Facultad de Ciencias Bioqumica (Licenciatura en Ciencias Biolgicas) Bioqumica I (Licenciatura en Bioqumica)

Laboratorio VI: Acidos nucleicos III 2007

PRCTICO N 6.

ACIDOS NUCLEICOS II
Espectrofotometra, Electroforesis, Mapas de Restriccin

Espectrofotometra de cidos nucleicos Los dobles enlaces conjugados de las bases nitrogenadas hacen que los cidos nucleicos (AN) absorban luz ultravioleta (UV). El espectro de absorcin caracterstico de AN presenta un mximo a ~ 260 nm. Si bien el coeficiente de extincin de un AN en particular depende de la secuencia de nucletidos, algunas reglas empricas permiten estimar la concentracin a partir del valor de A260. As, una unidad de absorbancia a 260nm corresponde aproximadamente a una concentracin de 50 g/ml de ADN doble hebra, 40 g/ml de ARN o 33 g/ml de fragmentos cortos de ADN monohebra (oligodesoxinucletidos). En las preparaciones de AN, son frecuentes las impurezas de naturaleza proteica. Dado que los aminocidos aromticos (Phe, Tyr, Trp) absorben luz UV, la presencia de protenas lleva a sobrestimaciones de la concentracin de AN. Dado que el mximo de absorbancia de las protenas se encuentra en ~ 280 nm, es posible estimar el grado de impurezas de origen proteico a partir del cociente A260/A280. La presencia de protenas en la muestra har que el cociente A260/A280 sea menor que el esperado para cidos nucleicos puros. Para el ADN doble hebra en soluciones de alta pureza se espera A260/A280 1.8, y para ARN, A260/A280 2.0. Separacin de molculas de ADN por electroforesis en geles de agarosa. (Se recomienda remitirse al repartido de laboratorio de electroforesis de protenas para los fundamentos generales de esta tcnica). A los valores de pH en los cuales usualmente se trabaja con cidos nucleicos, los grupos fosfato confieren carga neta negativa a estas molculas. En la electroforesis en geles de agarosa, las molculas de ADN lineales migran segn su tamao y se pueden visualizar mediante tincin, con el agente intercalante bromuro de etidio (BET). Destacamos que el bromuro de etidio es mutagnico y debe ser manipulado con precaucin. Los geles de agarosa se preparan fundiendo agarosa en presencia del buffer adecuado hasta que se logra una solucin transparente. La solucin fundida es puesta en un molde donde gelifica. El gel forma una matriz cuya densidad est determinada por la concentracin de agarosa. Cuando se aplica un campo elctrico a travs del gel, el ADN migra hacia el nodo. La velocidad de migracin est determinada por varios parmetros, algunos de los cuales son detallados a continuacin. (a) Tamao del ADN: Las molculas de ADN lineal de doble hebra migran a travs del gel a velocidades que son inversamente proporcionales al log del nmero de pares de bases. Dado que la carga del ADN est dada por los grupos fosfato y que por cada par de bases hay dos grupos fosfato, la relacin carga/masa es la misma para molculas de ADN de diferente tamao. Pero, debido a la friccin que impone la malla del gel de agarosa, las molculas de mayor tamao sern retardadas respecto a las de menor tamao.

Facultad de Ciencias Bioqumica (Licenciatura en Ciencias Biolgicas) Bioqumica I (Licenciatura en Bioqumica)

Laboratorio VI: Acidos nucleicos III 2007

(b) Concentracin de la agarosa: Un fragmento de ADN lineal migra a diferentes velocidades dentro de geles con diferentes concentraciones de agarosa. La tabla siguiente muestra concentraciones de agarosa usadas para resolver fragmentos de ADN en los rangos indicados. Concentracin del gel de agarosa (% w/v) 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 Rango de peso molecular (kpb) 5-60 1-20 0.8-10 0.5-7 0.4-6 0.2-3 0.1-2

