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Quimica II ADN FORENSE

INTRODUCCIN
Para abordar de lleno el tema de la tcnica de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) debemos hablar primero de Biologa Molecular, esta es una ciencia cuyo objetivo fundamental es la comprensin de todos aquellos procesos celulares que contribuyen a que la informacin gentica se transmita eficientemente de uno seres a otros y se exprese en los nuevos individuos, este conocimiento nos permite cruzar las barreras naturales que existen entre las especies y "colocar" genes de un organismo otro llamado hospedero, empleando tcnicas de ingeniera gentica. Gracias a este avance, se pueden producir fragmentos de cidos nucleicos a gran escala, abriendo as las puertas a la secuenciacin de los cidos nucleicos y por ende a nuevas disciplinas como el diagnstico molecular, la terapia gnica o la obtencin de organismos superiores recombinantes.

Prueba de ADN Forense


Prueba de ADN Forense se utiliza tpicamente para identificar/verificar una evidencia biolgica desconocida.Las muestras forenses son descritas generalmente como muestras no estndar, por ejemplo: Sangre y manchas de sangre (Ej. sangre seca en la ropa interior, la alfombra, la cama, los vendajes, etc.) Lquido seminal o vaginal y manchas secas (Ej. encontrado en las ropas interiores, la cama, la ropa, etc.) Pelo con las races intactas Sobres y estampillas lamidos, tazas que fueron usadas Propsito de la prueba forense de ADN: Examinacin de la evidencia El perfil de ADN de la evidencia para determinar el origen del ADN. Testimonio experto (despus de la examinar la evidencia) Los expertos interpretan los resultados de la prueba de ADN. Deteccin del semen y prueba de infidelidad Para casos criminales o para fines privados donde un individuo puede dudar de la fidelidad de su esposo(a). Verificacin de la muestra del laboratorio Se verifica el perfil de ADN de un paciente, la muestra de un laboratorio (Ej. laboratorio de la patologa) y se efecta la comparacin para evitar errores. Nios(as)/personas desaparecidas Comparacin del ADN de muestra conocida con el ADN de muestra desconocida.

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DESARROLLO DE LA TCNICA DE REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA


En los aos setenta se desarrollaron los mtodos que permitieron de manera simple y relativamente rpida para determinar la secuencia nucleotdica de cualquier fragmento de DNA. Estos primeros intentos de secuenciar los cidos nucleicos siguieron los pasos empleados en la secuenciacin de protenas: romper las molculas en pequeos fragmentos, determinar su composicin de bases y deducir la secuencia a partir de fragmentos solapantes. Este mtodo resulta mas o menos sencillo para protenas que resultan de la combinacin de hasta veinte aminocidos distintos, pero constituye un problema en el caso de los cidos nucleicos donde la secuencia resulta de la combinacin de nicamente cuatro nucletidos diferentes.

REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA


La tcnica se basa en la replicacin del ADN en los organismos eucariotas realizada por la DNA polimerasa. Estas enzimas realizan la sntesis de una cadena complementaria de DNA en el sentido 5-> 3 usando un molde de cadena sencilla, pero a partir de una regin de doble cadena. Para crear esta regin doble cadena se usan los denominados iniciadores (primers). Son una pareja de oligonucletidos sintetizados de manera que sean complementarios a cada uno de los extremos 3 del fragmento de DNA que se desea amplificar. Partiendo de este principio, la reaccin en Cadena de la Polimerasa se basa en la repeticin de un ciclo formado por tres etapas: 1 Desnaturalizacin del ADN doble cadena 2 Hibridacin de los iniciadores a la zona 3 especfica de cada una de las hebras 3 Extensin del cebador por actuacin de la DNA polimerasa En la primera etapa (desnaturalizacin) la doble hlice de ADN se separa en dos hebras. Para ello se realiza una incubacin de la muestra a altas temperaturas (93-97C). La renaturalizacin se producir cuando la temperatura disminuya. En el segundo paso (hibridacin) los cebadores se unen a las zonas 3 complementarias que flanquean el fragmento que queremos amplificar. Se realiza gracias a la bajada de la temperatura (50-65 C) En la tercera etapa (elongacin) se produce la sntesis de una cadena sencilla (producindose un fragmento de doble cadena por la complementariedad) en la direccin 5-> 3 mediante la enzima DNA polimerasa, la cual incorpora los desoxinucletidos fosfato presentes en el medio siguiendo la cadena molde. Todos estos pasos se pueden apreciar grficamente en la Figura 1.

