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ISSN 0101-2061

Cincia e Tecnologia de Alimentos

Avaliao da produo de cido ltico por Leuconostoc mesenteroides B512F em xarope de caju
Avaliao da produo de cido ltico por Leuconostoc mesenteroides B512F em xarope de caju
Alexandre de Araujo GUILHERME1, Gustavo Adolfo Saavedra PINTO2, Sueli RODRIGUES3*
Resumo
O cido ltico um produto de grande importncia industrial. Sua obteno por fermentao representa mais de 50% da produo mundial. Para comportar a demanda, esforos para se baixar os custos tm sido alvo de vrios estudos. Este trabalho teve como objetivo avaliar a produo de cido ltico utilizando o xarope do pednculo do caju (Anacardium orcidentale). O microrganismo escolhido foi o Leuconostoc mesenteroides B512F. Foi realizado um planejamento experimental para se determinar a faixa de extrato de levedura e acares redutores totais iniciais adequados ao meio de cultura. Um segundo planejamento foi realizado com a adio de extrato de levedura, fosfato e a diluio xarope em relao aos acares iniciais de acordo com o planejamento para se otimizar o meio de cultura baseado no xarope de caju. Uma cintica foi realizada com o substrato otimizado de acordo com o planejamento. Portanto, conclui-se que a linhagem produz o cido ltico em concentrao satisfatria em se tratando de um substrato natural acrescido apenas de fontes de nitrognio e fosfato. Palavras-chave: bioprocessos; otimizao de meio de cultura; fermentao submersa.

Abstract
The production of lactic acid by fermentation accounts for more than 50% of the world production. To meet the demand, efforts to lower the costs have been the objective of several studies. This work aimed to study the lactic acid production in cashew apple (Anacardium orcidentale) syrup. The microorganism used was the Leuconostoc mesenteroides B512F. In the experimental investigation, the ideal concentrations of yeast extract and initial sugar were determined. A second experimental investigation was carried out with cashew apple syrup by adding yeast extract and phosphate and by diluting the syrup according to the initial sugar concentrations to optimize the medium culture. A kinetic study was carried out with the optimized substrate obtained. The results showed that the studied strains can produce lactic acid in satisfactory concentrations provided the natural syrup substrate contains only yeast extract and phosphate. Keywords: bioprocess; culture medium optimization; submerge fermentation.

1 Introduo
O cido ltico tem sido extensivamente utilizado em diversas aplicaes industriais, incluindo as indstrias qumica, farmacutica e de alimentos. Atualmente o cido ltico se tornou um insumo industrial de larga produo, sendo a produo anual estimada em 100 mil toneladas. O cido ltico um produto qumico industrial valioso e tem sido utilizado como acidulante, conservante de bebidas e alimentos. Tambm empregado em curtumes, na indstria txtil e de lavanderia. O lactato de clcio utilizado na indstria de panificao, como suplementao em rao animal e em preparaes farmacuticas (KISHOR; TRIVEDI; PATEL, 2007). O produto ainda empregado para produo de plsticos biodegradveis, produtos qumicos oxigenados, reguladores do crescimento de plantas, solventes no poluentes e intermedirios para sntese qumica, alm dos usos j citados na indstria de alimentos. Dessa forma, o cido ltico tem se tornado um importante monmero na indstria de plsticos, sendo facilmente polimerizado em plstico biodegradvel utilizado para confeco de embalagens, incluindo embalagens para alimentos (GAO et al., 2004, 2005, 2006; HIRATA et al., 2005). Polmeros base de cido ltico so tambm aplicados na produo de rgos artificiais biocompatveis, estruturas autodissolveis e carreadores de drogas com liberao controlada (KISHOR; TRIVEDI; PATEL, 2007). A taxa de consumo de cido ltico tem crescido em mdia 15% ao ano e um mercado de aproximadamente 390 mil tonelas/ano projetado para 2008 (TONG et al., 2004). O cido ltico pode ser obtido industrialmente atravs de sntese qumica ou processo fermentativo com bactrias lticas (KISHOR; TRIVEDI; PATEL, 2007), sendo este cido um produto metablico destes microrganismos. A produo de cido ltico a partir da fermentao microbiana representa mais de 50% da produo mundial. Devido crescente demanda, esforos para a diminuio do custo do processo produtivo tm sido alvo recente de estudos. A utilizao de substratos de origem agropecuria tais

Recebido para publicao em 28/11/2007 Aceito para publicao em 20/3/2008 (003048) 1 Departamento de Engenharia Qumica, Universidade Federal do Cear UFC 2 Embrapa Agroindstria Tropical, Rua Dra. Sara Mesquita 2270, Pici, CEP 60511-110, Fortaleza CE, Brasil 3 Departamento de Tecnologia de Alimentos, Laboratrio de Biotecnologia, Universidade Federal do Cear, Av Mister Hull, 2977, Bloco 858, Campus do Pici, CEP 60356-000, Fortaleza CE, Brasil, E-mail: sueli@ufc.br *A quem a correspondncia deve ser enviada

