de la anilina a la vez que la industria qumica desarrollo derivados del alquitrn con propiedades
satisfactorias; estn sustancias son los colorantes. Las tcnicas de tincin que se usan en microbiologa se desarrollaron como una necesidad para poner de manifiesto a las bacterias y sus estructuras, como ya se haba hecho en la observacin de clulas y tejidos diversos desde mucho tiempo antes. Los colorantes fueron usados por los microscopistas para mejorar el contraste entre los objetos que observaban y el medio que los rodeaba. Se aprovecharon las experiencias de la industria textil y de pieles para obtener mejores resultados. De tal modo que se desarrollaron mtodos de fijacin que favorecan unin de los colorantes con las estructuras celulares y mtodos adicionales con el mismo propsito, para lo cual se aplicaban ciertas sustancias, como los taninos, a las que se les denomin mordentes los cuales tambin facilitaban la tincin. Se desarrollaron tcnicas muy variadas, que tuvieron un fuerte impacto en las observaciones microscpicas, pues se utilizaron con gran xito en la tincin de las clulas que tomaban las sustancias colorantes permitiendo distinguir no solo a las clulas sino a muchas de las estructuras intracitoplasmticas en numerosos tejidos animales, vegetales y organismos microscpicos, lo que propicio un gran avance a ramas del saber como la histologa, patologa, citologa, botnica, zoologa y protozoologa. Tomando en cuenta que las bacterias son clulas muy pequeas y casi transparentes, que escapan a la observacin microscpica, su tincin es indispensable para conocerse forma, tamao y agrupacin.
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BACTERIOLOGA I
Los colorantes son sustancias que originalmente se derivaron de la anilina o del alquitrn; qumicamente estn constituidos por uno o ms arillos aromticos, los cuales tienen sustituyentes diversos llamados cromforos, que le dan la cualidad del color, a estos compuestos se les llama cromgenos; adems tienen un grupo funcional ionizable, llamado auxcromo que permite su unin a componentes de carga contraria presentes en las estructuras celulares y tejidos que se desea observar. Algunos ejemplos de colorantes usados en las tcnicas microbiolgicas son los siguientes: cristal violeta, azul de metileno, verde de malaquita, safranina, fucsina, azul de algodn, rojo congo; y algunos que no se usan para visualizar directamente bacterias pero se utilizan para contrastar estructuras en otros tipos de clulas son el cido
pcrico, el rojo neutro y la eosina. Se utilizan preferentemente algunos colorantes porque son bsicos, es decir, al ionizarse la porcin de la molcula que tiene color est cargada positivamente, lo cual le da afinidad por las estructuras celulares de carga negativa; las bacterias en su superficie tienen una carga neta negativa en medio neutro o alcalino, por lo cual los colorantes cidos no son adecuados para teirlas.
La tincin simple es aquella en la que se aplica un solo colorante. Las soluciones empleadas para teir a las bacterias son generalmente acuosas. En ocasiones se prepara una solucin concentrada en alcohol para favorecer la rpida disolucin del colorante y despus se diluye con agua. La concentracin final del colorante vara de 0.5 hasta 5% segn sea la intensidad del color. Se obtienen mejores resultados de coloracin si se utilizan soluciones de baja concentracin por un tiempo largo en vez de soluciones concentradas por un tiempo corto.
OBJETIVO Realizar las tcnicas de preparacin de frotis y de tincin simple para la observacin de algunas formas y agrupaciones de los microorganismos.
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BACTERIOLOGA I
MATERIAL Soluciones de: cristal violeta, safranina, azul de metileno y fucsina bsica. 4 Portaobjetos 1 Puentes de coloracin. Microscopio ptico Mechero bunsen Cepas: Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae. Staphylococcus aureus, Bacillus megaterium,
MTODOS I. Frotis a partir de un medio slido. 1. Marcar en un extremo los portaobjetos limpios y desengrasados. 2. Colocar con el asa una pequea gota de agua en el centro del portaobjetos. 3. Tomar con el asa estril una porcin muy pequea del crecimiento y hacer una suspensin homognea en la gota de agua, extender para formar una pelcula fina. 4. Dejar secar al aire. 5. Fijar el frotis al calor, para lo cul se calienta suavemente pasando rpidamente la parte posterior del portaobjetos dos o tres veces por la flama del mechero, hasta alcanzar una temperatura que sea soportable en el dorso de la mano.
II. Frotis a partir de un cultivo en medio lquido. 1. Marcar en un extremo los portaobjetos limpios y desengrasados. 2. Sin poner agua, tomar con el asa estril dos a tres gotas del cultivo y colocarlas en el centro del portaobjeto; extender para formar una pelcula delgada y uniforme. 3. Dejar secar al aire. 4. Fijar al calor, como se indic arriba.
