Universidad Nacional del Litoral Facultad de Humanidades y Ciencias Departamento de Ciencias Naturales. Profesorado de Biologa - Licenciatura en Biodiversidad.

Ctedra: BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR Guas de Trabajos Prcticos

AO ACADEMICO

2010

TRABAJO PRCTICO N 1
LA CLULA EUCARIOTA Y SUS ESPECIALIZACIONES OBJETIVOS: Reconocer y esquematizar clulas eucariotas de los diferentes Reinos. (Animal, Vegetal, Fungi, Protoctista) Reconocer y sealizar las diferentes adaptaciones presentes en la clula eucariota. Adquirir habilidades y destrezas en la confeccin de preparaciones para la observacin celular. Poner a punto tcnicas experimentales que permitan la observacin de fenmenos de fisiologa celular. INTRODUCCIN. Las clulas eucariotas se caracterizan por la presencia de compartimentos delimitados por membranas en los cuales se desarrollan funciones diferenciales que contribuyen al funcionamiento global de la entidad. Se recomienda consultar bibliografa sobre las caractersticas morfolgicas de las clulas eucariotas. Procedimientos que permiten la observacin microscpica: a) Cortes a mano alzada o libre: Se utiliza para cortes en vegetales y consiste en tomar la parte del vegetal a trabajar con una mano, ubicarlo a la altura de los ojos y con la otra deslizar perpendicularmente una hoja de afeitar. Es conveniente mantener hmeda la superficie a cortar. Recoger los cortes en vidrio de reloj con agua destilada. Seleccionar los cortes ms delgados bajo la lupa (si no tiene lupa, procure quedarse con aquellos ms translcidos). Si no son procesados en el momento guardar en alcohol 70%. b) Tcnicas de tincin: Las sustancias que se utilizan para colorear los componentes celulares contienen dos clases de grupos qumicos activos: grupos cromofricos y grupos auxocrmicos. Los primeros imparten color y los segundos dan al colorante su capacidad de unirse al componente celular de inters. Si los auxocrmicos son sulfatos, hidroxilos o carboxilos el colorante es cido y se emplean para la tincin del citoplasma, por Ej. Fucsina cida, Rojo Congo. Si en cambio son aminas el colorante es bsico se utilizan entre otros para la tincin de cidos nucleicos por Ej. Fucsina Bsica, Safranina, Verde de Metilo y Azul de Metileno, MATERIALES: Porta y cubreobjetos Cajas de Petri Microscopios Cinta adhesiva Hojas de afeitar Alcohol Colorantes Pipetas Mecheros Bistur, esptula Material biolgico a observar (fresco y preparados por la ctedra).

DESARROLLO: Para cada observacin realice un esquema con el aumento que considere le ofrece el mejor detalle del objeto observado. Los esquemas estn correctamente realizados cuando se realizan con lpiz, se colocan las referencias correspondientes as como la leyenda explicativa del esquema. I) Observacin de clulas del REINO VEGETAL y sus elementos caractersticos Procedimiento: Colocar una gota de agua sobre un portaobjetos. Con la ayuda de un alfiler, levantar el vrtice de una "V", practicada sobre el material correspondiente. Montarlo sobre la gota de agua, colocar un cubreobjeto y llevar a microscopio. Observar y esquematizar; los siguientes cortes: a) Tejidos epidrmicos: Con un bistur u hoja de afeitar realizar un corte en V sobre la cara abaxial de la hoja de malvn o helecho y con la ayuda de un alfiler separar el tejido epidrmico y realice un preparado fresco. Observar con las lentes objetivas de 10X y 45X. Separe tejido epidrmico con el mismo procedimiento en pimiento rojo o tomate. Observar las caractersticas celulares y las modificadas tales como pelos secretores y protectores, estomas, etc. Preste especial atencin a la estructura de la pared celular y contenidos citoplasmticos en cada una de las preparaciones realizadas. Tome una hoja joven de Elodea (Anacardis sp.) confeccione un preparado fresco. Observe las estructuras celulares y subcelulares con el lente objetivo de 10X y 45X. Deje durante 10 minutos la preparacin expuesta a la luz del microscopio y observe nuevamente. b) Tejidos parenquimticos: De reserva: 1- realizar cortes delgados en pecolo de camalote (Eichhornia crassipes). Montar sobre portaobjeto con una gota de agua. Observar con las lentes de 10X y 45X. Analizar los diferentes tipos celulares y las adaptaciones que presentan. 2- En papa (Solanum tuberosum), tallo modificado de reserva, realice cortes muy delgados, confeccione un preparado fresco con el agregado de lugol lo mismo para banana. Compare con las estructuras observadas en los tejidos epidermicos. c) Tejidos de Conduccin: Colocar en agua durante (4 das), hojas de lechuga, achicoria o acelga. Realice cortes a mano alzada de pecolo de lechuga o en tallo de zapallo en sentido paralelo al mismo. Confeccione preparaciones frescas. Montar entre porta y cubre un poco de la preparacin y llevar a microscopio Observar con los lentes objetivas de 10 X y 45X ubique y describa las trqueas lignificadas con relieves espiralados, anillados, etc. II) Observacin del REINO ANIMAL y sus elementos caractersticos. a) La ctedra le ofrecer preparaciones histolgicas. Observar y analizar la morfologa y caractersticas de Clulas nerviosas, musculares, drmicas especializadas u otras. b) Observacin de extendidos sanguneos, coloreados con la tcnica de May Grunwald- Giemsa, de vertebrados mamferos y otros vertebrados. El tejido sanguneo presenta la particularidad que la sustancia intercelular es lquida y se la conoce como plasma. Las clulas de este tejido son: Glbulos rojos o eritrocitos que presentan ncleo en todos los vertebrados excepto en los mamferos que lo pierden durante la maduracin del elemento (suelen no ser