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como: amido, melao de cana, xarope de abacaxi e suco uva tem sido estudada como uma forma de reduo de custos e, portanto, aumento da competitividade no mercado mundial. O cido ltico produzido por bactrias lticas que necessitam de minerais especficos, vitaminas do complexo B e diversos aminocidos para garantir seu crescimento. O extrato de levedura uma fonte de nutriente comumente utilizado em laboratrio para o cultivo de microrganismos. Trata-se de uma fonte muito rica de nutrientes e, segundo diversos autores, a melhor para o cultivo de bactrias lticas (ARASARATNAM; SENTHURAN; BALASUBRAMANIAN, 1996; GKSUNGUR; GVENC, 1997; NANCIB et al., 2005). Neste contexto, o uso de excedentes agrcolas regionais como substrato de baixo custo para o desenvolvimento de processos fermentativos uma alternativa interessante. O caju possui pednculo que desperdiado, pois o maior valor dessa cultura est associado amndoa da castanha. O produto de maior expresso econmica a amndoa, sendo tipicamente um produto de exportao, enquanto os produtos obtidos a partir do processamento do pednculo destinam-se basicamente ao mercado interno (LEITE, 1994). Considerando-se que o pseudofruto corresponde a 90% do peso do caju, calcula-se que o Pas produza cerca de dois milhes de toneladas desse produto. No entanto, menos de 10% desse total aproveitado industrialmente ou para consumo in natura, sendo grande parte perdida no campo, no momento do descastanhamento feito para a indstria de beneficiamento de castanha. O produto industrial mais significativo do pednculo o suco de caju (PAIVA; GARRUTI; SILVA NETOM, 2000; SANCHO, 2006). O suco de caju rico em nutrientes e sais minerais. Seus acares majoritrios so glicose e frutose e, portanto, o produto no requer nenhum tratamento prvio como hidrlise ou tratamento enzimtico para a fermentao ltica. Sendo assim, o xarope de caju uma matria-prima de baixo custo para a produo do cido ltico (CHAGAS et al., 2007; HONORATO et al., 2007). Este trabalho teve como objetivo a otimizao de um meio de cultura e a avaliao da produo de cido ltico utilizando xarope de caju como substrato. O microrganismo escolhido para este trabalho foi o L. mesenteroides B512F, uma bactria ltica que tem sido estudada no Laboratrio de Biotecnologia da Universidade Federal do Cear e que apresentou bom crescimento no xarope de caju. Com isso pretende-se reduzir o custo do meio de cultura a partir do aproveitamento de excedentes da agroindstria tropical local pelo desenvolvimento de tecnologia, processos e conhecimentos que viabilizem o uso eficiente de recursos e que permitam a reduo de perdas e aumento de viabilidade econmica.

sinttico contendo sacarose como fonte de carbono segundo procedimento padro otimizado (GUIMARES et al., 1999). O pH do meio de cultura foi ajustado para 6,5, pH timo de crescimento do L. mesenteroides B542F, e o meio, esterilizado em autoclave a 121 oC por 15 minutos. O microrganismo foi ativado temperatura de 30 C em shaker rotatrio (150 rpm) em 100 mL de meio dispostos em Erlenmyer de 250 mL. O meio padro de ativao constitudo de sacarose (50 g.L1); extrato de levedura (20 g.L1); K2HPO4 (20 g.L1), MgSO4 (0,20 g.L1); MnSO4 (0,01 g.L1); FeSO4 (0,01 g.L1), CaCl2 (0,02 g.L1) e NaCl (0,01 g.L1). Aps 8 horas de cultura, foi realizado um repique e a fermentao foi conduzida por mais 15 horas, sendo esta ltima cultura utilizada como inculo para os ensaios fermentativos. 2.2 Obteno do xarope de caju O xarope de caju utilizado neste trabalho foi obtido junto Embrapa Agroindstria Tropical, que o produz a partir da concentrao do suco clarificado por evaporao a vcuo. O suco obtido a partir do pednculo (pseudofruto) do cajueiro por prensagem mecnica (ABREU, 2006). Uma caracterizao fsico-qumica do xarope foi realizada, sendo avaliados os teores de acares redutores totais (glicose e frutose) pelo mtodo de DNS (MILLER, 1959); o nitrognio proteico determinado segundo o mtodo KJELDAHL (AOAC,1990) e a composio mineral determinada por absoro atmica. A composio mineral foi realizada de acordo com a metodologia segundo Silva (1999). Todas as vidrarias usadas para o preparo das amostras foram lavadas com detergente neutro e enxaguadas cinco vezes com gua deionizada. Em seguida, as vidrarias foram deixadas por 24 horas em uma soluo de HCl 10% (preparada com gua deionizada) e depois enxaguadas cinco vezes com gua deionizada. Os xaropes foram diludos na proporo de (1:4) com gua deionizada, sendo usados 5 mL destas solues para a mineralizao das amostras. A mineralizao foi realizada utilizando-se uma soluo de cidos HNO3: HClO4 (3:1 v/v) no bloco digestor (Tecnal model TE007D, So Paulo, Brasil) a 200 C at o volume de 1,5 mL em 3 a 4 horas. Este volume foi aferido para 50 mL com gua deionizada em balo volumtrico. Um branco foi realizado com gua deionizada em lugar das amostras. Padres da Carlo Erba (Carlo Erba Reagent, Limito, Italy) foram utilizados para quantificar os minerais. Os minerais ferro, clcio, mangans, magnsio, zinco e cobre foram quantificados por espectrofotmetro de absoro atmica (Perkin-Elmer, model A-Analyst 300, USA) usando chama de acetileno (Single Slot Burner Heads for Perkin-Elmer Analyst series Spectrometers, Slot length: 10 cm). Ferro, cobre e zinco foram diretamente determinados a partir das diluies descritas acima. Clcio e magnsio foram diludos previamente em gua deionizada e com soluo de lantnio em uma segunda diluio. Potssio e sdio foram determinados por fotometria de chama em um equipamento DIGIMED modelo DM-61 (So Paulo, Brasil).
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2 Material e mtodos
2.1 Ativao do Leuconostoc mesenteroides B512F A bactria L. mesenteroides NRRL B512F foi obtida junto ao banco de microrganismos ARS Culture Collection (Agricultural Reserch Service Culture Collection, Peoria, Illinois USA) na forma liofilizada e foi ativada a partir de meio
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Produo de cido ltico