III. Tincin simple de los frotis. 1. Colocar los portaobjetos con los frotis sobre el puente de coloracin.
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BACTERIOLOGA I
2. Cubrir el frotis con unas gotas del colorante y dejarlo actuar durante un minuto. 3. Con las pinzas de diseccin tomar el portaobjetos por un extremo y escurrir el colorante. 4. Lavar el exceso de colorante con un chorro suave de agua. 5. Dejar secar al aire. IV. Observacin microscpica de los frotis. 1. Examinar las preparaciones con el objetivo de inmersin. Diversidad de formas y agrupaciones de organismos procariticos Forma Agrupacin Pares (diplococos) Racimos (estafilococos) Esfrica (cocos) Cadenas (estreptococos) Tetradas Cubos de 8 (sarcinas) Lminas Bacilos cortos aislados Bacilos largos en pares Cilndrica Bacilos largos en cadena Bacilos largos en empalizada Bacilos largos en tricomas Bacilos fusiformes aislados Helicoidal Curva Espiral Plana Estrella Aislados Aislados Aislados Mosaicos cuadrados aislados Treponema Vibrio Beggiatoa Haloarcula Stella Caulobacter Beggiatoa Corynebacterium Pediococcus Micrococcus Lampropedia Escherichia Bacillus Bacillus,Lactobacillus Ejemplo Neisseria Staphylococcus Streptococcus
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BACTERIOLOGA I
INFORME
1. De acuerdo con sus observaciones, indique en la tabla siguiente la morfologa microscpica de cada microorganismo.
Morfologa microscpica Microorganismo Bacillus megaterium Escherichia coli Staphylococcus aureus Saccharomyces cerevisiae forma agrupacin esporas
2. Hacer esquemas a colores de cada una de las preparaciones observadas.
Bacillus megaterium Staphylococcus aureus Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae
CUESTIONARIO
1. Cul es el propsito de fijar los frotis con calor? 2. Qu otros mtodos de fijacin se pueden emplear? 3. Cules son las caractersticas que debe tener un frotis bacteriano de buena calidad? 4. En qu casos se aplica la tcnica de tincin simple? 5. Desde el punto de vista molcula, a qu debe un colorante su color?
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BACTERIOLOGA I
LECTURAS RECOMENDADAS
1. Conn, H. J. 1977. Biological Stains. 9th. Ed. Williams y Wilkins Co. Baltimore MD. EUA. 2. Salle, A: J. 1971. Fundamental Principles of Bacteriology. 7th. Ed.McGrawhill Book Company, EUA.
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BACTERIOLOGA I
PRCTICA No. 8 TINCION DE GRAM
INTRODUCCIN
La observacin microscpica de las bacterias es ms fcil cuando se tien. Sin embargo, es fcil confundir un punto o bastn teido sobre un fondo del mismo color con algn artefacto. Este problema apareci cuando las muestras de tejidos infectados se tean con azul de metileno buscando a las bacterias incluidas. El primer intento para resolver el problema fue decolorar los cortes despus de la coloracin. En los tejidos que tenan el bacilo tuberculoso, esto fue efectivo pero las bacterias se decoloraban igual que los tejidos y no se ganaba nada. El problema fue resuelto por Hans Christian Gram, patlogo dans que en 1884 introdujo un colorante de contraste despus de la decoloracin. En esta tincin diferencial las bacterias se tean de color
prpura oscuro usando la llamada solucin de Ehrlich, violeta de genciana y los tejidos circundantes con caf de Bismarck o Vesuviana. Originalmente la coloracin de Gram se desarrollo para visualizar las bacterias en los tejidos animales pero pronto se advirti que era til para la diferenciacin de bacterias. Las bacterias teidas por esta coloracin se dividen en dos grupos: las que retienen el violeta de genciana o cristal violeta o Gram positivas y las que se decoloran con el decolorante y se tien con el colorante de contraste (generalmente de color rojo como la safranina o la fucsina bsica aunque puede usarse verde de malaquita para los observadores daltnicos) o Gram negativas. La afinidad tintorial seguramente se debe a numerosas diferencias en la estructura y composicin qumica de muchos componentes celulares entre los que destaca la pared celular. Las bacterias Gram positivas tienen una pared compuesta principalmente de una capa de peptidoglicana relativamente gruesa (20-80 nm). En cambio las Gramnegativas tienen una capa de peptidoglicana delgada (5-10 nm) adems de una membrana externa constituida de fosfolpidos y lipopolisacarido.
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BACTERIOLOGA I
En general, las bacterias Gram positivas son susceptibles a las penicilinas y varios agentes qumicos y son ms resistentes a la desintegracin por tratamiento mecnico que las Gram negativas, como grupo, son ms susceptibles a otros antibiticos como la estreptomicina. Las diferencias bsicas en las estructuras superficiales de las bacterias Gram positivas y las Gram negativas contribuyen a aclarar la diferencia en la respuesta a la coloracin de Gram. Durante la tincin de Gram, ambos grupos de bacterias se tien con el colorante primario (cristal violeta) y mordente (yodo). El completo colorante-mordente, es atrapado dentro de la clula Gram positiva por la deshidratacin y la porosidad reducida de la gruesa pared celular que ocurre durante la etapa del lavado diferencial con etanol al 95%. En cambio, en las Gram negativas la delgada capa de peptidoglicana no impide la extraccin del complejo colorante-mordente en la decoloracin. El colorante secundario o de contraste tie fcilmente a las clulas decoloradas, Gram negativas. El rompimiento mecnico o disgregacin enzimtica a la pared celular de los Gram positivos los hace teirse como Gram negativos.
