PARTE EXPERIMENTAL

1) Propiedades Qumicas de la Cafena - Frmula Qumica: C8H10N4O2 (polar) - Peso Molecular: 194.19 g/mol - Densidad: 1.23 g/ml

2) Preparacin de muestras patrn para curva de calibrado en determinacin de cafena por espectrofotometra UV 2.1.) Instrumentacin - Equipos: Unidad de purificacin de agua para laboratorios ELGA, Purelab Classic. Balanza analtica Mettler, AB-104-S Estufa Selecta, Digitheat. - Reactivos: Cafena (Sigma-Aldrich, reactivo analtico) Agua Milli-Q (Millipore). cido clorhdrico 0,01 M 2.2) Preparacin de la solucin patrn primario de cafena Primero se ha preparado la disolucin patrn de cafena, a partir de 40 mg de cafena (previamente secada que se disuelven, en matraz aforado de 100 ml, en agua Milli-Q. En partes por milln ser:

C8 H10 N 4O2 en solucion madre

40mg 1000ml 400 ppm 100ml 1L

2.3) Preparacin de solucin patrn intermedia de cafena Seguidamente, se traspasan, con ayuda de pipeta aforada, 10 ml de la disolucin patrn primario a otro matraz aforado de 100 ml y se lleva a enrase con la misma agua Milli-Q, lo que nos da una concentracin de:

C8 H10 N 4O2 ensolucinpatrn int ermedia 400 ppm

f d 400 ppm
factor de dilucin

10ml 100ml

C8 H10 N 4 0 2 ensolucinpatrn int ermedia 40 ppm

2.4) Preparacin de estndares A partir de la solucin patrn intermedia de cafena de 40 ppm, se preparan 5 soluciones ms diluidas de concentraciones de 4, 8, 16, 24 y 32 microgramos de cafena por litro: (5 ml de solucin patrn de cafena de 40 ppm + 2 ml HCl 0,01 M)/50 ml de agua (4 ppm) (5 ml de solucin patrn de cafena de 40 ppm + 1 ml HCl 0,01 M)/25 ml de agua (8 ppm) (10 ml de solucin patrn de cafena de 40 ppm + 1 ml HCl 0,01 M)/25 ml de agua (16 ppm) (15 ml de solucin patrn de cafena de 40 ppm + 1 ml HCl 0,01 M)/25 ml de agua (24 ppm) (20 ml de solucin patrn de cafena de 40 ppm + 1 ml HCl 0,01 M)/25 ml de agua (32 ppm)

3) Preparacin de muestras patrn para curva de calibrado en determinacin de cafena por mtodo cromatogrfico (HPLC) 3.1.) Instrumentacin - Equipos: Cromatgrafo Perkin Elmer Series 410 LCPump: Bomba Perkin Elmer LC-410 Detector Perkin Elmer LC-410 Interfase Perkin Elmer 970 Jeringa: Tipo Hamilton de 50 L Columna de acero Inoxidable Nucleosil 100 (C18): Longitud: 100mm, dimetro interno: 4.6 mm, tamao de partcula: 5m, flujo: 1 ml/min, volumen de inyeccin: 20L

- Reactivos: Cafena anhidra Agua HPLC Acetonitrilo HPLC 3.2) Preparacin de la solucin patrn primario de cafena Primero se ha preparado la disolucin patrn de cafena, a partir de 39.90 mg de cafena (previamente secada que se disuelven, en matraz aforado de 100 ml, en agua Milli-Q. En partes por milln ser:

C8 H10 N 4O2 en solucion madre 39.90mg 1000ml

100ml 1L

399 ppm

3.3) Preparacin de solucin patrn intermedia de cafena Seguidamente, se traspasan, con ayuda de pipeta aforada, 10 ml de la disolucin patrn primario a otro matraz aforado de 100 ml y se lleva a enrase con la misma agua Milli-Q, lo que nos da una concentracin de:

C8 H10 N 4O2 ensolucinpatrn int ermedia 399 ppm

f d 399 ppm
factor de dilucin

10ml 100ml

C8 H10 N 4 0 2 ensolucinpatrn int ermedia 39 .9 ppm

3.4) Preparacin de estndares A partir de la solucin patrn intermedia de cafena de 39.9 ppm, se preparan 5 soluciones ms diluidas de concentraciones de 3.99, 7.98, 15.96, 23.94 y 31.92 microgramos de cafena por litro: (5 ml de solucin patrn de cafena de 39.9 ppm + 2 ml HCl 0,01 M)/50 ml de agua (3.99 ppm) (5 ml de solucin patrn de cafena de 39.9 ppm + 1 ml HCl 0,01 M)/25 ml de agua (7.98 ppm) (10 ml de solucin patrn de cafena de 39.9 ppm + 1 ml HCl 0,01 M)/25 ml de agua (15.96 ppm) (15 ml de solucin patrn de cafena de 39.9 ppm + 1 ml HCl 0,01 M)/25 ml de agua (23.94 ppm) (20 ml de solucin patrn de cafena de 39.9 ppm + 1 ml HCl 0,01 M)/25 ml de agua (31.92 ppm)