2.3 Planejamento experimental para otimizao do meio de cultura base de xarope de caju para produo de cido ltico As fermentaes foram realizadas em 50 mL de meio dispostos em Erlenmyers de 125 mL. As culturas foram cultivadas estaticamente em estufa incubadora tipo BOD a 30 1 C. As concentraes de acares redutores totais (AR) e extrato de levedura inicial variaram de acordo com os planejamentos experimentais estudados. O primeiro planejamento (Tabela 2) foi realizado em meio sinttico com a seguinte composio: K2HPO4 (20 g.L1); MgSO4 (0,20 g.L1); MnSO4 (0,01 g.L1); FeSO4 (0,01 g.L1); CaCl2 (0,02 g.L1); e NaCl (0,01 g.L1). Os acares foram Glicose e Frutose na proporo de 1:1. As concentraes de extrato de levedura e acares iniciais foram variadas de acordo com o planejamento experimental. Para o primeiro planejamento, as amostras foram retiradas nos seguintes tempos: em meio contendo 50 g.L1 de AR inicial, as amostras foram retiradas em 24 horas de fermentao; em meio contento 175 g.L1 de AR inicial, as amostras foram retiradas em 72 horas; e em meio contendo 300 g.L1 de AR inicial, as amostras foram retiradas em 144 horas. Os tempos diferentes para a retirada das amostras se devem ao fato de se saber, por ensaios anteriores, que quanto maior a quantidades de acares, maior o tempo necessrio para o L. mesenteroides consumi-los. O segundo planejamento foi realizado com a adio de fosfato (20 g.L1) ao xarope de caju, j o extrato de levedura e o teor de acares iniciais variaram de acordo com o planejamento experimental (Tabela 9). No foram adicionados sais minerais ao xarope de caju, pois este apresenta em sua composio os principais sais necessrios ao crescimento do microrganismo estudado. Os acares majoritrios presentes no xarope de caju utilizado so glicose e frutose aproximadamente na proporo de 1:1. As concentraes iniciais dos acares, de acordo com o planejamento, foram obtidas atravs da diluio do xarope de caju. Para o segundo planejamento, as amostras foram retiradas nos seguintes tempos: em meio contendo 50 g.L1 de AR inicial, amostras retiradas em 48 horas de fermentao; em meio contendo 100 g.L1 de AR inicial, amostras retiradas em 96 horas; e em meio contendo 150 g.L1 de AR inicial, amostras retiradas em 168 horas. O aumento do tempo de amostragem no segundo planejamento se deve verificao de grandes quantidades de acar redutor nas amostras retiradas em tempos menores no primeiro planejamento. As concentraes de extrato de levedura e acares redutores totais foram variadas segundo os nveis determinados pelo planejamento experimental composto central completo utilizado. Os planejamentos foram gerados utilizando-se o software Statistica v 5.0 (Statsoft). Os resultados foram analisados atravs da metodologia de anlise de superfcie de resposta (BARROS NETO; SCARMINIO; BRUNS, 2002; RODRIGUES; IEMMA, 2005). As anlises de varincia e dos efeitos significativos foram feitas utilizando o software Statistica com nvel de significncia de 90%. Nas Tabelas 2 e 9 so apresentados os planejamentos realizados.
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2.4 Estudo cintico da produo de cido ltico em xarope de caju O estudo cintico foi realizado com o xarope de caju diludo para (125 g.L1) de acares totais, tendo sido a ele adicionados 8,0 g.L1 de extrato de levedura e 20 g.L1 de fosfato como complementao nutricional do meio de cultura. O pH inicial foi ajustado para 6,5. O tampo fosfato foi utilizado para tamponar o meio, sendo o fosfato tambm utilizado como nutriente pelo microrganismo. A fermentao foi realizada de forma esttica em estufa incubadora tipo BOD a 30 C em duplicata em Erlenmyers de 125 mL contendo 50 mL de meio. As amostras foram retiradas assepticamente em intervalos regulares de tempo. 2.5 Determinao do valor do pH O pH foi determinado por potenciometria direta to logo as amostras eram coletadas. Utilizando-se um potencimetro Marconi PA 200. 2.6 Determinao do crescimento microbiano O crescimento microbiano foi determinado por mtodo espectrofotomtrico atravs de densidade tica a 590 nm. Os valores, expressos em massa seca, foram calculados a partir de uma curva de calibrao. 2.7 Remoo das clulas do fermentado Antes da realizao das anlises de acares redutores finais e cido ltico, as clulas foram removidas das amostras por centrifugao a 11806 g por 10 minutos. 2.8 Determinao do cido ltico O cido ltico produzido durante a fermentao foi quantificado atravs do mtodo colorimtrico (TAYLOR, 1996). Neste mtodo o cido ltico reage com H2SO4 a quente liberando acetaldedo, o qual reage com cobre e p-fenilfenol (pPP), resultando em um cromgeno que absorve luz a 570 nm. 2.9 Determinao dos acares redutores totais A determinao dos acares redutores totais foi realizada pelo mtodo de DNS (MILLER, 1959). 2.10 Determinao da taxa de crescimento, consumo de substrato e produo de cido ltico As taxas de crescimento especfico, consumo especfico dos substratos (glicose e frutose) bem como de produo do cido ltico foram determinadas de acordo com as Equaes 1, 2 e 3:
X = 1 dX X dt 1 dS X dt 1 dP X dt (1)

s =

(2)

p =

(3)