OBJETIVOS Realizar la tcnica de coloracin de Gram con especies bacterianas conocidas. Observa el efecto de algunas variaciones de la tcnica de coloracin.
MATERIAL Solucin de cristal violeta Solucin de lugol Solucin de alcohol-acetona Solucin de safranina 6 Portaobjetos 6 cubreobjetos Microscopio Asa y portaasa Puentes de coloracin. Mechero bunsen
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BACTERIOLOGA I
Cepas: Escherichia coli, Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus, cultivos de las cepas jvenes de 24 h y viejos de 96 h de incubacin. METODOS I. Tincin de Gram 1. Hacer frotis de cada bacteria y fijarlos con calor. 2. Cubrir los frotis con cristal violeta y dejarlo actuar durante 1 minuto. Escurrir el colorante y lavar con un chorro suave de agua. 3. Cubrir los frotis con solucin de lugol y dejarlo actuar durante un minuto. Escurrir el reactivo y lavar con un chorro suave de agua. 4. colocar el frotis en forma vertical y usando un fondo blanco, decolorar aadiendo gota a gota el alcohol-acetona durante 5 a 15 segundos. 5. Cubrir los frotis con safranina y dejarlo actuar durante 1 minuto. Escurrir el colorante y lavar con un chorro suave de agua. Dejar secar al aire. 6. Observar al microscopio con el objetivo de inmersin. II. Influencia de la edad de los cultivos bacterianos sobre la tincin de Gram. 1.De cada uno de los cultivos viejos de bacterias (96 hrs. De incubacin), hacer frotis y fijarlos al calor. 2. teir los frotis con la tcnica de Gram. 3. Observar al microscopio con el objetivo de inmersin.
III. Tcnica de Gram por pasos. 1. Hacer cuatro frotis con la mezcla de E. coli y B. megaterium y fijarlos al calor. 2. Iniciar la tincin de Gram y separar un frotis despus de cada uno de los pasos de la tcnica. 3. Observar al microscopio con el objetivo de inmersin.
IV. Influencia del tiempo de decoloracin en la tcnica de Gram. 1. Hacer dos frotis con una mezcla de E. coli, B. subtilis. 2. Teir los frotis con la tcnica de Gram dejando actuar el alcohol-acetona tres segundos en uno y tres minutos en el otro. 3. Observar al microscopio a inmersin.
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BACTERIOLOGA I
INFORME 1. Despus de aplicar la tcnica de Gram a las cepas proporcionadas y de acuerdo con sus observaciones, indique en la tabla siguiente la morfologa microscpica y la reaccin de Gram de cada microorganismo.
Morfologa microscpica Microorganismo Escherichia Coli. Staphylococcus aureus Bacillus megaterium Forma Agrupacin Gram
2. Haga esquemas a colores de cada una de las preparaciones observadas en el punto 1. Escherichia Coli. Staphylococcus aureus Bacillus megaterium 3. Haga esquemas a colores de cada una de las preparaciones observadas del punto II. Escherichia Coli. Staphylococcus aureus Bacillus megaterium 4. Haga esquemas a colores de cada una de las preparaciones observadas en el punto III. Frotis 1 (cristal violeta) Frotis 2 (cristal violeta + Lugol) Frotis 3 (cristal violeta + lugol + decoloracin) Frotis 4 (Gram completo) 5. Haga esquemas a colores de las preparaciones observadas en el punto IV. Primer frotis (decoloracin 3 segundos) Segundo frotis (decoloracin 3 minutos)
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BACTERIOLOGA I
CUESTIONARIO 1. Qu importancia tiene la tcnica de coloracin de Gram en identificacin de las bacterias? 2. Cul es el paso critico en l tcnica de coloracin de Gram? diga por que. 3. diga el nombre de tres bacterias (gnero y especies) Gram positivas y tres Gram negativas diferentes citadas a la prctica.
LECTURAS RECOMENDADAS 1.-DaviesJ.A.., G.K.,Anderson; T.J. Beveridge & H.C. Clark . 1983. Chemical mechanismof the Gram stair and synthesis of a new electron-opaque marker for electron microscopy which replaces the iodine mordant of the saint. J. Bacteriol. 156:837-845. 2.-Beveridge, T.J..1990 Mechanism of gram variability in selec bacteria. J.Bacteriol. 172:1609-1620. 3.- Beveridge,T.J. & J.A. Davies. 1983. Celular response of Bacillus subtilis and Escherichia coli to the gran stain, J.Bacteriol. 156:846-858. 4.- Beveridge,T.J. & S. Schultze-lam. 1996. the response of selected members of the archea to the Gram stain. Microbiology. 142:2887-2895.
