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Avaliao de testes de ELISA para o diagnstico sorolgico de infeces pelos sorotipos 3, 5 e 7 de Actinobacillus pleuropneumoniae em sunos
[Evaluation of ELISAs for the diagnosis of Actinobacillus pleuropneumoniae infections serotypes 3, 5 and 7 in pigs]

H.G. Machado1, I.A. Piffer2,4*, A.L. Guidoni, C. Klein2, C. Gil-Turnes3,4

2

CEDISA, Concrdia, SC Centro Nacional de Pesquisa em Sunos e Aves Embrapa Caixa Postal 21 89700-000, Concrdia, SC, Brasil 3 Universidade Federal de Pelotas 4 Bolsista CNPq

Recebido para publicao em 11 de novembro de 1999. Recebido para publicao, aps modificaes, em 24 de janeiro de 2001. *Autor para correspondncia E-mail: itamar@cnpsa.embrapa.br

RESUMO Compararam-se dois antgenos no teste de ELISA para o diagnstico sorolgico dos sorotipos 3, 5 e 7 de A. pleuropneumoniae prevalentes no Brasil. Um compunha-se da fase aquosa da extrao fenlica de suspenso bacteriana (FAF) e o outro de lipopolissacardeos de cadeia longa (LPS-CL). Com esses antgenos foram padronizados ELISAs monovalente e polivalente para os sorotipos prevalentes no Brasil. Com os resultados dos testes de um conjunto de amostras de soro de sunos livres de infeco para A. pleuropneumoniae e um conjunto de amostras de soro obtidas de leites inoculados com os sorotipos citados e que apresentaram soroconverso, determinaram-se as equaes discriminantes para os conjuntos de soros e compararam-se os testes quanto distncia generalizada de Mahalanobis, ao coeficiente de determinao, ao teste F, ao coeficiente global, sensibilidade e especificidade. Na anlise desses parmetros observou-se que o antgeno FAF foi superior. Com o ELISA PFAF reaes positivas no esperadas foram observadas com animais inoculados com os sorotipos heterlogos 2 e 9, no observadas com o PLPS-CL. A sensibilidade dos testes polivalentes ficou entre 91,5 e 95,7% com especificidade similar, indicando que ambos os testes so adequados para triagem sorolgica uma vez que detectam os sorotipos 3, 4, 5, 6, 7 e 8. Palavras-chave: Suno, Actinobacillus pleuropneumoniae, pleuropneumonia, ELISA ABSTRACT This paper describes the use of two antigens in ELISAs for the diagnosis of A. pleuropneumoniae (serotypes 3, 5 and 7) infections in Brazil. One antigen comprised the aqueous fraction obtained by phenol extraction from bacterial cultures (FAF) and the other was composed of long lipopolysaccharide chains (LPS-CL). Mono and polyvalent ELISA systems were standardized with the prevalent serotypes. Discriminating equations were developed with the ELISAs results obtained with two sets of serum samples. One set of sera had been collected from piglets free from A. pleuropneumoniae infections (known negative sera) and the other set collected from inoculated piglets after seroconversion (known positive sera). The results were compared using the generalized distance of Mahalanobis, the coefficient of determination, the F test, the global coefficient, the sensitivity, and the specificity. The results obtained with the FAF antigen were superior regarding all the evaluated parameters. However, the FAF-ELISA