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em que: X: taxa especfica de crescimento do microrganismo (h1); S: taxa especfica de consumo de acares redutores totais (h1); P: taxa especfica de formao do cido ltico (h1); X: concentrao de biomassa em base seca (g.L1); S: concentrao de acares redutores totais (g.L1); e P: concentrao de cido ltico (g.L1). 2.11 Determinao do rendimento em cido ltico O rendimento do processo foi calculado ao longo da fermentao com base no acar consumido conforme a Equao 4.
Rendimento em cido latico (%) = cido ltico ( g.L1 ) 100 Acar consumido (g.L1 ) (4)

Observa-se que o xarope de caju um meio rico em minerais e acares, servindo como substrato para a obteno de produtos via processos fermentativos incluindo o cido ltico. No caso do cido ltico, o xarope foi enriquecido com fontes de nitrognio, vitaminas e fosfatos para suprir as necessidades nutricionais do L. mesenteriodes B512F, uma vez que no processo fermentativo o xarope diludo para concentraes mais baixas de acar, diminuindo, portanto, sua concentrao de nitrognio final. O primeiro planejamento foi realizado com o intuito de serem obtidos resultados em meio sinttico padro para serem comparados com o segundo planejamento realizado com o xarope de caju, uma vez que outros componentes do xarope poderiam interferir na fermentao, alm da carncia de nutrientes tais como nitrognio proteico. Na Tabela 2 apresentado o planejamento executado em meio sinttico, bem como os resultados das anlises de cido ltico produzido, biomassa produzida, valores de pH e acares redutores consumidos. Observa-se que a produo mxima de cido ltico (15,96 1,20 g.L1) ocorreu no meio 4. Entretanto, muito acar redutor residual para ser biotransformado em cido ltico foi encontrado em todos os ensaios. O rendimento em cido ltico, com base no acar redutor consumido, foi de 8% para o meio 4. Nas Tabelas de 3 a 5 esto apresentados os efeitos principais e das interaes entre a concentrao de extrato de levedura e a de acares redutores iniciais para o planejamento (Tabela 2) realizado com o meio sinttico ao nvel de 90% de significncia.

3 Resultados e discusso
Na Tabela 1 apresentada composio do xarope de caju em relao aos acares redutores totais, minerais e nitrognio proteico.

Tabela 1. Composio do xarope de caju.

Componentes Concentrao Unidades Nas Tabelas de 6 a 8 so apresentadas as anlises de Nitrognio proteico 7,0 0,35 g.L1 varincia (ANOVA) dos modelos de regresso (Equaes de 5 Acares redutores totais 694,0 0,72 g.L1 a 7) obtidos com os resultados do planejamento realizado com P 65,2 0,15 g.L1 o meio sinttico (Tabela 2). K 840,0 0,34 g.L1 Ca ND cido Ltico( g.L1 ) = 3,71 + 8,62 10 3 AR 1,00 10 5 AR 2 2,10 10 1 EL + 2,00 10 3 Mg 106,8 0,05 g.L1 (5) 1 Na 14,0 0,01 g.L cido Ltico( g.L1 ) = 3,71 + 8,62 10 3 AR 1,00 10 5 AR 2 2,10 10 1 EL + 2,00 10 3 EL2 + 2,00 10 3 EL AR 1 S 4,8 0,03 g.L R2 = 0,8740 Cu ND Fe 606,8 12,91 mg.L1 Biomassa( g.L1 ) = 5,05 2,38 10 2 AR + 4,30 10 5 AR 2 2, 47 10 2 EL 4,35 10 4 EL Zn 413,2 1,15 mg.L1 (6) Biomassa( g.L1 ) = 5,05 2,38 10 2 AR + 4,301 10 5 AR 2 2, 47 10 2 EL 4,35 10 4 EL2 + 3,62 10 4 EL AR Mn 280,0 0,30 mg.L
ND = no detectado.

R2 = 0,6599

Tabela 2. Planejamento experimental composto central realizado com meio sinttico com propores iguais de glicose e frutose, bem como os respectivos resultados.
Meio 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Acares redutores (g.L1) 50 (1) 50 (1) 300 (+1) 300 (+1) 50 (1) 300 (+1) 175 (0) 175 (0) 175 (0) 175 (0) Extrato de levedura (g.L1) 4 (1) 20 (+1) 4 (1) 20 (+1) 12 (0) 12 (0) 4 (1) 20 (+1) 12 (0) 12 (0) cido ltico (g.L1) 2,58 0,20 3,24 0,18 7,13 0,78 15,96 1,20 3,59 0,15 8,64 0,76 6,57 0,97 6,22 0,62 7,11 0,95 8,05 0,32 Biomassa (g.L1) 3,91 0,64 3,23 0,68 2,43 0,01 3,20 0,80 4,28 0,27 2,54 0,36 2,07 0,23 3,34 0,57 3,18 0,30 1,78 0,49 Acares consumidos (g.L1) 46,09 0,11 48,44 0,56 184,08 2,26 199,78 2,33 48,03 0,06 187,33 2,15 123,88 1,13 124,98 2,69 135,73 0,78 138,53 0,49 Valores de pH final 4,07 4,10 3,82 3,88 4,15 3,97 3,79 3,99 3,77 3,77