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BACTERIOLOGA I
PRCTICA No. 9 TINCIN DE ZIEHL-NEELSEN
INTRODUCCION
La
tincin de Ziehl-Neelsen es un tipo de coloracin artificial que fue
desarrollado inicialmente por Paul Ehrlich para poner de manifiesto la presencia de los bacilos causantes de tuberculosis en muestras clnicas de pacientes. Robert Koch usaba los tejidos previamente fijados en soluciones diversas y los tea sumergiendo las preparaciones en una solucin alcalina de azul de metilo durante 24 horas tratndolas despus con vesuvina (caf Bismarck), lo que daba al fondo y a las estructuras un color caf y los bacilos permanecan de color azul intenso. Ehrlich modifico ese procedimiento para observar bacilos en preparaciones de esputo las cuales fijaba por medio de calentamiento en horno a 100 110 C o directo a la flama del mechero y tea 15 30 minutos en una solucin saturada de anilina a la que aada fucsina o violeta de metilo. La decoloracin con vesuvina era muy lenta, por lo que recurri al uso de soluciones concentradas de acido ntrico. Como era difcil observar a las bacterias teidas por su escasez y por todo el material que las rodeaba era incoloro, procedi a contrastar el fondo del campo con un colorante amarillo, si la tincin inicial era violeta o son un colorante azul, si el inicial era rojo. La tcnica de Ziehl-Neelsen usada actualmente es una ligera modificacin es a la original de Ehrlich. La tcnica de tincin de Ziehl-Neelsen aprovecha las cualidades peculiares de las bacterias de los gneros Mycobacterium y Nocardia que no son decoloradas por alcohol cido, pero que se pueden teir con muy diversos colorantes si estos se aplican en soluciones alcalinas con una pequea cantidad de fenol y calentando suavemente por unos pocos minutos. Los gneros mencionados presentan en su estructura un alto contenido de cidos grasos de cadena muy larga constituidos en ceras, y cidos miclicos y nocrdicos, respectivamente. Estas ceras parecen jugar un papel muy importante en las respuestas de las bacterias a la coloracin. Se ha postulado
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BACTERIOLOGA I
que el alto contenido de cidos grasos intervienen decisivamente en la coloracin ya que al calentar la preparacin con el colorante primario hasta emisin de vapores se favorece la fusin de las ceras y se aumenta la funcin cintica de las molculas, ambos fenmenos facilitan la penetracin de colorantes a la clula; al suspender el calentamiento y lavar con agua fra se provoca la solidificacin de las ceras, de modo que el colorante ya no puede salir .Tambin se ha postulado que la mezcla del colorante-fenol es mas soluble en los lpidos bacterianos que en el agente decolorante, lo cual contribuye a su permanencia en el interior de las clulas. Puesto que en el proceso de decoloracin es muy energtico, cualquier bacteria que no contenga abundantes lpidos como los de Mycobacterium y Nocardia perder el colorante primario durante la decoloracin y tomara el color del contraste. Las bacterias que resisten la decoloracin por alcohol acido, se denominan bacilos acido-alcohol resistente (BAAR). Actualmente la tincin de Ziehl-Neelsen tiene gran importancia como una de las pruebas en el diagnostico de Mycobacterium tuberculosis, agente causal de la tuberculosis, enfermedad cuya incidencia esta aumentando recientemente.
OBJETIVO Realizar la tcnica de coloracin de Ziehl-Neelsen para la diferenciacin de bacterias acido-alcohol resistentes.
MATERIAL 6 portaobjetos 6 cubreobjetos Microscopio ptico Agar BHI Mechero bunsen Solucin fucsina fenicada. Solucin de alcohol cido. Solucin de azul de metileno. 1 Puentes de coloracin.
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BACTERIOLOGA I
Cepas: Mycobacterium phlei, Mycobacterium bovis [Bacilo de Calmette y Guerin (BCG)] y Staphylococcus aureus METODOS I. Tcnica de Ziehl-Neelsen. 1.- Hacer un frotis con cada una de las cepas y otro con una mezcla de BCG y S. aureus. 2.- Dejar secar el aire y fijar por calor. 3.- Cubrir el portaobjetos con fucsina fenicada. 4.- Calentar suavemente con el mechero hasta la emisin de vapores. El colorante no debe secarse ni hervir, aadir ms si es necesario. Mantener la emisin de vapores durante 5 minutos. 5.- Lavar con un chorro suave de agua. 6.- Decolorar exhaustivamente con alcohol cido. 7.- Lavar con un chorro suave de agua. 8.- Cubrir el frotis con azul de metileno durante un minuto. 9.- Lavar con un chorro suave de agua escurrir y dejar secar al aire. 10.- Observar el microscopio con el objetivo de inmersin.
INFORME 1.- De acuerdo con sus observaciones indique en la tabla siguiente, la morfologa microscpica y la reaccin a la tincin de cada uno de los microorganismos.
Morfologa microscpica microorganismos Mycobacterium pheil BCG Staphylococcus aureus forma agrupacin Acido-alcohol resistencia
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BACTERIOLOGA I
2.-Hacer esquemas a colores de cada una de las preparaciones observadas. Mycobacterium pheil BCG Staphylococcus aureus BCG + S. aurens CUESTIONARIO 1.- Desde el punto de vista clnico por qu es importante la coloracin de Ziehl-Neelsen?
LECTURA RECOMENDADA 1. Marchal. G. 1993. El surgir de la tuberculosis. Mundo cientfico (#136) 13:520-528.