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Figura 1: Pasos bsicos de la PCR (de Andy Vierstracte 1999)

Este proceso se lleva a cabo en un equipo llamado termociclador (fig.2). Este aparato realiza los ciclos en los tiempos y temperaturas programadas de forma exacta. Observemos en las figuras 3a y 3b, observamos que una vez completado el primer ciclo, disponemos de 2 copias de la muestra original, al final del segundo ciclo tenemos 4, al final del tercero 8...Si los ciclos se producen un nmero "n" de veces y suponiendo que el nmero de copias de ADN se duplica en cada ciclo, obtenemos una cantidad de ADN de 2n, por lo que la amplificacin se realiza en forma de progresin geomtrica.

Figura 3: Amplificacin exponencial del PCR (de Andy Vierstracte 2001) 3

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Secuenciacin de ADN
La secuenciacin de ADN es un conjunto de mtodos y tcnicas bioqumicas cuya finalidad es la determinacin del orden de los nucletidos (A, C, G y T) en un oligonucletido de ADN. La secuencia de ADN constituye la informacin gentica heredable del ncleo celular, los plsmidos, la mitocondria y cloroplastos (En plantas) que forman la base de los programas de desarrollo de los seres vivos. As pues, determinar la secuencia de ADN es til en el estudio de la investigacin bsica de los procesos biolgicos fundamentales, as como en campos aplicados, como la investigacin forense. El desarrollo de la secuenciacin del ADN ha acelerado significativamente la investigacin y los descubrimientos en biologa. Las tcnicas actuales permiten realizar esta secuenciacin a gran velocidad.

Grfico de una secuencia de ADN obtenido por electroforesis capilar (Electroferograma)

Otras tecnologas de secuenciacin


Otros mtodos de secuenciacin por ADN podan tener ventajas en trminos de eficiencia o exactitud. Al igual que la secuenciacin por terminador marcado por tincin, estn limitadas a la secuenciacin de fragmentos nicos aislados. La "secuenciacin por hibridacin" es un mtodo no enzimtico que usa un chip de ADN. En este mtodo, un nico reservorio de ADN se marca mediante fluorescencia y se hibrida con un coleccin de secuencias conocidas. Si el ADN desconocido se hibrida fuertemente en un punto dado de entre las secuencias, hacindole que "luzca", entonces se infiere que esa secuencia existe dentro de los ADN desconocidos que son secuenciados. La Espectrometra de masas tambin se puede usar para secuenciar las molculas de ADN; las reacciones convencionales de terminacin de la cadena producen molculas de ADN de diferentes longitudes y la longitud de esos fragmentos se determina entonces por las diferencias de masa entre ellas (en lugar de utilizar una separacin por gel). Hay nuevas propuestas para la secuenciacin de ADN, entre estas estn el marcaje de la ADN polimerasa, la lectura de la secuencia a medida que la cadena de ADN pasa por nanoporos (secuenciacin por nanoporos), y tcnicas basades en microscopas, como la microscopa de fuerza atmica o el microscopio electrnico que se usan para identificar las posiciones de los nucletidos individuales dentro de largos fragmentos de ADN marcando los nucletidos con elementos pesados (p.ej.halgenos) para la deteccin visual y su registro.

Quimica II ADN FORENSE

INDICE
INTRODUCCIN_____________________________________________________________ 1 Prueba de ADN Forense ______________________________________________________ 1 DESARROLLO DE LA TCNICA DE REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA ___________ 2 REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA ______________________________________ 2 Secuenciacin de ADN _______________________________________________________ 4