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resulted in unexpected positive reactions with serum samples collected from animals that had been inoculated with heterologous serotypes (2 and 9). The sensitivity and the specificity of both tests ranged from 91.5 to 95.7, indicating that these two antigens are appropriate for use in A. pleuropneumoniae screening tests, as they can detect serotypes 3, 4, 5, 6, 7 and 8. Keywords: Swine, Actinobacillus pleuropneumoniae, pleuropneumonia, ELISA INTRODUO A pleuropneumonia suna (PPS) causada pelo Actinobacillus pleuropneumoniae (App) uma doena infecto-contagiosa que afeta predominantemente sunos nas fases de crescimento-terminao e pode se apresentar sob as formas superaguda, aguda, sub-aguda e crnica (Nicolet, 1992). Essa doena caracteriza-se por uma pleurisia fibrinosa com leses pulmonares necrohemorrgicas e adeses pleurais fibrticas (Nicolet, 1992). O App pode ser discriminado em dois biovares: biovar 1, NAD dependente e biovar 2, NAD independente (Pohl et al., 1983). So reconhecidos 12 sorotipos de App, apresentando vrios graus de virulncia (Frey & Nicolet, 1990). A sorotipagem baseada em antgeno capsular. Porm, os sorotipos reconhecidos possuem composio liposacardica (LPS) diversa, com exceo dos sorotipos 1, 9 e 11, dos sorotipos 3, 6 e 8 e dos sorotipos 4 e 7 que apresentam eptopos comuns (Nakai et al.,1992). A PPS ocorre em todas as regies do planeta e sua importncia epidemiolgica se relaciona com a intensificao e industrializao da produo suna (Sebunya & Saunders, 1983). No Brasil, a PPS foi descrita pela primeira vez no Estado de Santa Catarina. Nesse primeiro surto, onde se isolou o sorotipo 5, a morbidade foi de 70% e a mortalidade entre 10 e 20% (Locatelli et al., 1981). Posteriormente, os estudos de sorotipagem das amostras isoladas de casos clnicos no Brasil identificaram os sorotipos 3, 5 e 7 como os prevalentes (Piffer et al., 1987; Piffer et al., 1997). Alm desses sorotipos foram isolados os sorotipos 1, 4, 9 e 12 (Saito et al.,1988; Kich, 1996). Animais que sobrevivem a uma infeco por App geralmente tornam-se doentes crnicos e portadores do agente (Fenwick & Henry, 1994). Na condio de infeco subclnica, sem a presena de sintomas ou leses, o diagnstico normalmente baseado na sorologia, embora o agente possa ser recuperado da cavidade nasal (Kume et al., 1984), das tonsilas e do tecido pulmonar necrtico encapsulado (Sidib et al., 1993). No diagnstico sorolgico da pleuropneumonia vrios testes tm sido utilizados, entre eles a aglutinao (Gunnarsson et al., 1977), a fixao de complemento (Gunnarsson, 1979b), o ELISA (Nicolet et al., 1981), a soroaglutinao com 2 mercaptoetanol (Mittal et al., 1984) e a inibio das citolisinas (Fenwick, 1992). Em uma comparao crtica entre os testes sorolgicos, o teste de ELISA e o de neutralizao das citolisinas foram os melhores, porm esse ltimo no foi eficiente para o sorotipo 7 (Fenwick, 1992). O ELISA considerado um teste rpido e sensvel, facilmente automatizvel, porm sua especificidade depende da qualidade do antgeno. Vrios tipos de antgenos podem ser usados no teste de ELISA, entre eles o extrato salino fervido e centrifugado, o lipopolissacardeo de cadeia longa (LPS-LC) e o polissacardeo capsular (Gottschalk et al.,1994a). Na utilizao desses antgenos o LPS-CL e os baseados em cpsula, tanto monovalente como polivalente, foram os melhores tanto no aspecto de sensibilidade como no de especificidade (Boss et al., 1990; Boss et al., 1992; Bunka et al.,1992; Gottschalk et al., 1992; Gottschalk et al.,1994a; Gottschalk et al.,1994b; Gottschalk et al.,1997). Quando se constri um teste ELISA tenta-se obter um antgeno o mais sensvel e especfico possvel. Porm, um antgeno muito purificado pode inviabilizar o teste pelos custos, sem necessariamente garantir que ele ter sensibilidade ou especificidade superior. Gunnarsson (1979a), utilizando a fase aquosa de uma nica extrao fenlica de uma suspenso bacteriana, conseguiu antgenos sorotipo especficos no teste de imunodifuso, e essa preparao antignica com os sorotipos de 1 a 5 foi a que apresentou maior