considerados como clula). Presentan forma de disco bicncavo. Estn especializados en el transporte de gases. Glbulos Blancos: son de mayor tamao que los anteriores, redondeados y en los mamferos presentan ncleos de formas muy variadas, que conjuntamente con las granulaciones citoplasmticas permite su clasificacin. Actan en la defensa del organismo. Plaquetas: Son elementos menores, fragmentos citoplasmticos anucleados, que surgen por particin de una clula predecesora de la medula sea (megacariocito) y su funcin principal est relacionada con los procesos de coagulacin. Observe con las lentes objetivas de 45X y 100X. Analice la preparacin y esquematice los elementos observados. c) La ctedra le ofrecer extendidos de esperma. Realice la observacin con las lentes objetivas de 45X y 100X. Analice y esquematice la estructura de los espermatozoides. d) Preparaciones frescas de msculo vacuno: Tomar una pequea porcin de msculo vacuno y colocarlo en un portaobjeto con una gota de agua, con la ayuda de dos agujas de diseccin desmembrar lo ms fino posible. Montar y observar con las lentes objetivas de 10X y 45X. Esquematizar la fibra muscular estriada. e) Preparaciones frescas de tejido adiposo vacuno: Tomar una pequea porcin de grasa vacuna y colocarla en un portaobjeto con una gota de agua, con la ayuda de dos agujas de diseccin desmembrar lo ms fino posible agregar una gota de Rojo Congo. Montar y observar con las lentes objetivas de 10X y 45X. Esquematizar los adipocitos. f) Preparacin fresca de Mucosa bucal: Tomar dos portaobjetos limpios y desinfectarlos con alcohol. Con uno de ellos proceda a tomar una muestra de mucosa bucal y confeccione un extendido. Coloque una gota Azul de Metileno montar y observar con las lentes objetivas de 10X y 45X. III) Observacin de clulas del REINO HONGOS. a) Para la observacin de hongos unicelulares se utilizar una suspensin de levaduras de panadera (Saccharomyces cerevisiae) de la cual se colocar una gota con el ansa de siembra sobre el portaobjeto y se proceder a su frotado, luego fijar con calor flameando el porta a la llama y colorear con azul de Metileno. Secar y observar con las lentes objetivas de 10X; 45X y 100X. b) Para el anlisis de hongos pluricelulares se observar moho de pan, de frutas o de pared. Con la ayuda de un bistur, esptula o cinta adhesiva transparente, segn indicacin del docente, recoja una porcin del hongo. Colocarlo sobre un portaobjeto limpio con una gota de agua y agregar azul de metileno. Colocar el cubre y observar con los lentes de 10X, 45X. En todos los casos, cuando se ha logrado un campo apropiado, se puede pasar a mayor aumento para realizar observaciones de detalles: nivel celular y orgnico. IV) Observacin de clulas de organismos del REINO PROTOCTISTAS 1- ORGANISMOS HETERTROFOS (PROTOZOOS). Se utilizarn muestras de agua (floreros, charcas, zanjas, lagunas) espigas de trigo, granos, achicoria, cpsulas de Petri, cereal hervido, plantas acuticas,

-Cultivo de ciliados. Preparacin 1: Desmenuzar unas cuantas espigas de trigo y colocar los granos con sus envoltorios en un recipiente de vidrio con agua corriente. Dejar por lo menos una semana a la temperatura del laboratorio para que macere su contenido. Preparacin 2. Cortar hojas de achicoria, colocarlas dentro de un recipiente de vidrio y aadir agua corriente hasta cubrir los fragmentos. Dejar reposar a temperatura ambiente durante una semana. -Cultivo de amebas. Colocar hojas putrefactas con 50 cc. de agua de charco en cpsulas de Petri. La temperatura adecuada es de 24 C (siendo perjudicial la luz directa del sol). Agregar a cada cpsula unos granos de trigo u otro cereal hervido durante 5 minutos. A las dos semanas ya pueden observarse amebas en el sedimento. -Observacin de protozoos del ambiente: Repetir el procedimiento con gotas extradas de las muestras de agua de charca, laguna, etc. Arrancar hojas de plantas acuticas y proceder al raspado de la epidermis inferior contra el borde del portaobjeto. Repetir varias veces para que se deposite un poco de material sobre el portaobjetos. Distribuir el raspado y cubrir. Colocar el preparado en el microscopio, observar y esquematizar. En todos los casos, cuando se ha logrado un campo apropiado, se puede pasar a mayor aumento para realizar observaciones de detalles: citoplasma, ncleo, lmites celulares, cilios, flagelos, seudpodos, etc.
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ORGANISMOS AUTOTRFICOS (ALGAS MICROSCPICAS).

Observar muestras de agua de floreros, charcas, zanjas, lagunas, madrejones y de races de plantas acuticas. Con una pipeta de vidrio se extrae una gota del medio de cultivo, se deposita sobre el portaobjeto y se cubre, cuidando que no queden burbujas en el preparado. Coloca el preparado en el microscopio y observar. En todos los casos, cuando se ha logrado un campo apropiado, se puede pasar a mayor aumento para realizar observaciones de detalles: citoplasma, ncleo, limites celulares cloroplastos, pirenoides (sustancias de reserva), flagelo. Preguntas 1) Qu criterios, supone usted, se proponen para la seleccin de los diferentes aumentos de observacin en cada preparacin? 2) Qu estructuras que componen la clula Eucariota podr usted observar al microscopio ptico? Realice un esquema de ellas en la posicin intracelular que se encuentran 3) Seale las diferencias fundamentales entre la clula eucariota vegetal y animal. Cuales de ellas realmente podr observar? 4) Por qu en cada preparacin se proponen diferentes colorantes. BIBLIOGRAFA.

ALBERT, B Y OTROS. 1996. Biologa Molecular de La CLULA. Ed. Omega CURTIS, H Y BARNES, S. 2000. Biologa. Ed. Mdica Panamericana DE ROBERTIS, E Y OTROS. 1996. Biologa Celular y Molecular