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BACTERIOLOGA I
PRCTICA No. 10 AISLAMIENTO DE BACTERIAS A PARTIR DE PRODUCTOS BIOLGICOS
INTRODUCCIN
A excepcin de algunos ambientes extremos se puede decir que en la naturaleza no existen los cultivos puros, los seres vivos se encuentran concibiendo en relaciones ecolgicas que van desde el parasitismo hasta la simbiosis obligada. En partculas los microorganismos se pueden encontrar, viviendo en los tegumentos, mucosas, cavidades y hasta dentro de algunos tejidos de plantas, animales y el hombre, constituyendo lo que se llama microbiota normal o flora normal. Las funciones de esta microbiota son variadas, siendo frecuente que la salud, resistencia a infecciones, o funcionamiento de organelos vitales del organismo que la alberga dependan de la integridad de estos organismos asociados. El estudio de la microbiota humana permite detectar individuos portadores de microorganismos
potencialmente patgenos para otros individuos. En el hombre se pueden encontrar microorganismos de la microbiota normal como bacterias, hongos y protozoarios en cavidades como la nasal, bucal, vaginal y tica, en la piel, en los tractos digestivo y respiratorio. En algunos casos, la cantidad de microorganismos es muy abundante como en piel, cavidad bucal, oral y vaginal. En organismos sanos no hay microorganismos en la sangre, lquido cefalorraqudeo, orina y rganos internos y generalmente la presencia no transitoria de estos en esas localizaciones indica el desarrollo de un proceso infeccioso. En el aislamiento de microorganismos a partir de productos biolgicos se usan varios medios de cultivo. La seleccin de estos depende de la cantidad y variedad de microorganismos en la muestra original, del tipo de
microorganismos que se prefiere aislar y los que se quiere eliminar para que su abundancia no encubra o dificulte nuestras preferencias. Para este propsito se usan una gran variedad de medios de cultivo slidos entre los que se
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BACTERIOLOGA I
encuentran medios ricos, con una abundancia en la cantidad, variedad y calidad de los nutrientes, medios simples, con una formulacin ms limitada que los anteriores; o medios mnimos Con los requerimientos mnimos indispensables para el crecimiento de un microorganismo en particular. Tambin se pueden usar medios selectivos , que tienen un componente o varios en su formulacin que inhibe a ciertos grupos de microorganismos permitiendo el crecimiento de otros y medios
diferenciales que permiten distinguir los microorganismos que crecen en ellos por diferencias en una actividad metablica que en general se pone de manifiesto por una coloracin, precipitacin o hemlisis (tabla 1) Existen otros medios no definitivos que sirven nicamente como medios para el traslado adecuado de la muestra sin prdida de la viabilidad de los microorganismos desde el sitio donde se tomo hasta el laboratorio, estos se llaman medios de transporte; hay otros que promueven el desarrollo preferencial de un grupo o tipo de microorganismo escaso en la muestra o inhibiendo el de organismos abundantes sin llamados medios de enriquecimiento. ningn inters en particular,
Tabla 1 Caractersticas de algunos medios de cultivo selectivo y diferenciales. COLOR DE LAS COLONIAS
Medio cultivo EMB
de Microorganismo fermentados de la lactosa Rosa o morado con y
Microorganismo
no
fermentador de la lactosa en Incoloras o blanco
ocasiones metlico MaC Rosa intenso
brillo cremoso
Incoloras cremoso
blanco
SS
Rosa intenso
Incoloras o blancas con el centro negro cuando produce H2 S
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BACTERIOLOGA I
GELOSA SANGRE Hemlisis o hemlisis parcial. Hemlisis o hemlisis total. Hemlisis o sin hemlisis.
Presencia de un halo verdoso alrededor de la colonia. Presencia de un halo transparente alrededor de la colonia. Sin halo.
AGAR Staphylococcus SAL MANITOL
Organismos fermentadores de manitol. Organismos no fermentadores de manitol
Halo amarillo alrededor de la colonia Halo rojizo alrededor de la colonia
La toma de las muestras a partir de fluidos y rganos puede ser una actividad muy fcil, como la de exudados farngeo (Fig. 1 a.), nasal y tico, raspados dentales y bucal, la obtencin de sangre, orina y materia fecal, pero puede requerir tambin de instrumental mdico y personal especializado para su obtencin como las tomas de lquido cefalorraqudeo y amnitico, la puncin de mdula sea y el exudado nasofarngeo (Fig. 1b).
OBJETIVO Conocer algunas tcnicas y medios de cultivo para el aislamiento y cultivo de microorganismos a partir de productos biolgicos. Reconocer que tipo de medios son los que se utilizan en esta prctica y que componentes de su formulacin les contienen sus caractersticas. Algunas de las caractersticas de los medios de cultivo usados en la prctica estn en la Tabla 1.
