Validacin del Mtodo Analtico por HPLC/UV para la Determinacin de Terbutil Hidroxiquinona T!

H"# en Aceite Ve$etal%

QFB. Jos Eduardo Hernndez Torres; Brenda Abigail Macias Ramrez; r. Mar!n "#mez Hernndez. e$!o. de %is!emas Biol#gicos& 'ni(ersidad Au!#noma Me!ro$oli!ana )oc*imilco& M+ico F.
Resumen. Con la finalidad de cualificar y cuantificar por medio de la adicin de estndar interno la TBHQ en aceites vegetales se efectu la validacin de la metodologa para la determinacin de la TBHQ por cromatografa lquidos de alta resolucin (HPLC) con base en el mtodo oficial de la Association of Analytical Communities (AOAC) realizando en algunas modificaciones. En la linealidad se obtuvo un coeficiente de correlacin r=0,9974. Para la precisin del sistema se evalu la relacin de reas bajo la curva (ABC), hallndose coeficientes de variacin menores al 3%. Para la repetibilidad del mtodo se obtuvo un valor de P de 0.9739 apoyndose en un anlisis de varianza (ANOVA). Para la recuperacin se obtuvo un porcentaje de 83.1%. Con los resultados obtenidos se demuestra que el mtodo en estudio es lineal, repetible, preciso y tiene buena recuperacin (aunque no ideal) para ser utilizado en el control de calidad de alimentos, especficamente en aceite vegetal para la determinacin de TBHQ. Summary. In order to qualify and quantify the addition of internal standard TBHQ in vegetable oils was carried out to validate the methodology for the determination of TBHQ by high pressure liquid chromatography (HPLC) method based on official Association of Analytical Communities (AOAC) making some changes. The linearity was obtained a correlation coefficient r = 0.9974. For the accuracy of the system evaluated the relationship of areas under the curve (AUC), being coefficients of variation less than 3%. For the repeatability of the method yielded a P value of 0.9739 based on an analysis of variance (ANOVA). Recovery was obtained for a percentage of 83.1%. With the results demonstrated that the method under consideration is linear, repeatable, accurate and has good recovery (though not ideal) for use in food quality control, specifically in vegetable oil for the determination of TBHQ.

INTRODUCCIN El trmino antioxidante se refiere a la capacidad de un compuesto de oponerse a la accin del oxgeno y de ciertas especies oxidantes; lo realizan liberando electrones que son captados por los radicales libres. (BALLESTER, 1996). Los conservadores son productos qumicos que se adicionan para prevenir o inhibir el crecimiento de microorganismos (SATTIGERI, 2000). Los antioxidantes-conservadores detienen la degradacin qumica de medicamentos cosmticos y de alimentos, que se provoca por la presencia del oxgeno (ANDR, 2010). Los aceites vegetales son muy importantes en la preparacin de cosmticos y alimentos convirtindose en productos de uso cotidiano, y que requieren una excelente calidad. Uno de los antioxidantes ms utilizados es el terbutilhidroquinona (TBHQ) (figura 1) tambin conocido como antioxidante E-319, es un compuesto

aromtico de tipo de fenol derivada de la hidroquinona. El TBHQ es un antioxidante de calidad alimentaria, que fue desarrollado para retardar el desarrollo de la rancidez y prolongar su vida til de almacenamiento (SUMIKO, 2004). El TBHQ tambin puede ser ventajoso en aceites esenciales, frutos secos y materiales de envasado (XIU-QIN, 2009).

Figura 1. Estructuras qumicas de TBHQ y PG respectivamente

El propil galato (PG) es un antioxidante grado alimentario para grasas y aceites en general, incluido tambin en alimentos y cosmticos que los contengan. Tambin es inhibidor en la auto oxidacin de paraldehdo y sustancias similares expuestas a perxidos en presencia

de oxigeno. El PG puede combinarse con otros productos antioxidantes como el TBHQ y el cido ctrico para evitar la formacin de colores no deseados (XIU-QIN, 2009). Los antioxidantes deben proteger la calidad en los productos cosmticos y alimentarios, pero un incremento en su concentracin puede producir toxicidad o mutagnesis, daando la salud del consumidor (WEI, 2010). Por lo tanto, es conveniente establecer un mtodo analtico que monitoree su cualificacin y cuantificacin en los diversos productos que los utilizan. Dentro de los mtodos de anlisis existentes para la determinacin y cuantificacin de antioxidantes se encuentra la cromatografa de lquidos y la cromatografa de gases. Se pueden analizar hasta 15 diferentes antioxidantes en un slo anlisis. (SATTIGERI, 2000). Actualmente se cuantifican estos antioxidantes por el mtodo oficial de la AOAC para antioxidantes fenlicos en aceites y grasas; entre sus caractersticas ms importantes de este mtodo son la utilizacin de una extraccin liquido-liquido acetonitrilo: hexano; por otro lado dentro del anlisis cromatrogrfico su elucin es de tipo gradiente, mientras que el tipo de columna utilizada es una C18 con fase estacionaria de slice esfrica. (AOAC Mtodo oficial, 1994) Para que el mtodo analtico sea confiable tiene que estar validado. La validacin proporciona un alto grado de confianza y seguridad del mtodo analtico y se realiza para asegurar que el mtodo propuesto cumpla con su funcin. El presente trabajo tuvo como objetivo la validacin de un mtodo analtico para la determinacin cualitativa y cuantitativa del antioxidante TBHQ a travs de HPLC, contenido en aceite vegetal comercial, variando algunos aspectos de acuerdo al mtodo oficial, en los que se encuentran: diferente extraccin de acuerdo a los solventes utilizados, tipo de columna y tipo