(c) Conformacin del ADN El ADN circular cerrado de doble hebra superenrollado (forma I), el circular relajado con un corte en una de las hebras (forma II) y la forma lineal (forma III) que tengan idntico peso molecular y misma secuencia van a migrar a distinta velocidad en los geles de agarosa. Las movilidades relativas de las tres formas dependen primariamente de la concentracin de agarosa, pero tambin estn influidas por otros factores como la corriente elctrica aplicada, la fuerza inica del buffer y de la cantidad de BET presente (fundamentalmente en el caso de la forma I). (d) Corriente aplicada A bajo voltaje, la velocidad de migracin de los fragmentos lineales es proporcional al voltaje aplicado. Sin embargo a medida que la fuerza del campo elctrico aumenta, la movilidad de los fragmentos de ADN de alto peso molecular se incrementa menos. Por lo tanto el rango efectivo de separacin en los geles de agarosa disminuye a medida que el voltaje es incrementado. (e) Otros factores Otros factores que influyen (y que no se discutirn en este repartido) son: la direccin del campo elctrico, la composicin de bases de los fragmentos a analizar, la temperatura, la composicin del buffer de electroforesis. Enzimas de restriccin Las endonucleasas de restriccin son enzimas aisladas fundamentalmente de organismos procariotas, que generalmente reconocen secuencias especficas en el ADN de doble cadena, palindrmicas y formadas por 4 o 6 nucletidos. Por ejemplo, la enzima BamHI, extrada de Bacillus amyloliquefaciens H, reconoce la secuencia: 5 GGATCC 3 3 CCTAGG 5 hidrolizando el enlace fosfodister en sitios especficos, produciendo los siguientes fragmentos de ADN con extremos 5 salientes y cohesivos: 5 ...G 3 5GATCC....3 3....CCTAG5 G....5 Estos extremos pueden formar pares de bases con cualquier otro extremo complementario. Fragmentos de cualquier ADN que contengan tales sitios de reconocimiento porque hayan sido digeridos por ejemplo con la misma enzima de restriccin podrn unirse con otros fragmentos para formar molculas recombinantes.

Facultad de Ciencias Bioqumica (Licenciatura en Ciencias Biolgicas) Bioqumica I (Licenciatura en Bioqumica)

Laboratorio VI: Acidos nucleicos III 2007

Mapas de restriccin Los sitios de corte de las enzimas de restriccin pueden utilizarse como puntos de referencia en la secuencia de ADN. El ADN se somete a digestiones sucesivas con distintas enzimas de restriccin. Al separar los fragmentos mediante electroforesis en geles de agarosa, puede deducirse el mapa de los sitios de restriccin. Los mapas de restriccin son caractersticos de una molcula de ADN y quedan determinados por su secuencia de bases. Para construir el mapa de restriccin de un ADN determinado, los fragmentos resultantes de digerir dicho ADN con diferentes enzimas de restriccin se separan mediante electroforesis. El tamao de cada fragmento se determina comparando con un estndar de pesos moleculares. A partir de esos tamaos, y conociendo el tamao total de esa molcula de ADN, se infiere el orden en el que estn dispuestos los sitios de restriccin (Ver Ejercicio 5). PARTE EXPERIMENTAL. Objetivos Analizar la preparacin de ADN obtenida la clase anterior. En particular: 1) Estimacin de la concentracin y pureza por espectrofotometra. 2) Anlisis de la preparacin por electroforesis en geles de agarosa. 3) Anlisis con enzimas de restriccin (solo demostrativo). Procedimiento Espectrofotometra (1) Hacer una dilucin 1 en 100 en un volumen final de 2 ml a partir del ADN extrado en el practico anterior. (2) Hacer un espectro de absorcin entre =220 nm hasta =300 nm, tomando los valores de absorbancia cada 10 nm. (3) Calcular la concentracin en la preparacin; -suponiendo que todo fuera ADN -suponiendo que todo fuera ARN (4) Calcular el cociente A260/A280. Discuta (5) Graficar Absorbancia en funcin de la longitud de onda. Como control, tambin se realizar un espectro de ADN de esperma de salmn. Electroforesis de ADN en gel de agarosa ADVERTENCIA: El bromuro de etidio es mutagnico y cuando se manipulen soluciones que lo contienen deben tomarse las precauciones correspondientes. Usar guantes de ltex. Preparacin del gel: Se calientan hasta ebullicin 1g de agarosa en polvo y 100 mL de buffer de electroforesis TAE (Tris-acetato 40 mM, EDTA 1 mM). Se deja enfriar hasta 60C, se agrega 1.5 L de BET (bromuro de etidio, 10g/L) y se vierte sobre la placa previa colocacin de un peine de tefln para generar los pocillos en el gel. Al enfriarse se observar la gelificacin de la agarosa. Preparacin de las muestras: En cada tubo, poner 15 L de la muestra correspondiente. Agregar 3 L de "buffer de carga 6x" (0.25% xilencianol, 0.25% azul de bromofenol, 30% glicerol). Se prepararn las muestras preparadas en la clase anterior, junto a un marcador de peso