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BACTERIOLOGA I
Figura 1a. Toma de exudado farngeo. Se inclina la cabeza del paciente hacia atrs se oprime la lengua con un abatelenguas. Se introduce un hisopo hasta las amgdalas y se frota contra la parte posterior de la mucosa de un lado a otro cualquier mancha blanca o ulceracin. No tocar la lengua. vula, o la zona periododontal
Figura 1b. Toma de exudado nasofarngeo. Se usa un hisopo de alginato de calcio, nylon o dacrn con mango flexible. Se introduce por una narina diez centmetros sin tocar los cornetes. Al llegar al fondo de la nasofaringe rotar suavemente y retirarlo para inocular en los medios apropiados.
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BACTERIOLOGA I
MATERIAL 5 Cajas de Petri con gelosa sangre. 3 Cajas de agar chocolate. 6 Cajas de Petri con agar Staphylococcus-sal manitol (ASM) 6 Cajas de Petri con agar infusin de cerebro y corazn. (BHI) 4 Cajas de Petri con agar MacConkey (MaC) 13 Cajas de Petri con agar Salmonella-Shigella (SS) 3 Cajas de Petri con eosina-azul de metileno (EMB) 5 Tubos de 13 x 100 mm con 3 ml de agua destilada estril Hisopos estriles. Muestras de materia fecal, orina, exudados farngeo, nasal y tico. Equipos de tincin de Gram. Gelosa sangre Agar sal y manitol Agar infusin cerebro y corazn Agar MacConkey Agar Salmonella Shigella Agar eosina y azul de metileno Mechero bunsen
MTODOS
I. Aislamiento de bacterias de materia fecal. 1. tomar con el asa estril una asada de materia fecal y depositarla en cada una de las placas con los medios de cultivo de EMB, MaC Y SS. 2. Aislar por estra cruzada. 3. Incubar las placas a 37 C por 24 a 48 h.
II. Aislamiento de bacterias de orina. 1. Tomar con el asa estril dos asadas de orina y depositarlas en cada una de las placas con los medios de cultivo de EMB, BHI, MaC, Y ASM 2. Aislar por estra cruzada. 3. Incubar las placas a 37 C por 24 a 48 h.
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BACTERIOLOGA I
III. Aislamiento de bacterias de exudado farngeo. 1. Tomar con un hisopo estril un exudado farngeo atendiendo a las instrucciones del profesor. Depositar la muestra del hisopo en placas con agar sangre, BHI y ASM. 2. Con el asa aislar por estra cruzada. 3. Incubar las placas a 37 C por 24 a 48 h.
IV. Aislamiento de bacterias a partir de otras muestras biolgicas. 1. Tomar con un hiposo estril humedecido en agua una muestra de exudado de odo, piel lesionada, fosas nasales o abscesos. 2. Depositar la muestra del hisopo en placas con BHI, gelosa sangre y agarStaphylococcus-sal-manitol. 3. Con el asa aislar por estra cruzada. 4. Incubar las placas a 37 C por 24 a 48 h.
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BACTERIOLOGA I
INFORME 1. Describa en la tabla siguiente, la morfologa colonial y microscpica de una colonia bacteriana aislada de cada medio de cultivo. Caracterstica Colonia 1 Forma Tamao Color Borde Superficie Luz trasmitida Luz reflejada Elevacin Aspecto Consistencia Efecto sobre el medio Medio de cultivo Colonia 2 Colonia 3 Colonia 4 Colonia 5
Morfologa microscpica Gram. Forma Agrupacin Esporas
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BACTERIOLOGA I
CUESTIONARIO
1. Clasifique los medios de cultivo usados en la prctica de acuerdo con sus caractersticas y explique cules componentes de la formulacin les confieren sus propiedades.
Medio de cultivo
Tipo
Componente determinante del tipo
Gelosa sangre (GS) Agar (ASM) Agar infusin de cerebro-corazn (BHI) Agar Salmonella-Shigella (SS) Agar eosina-azul de metileno (EMB) Staphylococcus sal-manitol
2. Tiene alguna importancia para su carrera o desarrollo profesional estas tcnicas? Explique. 3. Qu caractersticas en comn tienen los medios de cultivo usados para cada muestra? Por qu cree que se seleccionaron en particular para cada muestra?
LECTURAS RECOMENDADAS.
1. Manafi, M y W Kneifel. 1990. Rapad methods for differentiating Grampositive from Gram-negative aerobic and Facultative anaerobic bacteria. J. Appl. Bacteriol 69:822-827. 2. May, J.T.1988. Microbial contaminants and antimicrobial properties of human milk. Microbiogical Sciences 5:42-46.
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BACTERIOLOGA I
3. Tannock, G. W. 1988.The normal microflora: new concepts in health promotion. Micro-biological Sciences 5:4-8
PRCTICA No. 11 FACTORES QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS
INTRODUCCIN Parmetros fsicos y qumicos que afectan el crecimiento y desarrollo de los microorganismos Los aspectos fsicos que influyen de manera determinante en el crecimiento microbiano son: la temperatura, el pH y la presin osmtica. Los qumicos son: el agua, las fuentes de carbono y de nitrgeno, los minerales, el oxgeno y los factores orgnicos del propio microorganismo.