4) Preparacin de las muestras de caf (para el mtodo espectrofotomtrico y cromatogrfico) Suponiendo que en cada caf la proporcin de cafena sea del 1,2%, se pesan aproximadamente 300 mg y se ponen a reflujo con 200 ml de Agua Milli-Q durante 15 minutos. Seguidamente, se filtra la solucin en caliente y se aaden 5 g de Na2CO3 hasta la total disolucin. Se deja enfriar y se agregan 15 ml cloroformo que se extraen agitando suavemente durante unos minutos y se repite esta operacin una vez ms. Despus de la separacin de las dos fases, se aaden pequeas cantidades de Na2SO4 para absorber el agua, se filtra la fase clorofrmica hacindola pasar por papel filtro hacia un matraz erlenmeyer o baln, y se deja evaporar hasta sequedad. Una vez eliminado el cloroformo, se aade al mismo matraz o baln, 50 ml de Agua Milli-Q y se agita bien hasta perfecta disolucin. Posteriormente, mediante un embudo se enrasa a 100 ml en un matraz aforado. Finalmente, se toman 10 ml de esta ltima solucin, se aade 1 ml de la solucin de cido clorhdrico 0,01 M y se enrasa a 25 ml con Agua Milli-Q. Este mtodo es rpido y eficaz, por lo que se concluy y se aceptaron estas condiciones de extraccin.

5) Resultados obtenidos por espectrofotometra UV - Se empez a ensayar con las soluciones patrn (estndares) realizadas y las soluciones de cafena de caf obtenidas mediante extraccin para inyectar como muestras. - La deteccin se hace a 273 nm, ya que la cafena presenta, a esa longitud de onda su mximo de absorcin. - Las soluciones patrn de cafena con concentraciones: 4,00 ppm, 8,00 ppm, 16,00 ppm, 24,00 ppm y 32,00 ppm registraron los siguientes datos de absorbancia con su correspondiente espectrofotograma.

TABLA 1: Concentraciones estndares de cafena y absorbancias Estndares Vol. Sol. V. HCl 1M V. final [Cafena]ppm Absorbancia Intermedia (ml) (ml) (273nm) (ml) Std-1 5 2 50 4 0.2179 Std-2 5 1 25 8 0.4267 Std-3 10 1 25 16 0.8298 Std-4 15 1 25 24 1.2315 Std-5 20 1 25 32 1.6018

- En la siguiente figura se representaron grficamente las absorbancias obtenidas con las soluciones patrn frente a sus correspondientes longitudes de onda (nm).

Figura 1: Espectro de los estndares

- En la siguiente figura se representaron grficamente las absorbancias obtenidas con las soluciones estndares frente a sus correspondientes concentraciones (ppm).

Figura 2: Curva de calibrado obtenida con espectrofotmetro UV-Visible

- Se interpol la absorbancia correspondiente a una muestra de cafena de caf (en este caso usaremos como muestra el caf Guatemala del tostadero Bon Mercat) en la curva estndar y se obtuvo la concentracin de la muestra (ver recorrido de las flechas rojas).

Figura 3: Interpolacin de una muestra de caf en la curva de calibrado

- DE AQU PEGA TODO LO Q ESTA EN LAS PGINAS 120, 121, 122, 123, 124, 126 Y 127 (LA NUMERACIN ES LA QUE EST AL PIE DE LA PGINA).

6) Resultados obtenidos por el mtodo cromatogrfico (HPLC) - A partir de los resultados obtenidos en la puesta a punto del sistema cromatogrfico, se defini que la fase mvil que permita una mejor determinacin cuantitativa de la cafena era la compuesta por la fase mvil agua-acetonitrilo en proporcin 20:80. - Se empez a inyectar las soluciones estndares realizadas nuevamente y las soluciones de cafena obtenida por extraccin en diferentes tipos de cafs. - Se inyectaron 20 L de muestra (volumen del loop de inyeccin) con una velocidad de flujo de fase mvil de 1 ml/min con elucin de modo isocrtico y a temperatura ambiente. -Las soluciones estndares de cafena con concentraciones: 4,00 ppm, 8,00 ppm, 16,00 ppm, 24,00 ppm y 32,00 ppm se inyectaron por separado en el sistema cromatogrfico y se registraron los siguientes cromatogramas con sus respectivos datos:
TABLA 2: Concentraciones estndares de cafena y sus reas Estndares Vol. Sol. V. HCl V. final [Cafena] reas Intermedia 1M (ml) (ml) ppm (ml) Std-1 5 2 50 4 1195488.17 Std-2 5 1 25 8 2344794.17 Std-3 10 1 25 16 4664782.50 Std-4 15 1 25 24 6921478.17 Std-5 20 1 25 32 9499379.17

Tiempo de retencin 1.26 1.27 1.28 1.29 1.30

- PEGA LAS IMAGINES DE LAS PGINAS 96 Y 97 (PIE DE PGINA). - En la siguiente figura se representaron grficamente las reas obtenidas con las soluciones estndares frente a sus correspondientes concentraciones (ppm).

- Se interpol el rea del pico correspondiente a la muestra de cafena de caf (en este caso usaremos la muestra de caf soluble de tueste 100% natural, NESCAFE Classic Natural) en la curva estndar y se obtuvo la concentracin de la muestra inyectada. - DE AQU PEGA LOQ ESTA EN LAS PGINAS 99, 105 Y 107 (ENUMERADAS SEGN PIE DE PGINA). EN LA PGINA 107 SOLO CAMBIA LOS DATOS: Caf soluble de tueste 100% natural, NESCAF Classic Natural:

100mlsolA

25mlsolB 29.94mgcaf enae ncaf 7.485mgcaf ena 10mlsolA 1000mlsolB

7.485 mgcafena 100 2.495 % 300 mgdecaf

Por lo tanto, se estara hablando de que el caf soluble de tueste 100% natural, NESCAF Classic Natural posee una concentracin real de 2.495% de cafena.

- DE AQU PEGA PGINAS 108, 114, 137, 139, 140 (NUMERACIN DE PIE DE PGINA).