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especificidade no teste de fixao do complemento (Gunnarsson, 1979b). Por esse motivo, este trabalho teve por objetivo comparar essa preparao antignica com a descrita por Radacovicci et al. (1994), composta por lipopolissacardeos de cadeia longa (LPS-CL), visando um teste de ELISA barato, mas que apresentasse sensibilidade e especificidade adequadas para detectar infeces pelos sorotipos prevalentes de App nos rebanhos brasileiros. MATERIAL E MTODOS Foram testadas duas preparaes antignicas, uma composta de polissacardeo capsular, lipopolissacardeo, protenas e possivelmente outros componentes antignicos, obtidas da fase aquosa da extrao fenlica (FAF) como descrito por Gunnarsson (1979a) e outra, composta por lipopolissacardeos de cadeia longa (LPS-CL), como descrito por Radacovicci et al. (1994). Com cada uma dessas preparaes antignicas foram otimizados ELISAs monovalentes para os sorotipos 3, 5 e 7, conforme preconizado por Jacobson & Downing (1991). ELISAs polivalentes foram obtidos da mistura, em propores timas, dos antgenos FAF (PFAF) e LPS-CL (PLPS-CL) dos sorotipos 3, 5 e 7, como foi descrito por Boss et al. (1992), Bunka et al. (1992), Fenwick (1992) e Gottschalk et al. (1992). Para padronizar esses ELISAs foram utilizados: a) 130 soros oriundos de um rebanho SPF estabelecido por histerectomia e livres de infeco por A. pleuropneumoniae; b) soros de animais SPF inoculados com A. suis e Haemophillus parasuis, outros com Mycoplasma hyopneumoniae ou M. flocullare e alguns vacinados contra a rinite atrfica; c) soros de campo com teste de fixao do complemento positivo para A. pleuropneumoniae e soros de sunos SPF inoculados com todos os sorotipos de A. pleuropneumoniae. Estes soros fazem parte da soroteca do CNPSA. Alm desses, foram inoculados leites com os sorotipos 3, 5 e 7 e Actinobacillus suis (Tab. 1), acompanhados com coleta semanal at a 15a semana aps a inoculaos, quando foram necropsiados. As inoculaes, necropsias e exames morfopatolgicos e sorolgicos foram conduzidos de acordo com o protocolo descrito por Piffer & Mores (1995). Tabela 1. Origem dos microorganismos utilizados na inoculao de leites para avaliao de testes de ELISA
Bactria Amostra Referncia A. pleuropneumoniae sorotipo 3 1421 Dr. R. Ross* sorotipo 5 K17 ATCC 33377 sorotipo 7 WF83 SCI-A Dr. R. Petersen** A. suis 110UK Dr. D. Barcellos*** * Iowa State University, USA. **Intervet, Denmark. ***Instituto de Pesquisas Veterinrias Desidrio Finamor, Brasil

Para a primeira otimizao dos testes de ELISAs foram escolhidos trs soros considerados positivos (positivo fraco, moderado e forte) pelo teste de fixao do complemento para cada um dos sorotipos (3, 5 e 7) de App, e um soro SPF (controle negativo). Com esses soros-controle, trs diluies de antgeno FAF e quatro diluies de conjugado, todos em duplicatas, procedeu-se padronizao multifatorial dos testes de uma s vez, como preconizado por Jacobson & Downing (1991). Aps a padronizao inicial de todos os reagentes do teste, submeteram-se todos os soros selecionados, no mesmo instante, ao teste de ELISA. Com os resultados, foram selecionados os soros para a composio dos soros-controle como se segue: como controle negativo (CO) foi misturada uma frao de cada soro que apresentou densidade ptica (DO) menor que a mdia da populao negativa (Mn) at um valor igual Mn acrescida de trs desviospadro dos negativos (DPn); como controle positivo foram considerados todos soros oriundos de animais inoculados que apresentaram densidade ptica superior Mn acrescida de 3 DPn. Desse conjunto de soros positivos, determinaram-se a mdia da populao positiva (Mp) e o desvio-padro (DPp) das leituras para cada sorotipo em estudo. Eles foram discriminados em trs categorias: fracamente positivo (soros com leitura maiores que a Mn + 3 DPn e menores que a Mp -0,5 DPp) (C1), moderadamente