Parmetros fsicos: Temperatura: la supervivencia de los microorganismos se presenta Normalmente en las temperaturas usuales para el desarrollo de los animales superiores, aunque se da el caso de algunas bacterias resistentes a extremos de fro o de calor. Se puede hablar por consiguiente de una taxonoma microorgnica referida a rangos ptimos de adaptacin a la temperatura. Esta clasificacin contempla los tres casos siguientes: Microorganismos psicrfilos adaptados a bajas temperaturas, en trminos generales se maneja un rango de 0C a 20C como lmites normales para su crecimiento. Mesfilos, viven en temperaturas moderadas, en un rango de 20C a 40C., los microorganismos mesfilos, son los ms comunes. Por ejemplo, la temperatura ptima para la mayora de las bacterias patgenas se aproxima a los 37C. Termfilos, soportan altas temperaturas, contemplan como rangos usuales de tolerancia de 40C. a 80C. y por consiguiente sus endosporas son normalmente resistentes al calor y sobreviven a los tratamientos trmicos aplicados a conservas enlatadas aunque no crecen a las temperaturas normales de almacenamiento. De todas maneras, el crecimiento se da dentro de ciertos rangos de temperatura, que generalmente comprenden unos lmites de tolerancia de unos 30 C.
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BACTERIOLOGA I
pH Normalmente los pH (acidez o alcalinidad de una solucin o medio de crecimiento) de rango neutro (6,5 a 7,5) son los ms adecuados para el crecimiento bacteriano y muy pocas bacterias soportan pH inferiores a 4.0. Por esta razn el manejo de la acidez es un recurso para el control microorgnico. Como en el caso de las temperaturas existen algunas bacterias que soportan niveles extremos de acidez, razn por la cual se Las denomina acidfilas. Se conocen bacterias que sobreviven a pH de 1. Los rangos alcalinos generalmente inhiben el crecimiento microbiano. En los ensayos de laboratorio para el cultivo de bacterias se requiere neutralizar los cidos que producen las bacterias mediante sustancias qumicas denominadas tampones. Las sales de fosfato amortiguan la acidez y la mantienen en el rango usual de crecimiento para la mayora de las bacterias (de 6,5 a 7,5) y de paso aportan el fsforo que es un nutriente necesario. El intervalo ptimo de pH para mohos y levaduras esta entre 5,0 y 6,0. Una tabla de rangos de tolerancia a la acidez es la siguiente: Microorganismos Acidfilos Neutrfilos Alcalfilos Presin osmtica Los microorganismos estn formados por un 80-90% de agua y por consiguiente son fcilmente afectados por soluciones hipertnicas o sea con una concentracin de solutos mayor a la de la clula microbiana, razn por la cual esta pierde agua por el efecto conocido como plasmlisis. Por consiguiente la adicin de sales o de azcar produce una contraccin celular que evita el crecimiento bacteriano Sin embargo existen las bacterias llamadas halfilas extremas que requieren alta concentracin salina para supervivir (alrededor del 30% de sal). Otro caso es el de las halfilas facultativas que no necesitan altas concentraciones salinas pero pueden soportar concentraciones entre el 2 y el 15% de sal. Se comprende entonces la tcnica usada para solidificar los medios de cultivo microbiano con agar, con una concentracin del orden del 1,5%. pH 1,0 a 6,0 6,5 a 7,5 8,0 a 11,0
Parmetros
qumicos
Las fuentes de carbono son necesarias para el crecimiento bacteriano ya que

BACTERIOLOGA I
este elemento es una estructura bsica en todos los compuestos orgnicos que constituyen la clula viva. Por consiguiente los microorganismos obtienen su carbono a partir de compuestos orgnicos (microorganismos quimihetertrofos), o del bixido de Carbono (caso de los quimioauttrofos y fotoauttrofos). Nitrgeno, Azufre y Fsforo: en la sntesis de su material celular los microorganismos utilizan el nitrgeno principalmente para formar el grupo amino de los aminocidos constituyentes de las protenas. En algunos casos de simbiosis el nitrgeno fijado por bacterias se comparte con ciertas plantas (generalmente leguminosas), lo cual permite aumentar la fertilidad del suelo. El azufre se utiliza generalmente para sintetizar aminocidos y vitaminas como la timina y la biotina. El fsforo se utiliza en sntesis de cidos nucleicos y de los fosfolpidos de las membranas celulares. De manera similar los microorganismos necesitan otros elementos como potasio, magnesio, y calcio necesarios para su utilizacin como cofactores de las enzimas. Por otra parte los microorganismos requieren algunos elementos minerales en cantidades muy pequeas, como es el caso de los oligoelementos: hierro, cobre, molibdeno y zinc, los cuales son esenciales como cofactores en la actividad enzimtica Oxgeno: los microorganismos aerobios utilizan el oxgeno molecular con el cual producen ms energa a partir de los nutrientes. Sin embargo existen microorganismos anaerobios facultativos que utilizan el oxgeno disponible, pero si no lo hay pueden crecer mediante procesos de fermentacin o respiracin anaerbica. La bacteria Escherichia coli y muchas levaduras son anaerobios facultativos. Existen adems los anaerobios obligados para los cuales el oxgeno es perjudicial y por consiguiente no lo utilizan. En este caso los tomos de oxgeno de sus componentes celulares los obtiene normalmente del agua. Es comprensible entonces el uso del in perxido para el control bacteriano ya que en este caso es una forma txica de oxgeno. Microaerfilos crecen solo en presencia de oxgeno, pero con presiones inferiores a la atmosfrica. OBJETIVOS 1. Evaluar el efecto de los factores intrnsecos y extrnsecos sobre el crecimiento bacteriano. 