TRABAJO PRCTICO N 2 CLULAS PROCARIOTAS

OBJETIVOS. Conocer y analizar la estructura de las clulas Procariotas. Desarrollar criterios y normas de trabajo en el laboratorio. Desarrollar habilidades y destrezas en tcnicas sencillas de microbiologa. INTRODUCCIN. Las clulas procariotas se caracterizan por carecer de compartimentos en su citoplasma, por consiguiente, el material gentico de estas clulas se halla disperso por el citoplasma en una regin denominada nucleoide. Este tipo celular es el caracterstico de los organismos del Reino Moneras y del Reino Archaea. El reino Moneras a su vez, se divide en dos grupos importantes: Las Bacterias y las algas verde-azules o Cianobacterias. Las bacterias miden en promedio unas 5 y presentan formas bastantes regulares que permiten su clasificacin en Cocos, cuando son redondeados. Se denominan: Micrococos, cuando aparecen aislados y dispersos tras la divisin celular. Diplococos, cuando se disponen en pares Tetracocos cuando lo hacen de a cuatro. Estreptococos, tienden a unirse formando cadenas. Estafilococos, aparecen en grupos irregulares, formando racimos, a veces de gran tamao; Los Bacilos, presentan forma de bastones alargados finos, gruesos o ramificados. Tienen grandes variaciones morfolgicas: fusiformes, estreptobacilos, cocobacilos; pueden agruparse en cadenas de longitud variable Se denominan Espirilos cuando son alargados con torsiones suaves en tirabuzn rgido o flexible; finalmente los Vibriones presentan formas de coma. La membrana celular de los procariotas est rodeada por una pared celular externa elaborada por la clula misma, est constituida por un polmero complejo de azcares y aminocidos, llamado Murena o peptidoglucano. Mientras que algunas bacterias tienen esta pared en forma de una gruesa trama a manera de un rgido cors, (Gram +); en otras es 20 veces menor, (Gram -) y se observa por fuera de sta una membrana externa de naturaleza lipdica con un componente exclusivo el Lipopolisacrido bacteriano o LPS y canales proteicos hidrfilos especiales denominados porinas. El aspecto que vuelve Gram positivas a las primeras es la capacidad de retener el complejo cristal violeta-lugol y depende de la estructura de la pared celular. El alcohol, decolorante, en las Gram negativas acta como un modificador de la permeabilidad de la membrana externa provocando el escape del complejo colorante, hacindose necesario una coloracin de contraste (safranina) Cuando las bacterias son crecidas sobre medios apropiados forman colonias las cuales son macroscpicas, con forma y aspecto particular. Surgen por divisiones sucesivas de una nica clula inicial que se denomina Unidad Formadora de Colonia (UFC), por consiguiente cada colonia equivale a decir una bacteria. Ej. 9 colonias = 9 UFC Las formas de las colonias son variadas y dependen si crecen sobre la superficie de medio de cultivo o en el interior del mismo. Pueden presentar coloraciones caractersticas, algunas iridiscentes y otras opacas. Sus bordes pueden ser lisos, festoneados o irregulares

Esquema de formas y agrupaciones de bacterias

Divisin a lo largo del mismo plano, Cadenas de bacilos: Divisin Forma de vara: se Dos bacilos juntos: Empalizadas, Bacilos lado a lo largo de 3 planos llaman Bacilos Diplobacilos Estreptobacilos con lado o en figuras en forma formando cadenas cortas X, V o Y Divisin a lo largo de esfrica: 2 planos diferentes: regularmente: se llama 2 cocos 4 - 20 en cadenas: irregularmente: Estafilococos Ttradas juntos: Sarcinas Coco Estreptococos Diplococos

Forma espiral rgida se llama: Espirilo

Si la espiral es flexible y ondulada se llama: Espiroqueta

Cocos
Racimos: forma tpica de Staphylococcus aureus Tetradas: forma tpica de Micrococcus sp. Cadenas: forma tpica de Streptococcus pneumoniae

Bacilos
Gruesos: forma tpica de Clostridium sp. Finos: forma tpica de Listeria Sp Ramificados: forma tpica de Actinomycetes y Nocardia

PROCEDIMIENTO Para cada observacin realice un esquema con el aumento que considere le ofrezca el mejor detalle del objeto observado I) Realizacin de un cultivo sencillo de bacterias. Recibir cajas de Petri con 15 ml de medio nutritivo slido (caldo de Carne + agar). a) Se realizar la siembra o inoculacin de 1 ml de las diluciones 10-1, 10-2,10-3, 10-4 de muestras colectadas en cuerpos de agua locales. La realizacin de las diferentes diluciones tiene por objetivo obtener una placa con el nmero de colonias, identificables y contables que permita cuantificar su concentracin aproximada en la muestra de origen. Placas con demasiadas colonias o excesivamente pocas NO
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sirven, un nmero apropiado ronda alrededor de las 150 colonias. b) Siguiendo las instrucciones del docente realice un estriado sobre medio nutritivo slido con la solucin madre. Incube, todas las placas, durante 24 hs en estufa de cultivo a 37 C, al cabo de este tiempo los cultivos deben trasferirse a heladera hasta la semana siguiente, en la cual se proceder a la tipificacin de las colonias crecidas, de sus organismos constitutivos y al clculo de la densidad de organismos en el medio natural en la placa que as lo permita es decir aquella en la que el nmero de colonias formadas se recuente sin lugar a dudas. Ej. Si en la disolucin 10-3 se cuentan 9 UFC. Cul es la densidad de bacterias por ml de muestra procedente del medio natural? Si en la dilucin 10-3 se observan 9 UFC Por tanto en 1ml de la muestra del medio natural habr 1000 x 9 = 9000 bacterias por ml. II) Observacin de bacterias en yogur Coloque una pequea cantidad de yogur a un tubo de ensayo y entibie a bao Mara. Tome con el ansa de siembra una muestra del mismo, frote sobre portaobjeto y realice un preparado fresco coloreando con Azul de Metileno. Observe con la lente objetiva de 10X y 45X. III) Observacin de bacterias de cultivo La ctedra entregar cajas de Petri con cultivos en medios nutritivos, que han desarrollado crecimiento bacteriano, razn por la cual se deber manipular los elementos evitando la contaminacin, tanto del operador como del cultivo, trabajando en condiciones aspticas cerca de un mechero. Coloque sobre un portaobjeto una gota de agua. Recoja material bacteriano haciendo un toque suave sobre una colonia con un ansa de siembra previamente esterilizada, puesta al rojo vivo y enfriada. Disperse el material recogido realizando crculos (frotis) de manera que la preparacin quede tenue y transparente. Seque a temperatura ambiente y finalmente fije flameando 2 o 3 veces por la llama (Importante: el portaobjeto NO debe calentarse en exceso y debe tolerarse sobre el dorso de la mano). Llevar la preparacin a la cubeta de coloracin y realizar la tincin diferencial de GRAM: Cristal Violeta 1 minuto Lavar con agua Lugol 1 minuto (acta como mordiente formando un complejo con el Cristal Violeta) Lavar con alcohol 96 20 segundos Lavar con agua Safranina 30 segundos Lavar con agua Secar a temperatura ambiente. Observar con las lentes objetivas de 45X y 100X. Elabore un informe con los resultados obtenidos, discuta los mismos y saque conclusiones. IV) Realizacin de un cultivo de cianfitas. Llamadas comnmente como algas verde-azuladas por su color verde-azulado Se caracterizan porque son auttrofos, su citoplasma no suele presentar estructuras reconocibles pero existen vesculas gasferas (llenas de gas) y tilacoides, vesculas aplastadas formadas por invaginacin de la membrana plasmtica (con la que suelen conservar comunicacin o contacto) donde reside el aparato molecular de la .fotosntesis Constituidos por elementos idnticos aislados (unicelulares) o en

cenobios filamentosos, planos o globulares, viven en medios hmedos o acuticos con una gran adaptabilidad. Las cianobacterias son microorganismos cuyas clulas miden slo unos micrmetros (m)de dimetro, pero son ms grandes que lo tpico de las otras bacterias.

Anabaena sp Medio de cultivo:

Nostoc sp.