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positivo (maior que a Mp - 0,5 DPp e menor que a Mp + 0,5 DPp) (C2) e fortemente positivos (igual ou maior que a Mp + 0,5 DPp) (C3). As amostras de soro de cada categoria positiva (C1,C2 C3) foram misturadas entre si, em propores iguais, para constiturem os controles positivos do teste de ELISA. Com os controles assim estabelecidos foi feita uma padronizao multifatorial e definitiva dos reagentes. Para eliminar o efeito do dia do teste foi estabelecida uma curva padro para cada teste de ELISA. Os valores dessa curva foram obtidos com as mdias dos soros-controle (C0, C1, C2 e C3 ) obtidos em 15 testes realizados em dias distintos, em trs rplicas cada. Esses valores foram avaliados pelo programa KELA (Jacobson & Downing, 1991). A cada teste, os resultados eram automaticamente ajustados por meio da curva padro por anlise de regresso linear, que considera os valores mdios da densidade ptica de trs rplicas de cada soro testado e seus respectivos controles (valores observados de Y), para um soro referncia correspondente a cada controle (valores esperados de X). Aps esse ajuste, os soros eram classificados como positivos quando sua DO ajustada (mdia corrigida) era superior mdia dos controles negativos acrescidos de quatro desvios-padro. Caso contrrio, eram considerados negativos. Os resultados obtidos com essa classificao das populaes negativa e positiva foram submetidos anlise discriminante de Anderson (1958). Nessa nova reclassificao, os soros foram considerados positivos quando a probabilidade de pertencer populao positiva era superior a 50%. Alm disso, todos os testes de ELISA desenvolvidos foram testados com soros de animais sabidamente positivos para a maioria dos sorotipos de Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophillus parasuis, Actinobacillus suis, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma flocculare e de animais vacinados contra Bordetella bronchiseptica e Pasteurella multocida, para determinar a especificidade O teste de ELISA propriamente dito foi realizado em microplacas de poliestireno (Limbro/Titertek, ICN com 96 orifcios. A intensidade de colorao ou densidade ptica foi medida diretamente em cada poo da microplaca com espectrofotmetro (Titertek Multiskan) e os dados processados pelo programa KELA (Kinetics Enzyme-Linked Assays) (Jacobson & Downing, 1991). As microplacas foram sensibilizadas com antgeno diludo em 0,02 M de tampo fosfato (PBS) pH 7,4, acrescido de 0,03M de NaCl, no volume de 100l em cada poo, incubadas por aproximadamente 18h em cmara mida a 4C estocadas a 70C.
Biomedicals Inc, Ohio, EUA)

No momento do teste, as placas eram descongeladas e lavadas trs vezes em 0,05 M de PBS pH 7,4 contendo 0,05% de Tween-20 (PBS/Tween-20). A seguir adicionavam-se, em trs rplicas, 100l dos soros em teste e soros-padro, diludos a 1:50 em PBS / Tween-20 com 1% de soro albumina bovina (BSA). As placas eram incubadas a 37C por 30 minutos. Aps esse tempo, eram lavadas e, em cada poo, eram colocados 100l de conjugado anti-IgG de suno diludo em PBS/Tween 20 com 1% BSA. Procedia-se incubao e lavagem como indicado anteriormente e adicionavam-se 100l de uma soluo a 1mM do revelador ABTS [2,2-azino-bis (3 ethylbenzthazoline-6 sulfonic acid)] (Sigma, EUA), acrescido de 4mM de H2O2 em tampo fosfato com 0,05M de citrato (pH 4,0). A reao enzimtica ocorria durante 30 minutos temperatura ambiente e ao findar esse tempo, adicionavam-se 50l de uma soluo a 0,5M de cido ctrico para interromper a reao. A seguir as placas eram agitadas para homogeneizar a colorao, realizando-se a leitura. Com os resultados da anlise discriminante, os testes de ELISA foram comparados quanto distncia de Mahalanobis entre as populaes positiva e negativa (D2), quanto variabilidade total existente entre os grupos das populaes positiva e negativa, quanto ao percentual que a funo discriminante classificou corretamente (coeficiente de determinao), quanto ao nvel de significncia de cada teste (teste F) e quanto ao coeficiente global do teste de concordncia (CG) entre o status dos animais e a reclassificao realizada pela funo discriminante. Alm disso, realizou-se uma anlise de concordncia entre o status dos animais (positivos ou negativos) e os dados da funo discriminante, quando ento determinaram-se a sensibilidade e a especificidade dos testes. Os passos da anlise estatstica pertencem ao procedimento DISCRIM do SAS (1985). O status de animal positivo foi definido como aquele em que o animal teve contato com o agente, por meio de inoculaes experimentais e/ou contato com animais inoculados, e apresentou soroconverso definida como densidade ptica igual ou superior mdia das leituras dos soros obtidos de leites originados de rebanho SPF estabelecido por histerectomia e livre de infeco por