2. Conocer tcnicas de identificacin de microorganismos basados en su capacidad metablica. MATERIAL 5 Tubos con caldo nutritivo estril 1 Tubo con Tioglicolato
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BACTERIOLOGA I
1 tubo con caldo nutritivo pH 3.0 1 tubo con caldo nutritivo pH 7.0 1 tubo con caldo nutritivo pH 11.0 Aceite mineral estril Asas bacteriolgicas Pipeta estril Gradilla Incubadora Nevera Tubo con cepa bacteriana Mechero Bunsen. PROCEDIMIENTO A. Influencia de la temperatura Marque 3 tubos de caldo nutritivo con los siguientes datos:
Tubo 1: No. de grupo, fecha, no. de bacteria y 4C Nevera Tubo 2: No. de grupo, fecha, no. de bacteria y 20C Ambiente Tubo 3: No. de grupo, fecha, no. de bacteria y 37C Incubadora Esterilice el asa recta o curva y djela enfriar Recoja con el asa estril la bacteria indicada y siembre en los tubos marcados. Esterilice el asa. Separe los tubos de nevera y temperatura ambiente, entrguelos al coordinador del laboratorio para que los incube a 4c y 18c. Los otros tubos envulvalos en cinta de enmascarar, mrquelos con el nmero del grupo y entrguelos al coordinador para incubarlos a 37C Cumplido el tiempo de incubacin observe en cada tubo la presencia de crecimiento en este caso la bacteria. Establezca que tipo de bacteria es de acuerdo a sus rangos ptimos de adaptacin a la temperatura
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BACTERIOLOGA I
B. Influencia del pH Marque 3 tubos de caldo nutritivo con los siguientes datos:
Tubo 1 pH 3.0: No. de grupo, fecha, no. de bacteria y pH 3.0 Tubo 2 pH 7.0: No. de grupo, fecha, no. de bacteria y pH 7.0 Tubo 3 pH 11.0: No. de grupo, fecha, no. de bacteria y pH 11.0 Esterilice el asa recta o curva y djela enfriar. Recoja con el asa estril la bacteria indicada y siembre en los tubos marcados. Esterilice el asa. Incube los tres tubos a temperatura de 37 C por 24 a 48 horas. Cumplido el tiempo de incubacin observe la presencia de turbidez en los tubos, lo cual indica que hay crecimiento. Cul fue el pH ptimo para el crecimiento de la bacteria en estudio. C. Influencia de la Tensin de oxgeno Marque los tubos de la siguiente manera Tubo de Tioglicolato: No. del grupo, fecha, no. de bacteria y tioglicolato y microaerfilo (recuerde que el tioglicolato se usa para el cultivo y aislamiento de anaerobios estrictos y facultativos de microorganismos microaerfilos Tubo de Caldo Nutritivo: No. del grupo, fecha, no. de bacteria y aerobio. Tubo de Caldo Nutritivo: No. del grupo, fecha, no. de bacteria y anaerobio. Esterilice el asa recta o curva y djela enfriar Recoja con el asa estril la bacteria indicada y siembre en los tubos marcados. Esterilice el asa. Adicione 2 ml de aceite mineral estril a los tubos de tioglicolato y al anaerobio para crear un ambiente de anaerobiosis. Incube los tubos a 37C por 24 a 48 horas. Cumplido el tiempo de incubacin observe la presencia de crecimiento en los tubos. Determine en qu ambiente creci la bacteria.
BACTERIOLOGA I
Procedimiento para la lectura Solicite los tubos de temperatura ambiente, nevera e incubadora al coordinador de laboratorio. Colquelos en orden por temperatura, pH, y disponibilidad de oxgeno. Observe si se presenta crecimiento (turbidez) y si el crecimiento es escaso, moderado o abundante. Anote sus observaciones y si el crecimiento microbiano es igual o diferente para las diversas condiciones de pH, temperatura y Tensin de oxgeno. De acuerdo con lo analizado clasifique el microorganismo segn su necesidad de oxgeno en aerobio, anaerobio, micro aeroflico, anaerobio facultativo. Segn la temperatura ptima de crecimiento en psicrfilo, mesfilo o termfilo y cul es el pH ideal para su ptimo desarrollo. Cul es la utilidad de la anterior evaluacin? Qu factores intrnsecos y extrnsecos afectan el crecimiento de los microorganismos? LECTURAS RECOMENDADAS 1. Campbell, R. C. 1974 Statictics for biologists. 2 nd. Ed. Cambridge University Press. London. P 385. 2. Deacon. J. W. 1984. introduction to modern Mycology. 2nd. Ed. Blackwell Scientific Pub. Pp. 42-56. 3. Kolter, R; D.A .A Siegele y A Tormo. 1993. The stationary phase of the bacterial life cycle. Am. Rev. Microbiol. 47: 855-874
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