El medio de cultivo debe proporcionar los requerimientos mnimos de la especie a cultivar. Habitualmente contiene: agua del medio natural (agua de mar o dulce) o artificiales (destilada) Sales minerales: a) macronutrientes como Nitrato de calcio o potasio, Fosfato monopotasico Sulfato magnesio, Cloruro de potasio. b) micronutrientes), Sulfato de zinc, Cloruro de cobre, Cloruro de magnsio, Acido brico, Cloruro frrico. Adems una fuente de nitrgeno, pH adecuado y en algunos casos hormonas y vitaminas. Los medios de cultivos son utilizados para obtener buenos rendimientos aplicables a procesos de inters biotecnolgico como alimentacin en acuicultura, extraccin de metabolitos secundarios y productos qumicos de alto valor. Preguntas: 1- Diga a cuntos milmetros corresponde una micra, recapacite sobre las dimensiones de las bacterias y los aumentos brindados por el microscopio ptico. 2- Realice un esquema de una clula procariota y ubique en l sus elementos constituyentes. Cules de ellos piensa sern observados con el mayor aumento de un microscopio ptico? 3- Mencione los diferentes componentes de la Pared Celular. Relacione con las biomolculas y sus propiedades. 4- Realice el clculo referidos a volmenes a colocar para realizar 100 ml. de una dilucin 10-5. 5- Si usted dispone de una solucin 10 M de Hidrxido de Bario y desea preparar 50 ml de una solucin 1,2 M. Recuerde C1 x V1 = C2 x V2 6- Qu es la Esterilizacin? Qu mtodos conoce y para qu tipo de materiales se utiliza cada uno? 7- Mencione algunas actitudes que promueven su salud y la de sus compaeros cuando se trabaja en un laboratorio con material biolgico.

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BIBLIOGRAFA

ALBERT, B Y OTROS. 1996. Biologa Molecular de La CLULA. Ed. Omega CURTIS, H Y BARNES, S. 2000. Biologa. Ed. Mdica Panamericana DE ROBERTIS, E Y OTROS. 1996. Biologa Celular y Molecular MADIGAN, M; MARTINKO, J.; J. PARKER. 1998. Brock Biologa de los Microorganismos. 8 Edicin. Prentice Hall Internacional (UK) Ltd. Espaa. ZINSSER, J. 1994. Microbiologa. Editorial Panamericana, Mxico, Bs. As.
VILLAFAE, V. E. y REID, F. M. H. 1995. Mtodos de Microscopa para la cuantificacin del fitoplancton. En: K. ALVEAL.M.E. FERRARIO,E.C.OLEVEIRA & E.SAR(eds.), Manual de Mtodos Ficolgicos. pp 169-185. Universidad de Concepcin, Chile.

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TRABAJO PRCTICO N 3 TRANSPORTE DE MEMBRANA

OBJETIVOS: Comprobar los fenmenos de turgencia, plasmlisis y presin osmtica en hojas de Anacharis sp. (Elodea) Verificar la respuesta del eritrocito a cambios de la osmolaridad del fluido extracelular Desarrollar habilidades en la grfica e interpretacin de resultados Desarrollar habilidades y destrezas en el desarrollo de experiencias en el laboratorio. INTRODUCCIN. La smosis es un caso especial de la difusin. Se la puede definir como el pasaje de cualquier solvente a travs de una membrana diferencialmente permeable. El solvente universal de los seres vivos es el agua, por consiguiente la smosis puede definirse como la difusin de agua a travs de una membrana semipermeable a favor de su gradiente de concentracin. Las molculas de agua se desplazan de un lugar a otro en virtud de diferencias de energa potencial (potencial hdrico). El potencial hdrico es influido por la concentracin de partculas disueltas. Es directamente proporcional a la concentracin de molculas de agua, a mayor concentracin de molculas de agua mayor potencial hdrico; por el contrario a mayor concentracin de partculas de soluto menor es el potencial hdrico. Las Soluciones hipotnicas son aquellas en las cuales la concentracin de solutos es baja y por lo tanto poseen una alta concentracin de solvente (agua). En cambio, las Soluciones hipertnicas son aquellas en las cuales la concentracin de solutos es muy alta y por lo tanto poseen una baja concentracin de solvente (agua). Dos o ms soluciones son isotnicas cuando tienen la misma cantidad de partculas disueltas por unidad de volumen por ende el mismo potencial hdrico. Cuando una clula vegetal es sometida a soluciones hipertnicas se produce un flujo global del agua hacia afuera, de manera tal que la clula se observa plasmolizada, es decir sufre una retraccin de la membrana y su contenido citoplasmtico, por consiguiente se visualiza una separacin de la masa citoplasmtica de la pared celular y consiguiente perdida de turgencia. En la clula animal el efecto global es idntico, pero al carecer de pared se la observa simplemente disminuida de tamao. Cuando una clula de origen animal es sometida a soluciones hipertnicas se produce un flujo global del agua hacia afuera, por lo cual la clula se observa muy disminuida de tamao y encogida con cambios a nivel de la membrana plasmtica (el glbulo rojo se dice esta crenado) MATERIALES: - Una rama de Elodea - Soluciones 1M; 0,5 M; 0,1 M; 0,05 M; 0,01 M. El peso molecular de la sacarosa 342,30 g/mol. -Soluciones de cloruro de sodio: Hipotnica, Hipertnica e Isotnica la cual es 0,15 M PROCEDIMIENTO: I) Turgencia y Plasmlisis en clulas vegetales. a) Por grupo de trabajo coloque de dos a tres hojas de Elodea en cada uno de los recipientes que contienen las diferentes concentraciones de sacarosa.

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b) A los 15 minutos, analice al menos dos de las hojas de cada concentracin, comenzando por la ms concentrada, al microscopio ptico, analice tres campos visuales al aumento objetivo de 40X. Anote el nmero de clulas plasmolizadas por campo analizado, as como el nmero total de clulas por campo. c) Grafique el porcentaje total de clulas plasmolizadas versus concentracin. Estime la concentracin isotnica con respecto al protoplasma. Por definicin es aquella solucin en la cual el 50% de las clulas observadas presentan plasmlisis incipiente, o sea que su membrana plasmtica apenas esta separada de la pared celular. II) Lisis en clulas animales. a) Sobre un portaobjeto coloque una gota de la solucin hipotnica, al lado una isotnica y finalmente una hipertnica, en cada gota deposite una gota de sangre. El docente explicar como obtenerla. b) Coloque el cubreobjeto y analice en el siguiente orden las diferentes soluciones. 1 la isotnica ya que le evaporacin de molculas de agua la transforma rpidamente en hipertnica, 2 la hipotnica y finalmente la hipertnica. Preguntas 1) Qu entiende por smosis? 2) Qu componentes de membrana permite el pasaje del agua a su travs? 3) Qu es lo que marca la diferencia entre una solucin hipotnica y una hipertnica? 4) Esquematice lo que espera observar cuando las clulas vegetales son sometidas a soluciones hipertnicas. 5) Realice lo mismo para las clulas animales