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Actinobacillus pleuropneumonae (status de animal negativo), acrescido de quatro desvios-padro da mdia. RESULTADOS E DISCUSSO A dinmica do aparecimento de anticorpos nos leites infectados experimentalmente com os diferentes sorotipos de App foi similar entre todos os grupos de leites independentemente do tipo de antgeno (FAF ou LPS-CL) e do teste (monovalente ou polivalente). Para exemplificar, nas Fig. de 1 a 4 so apresentados os resultados com os animais inoculados com o sorotipo 5. Observa-se que os ttulos permaneceram positivos at o momento da necropsia, 15 semanas aps a exposio ao agente, sugerindo que os testes constituem-se em excelentes ferramentas tanto para o diagnstico quanto para a determinao de perfis sorolgicos. Os ttulos de anticorpos com os antgenos polivalentes foram menores do que os observados com os antgenos monovalentes. Explica-se essa diferena pela forma como os ELISAs polivalentes foram montados, ou seja, pela mistura dos antgenos monovalentes padronizados que competiam pelo mesmo nmero de pontos de ligao existentes nos poos das microplacas.

Limite superior Mdia Limite inferior Controles

1,5

DO 1

0,5

0 0 1 2 3 4 5 6 7

semanas

10

11

12

13

14

14

15

Figura 1. Ttulo de anticorpos detectados pelo teste de ELISA com antgeno LPS-CL de App sorotipo 5 dos leites agredidos com o sorotipo 5 de App.
2

Limite superior Mdia Limite inferior Controles

1,5

D O1

0,5

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 semanas 9 10 11 12 13 14 15

Figura 2. Ttulo de anticorpos detectados pelo teste de ELISA com antgenos FAF de App sorotipo 5 dos leites agredidos com o sorotipo 5 de App.

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0,7

Limite superior Mdia Limite inferior

0,6

Controles

0,5

0,4 DO 0,3

0,2

0,1

0 0 1 2 3 4 5 6 7 s e m a n8 s a 9 10 11 12 13 14 15

Figura 3. Ttulo de anticorpos detectados pelo teste de ELISA com antgeno PLPS-CL de App sorotipos 3, 5 e 7 dos leites agredidos com o sorotipo 5 de App.

0,7

Limite superior Mdia Limite inferior Controles

0,6

0,5

0,4 DO 0,3

0,2

0,1

0 0 1 2 3 4 5 6

semanas

10

11

12

13

14

15

Figura 4. Ttulo de anticorpos detectados pelo teste de ELISA com antgenos PFAF de App sorotipos 3, 5 e 7 dos leites agredidos com o sorotipo 5 de App.

Com os sorotipos 5 (Fig. 1-4) e 7 (dados no demonstrados) foi observada soroconverso em todos os animais experimentais, com ambos os antgenos e testes entre a primeira e a segunda semana aps a exposio ao respectivo sorotipo. Com o sorotipo 3 isso ocorreu entre a segunda e a quarta semana (dados no demonstrados). Isto parece estar associado diferena de virulncia dos sorotipos de App (Nicolet, 1992).

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Na Tab.2 so mostrados os resultados dos testes de ELISA com antgenos polivalentes de leites inoculados com diferentes sorotipos de App. No ELISA com antgeno polivalente dos sorotipos 3, 5 e 7 (PFAF) foi observada sorologia positiva nos leites inoculados com os sorotipos 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8 e com um de cinco soros do sorotipo 9. No ELISA com antgeno polivalente (PLPS-CL), resultados positivos foram observados com os leites inoculados com os sorotipos 3, 4, 5, 6, 7 e em dois dos trs leites inoculados com o sorotipo 8. Essas reaes com soros positivos para os sorotipos 4, 6 e 8 ocorreram devido presena de antgenos somticos comuns entre os sorotipos 3, 6 e 8 e entre os sorotipos 4 e 7 (Nakai et al., 1992).