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Produo de cido ltico

Tabela 3. Efeitos estimados da concentrao de extrato de levedura Acar Cons( g.L1 ) = 3,63 + 7,77 10 1 AR 7,10 10 4 AR 2 + 1, 44 EL 6,79 10 2 EL2 + (EL) e de acares redutores iniciais (AR) na produo de cido ltico (7) 1 4 2 2 2 3 Acar Cons( 1 para o primeiro planejamento (Tabela 2). g.L ) = 3,63 + 7,77 10 AR 7,10 10 AR + 1, 44 EL 6,79 10 EL + 3,33 10 EL AR
Fatores *Mdia *AR (L) AR (Q) EL (L) EL (Q) AR . EL
* Parmetros significativos.

Efeitos 6,92 7,43 0,30 3,04 0,25 4,08

Erro 1,20 1,65 2,65 1,65 2,65 2,02

R2 = 0,9949

De acordo o teste de F, modelos de regresso apresentam significncia estatstica no intervalo de confiana considerado, quando Fcalculado > FTabelado (BARROS NETO; SCARMINIO; BRUNS, 2002; RODRIGUES; LONA; FRANCO, 2006). Dessa

Tabela 6. Anlise de varincia para a produo de cido ltico no primeiro planejamento em nvel de significncia de 90%.
Fonte de variao Regresso Resduos Total Soma dos quadrados 113,65 16,38 130,04 Graus de Quadrados liberdade mdios 5 22,73 4 4,09 9 Fcaculado 5,54 FTabelado 4,05

Tabela 4. Efeitos estimados da concentrao de extrato de levedura (EL) e de acares redutores iniciais (AR) no crescimento microbiano para o primeiro planejamento (Tabela 2).
Fatores *Mdia AR (L) AR (Q) EL (L) EL (Q) AR . EL
* Parmetros significativos.

Efeitos 2,60 1,08 1,35 0,45 0,05 0,72

Erro 0,41 0,56 0,90 0,56 0,90 0,69

Tabela 7. Anlise de varincia para o crescimento microbiano no primeiro planejamento em nvel de significncia de 90%.
Fonte de variao Regresso Resduos Total Soma dos Graus de Quadrados Fcaculado quadrados liberdade mdios 3,69 5 0,73 1,55 1,90 4 0,47 5,60 9 FTabelado 4,05

Tabela 5. Efeitos estimados da concentrao de extrato de levedura (EL) e de acares redutores iniciais (AR) no consumo de acares para o primeiro planejamento (Tabela 2).
Fatores *Mdia *AR (L) AR (Q) EL (L) EL (Q) AR . EL
* Parmetros significativos.

Efeitos 132,95 142,87 22,18 6,38 8,69 6,67

Erro 3,73 5,10 8,19 5,10 8,19 6,25

Tabela 8. Anlise de varincia para o consumo de acares no primeiro planejamento em nvel de significncia de 90%.
Fonte de Soma dos variao quadrados Regresso 31103,25 Resduos 156,55 Total 31259,80 Graus de Quadrados liberdade mdios 5 6220,65 4 39,13 9 Fcalculado 158,94 FTabelado 4,05

Tabela 9. Planejamento realizado em xarope de caju, bem como os respectivos resultados.


Meio 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Extrato de levedura (g.L1) 0 (1) 0 (1) 8 (+1) 8 (+1) 0 (1) 8 (+1) 4 (0) 4 (0) 4 (0) 4 (0) Acares redutores (g.L1) 50 (1) 150 (+1) 50 (1) 150 (+1) 100 (0) 100 (0) 50 (1) 150 (+1) 100 (0) 100 (0) cido ltico (g.L1) 4,63 0,68 10,81 0,24 4,60 0,39 13,03 1,19 9,01 0,72 15,48 0,55 3,96 0,39 12,71 1,01 11,52 0,01 9,73 0,46 Biomassa (g.L1) 1,25 0,27 1,59 0,11 1,74 0,23 2,25 0,01 2,12 0,04 2,54 0,25 1,73 0,38 2,19 0,12 2,52 0,01 2,14 0,37 Acares consumido (g.L1) 44,05 0,12 114,68 0,99 46,67 0,12 116,13 0,35 97,41 0,08 64,58 1,27 46,12 0,41 102,88 0,99 111,68 0,85 113,83 1,34 Valores de pH final 4,54 4,12 4,34 4,02 4,25 4,00 4,12 3,85 4,05 3,38