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TRABAJO PRCTICO N 4 METABOLISMO CELULAR

OBJETIVOS: Demostrar la actividad biolgica, involucrada en la conversin y obtencin de energa utilizable por la clula en sus procesos. Visualizar productos de la actividad metablica mediante cambios de pH por acumulacin de producto. Interpretar resultados cualitativos INTRODUCCIN. En todo sistema viviente se caracteriza por realizar intercambios de materia y energa e implican las ocurrencias simultneas de gran cantidad de reacciones qumicas. Algunas de estas reacciones descomponen molculas complejas en otras ms sencillas mientras que otras conducen a la formacin de molculas complejas a partir de otras ms simples. La sumatoria de todas estas reacciones qumicas se denomina METABOLISMO. Las series de reacciones qumicas que conducen a la degradacin de compuestos se denominan Vas Catablicas y tiene por finalidad la liberacin de energa contenida en el compuesto, as como metabolitos que sern materia prima para nuevas reacciones o bien de excrecin. Asimismo la serie de reacciones qumicas que conducen a la sntesis de compuestos complejos se denominan Vas Anablicas, y como se indica las mismas constituyen mecanismos de elaboracin de macromolculas. Como ejemplo de las primeras vas podemos mencionar a la Respiracin Celular, dependiente de la presencia de oxgeno y la Fermentacin. Como va anablica primaria podramos citar la Fotosntesis. Reaccin Global de la Respiracin Celular C6 H12 O6 + O2 6 CO2 + 6 H2 O + 38 ATP

Glucosa a nivel mitocondrial o bien con la batera enzimtica necesaria y en presencia de oxgeno produce dixido de carbono, agua y energa Reaccin Global de la Fermentacin de glucosa C6 H12 O6 2 C2 H6 O + 2 CO2 + 4 ATP

Glucosa a nivel citoplasmtico es procesada, por algunos organismos, a etanol, dixido de carbono y energa. Reaccin Global de la Fotosntesis LUZ 6 CO2 + 6 H2 O C6 H12 O6 + O2 Clorofila El dixido de carbono ms agua en presencia de luz y en un medio apropiado da origen a estructuras carbonadas y oxgeno libre.

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PROCEDIMIENTO I) Verificacin de los procesos respiratorios y/o fermentativos En esta actividad se realizar la oxidacin de la glucosa. Como indicador de la prueba se utilizar Azul de Metileno, este colorante se vuelve incoloro cuando se reduce a) Preparar una suspensin de levaduras de la siguiente manera: a 100 ml. de agua destilada agregar 1 g. de levadura de panadera fresca (Saccharomyces cerevisiae). Agitar con una esptula hasta homogeneizar la suspensin. b) Prepare 4 tubos de ensayo en una gradilla, y siga las instrucciones del cuadro tubo 1 1) Levadura 2) Tratamiento 3) Glucosa 4) Agua decarbonatada 5) Azul de bromotimol 1 gr. ------------------------------------tubo 2 1 gr. -----------------una punta de esptula 5 ml 5 o 6 gotas (hasta azul intenso) tubo 3 1gr. Calentar a ebullicin una punta de esptula 5 ml 5 o 6 gotas (hasta azul intenso) tubo 4 ------------------------------------una punta de esptula 5 ml 5 o 6 gotas (hasta azul intenso)

5 ml 5 o 6 gotas (hasta azul intenso)

c) Dejar en un ambiente con temperaturas entre 25 y 37 C. d) Verifique los cambios ocurridos cada 5 minutos II) Verificacin de los procesos de fotosntesis y respiracin en Vegetales. a) Coloque 4 tubos de ensayo en una gradilla. Tubo 1 Agua Decarbonatada 10 ml Azul de bromotimol Insuflar Aire Elodea Vaselina Lquida Tratamiento Tubo 2 10 ml Tubo 3 10 ml Tubo 4 10 ml 3 o 4 gotas NO NO 1 ml

3 o 4 gotas 3 o 4 gotas 3 o 4 gotas SI SI 1 ml LUZ SI NO 1 ml LUZ NO SI 1 ml

OSCURIDAD OSCURIDAD

b) Al cabo de 2 horas analice los cambios que se hayan verificado en los tubos. Realice un informe con los resultados y discusin de los mismos as como las
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conclusiones arribadas Preguntas 1. Que organismos realizan la respiracin celular? De que depende la posibilidad de realizar el proceso? Cuales pueden realizar la fermentacin? Que factores puede involucrar en la realizacin de uno u otro? 2. Cual de los dos procesos degradativos rinde mayor energa? Fundamente su respuesta. 3. Cul es el objetivo que se persigue con la implementacin de los cuatro tubos de la experiencia 4. En que tubos espera observar cambios y por qu 5. Pasara lo mismo si se colocar sacarosa como sustrato en vez de glucosa? 6. Que sucedera si se colocaran los tubos 1 y 2 a una temperatura de 5 C? 7. En la experiencia 2 que funcin cumple el tubo 1? 8. Que espera que ocurra en los tubos 1 de la experiencia 2? 9. Qu factores puede mencionar como limitantes en la realizcion del proceso fotosinttico? BIBLIOGRAFA: ALBERT, B Y OTROS. 1996. Biologa Molecular de La CLULA. Ed. Omega CURTIS, H Y BARNES, S. 2000. Biologa. Ed. Mdica Panamericana DE ROBERTIS, E Y OTROS. 1996. Biologa Celular y Molecular