Facultad de Ciencias Bioqumica (Licenciatura en Ciencias Biolgicas) Bioqumica I (Licenciatura en Bioqumica)

Laboratorio VI: Acidos nucleicos III 2007

molecular. Adems se sembrar una reaccin de digestin del plasmido pBluescript KS con la enzima de restriccin EcoRI. Migracin: Colocar el gel en la cuba de electroforesis. Verter buffer TAE en la cuba hasta cubrir el gel. Cargar las muestras en cada pocillo con una micropipeta en el orden de numeracin de los tubos. Conectar los electrodos a la fuente de poder. Fijar el voltage en 100 V. Dejar migrar aproximadamente 60 min. Observar el gel sobre un transiluminador de luz UV con proteccin adecuada (ADVERTENCIA: la radiacin UV altera
el ADN daando la molcula. Estos daos genticos pueden producir cancer de piel, tambin daos en los ojos, especialmente la crnea produciendo cegueras temporales).

Preguntas: A qu corresponde cada una de las bandas observadas? En base al patrn de bandas de la corrida electrofortica del marcador de peso molecular trazar la grfica del log. de n (n = longitud del fragmento correspondiente en pares de bases) en funcin de la distancia de migracin. Usando dicha grfica determinar el tamao (en pb) de los ADN de cada muestra. Ejercicios (1) De acuerdo al mapa de restriccin adjunto, cul sera la longitud de los fragmentos de ADN que se obtendran si el genoma del virus SV40 de mono es sometido a digestin con las enzimas de restriccin que se indican ms abajo? (El genoma completo de este virus tiene 5243 pb) (a) Eco RV (b) Eco RV + Bam HI (c) Eco RV + Kpn I + Pst I
Mapa del genoma del virus de mono SV40

(2)

Facultad de Ciencias Bioqumica (Licenciatura en Ciencias Biolgicas) Bioqumica I (Licenciatura en Bioqumica)

Laboratorio VI: Acidos nucleicos III 2007

Considere la digestin de la parte (c) del ejercicio anterior. Qu longitud tiene el fragmento en el cual est incluido el origen de replicacin (ORI) de este virus? Mantiene su integridad la regin que codifica el antgeno T? (3) El genoma del adenovirus 2 humano es ADN lineal doble hebra de 35937 pb; el mapa se representa en la figura adjunta. (a) Cules son los tamaos (en pb) de los fragmentos que obtendra si el genoma de adenovirus 2 es digerido con las enzimas de restriccin Rsr II y Nde I? (b) Si dispusiera solamente de las enzimas de restriccin que se indican en el mapa, cul/es debera utilizar para obtener el menor fragmento posible que contuviera el gen completo de la ADN polimerasa (indicado en la figura como E2b, DNA polymerase)? Cul sera la longitud de ese fragmento?
Mapa del genoma del adenovirus 2 humano

Facultad de Ciencias Bioqumica (Licenciatura en Ciencias Biolgicas) Bioqumica I (Licenciatura en Bioqumica)

Laboratorio VI: Acidos nucleicos III 2007

(4) Numere los fragmentos de los Ejercicios 1 [partes (a, b, c)] y 3 [parte (a)]. (a) Ubquelos en la respresentacin esquemtica de una electroforesis en gel de agarosa que se adjunta, teniendo en cuenta el estndar de peso molecular. (b) Seale en el esquema la polaridad de los electrodos.

marcador de peso molecular ejercicio 1(a)

ejercicio 1(b) ejercicio 1(c)

ejercicio 3(a)

48000

23000

15000

12000

10000

5000 3000

2000 1000 500

(5) La siguiente tabla muestra los valores obtenidos a partir de la digestin del plsmido pBR322 (4.363 pb): Enzima EcoRI EcoRI/BamHI EcoRI/BamHI/PstI EcoRI/BamHI/PstI/ HindIII EcoRI/PstI longitud de los fragmentos (pb) 4363 3988; 375 3238; 750; 375 3238; 750; 346; 29 3612; 750

En base a estos valores, ubique los sitios de corte de cada enzima sobre el esquema del plsmido en forma circular.