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forma, de acordo com os resultados apresentados nas Tabelas de 6 a 8, todos os modelos de regresso apresentaram significncia estatstica, exceto o modelo de regresso para a biomassa, uma vez que o valor de F calculado foi inferior ao tabelado. Dessa forma, no foi construda superfcie de reposta com o modelo de regresso para a biomassa. Nas Figuras 1 e 2 esto apresentadas as superfcies de resposta obtidas com os modelos do planejamento com o meio sinttico (Tabela 2). De acordo com a Figura 1, observa-se que a adio de extrato de levedura no apresentou influncia significativa na produo de cido ltico e que a concentrao de acar inicial apresentou um efeito mais acentuado na produo de cido ltico. A adio conjunta desses dois compostos favorece a produo ltica. De acordo com a Figura 2, observa-se que o extrato de levedura no influenciou no consumo de acares redutores totais, porm a concentrao inicial de acares redutores influenciou diretamente o consumo de acar. Os dois fatores juntos no apresentaram interao significativa para o consumo de acares. Observou-se que, em todos os pontos experimentais do primeiro planejamento, restou muito acar redutor e que a concentrao extrato de levedura pouco influenciou na produo de cido ltico. Dessa forma, um segundo planejamento com o xarope de caju foi realizado tomando-se como base os resultados do primeiro planejamento. Este planejamento foi feito, ento, baixando-se as concentraes iniciais de acares redutores totais e de extrato de levedura, bem como se estendendo o tempo de fermentao para se aumentar seu rendimento. Na Tabela 9 apresentado o segundo planejamento realizado com xarope de caju bem como os resultados das anlises para a produo de cido ltico e biomassa, valores de pH e acares redutores consumidos.

Observa-se uma produo de 15,5 g.L1 de cido ltico no meio 6. Entretanto, restou ainda muito acar para ser biotransformado em cido ltico. O rendimento em cido ltico, com base no acar consumido, obtido no ensaio 6 foi de 23,9%. Este rendimento da ordem de 15% superior ao rendimento mximo obtido no primeiro planejamento (Tabela 2). Observa-se que, em ambos os planejamentos experimentais, a fermentao foi encerrada com valores de pH abaixo de 5,0.
Tabela 10. Efeitos estimados da concentrao de extrato de levedura (EL) e de acares redutores (AR) iniciais na produo de cido ltico no segundo planejamento (Tabela 9).
Fatores *Mdia EL (L) EL (Q) *AR (L) *AR (Q) EL . AR
* Parmetros significativos.

Efeitos 11,10 2,88 1,30 7,78 -6,50 1,12

Erro 1,10 1,50 2,41 1,50 2,41 1,84

Tabela 11. Efeitos estimados da concentrao de extrato de levedura (EL) e de acares redutores iniciais (AR) no crescimento microbiano para o segundo planejamento.
Fatores *Mdia *EL (L) EL (Q) *AR (L) *AR (Q) AR . EL
* Parmetros significativos.

Efeitos 2,40 0,52 0,28 0,43 1,03 0,08

Erro 0,10 0,13 0,22 0,13 0,22 0,17

o.

20 18 16 14 12 cido 10 1 ltico (g.L ) 8 6 4 2 20 18 16

300 250 200 Acares 150 consumidos (g.L1) 100 50 20 18 16


30 26280 0 22 240 0 1 200 0 14 16080 12 0 80 100 0 Acares 4 60 redutores (g.L1)

3 2 28000 14 2224060 12 1 200 0 Extrato de 10 8 1416080 12 0 Acares levedura (g.L1) 6 8 100 0 redutores (g.L1) 4 60 0

14 12 10 Extrato de 8 1 6 levedura (g.L )

Figura 1. Influncia das concentraes de extrato de levedura e de acares redutores iniciais na produo de cido ltico (Primeiro planejamento Tabela 2).
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Figura 2. Influncia das concentraes de extrato de levedura e de acares redutores iniciais no consumo de acares (Primeiro planejamento Tabela 2).
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Produo de cido ltico

Dessa forma, o metabolismo do microrganismo pode ter sido Biomassa( g.L1 ) = 4,14 10 1 + 1,15 10 1 EL 8,92 10 2 EL2 + 4, 47 10 2 AR 2,06 (9) reduzido devido ao baixo valor de pH, afetando a produo 1 2 2 2 4 2 4 Biomassa( g.L1 = 4,14 10 1 + ltica. Nas Tabelas de 10 a 13 esto )apresentados 1,15efeitos da 8,92 10 EL + 4, 47 10 AR 2,06 10 AR + 2,13 10 AR EL os 10 EL concentrao de extrato de levedura e de acares redutores R2 = 0,9353 iniciais para o planejamento realizado com o xarope de caju ao nvel de 90% de significncia. Acares Cons( g.L1 ) = 36,63 + 4,07 EL 6, 40 10 1 EL2 + 2,00 AR 6,30 10 3 AR 2 + 1 Nas Tabelas de 13 a 15 so apresentadas 36,63 + 4,07 EL 6, 40 10 1 EL2 + 2,00 AR 6,30 10 3 AR 2 + 1,50 10 3 EL AR Acares Cons( g.L1 ) = as anlises de varincia ANOVA dos modelos de regresso (Equaes de 8 a R2 = 0,9449 10) obtidos com os dados para o planejamento realizado com o xarope de caju (Tabela 9). De acordo com os resultados apresentados nas Tabelas de 13 a 15, todos os modelos de regresso so estatisticamente cido Ltico( g.L1 ) = 9,34 2,24 10 1 EL + 4,0 10 2 EL2 + 3,26 10 1 AR 1,36 10 3 EL2 + 2,82 10 3 AR EL significativos (Fcalculado > FTabelado). Nas Figuras de 3 a 5 so (8) apresentadas as superfcies de resposta obtidas a partir dos 10 1 EL + 4,0 10 2 EL2 + 3,26 10 1 AR 1,36 10 3 EL2 + 2,82 10 3 AR EL modelos de regresso dos dados obtidos com o planejamento R2 = 0,9011 com xarope de caju (Tabela 9).
Tabela 12. Efeitos estimados da concentrao de extrato de levedura (EL) e de acares redutores iniciais (AR) no consumo de acares para o segundo planejamento.
Fatores *Mdia EL (L) EL (Q) * AR (L) AR (Q) AR . EL
* Parmetros significativos.