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TRABAJO PRCTICO N 5 AISLAMIENTO Y PURIFICACIN DE ADN EUCARIOTA

OBJETIVOS Conocer los procedimientos bsicos para la obtencin de ADN puro Aplicar dichos procedimientos para lograr aislar ADN a partir de muestras biolgicas eucariotas Valorar la relevancia biolgica y metodolgicas en la purificacin del DNA Adquirir experiencia bsica en el manejo del laboratorio de biologa molecular INTRODUCCIN. Los cidos nucleicos son molculas ms grandes que las protenas. Se los denomina Polinucletidos (polmeros de nucletidos). Cada Nucletido constituye una molcula compuesta por una base nitrogenada prica o pirimdica, un azcar de cinco carbonos (ribosa o desoxirribosa) y un grupo fosfato Existen dos cidos nucleicos: el cido Desoxirribonucleico o ADN y el cido Ribonucleico o ARN. El primero se encuentra localizado en el ncleo y el segundo si bien est en el ncleo, se halla sobre todo en el citoplasma celular. Los cromosomas eucariotas se presenta en el compartimiento nuclear en un nmero variable de cadenas de ADN lineal compuestas por un tercio de ADN y dos tercios de protenas: una fraccin de ellas fuertemente asociadas al ADN son unas pequeas protenas conocidas como Histonas (H2 A; H2 B; H3; H4; y H1), con quien forman una estructura estable o nivel primario de condensacin: el Nucleosoma. La otra fraccin est compuesta por protenas de diferente ndole que le ayudan por un lado a mantener su conformacin (topoisomerasas) y por otro a cumplir con las diferentes funciones (Replicacin, Transcripcin), denominadas genricamente como protenas No Histnicas. En la clula eucariota para lograr extraer al material gentico (ADN) se hace necesario romper las diferentes membranas que lo protegen para lo cual se puede trabajar con soluciones hipotnicas de manera de provocar la lisis celular o bien utilizar mtodos que combinen sistemas mecnicos con fsico-qumicos tales como el mortereo, las soluciones salinas y la utilizacin de detergentes que actan rompiendo las uniones entre los lpidos y protenas. Finalmente hay que extraer las diferentes fracciones segn su solubilidad de manera de obtenerlo lo ms puro para aplicar sobre l las diferentes metodologas de estudio. En el ADN las uniones puente hidrgeno, que se establecen entre las bases de una cadena y la otra, ms las uniones fosfodiester del apilamiento de los nucletidos contribuyen a dar rigidez a la estructura de doble hlice. Por consiguiente en soluciones acuosas del estado nativo (doble hlice) dada la rigidez de la molcula son muy viscosas y se manifiestan filantes. Cuando se rompen los puentes hidrgeno, por altas temperaturas o lcalis fuertes (desnaturalizacin) las soluciones se tornan menos viscosas. Desde la Biologa Molecular se pueden enfocar una serie de estudios sobre la molcula del ADN tales como el conocimiento de toda o algunas secuencias, es decir la ubicacin de las bases nitrogenadas, o bien conocida una secuencia determinada proceder a su localizacin en representantes de la misma especie o de especies diferentes, mediante el uso de enzimas de restriccin o de sondas marcadas. Cualquiera de las formas de trabajo permite la determinacin de uno de los aspectos de la Biodiversidad (diversidad gentica)

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MATERIALES Y MTODOS Timo o hgado de ternera (aproximadamente 1 a 2 g) Solucin de SSC 1X (NaCl 0,15 M, Citrato de Sodio 0,015 M, pH 5,5) constituye un medio apropiado. (Buffer de extraccin) cido Etilendiaminotetraactico (EDTA) 0,5 M pH 8. Bloqueador de la actividad enzimtica por secuestro de cofactores (Ca+ + y Mg + +) SDS 20% en solucin alcohlica de 45 . Detergente que ayuda en la lisis de membranas y extraccin de lpidos contaminantes de la solucin. Cloruro de sodio (NaCl) 3M. Provee cargas positivas ala solucin para que interactan con las negativas del DNA Cloroformo- Alcohol isoamlico (24: 1, v/v) para lavar la solucin y purificar de lpidos contaminantes Etanol absoluto fro. Precipitante de la molcula y permite su localizacin para su posterior enrollamiento sobre varilla de vidrio. Mortero enfriado Tubos de centrfuga de 15 ml graduados y con tapa (Tubos Falcon) Erlenmeyers Vasos de precipitados Varillas de vidrio PROCEDIMIENTO Colocar en un mortero fro, en bao de hielo, aproximadamente 1 g. de timo o hgado de ternera. Las temperaturas bajas disminuyen la actividad enzimtica (Proteasas, nucleasas, y otras). Disgregar el material con bistur descartando el tejido graso. A continuacin trabajar firmemente con el pilote y agregarle, de a poco, 8 ml de SSC 1X y 0,8 ml. de EDTA 0,5 M. Una vez finalizado el mortereo, trasvasar el homogenato a tubos de centrfuga, verificando que los tubos se hallen equilibrados. Centrifugar, los tubos a 5000 r.p.m. durante 15 minutos. Descartar el sobrenadante que contiene el complejo RNA-protenas En el pellet se halla el complejo DNA-protenas, el cual ser disgregado con pipeta pasteur y se le agregar lentamente 6 ml. SSC 1X, 1,2 ml. EDTA, 1,6 ml. de SDS al 20 % y 1,6 ml. de NaCl 3 M y mezclar con cuidado y calentar en bao termostatizado a 60 C, durante 10 minutos. Este paso permite la disociacin de las protenas histnicas del DNA. Tomar 4 ml de la solucin anterior y colocarla en un tubo Falcon agregar 4 ml de una mezcla de Cloroformo- alcohol isoamlico (24/1 v/v), cerrar el tubo y agitar suavemente. Centrifugar a 5000 r.p.m. durante 15 minutos. Se forman dos fases nuevamente, una acuosa superior que contiene DNA, una inferior orgnica que contienen lpidos si los hubiese, mientras que la interfase contiene protenas desnaturalizadas. Repetir hasta que la interfase se observe limpia. (aproximadamente 2 o 3 veces). Ayudado por una pipeta Pasteur analice la consistencia y el aspecto de la fase acuosa Transferir 4 ml. de la fase acuosa a otro tubo limpio y agregar 0,5 ml. de NaCl 3 M y 10 ml de etanol absoluto fro por las paredes. Homogeneizar lentamente hasta que aparezca la turbidez tpica del DNA precipitado. Centrifugar a 5000 rpm durante 10 minutos y desechar el sobrenadante, y lavar con alcohol 70%, centrifugar nuevamente desechar el sobrenadante y evaporar los restos de alcohol , finalmente resuspender en agua bidestilada estril para permitir su hidratacin y ser utilizado para otros anlisis. NOTA: en una de las extracciones realizadas introducir una varilla de vidrio y proceder a enrollar el DNA. Analice el aspecto del elemento fijado en la varilla

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de vidrio. Escurrir el exceso de alcohol.

Preguntas
1- Cmo definira el DNA? Cunto se estima la distancia que ocupan 10 nucletidos? Cunto mide el ancho de la doble hlice? Estos valores son visualizados al microscopio ptico. Justifique su respuesta. 2- Cul es la funcin de usar los siguientes reactivos o elementos en la extraccin del DNA? NaCl 3M: Alcohol Absoluto: EDTA: Alcohol 70%: Hielo: SSC 1X: SDS: 3- Cmo Preparara una solucin 1 Molar de NaCl y una 2X de SSC? Indague o repase el significado de molaridad y X.