Tabela 2. Ocorrncia de soros de sunos positivos aos ELISAs polivalentes (sorotipos 3, 5 e 7) em sunos inoculados com diferentes sorotipos de Actinobacillus pleuropneumoniae (App).
Leites inoculados com o sorotipos de App App1 App2 App3 App4 App5 App6 App7 App8 App9 App11 App12 PFAF 0/5a 5/5 5/5 6/6 5/5 2/2 5/5 4/4 1/5 0/6 0/6 PLPS-CLc 0/5 0/5 5/5 4/4 5/5 2/2 5/5 2/3 0/5 0/6 0/6 PFAF: antgeno polivalente obtido da fase aquosa da extrao fenlica; PLPS-CL: antgeno polivalente constitudo de lipopolissacardeo de cadeia longa a Positivos/soros examinados. Antgeno

Reaes cruzadas no esperadas com os sorotipos 2 e 9 ocorreram com o antgeno PFAF. Esse antgeno constitudo de polissacardeo capsular, lipopolissacardeos, protenas e outros componentes antignicos (Gunnarson, 1979a). A nica extrao fenlica parece no reduzir de forma significativa o contedo de protenas da fase aquosa, fazendo supor que a presena de tais protenas seja a causa das reaes cruzadas observadas. A ocorrncia de eptopos comuns na cpsula dos sorotipos 5 e 2, j registrada por Boss et al. (1990), pode ser uma explicao para as reaes positivas observadas com o sorotipo 2, uma vez que na preparao do antgeno FAF certamente existe antgeno capsular para o sorotipo 5 (Gunnarson, 1979a). Com o antgeno LPS-CL para os sorotipos 3, 5 e 7 no existem registros de reaes cruzadas com o sorotipo 9, fato tambm no observado com os soros de animais positivos para esse sorotipo neste experimento. Entre os animais inoculados com os principais microorganismos que afetam o sistema respiratrio dos sunos ou vacinados contra Bordetella bronchiseptica e Pasteurella multocida, no se observou resposta positiva para os ELISAs utilizados, indicando boa especificidade dos testes em relao a essas infeces comuns nos rebanhos sunos. Alguns autores tm registrado reaes cruzadas entre alguns sorotipos do App (1, 2, 3 e 5) e alguns do Actinobacillus suis ao utilizarem antgeno polissacardeo capsular ou outros testes sorolgicos (Boss et al., 1990; Gottschalk et al., 1994b). Neste experimento no ocorreram reaes cruzadas entre os sorotipos 3, 5 e 7 de App e os soros positivos contra a amostra de Actinobacillus suis utilizada na infeco experimental. Talvez essas reaes dependam do sorotipo de A. suis envolvido. A Tab.3 fornece a distncia generalizada de Mahalanobis (D2) entre populaes positiva e negativa, o teste F para verificar o grau de diferena entre os testes, o coeficiente de determinao (R2) e o coeficiente global (CG) e as caractersticas de sensibilidade dos testes. Observa-se D2 igual a 24,88 e 9,31, respectivamente, para os antgenos PFAF e PLPS-CL, indicando que o antgeno PFAF mais eficiente que o PLPS-CL. Como conseqncia observaram-se valores maiores para o R2, para o teste F e para o CG.

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Tabela 3. Estimativa da distncia generalizada de Mahalanobis (D2), coeficiente de determinao (R2), teste F e coeficiente global do teste de concordncia entre o status dos animais e a reclassificao feita pela funo discriminante (CG) e sensibilidade (S).
ELISA PFAF PLPS-CL FAF3 LPS-CL3 FAF5 LPS-CL5 FAF7 LPS-CL7 D2 24,88 9,31 45,00 20,90 31,78 36,78 76,67 34,58 R2(%) 86,10 69,84 90,86 83,22 84,72 84,83 94,64 88,36 Teste F 1784,36 685,50 1821,00 783,82 743,10 900,43 3427,81 1646,94 CG (%) 98,62 95,30 99,45 95,62 98,52 99,38 99,48 98,63 S (%) 97,5 91,5 98,3 88,3 93,3 96,6 98,5 95,7

PFAF: Antgeno polivalente obtido da fase aquosa da extrao fenlica; PLPS-CL: Antgeno polivalente constitudo de lipopolissacardeo de cadeia longa; FAF: Antgeno monovalente obtido da fase aquosa da extrao fenlica para o sorotipo n; LPS-CL: Antgeno monovalente constitudo de lipopolissacardeo de cadeia longa para sorotipo n.