(10)

Efeitos 101,99 9,58 20,49 65,61 33,48 0,58

Erro 10,67 14,58 23,38 14,58 23,38 17,86

De acordo com os resultados apresentados na Figura 3, observa-se a influncia direta do teor inicial de acares redutores e uma menor influncia para as concentraes de extrato de levedura na produo de cido ltico. Aumentandose o teor de acares iniciais, aumenta-se a concentrao final de cido ltico. Os resultados apresentados na Figura 4 mostram a interao dos dois fatores estudados. O mximo crescimento microbiano ocorre na faixa de concentraes superiores a 4 g.L1 para o extrato de levedura e concentraes na faixa de 80 a 125 g.L1 de acares redutores iniciais. De acordo com os resultados apresentados na Figura 5, a concentrao de extrato de levedura praticamente no influencia o consumo de acares. Entretanto, quanto maior a concentrao de acares iniciais, maior o consumo de acar durante a fermentao.

Tabela 13. Anlise de varincia para a produo de cido ltico no segundo planejamento em nvel de significncia de 90%.
Fonte de variao Regresso Resduos Total Soma dos quadrados 128,80 14,13 142,94 Graus de liberdade 5 4 9 Quadrados mdios 25,76 3,53 Fcalado 7,28 FTabelado 4,05

Tabela 14. Anlise de varincia para a produo de biomassa no segundo planejamento em nvel de significncia de 90%.
Fonte de variao Regresso Resduos Total Soma dos Graus de Quadrados quadrados liberdade mdios 1,46 5 0,29 0,10 4 0,02 1,56 9 Fcalado 11,57 FTabelado 4,05

20 18 16 14 12 cido ltico (g.L1) 10 8 6 4 2 140 120 6 7 8

Tabela 15. Anlise de varincia para o consumo de acares no segundo planejamento em nvel de significncia de 90%.
Fonte de variao Regresso Resduos Total Soma dos Graus de Quadrados quadrados liberdade mdios 8442,27 5 1688,45 491,86 4 122,96 8934,13 9 Fcalado 13,73 FTabelado 4,05

100

Acares redutores (g.L1)

80

60

Extrato de levedura (g.L1)

Figura 3. Influncia das concentraes de extrato de levedura e de acares redutores iniciais na produo de cido ltico (Segundo planejamento Tabela 9).
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A anlise da Figura 3 permite a seleo de uma concentrao ideal aproximada de acares iniciais e extrato de levedura para a produo de cido ltico com o xarope de caju. Estas concentraes so as seguintes: 125 g.L1 de acares e 8 g.L1 de extrato de levedura. Para o crescimento microbiano, de acordo com a Figura 4, os valores ideais aproximados so 120 g.L1 de acares inicias e 8 g.L1 de extrato de levedura inicial. Dessa forma, escolheu-se a concentrao de 125 g.L1 de acares redutores e de 8 g.L1 para o estudo cintico da produo de cido ltico em xarope de caju (Figura 5). Na Tabela 16 so apresentados os resultados dos rendimentos da produo de cido ltico obtidos durante o estudo cintico da fermentao com o xarope de caju.

O consumo de acares foi de 54,9%, restando ainda substrato disponvel para produo de cido ltico. Entretanto observou-se uma produo final de cido ltico de 11,9 g.L1, apresentando um rendimento final de 15% em 72 horas de fermentao nas condies estudadas. O rendimento mximo observado foi obtido em 24 horas de fermentao, quando 19,5% dos acares redutores totais consumidos foram convertidos em cido ltico. Nas Figuras 6 e 7 so apresentados os resultados da cintica de produo de cido ltico, do consumo dos acares redutores totais, do crescimento microbiano e dos valores de pH no meio de cultura. De acordo com os resultados apresentados na Figura 6, observa-se uma maior produo do cido ltico entre as 12 e 24 horas de fermentao. A produo final foi de 11,7 0,9 g.L1 em 72 horas de fermentao. O valor inicial de cido ltico no tempo zero devido presena deste produto no meio de inoculao do microrganismo, este valor foi subtrado no clculo do rendimento apresentado na Tabela 16. Observa-se um maior consumo dos acares redutores totais no intervalo de 12 a 24 horas, tendo

3,0 2,5 2,0 Biomassa (g.L1) 1,5 1,0 0,5 140 120 7 8

Tabela 16. Rendimento da produo de cido ltico durante a fermentao.


Tempo (horas) 0 2 4 6 8 12 24 28 32 36 48 60 72 Rendimento (%) 0,00 0,00 0,00 0,29 5,74 12,34 19,47 16,25 16,18 15,51 16,15 15,85 15,48

Acares 80 60 redutores (g.L1)

100

Extrato de levedura (g.L1)

Figura 4. Influncia das concentraes de extrato de levedura e de acares redutores iniciais para o crescimento microbiano (Segundo planejamento Tabela 9).

