Biologia Celular - Patrcia Machado Cardiopneumologia 2011/2012

Observao Microscpica de bactrias Colorao de Gram Autoria: Ana Rita Figueiredo

Eliana Gomes Ins Mira

Resumo:
A tcnica de colorao de Gram uma tcnica de colorao diferencial que permite distinguir com base na integridade da parede celular e na composio qumica os diferentes microrganismos das bactrias que podem ser classificados como Gram negativo e Gram positivo consoante a cor que adquirem. As bactrias Gram-positivo apresentam uma parede espessa, homognea, geralmente no estratificada e predominantemente constituda por

peptidoglicano (heteropolmero rgido e insolvel na gua, constitudo por cadeias lineares de dois acares aminados, apresenta-se na camada externa da bactria). Deste modo, o precipitado, fica retido no interior da clula pela camada espessa de peptidoglicano, logo, estas clulas no so descoradas permanecendo com a colorao conferida pelo corante primrio (violeta de cristal).

Palavras-Chave:
- Bactrias, Colorao de Gram, Diferenciao, Gram-negativas e Grampositivas.

Introduo:
A morfologia individual e as reaces tintoriais constituem, em geral, os critrios preliminares para identificao das bactrias e sua posterior classificao. O exame microscpico directo de um microrganismo

comumente suplementado com exame microscpico aps colorao que, alm de facilitar sua observao, permite a visualizao de determinadas estruturas. Porm, antes de ser corado, o microrganismo deve ser fixado lmina. Existem inmeros mtodos para colorao. A introduo de coloraes, no estudo dos microrganismos, veio a contribuir substancialmente com a Microbiologia, por quatro razes principais: permitem uma visualizao melhor das clulas, j que nas preparaes sem corantes so reveladas apenas o contorno e a conformao dos arranjos; permitem a caracterizao de alguns componentes intracelulares; podem levar diferenciao entre os grupos de microrganismos e podem, eventualmente, identificar alguns grupos. Existem diferentes tipos de colorao: Colorao simples cuja proposta apenas tornar a forma e estrutura bsica das clulas mais visveis; a Colorao diferencial nessa colorao o corante reage diferentemente com diferentes tipos de bactrias. A colorao de Gram e a lcool - cido resistente so exemplos de coloraes diferenciais; e a Colorao especial so aquelas utilizadas para corar e identificar partes especficas dos microrganismos como esporos (Conklin-Wirtz), flagelos ou ainda revelar a presena de cpsulas. A fixao um procedimento importante para imobilizar as substncias constituintes das clulas e dos tecidos, fornecendo maior resistncia para suportar as demais etapas, alm disso, os fixadores retardam os efeitos posmortem do tecido, mantendo a sua arquitectura normal. H duas maneiras de fixao: por processos fsicos ou qumicos. A fixao por processos fsicos (pelo calor) permite preservar a forma do microrganismo, mas alguns componentes celulares podem ser danificados. Na fixao qumica (ex. etanol, formaldedo, glutaraldedo, etc.), geralmente, no h destruio da estrutura das clulas que ficam fixadas lmina.

Material e Mtodos:
Os materiais necessrios para a realizao desta experincia so: bactrias de iogurte, gua destilada, lcool 90%, leo de imerso, lminas, conta-gotas, papel absorvente e corantes (Violeta de cristal, Reagente de Lugol e Soluo de safranina).

Iniciou-se a actividade prtica homogeneizando-se o iogurte, preparou-se um esfregao e colocou-se a secar ao ar. De seguida, fixou-se o esfregao com o lcool etlico e deixou-se secar ao ar. Depois de fixado o esfregao, utilizou-se o mtodo de Gram, ou seja, cobriu-se a preparao com reagente de Lugol, deixando-se actuar; escorreu-se a soluo de Lugol lavando-se com gua e colocou-se a secar; depois de seco diferenciou-se com lcool a 90%, lavou-se com gua, escorreu-se e secou-se com papel de filtro; tornou-se a corar a preparao com uma soluo de safranina, escorreu-se o corante, lavou-se com gua, secou-se com papel de filtro e observou-se a preparao.