De forma semelhante, as estatsticas D2, R2, teste F e CG permitem comparar os antgenos FAF3 com LPS-CL3, FAF5 com LPS-CL5 e FAF7 com LPS-CL7, indicando a superioridade do FAF3 e do FAF7 em relao ao LPS-CL3 e ao LPS-CL7, respectivamente. O mesmo no se observou entre FAF5 e LPSCL5, quando ocorreu ligeira superioridade do LPS-CL5. A sensibilidade e a especificidade dos testes de ELISA mono e polivalentes foram comparadas levando-se em conta a anlise de concordncia entre o status dos animais e a funo discriminante de Anderson. Todos os testes apresentaram especificidade de 100% em relao populao definida como negativa. Quanto sensibilidade, com exceo do sorotipo 5, os ELISAs que utilizaram o antgeno FAF apresentaram sensibilidade superior ao antgeno LPS-CL. Em todos os ELISAs a sensibilidade foi alta, variando de 88,3 a 96,6 % para o antgeno LPS-CL e de 93,3 a 98,5 % para o antgeno FAF. Muitos autores tm avaliado a sensibilidade e a especificidade de testes de ELISA tanto mono como polivalentes. Willson et al. (1988) avaliaram um ELISA monovalente com antgeno similar ao FAF utilizado neste trabalho, tanto sob o ponto de vista individual como de rebanho. A sensibilidade e a especificidade determinadas nos testes de rebanho foi de 89% para as duas caractersticas. Individualmente a sensibilidade foi de 97% e a especificidade de 96%. Gottschalk et al. (1994a), utilizando animais experimental e naturalmente infectados em ELISA indireto, com valores limites do ponto-de-corte calculados de forma similar aos deste trabalho, obtiveram com o antgeno FAF sensibilidade de 81% e especificidade de 88%, e com o antgeno LPS-CL, sensibilidade de 81% e especificidade de 98%. Neste experimento, a maior sensibilidade dos ELISAs que utilizaram antgeno FAF poderia ser devida ao fato de esse antgeno apresentar maior variedade de determinantes antignicos, j que composto de polissacardeo capsular, lipopolissacardeos e outros componentes antignicos (Gunnarsson, 1979b). Na preparao do antgeno LPS-CL a fervura deve ter degradado o antgeno capsular (Radacovici et al., 1994), e pelas repetidas extraes fenlicas adotadas, at no haver nenhuma precipitao na interface entre a frao aquosa e fenlica, deve ter havido reduo de forma significativa da contaminao protica, o que reduziu a sensibilidade e melhorou a especificidade do teste. Quanto pequena superioridade na sensibilidade do antgeno LPS-CL5 em relao ao FAF5, poderia estar relacionada com caractersticas peculiares dos determinantes antignicos do LPS-CL desse sorotipo. A alta sensibilidade observada com ambos os ELISAs polivalentes sugere que os testes so adequados para o diagnstico sorolgico da pleuropneumonia suna. Em rebanhos com infeces crnicas, a prevalncia de matrizes soropositivas variou de 56,1% a 99,0%, mdia de 90,7%, ao se utilizar o teste de ELISA com antgeno PLPS-CL (Kich, 1996). Na mais baixa prevalncia observada, o valor preditivo positivo foi de 93,0%.

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Avaliao de testes de ELISA para o diagnstico sorolgico de infeces...

Deve se chamar ateno para a necessidade de validar esses testes em campo, pois animais no experimentais so expostos a uma gama maior de antgenos provenientes de vrios microorganismos que podem afetar a especificidade dos testes, principalmente para o antgeno FAF. A vantagem dos testes polivalentes reside na capacidade de detectar vrios sorotipos prevalentes em uma determinada regio para posterior anlise com testes sorolgicos especficos para cada sorotipo (Boss et al., 1992; Bunka et al., 1992; Gottschalk et al., 1992). ELISAs baseados em PLPS-CL foram mais especficos do que os baseados em PFAF, embora estes ltimos tenham sido mais sensveis. Concluiu-se que os testes polivalentes contra os sorotipos 3, 5 e 7 de App, em virtude de suas sensibilidades, tm caractersticas para triagem, uma vez que detectam tanto a infeco dos sorotipos prevalentes no Brasil como aqueles que possuem LPS-CL homlogos, reduzindo a necessidade de se utilizar um teste sorolgico para cada sorotipo. Soros positivos nesses testes poderiam ser submetidos a um ELISA baseado em cpsula purificada para aumentar a especificidade, diminuindo os custos no diagnstico. Nos animais soropositivos poderia ainda ser feita pesquisa do agente nas amgdalas pelo isolamento ou pelo PCR especfico. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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