140

Acares consumidos (g.L1)

120 100 80 60 40 20 140 120 6 7 8

Tabela 17. Resultados das taxas de produo de cido ltico, consumo de acares redutores totais e crescimento microbiano.
Tempo (horas) 2 4 6 8 12 24 28 32 36 48 60 72 p (h1) 0,001 0,148 0,297 0,437 0,289 0,289 0,080 0,060 0,156 0,078 0,048 0,018 S (h1) 1,157 2,260 3,364 2,352 2,807 3,262 0,553 0,976 0,412 0,580 0,137 0,024 X (h1) 0,0342 0,0313 0,0309 0,0623 0,0314 0,0124 0,0131 0,0056 0,0055 0,0018 0,0018 0,0016

100 80 Acares redutores (g.L1) 60

4 5 Extrato de levedura (g.L1)

Figura 5. Influncia das concentraes de extrato de levedura e de acares redutores iniciais no consumo de acares (Segundo planejamento Tabela 9).
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Produo de cido ltico

sido observada simultaneamente uma maior produo de cido ltico. Na figura 7, so apresentados o crescimento microbiano e o pH do meio durante a fermentao. De acordo com os resultados apresentados na Figura 7, observa-se um maior crescimento microbiano no intervalo de 6 a 24 horas de fermentao e depois um crescimento com taxas menores. O valor inicial de biomassa devido ao inculo. Observa-se que o valor do pH diminui para 4,35 aps 24 horas de fermentao. Valores de pH abaixo de 5,0 afetaram as taxas metablicas do microrganismo reduzindo a produo de cido

ltico, o consumo de acares redutores totais e o crescimento microbiano. Na Tabela 17 so apresentados os valores das taxas de produo de cido ltico, consumo de substrato e produo de biomassa. Observa-se um aumento da taxa de produo do cido ltico entre o intervalo de 2 a 8 horas, e um decrscimo a partir de 8 horas de fermentao. Observa-se um aumento na taxa de consumo de acares at a sexta hora de fermentao que se manteve estvel at as 24 horas e decresceu aps esse perodo. Um aumento da taxa de crescimento microbiano observado at 8 horas de fermentao, quando a taxa mxima obtida e, em seguida, observa-se um decrscimo da taxa de crescimento. Durante o segundo dia de fermentao, foi observada a formao de bolhas que pode ser um indicativo da produo de CO2 j que a linhagem estudada heterofermentativa e produz tambm o etanol.

20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

10

20

30

40

50

60

70

130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Acares redutores (g.L1)


Biomassa (g.L1)

cido ltico (g.L1)

4 Concluso
De acordo com os resultados apresentados, conclui-se que o xarope de caju um meio rico em minerais e acares, servindo como substrato para a produo de produtos obtidos por processos fermentativos, incluindo os cidos orgnicos. No caso do cido ltico, o xarope deve ser enriquecido com fonte externa de nitrognio e fosfato para suprir as necessidades nutricionais do L. mesenteriodes B512F. A partir dos resultados obtidos nos planejamentos experimentais estudados, verificou-se um indicativo de que as taxas metablicas do microrganismo estudado so comprometidas quando valores elevados de acares so empregados, uma vez que restou muito acar no consumido especialmente no primeiro planejamento. A partir do planejamento com xarope de caju, conclui-se que a produo de cido ltico em xarope de caju vivel, chegando-se a valores de 15,5 g.L1 de cido em 96 horas no meio contendo 8 g.L1 de extrato de levedura e na faixa de 100 g.L1 de acares iniciais provenientes do xarope de caju. A partir dos grficos de superfcie de resposta, pode-se concluir como condies ideais aproximadas para a produo de cido ltico em xarope de caju a adio de 8 g.L1 de extrato de levedura ao xarope diludo para 125 g.L1 de acares iniciais. A partir do estudo cintico apresentado, pode-se concluir que o maior rendimento de cido ltico por L. mesenteroides B512F a partir do xarope de caju se deu nas primeiras 24 horas de experimento. A produo de cido ltico por fermentao submersa no vivel quando o valor do pH est abaixo de 5,0, pois se observou uma reduo das taxas metablicas da linhagem estudada aps valores de pH em torno de 4,3. Dessa forma, a produo de cido ltico por L. mesenteroides B512F em xarope de caju vivel. Entretanto, uma fermentao deve ser realizada com o valor de pH controlado acima de 5,0 atravs da adio de NaOH em fermentador batelada com adio de nutrientes essenciais como extrato de levedura e fosfato, para que os acares redutores totais sejam completamente consumidos e se possa observar a cintica de produo do cido ltico sem acares redutores residuais. Estes estudos so objetos de trabalhos futuros.
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Tempo (horas) cido ltico Acares redutores Figura 6. Produo de cido ltico e consumo de acares redutores totais em xarope de caju diludo para 125 g.L1 de acares redutores totais, contendo 8 g.L1 de extrato de levedura.

7 6
Valores de pH

3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0 10 20 30 40 50 60 70 0,0

5 4 3 2 1 0

Tempo (horas) Valores de pH Biomassa Figura 7. Crescimento microbiano e valores de pH no xarope de caju diludo para 125 g.L1 de acares redutores totais, contendo 8 g.L1 de extrato de levedura.
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Agradecimentos
Os autores agradecem ao CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico) o auxlio financeiro e bolsa concedida e ARS Culture Collection pelo microrganismo utilizado neste trabalho.

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