Resultados
Nesta actividade prtica realizou-se duas preparaes, ou seja, preparmos duas amostras, dois esfregaos de iogurte. Na primeira preparao (terminado o esfregao e a aplicao doa reagentes indicados) no foi possvel observar quaisquer tipos de bactrias que existem no iogurte. Na segunda preparao foi possvel observar as bactrias que existem no iogurte, nomeadamente, lactobacilos, streptococcus e coccus. Nesta segunda amostra, foi permitido observar os diferentes tipos de bactrias, pois essas bactrias foram capazes de reter o complexo formado pelo cristal violeta (CV) e o iodo (complexo iodo pararosanilina). Ou seja as bactrias obtiveram uma colorao violeta (Gram positivo), uma vez que quando expostas ao lcool esse no consegue lavar as clulas dessa colorao. possvel que na primeira amostra no se tenha conseguido observar as bactrias que existem no iogurte, pois podem ter existido alguns erros na preparao da mesma.

Discusso
O mtodo da colorao de Gram consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio slido ou lquido. O primeiro a ser usado e que cora todas as clulas de roxo o corante primrio: roxo de metilo (ou violeta de cristal), depois o mordente: lugol (soluo de iodo e iodeto de K): este reagente uma substncia que forma

um complexo insolvel ligando-se ao corante primrio. O complexo resultante serve para intensificar a cor do corante, ou seja, o lugol ajuda o roxo de metilo a penetrar nas clulas e a resistir descolorao. Nas bactrias Gram positivo este complexo mais difcil de ser removido do que nas bactrias Gram negativo. De seguida o descorante: lcool-acetona (ou lcool etlico a 95 %): este reagente serve de solvente de lpidos e de agente desidratante das protenas. Assim, a sua aco determinada pela concentrao lipdica das paredes celulares microbianas. Nas clulas Gram positivo a concentrao baixa de lpidos importante para reter o complexo corante-mordente. Os lipidos so dissolvidos pela aco do lcool causando a formao de pequenos poros na parede celular. Mas estes so prontamente fechados pela aco desidratadora do lcool e como consequncia o corante primrio difcil de ser removido e as clulas mantm-se roxas. Nas clulas Gram negativo a alta concentrao de lpidos na membrana externa da parede celular dissolvida pelo lcool, formando-se grandes poros na parede celular que no fecham apreciavelmente durante a desidratao das protenas da parede celular. Isto facilita a libertao do complexo corante-mordente deixando as clulas incolores. Por fim, o corante de contraste: fucsina diluda (ou safranina): este o ltimo reagente a ser aplicado e cora de vermelho as clulas que foram previamente descoradas. Uma vez que as clulas Gram negativo ficaram descoradas elas podem agora absorver o corante de contraste. As clulas Gram positivas mantm a cor do corante primrio. A diferena na colorao das bactrias Gram positivo e Gram negativo devese resistncia descolorao pelo lcool: as bactrias Gram positivas: so aquelas que retm o corante inicial e aparecem coradas de roxo e as bactrias Gram negativas: so aquelas que perdem o corante inicial quando lavadas com o lcool e depois coram de vermelho com o corante de contrate.

Concluso
Esta actividade prtica serviu maioritariamente para observar as bactrias existentes nos iogurtes atravs da tcnica de colorao de Gram. Como j foi acima referido, a tcnica de colorao de Gram uma tcnica que permite a identificao de bactrias, pois estas adquirem uma colorao violeta/roxa (Gram+). No desenrolar da actividade prtica foi-se concluir que as bactrias do iogurte eram Gram+, pois respeitavam os parmetros normais desta tcnica, colorao roxa. Contudo como foi referido na discusso deste relatrio, existiram resultados que no corresponderam ao esperado, assim conclui-se que esta tcnica que quando no aplicada correctamente pode-se demonstrar insatisfatria para se retirar concluses mais assertivas.Ou seja, esta colorao o ponto de partida na identificao bacteriana, mas no deve nunca ser utilizada como um diagnstico definitivo. importante salientar que a colorao de Gram somente um recurso rpido e til, quando correctamente realizada e interpretada.

Bibliografia
http://www3.uma.pt/gcosta/docs/microbiology/prat1a.pdf; http://www.infoescola.com/bioquimica/coloracao-de-gram/; http://renylab.com.br/instrucoes/kit_coloracao_de_gram.pdf;

Contribuio dos autores

Alunos Eliana Gomes Observao ao microscpio (focagem correcta da amostra, encontro das bactrias), Ins Mira pesquisa na Net, elaborao de parte do relatrio (concluso, resultados), organizao do relatrio (tipo de letra, espaamentos entre linhas, etc.). Apontamento de notas sobre o que se ia realizando durante o esfregao, observao ao Ana Rita Figueiredo microscpio da amostra (encontro das bactrias), pesquisa na Net, elaborao de parte do relatrio: material e mtodos, palavras-chave, bibliografia e contribuio dos autores. Trabalho elaborado Realizao do esfregao, elaborao de parte do relatrio: Introduo, resumo e discusso.