BIBLIOGRAFIA.

ALBERT, B y Otros. 1996. Biologa Molecular de La CLULA. Ed. Omega SAMBROOK, FRITSCH Y MANIATIS. 1998. Molecular Cloning. A laboratory manual. 2 Ed.. Clod Spring Harbor Laboratory Prees eds. AUSUBEL y otros. 1996. Currents Protocols in Molecular Biology. Harvard Medical School.1996. John Wiley & Sons, Inc.

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TRABAJO PRCTICO N 6 CUANTIFICACIN Y VISUALIZACIN DEL ADN MEDIANTE ELECTROFORESIS.

INTRODUCCIN. La cuantificacin del DNA, puede realizarse a travs de varias metodologas diferentes entre las que se pueden mencionar: Reaccin de Fuelgen: Para la cual se somete el material a hidrlisis cida en caliente, lo que produce un grupo aldehdo libre procedente de la desoxirribosa que reacciona con una sustancia bsica llamada reactivo de Schiff tiendo de color magenta al DNA. Se usa para teir cromosomas o usando un citofotmetro medir cantidad de DNA en ncleos interfsicos, se mide la cantidad de luz absorbida por los ncleos teidos con Fuelgen. Absorcin de luz ultravioleta: Utilizado para DNA aislado y purificado. Los anillos presentes en las bases nitrogenadas de los nucletidos absorben luz a una longitud de onda de 260 nm. Para medir la cantidad de luz absorbida se usan espectrofotmetros. Este mtodo sirve para estimar concentracin ya que la cantidad de luz absorbida es proporcional a la concentracin de DNA, se estima que una densidad ptica de 1 corresponde a 50 m/ml de DNA doble cadena. Tambin se usa para determinar pureza, realizando otra lectura a 280nm, si la relacin D.O. 260 nm/ D.O. 280 nm, oscila entre 1,8 y 2 se considerar un buen grado de pureza. Si la muestra est contaminada con fenoles o protenas la relacin disminuye. Si la relacin es muy baja pueden estimarse valores errados de concentracin. Autorradiografa: Se usa tritio que es un istopo radioactivo del hidrgeno (3H) que puede agregarse a diversos compuestos qumicos entre ellos a la Timidina o uridina. Se revela sobre placas radiogrficas. Electroforesis: Es un mtodo de laboratorio en el que se aplica una corriente elctrica controlada con la finalidad de separar biomolculas segn su tamao y carga elctrica a travs de una matriz gelatinosa soporte (gel). Cuando una mezcla de molculas ionizadas y con carga neta son colocadas en un campo elctrico, estas experimentan una fuerza de atraccin hacia el polo que posee carga opuesta. Las molculas cargadas positivamente se desplazaran hacia el ctodo (el polo negativo) y aquellas cargadas negativamente se desplazaran hacia el nodo (el polo positivo). Recordemos que los cidos nucleicos son macromolculas cargadas negativamente, debido a la presencia de grupos fosfato en su estructura. Son varios los factores que afectan a la tasa de migracin de las molculas: tamao de las molculas, concentracin de la matriz gelatinosa, conformacin de las molculas, voltaje aplicado y composicin del buffer de corrida. Existen distintos tipos de electroforesis de acuerdo a los objetivos experimentales (electroforesis en geles de poliacrilamida para pequeos DNA por debajo de 500pb o de Agarosa para molculas de mayor tamao., electroforesis en gradiente, en capilares, bidemensional etc. El DNA es incoloro y para poderlo visualizar debe colorearse con Bromuro de Etidio e iluminado en UV, radiactivos, colorantes fluorescentes como el Gel-Green o la tincin con plata. Electroforesis en geles de agarosa La agarosa es un polisacrido (originalmente obtenido de algas, como el agar19

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agar, pero de composicin homognea), cuyas disoluciones (tpicamente de 0.5 a 2 %) poseen la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 grados C y formar un gel, semislido al enfriarse. Este gel esta constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras polimricas embebida en gran cantidad de medio lquido, que retarda el paso de las molculas, se usa usualmente para separar molculas grandes de alrededor 20.000 nucletidos. La electroforesis en gel de agarosa es una tcnica habitual, que permite separar los fragmentos y localizarlos en funcin de su peso molecular por comparacin con la movilidad de unos estndares de tamao conocido, y si fuera preciso, recuperar fragmentos de inters para posteriores aplicaciones (amplificacin, clonacin, secuenciacin, transfeccin, etc.). DESARROLLO. I.- CUANTIFICACIN DEL ADN. Realizar diluciones del ADN extrado (1/10, 1/50 y 1/100) y cuantificar utilizando el espectrofotmetro. Analizar la pureza del material obtenido. II.- ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA. MATERIALES - Agarosa - Cuba de electroforesis horizontal. - Fuente de poder - Micropipetas y Tips PROCEDIMIENTO. 1) Preparacin de gel de agarosa. Pesar 1 gr de agarosa y se colocan en 100 ml de buffer TAE 1X. Fundir a bao Mara o en el microondas hasta que no queden fibras de agarosa y la solucin sea transparente. Agregarle 0,75 l del colorante GelGreen. Dejar enfriar hasta los 60 C aproximadamente y volcar en el soporte que ya tiene el peine colocado, cuidando de que no queden burbujas (las burbujas impiden el desplazamiento correcto del ADN a travs de la matriz). Dejar solidificar y quitar el peine con mucho cuidado. 2) Siembra de las muestras y corrida electrofortica. Preparacin de las muestras para la siembra: tomar 5-7 l de muestra y agregarle 0,5 l de buffer de siembra. El buffer de siembra sirve para asegurarse que la muestra caiga en el pocillo (le otorga mayor densidad) y como contiene un colorante que migra a velocidades predecibles, permite visualizar la corrida y calcular los tiempos de la misma de acuerdo al tamao de molcula que se desee ver. Colocar el gel en la cuba de electroforesis y cubrir toda la superficie del mismo con el buffer de corrida TAE 1X. Tomar las muestras preparadas y sembrar una en cada pocillo del gel. Una vez sembradas las muestras cerrar la tapa de la cuba y se enchufan los electrodos cuidando siempre de que coincidan los polos negativos y los - Muestras incgnita. - Colorante GelGreen - Buffer de Siembra.

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positivos. Se realizar la corrida durante 30 minutos a 70-80 Voltios. Finalizada la corrida, apagar la fuente de poder, quitar los cables y la tapa de la cmara de electroforesis y proceder a la tincin del gel. Preguntas 1- Cul es el significado de corrosivo? y Mutagnico? Identifica alguno de los reactivos o soluciones mencionadas en el TP como corrosivo o mutgeno. 2- Indague qu es y cmo funciona un espectrofotmetro? Qu longitudes de onda pertenecen a los espectros visibles y cules no? 3- Qu pasara si las lecturas de los tubos incgnitas dan por fuera de los valores de la curva patrn? Tiene alguna propuesta para esa situacin. 4- Qu medidas de bioseguridad estima sern aplicables en este trabajo prctico? Usted las cumple? BIBLIOGRAFIA.

ALBERT, B y Otros. 1996. Biologa Molecular de La CLULA. Ed. Omega SAMBROOK, FRITSCH Y MANIATIS. 1998. Molecular Cloning. A laboratory manual. 2 Ed.. Clod Spring Harbor Laboratory Prees eds. AUSUBEL y otros. 1996. Currents Protocols in Molecular Biology. Harvard Medical School.1996. John Wiley & Sons, Inc.

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TRABAJO PRCTICO N 8 DIVISIN CELULAR: MITOSIS

OBJETIVOS Conocer las modificaciones que se producen a nivel nuclear en la etapa de divisin celular. Reconocer e identificar las diferentes etapas de la divisin mittica. Estimar la duracin relativa de las diferentes etapas del ciclo celular a travs del clculo del ndice mittico y del ndice de fase. Adquirir destrezas en la realizacin de preparados temporarios y su interpretacin. INTRODUCCIN La divisin celular tiene lugar por Mitosis o por Meiosis. En el presente trabajo prctico se analizar la Mitosis, divisin por la cual se obtienen dos clulas hijas de igual caractersticas y constitucin que la clula que le dio origen. Comprende dos eventos uno involucra puramente al ncleo y se denomina CARIOCINESIS, es el mecanismo citolgico que asegura el reparto equitativo del material hereditario. El otro evento es citoplasmtico y se denomina CITOCINESIS, consiste en el reparto ms o menos equitativo de orgnulos y componentes citoplasmticos El principal objetivo, de este tipo de divisin, es provocar el crecimiento corporal del individuo por aumento en el nmero de clulas, as como reemplazar a las clulas que desaparecen por envejecimiento o muerte programada; tambin lo hacen durante situaciones patolgicas, como la reparacin de heridas. Este tipo de divisin ocurren en sitios bien definidos como los puntos de crecimiento de los vegetales, pices; y en las epfisis, parte terminal de los huesos largos o de otras zonas de amplia divisin en los animales (mdula). Tambin puede inducirse en un medio de cultivo. En los pices vegetales el tejido proliferativo se encuentra en equilibrio dinmico proliferativo, que es aquel que tiene el mismo nmero de clulas en proliferacin, esto es de las dos clulas producto de una divisin, una se vuelve a dividir y la otra se diferencia. Los meristemas de races de monocotiledneas, existe una hilera de clulas iniciales que constantemente se dividen, cumpliendo con el requisito equilibrio dinmico proliferativo. En estas condiciones se puede calcular la duracin total del ciclo de divisin y de cada una de las etapas; esto se realiza a travs del clculo del ndice Mittico, (porcentaje de clulas meristemticas en divisin, en un momento dado); e ndice de Fases porcentaje de clulas meristemticas en cada etapa de divisin. El valor absoluto en horas, se obtiene aplicando una regla de tres simple, conociendo la duracin total del ciclo 29,4 hs. en meristemas de Allium cepa (Liliceas). Para su estudio, y por sus eventos relevantes, a la mitosis se la divide en cinco etapas: PROFASE: La cromatina se condensa, se forma el uso mittico y desaparece el nucleolo. PROMETAFASE: Etapa de transicin, en la cual se desintegra la envoltura nuclear. METAFASE: Los cromosomas alcanzan el mximo de condensacin y se ubican en el plano ecuatorial

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ANAFASE: Se produce la separacin de las cromtidas hermanas, las cuales migran hacia polos opuestos. TELOFASE: Se caracteriza por la llegada de los cromosomas a los polos; y la reorganizacin de la envoltura nuclear, produciendo una clula con dos ncleos. Una vez reorganizado el material nuclear se procede a la separacin de los elementos citoplasmticos proceso denominado citocinesis. En los vegetales caracterizado por la formacin de una estructura particular llamada Fragmoplasto. MATERIALES. * Bulbos de cebolla (Allium cepa) * Portaobjetos y Cubreobjetos * Pinzas y agujas de diseccin, pincel * Bistur * Colorantes: Orcena actica, tiempo de coloracin de 8 a 10; o Fucsina bsica, dejando las raicillas sumergidas en el colorante una hora en oscuridad, o Giemsa con tiempo de coloracin de 8. * Papel absorbente. PROCEDIMIENTO. a) Tome un bulbo de cebolla, retire las raicillas secas y sumerja el tallo en un recipiente con agua, dejar de 2 a 3 das en lugar oscuro y a temperatura ambiente. b) Proceder a cosechar las raicillas que tengan un largo variable entre los 2 y 3 cm. de largo. c) Macerar las raicillas en Ac. Clorhdrico 1 N durante 3 a 5 minutos. Tiene por finalidad disolver las pectinas y favorecer la separacin entre las clulas. d) Lavar con agua durante 1 e) Colorear con el colorante elegido. f) Poner sobre un portaobjeto seleccionar el sector del pice, agregar una gota del colorante y proceder al aplastado o squash. g) Observar al microscopio, en principio a 100 aumentos totales para localizar la regin meristemtica y luego analizar con un aumento total de 450 veces. 1) Identifique y esquematice cada una de las diferentes etapas de la mitosis. 2) Calcule el ndice Mittico y el ndice de Fases. Para ello, cada grupo de trabajo deber muestrear un total de 50 clulas y sealar cuntas de ellas se encuentran en divisin y en que etapa y cuntas en interfase. Dichos datos se volcaran a una tabla comn, y con estos valores se calcularn los respectivos ndices. Preguntas: 1- Fundamente la eleccin del colorante para la tincin de las clulas meristemticas. 2- Qu es un meristema? Ubique dicho elemento en la estructura de una planta. 3- Cmo es el crecimiento en los animales y en los vegetales? Compare. 4- Recuerde la estructura que caracteriza a una clula animal y a una vegetal, analice las adaptaciones del proceso mittica a cada una de ellas. 5- Realice un cuadro comparativo entre el proceso que ha observado y la teora del proceso meitico. BIBLIOGRAFA. ALBERT, B Y OTROS. 1996. Biologa Molecular de La CLULA. Ed. Omega CURTIS, H Y BARNES, S. 2000. Biologa. Ed. Mdica Panamericana DE ROBERTIS, E Y OTROS. 1996. Biologa Celular y Molecular

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