de elucin, en este caso de tipo isocrtica, con el fin de optimizar el mtodo, as tambin se propone un mtodo con estndar interno. La validacin en este estudio considera los parmetros de: linealidad, precisin, repetibilidad y recuperacin (WALPOLE, 1987; ANDRE, 2010). MATERIAL Y PROCEDIMIENTO Reactivos. Los compuestos de referencia PG y TBHQ fueron proporcionados en un kit de antioxidantes fenlicos (SUPELCO) los compuestos contaban con una pureza de 99.1% y 97% respectivamente. Se utiliz tambin como compuesto de referencia Acido ascrbico (SIGMA). Los reactivos utilizados fueron cido actico glacial y Alcohol etlico (J. BAKER Grado reactivo), Alcohol isoproplico (OMNISOLV), Acetonitrilo (J. BAKER), Metanol (EMD) estos ltimos con grado HPLC. Para el proceso se obtuvieron dos aceites comerciales (1-2-3 y PAM ) el primero contiene el antioxidante de inters TBHQ mientras el segundo lo carece. Equipo. Se utiliz una balanza Mettler AE163, un sonicador Branson 3210. El equipo de HPLC est conformado por una Bomba LAB ALLIANCE Serie III modelo A20164; detector KNAVER UV; columna KINETEX 2.6 X 13- C-18 100 X 3 mm. Preparacin de disoluciones de estndar interno (IS) y disolucin stock de TBHQ y Acido ascrbico (AAs). Transferir por separado 5.0 mg de PG, 5.0 mg de TBHQ y 5.0 mg de AAs exactamente pesados, a matraces aforados de 5 mL, disolver y diluir a volumen de aforo con acetonitrilo: 2-propanol (1:1 v/v) y homogenizar. Para la solucin estndar de As se sonic por 5 min para su completa disolucin. Evaluacin de Linealidad, Repetibilidad y Precisin. Se adicionaron 60L de estndar interno a seis matraces aforados de 5 mL, posteriormente se adicion la disolucin stock de TBHQ, aadieron volmenes en un intervalo de 20 a 120L. Se lleva al volumen de afor con la fase mvil. La fase mvil fue

una mezcla de acetonitrilo, metanol, cido actico y agua en una proporcin de 50:5:2:43 v/v, se filtr y sonic por 15 min. Hecho esto las soluciones estndar fueron analizadas por HPLC. Evaluacin del Parmetro de Recuperacin. A seis matraces aforados de 5 mL se adiciona 120 L respectivamente de la disolucin de estndar interno y de la disolucin stock de As. De la disolucin stock de TBHQ se aadieron a los matraces diferentes volmenes en un intervalo de 20 a 200L llevando al aforo con fase mvil. Se prepar un blanco que contena todo menos la TBHQ. Preparacin de la muestra. Se pes 1 g de aceite comercial en un tubo, se le agreg 10mL de una mezcla de disolventes (Acetonitrilo, 2- propanol y Etanol en proporcin 2:1:1 v/v), y volmenes de 60L de la disolucin de estndar interno y 120 L de la disolucin As. Despus de homogenizar la mezcla coloc en el congelador durante una hora. Transcurrido el tiempo se filtro y se tom 1 mL el cual se evapor en una estufa al vacio; la muestra se redisolvi en 1mL de fase mvil y se analiz por HPLC. Anlisis por HPLC. Las condiciones de anlisis fueron: columna KINETEX, 2.6 X13, C-18 100 X 3 mm; volumen de inyeccin 20 L; temperatura de columna ~20 C; 280 nm; flujo 0.8 mL/min y duracin de anlisis de 3 min.

modelo y= mx + b, donde y es la relacin de rea, x la concentracin, m la pendiente y b el intercepto (Grafica 1). Los resultados del modelo lineal describen la relacin entre la relacin de rea y la relacin de concentraciones de TBHQ. La ecuacin del modelo es: ABCTBHQ/ABCPG = 0.6123x + 2 0.0173 El valor de R da un resultado de 0.9974 lo que representa una linealidad aceptable. El cromatograma de TBHQ Y PG se muestra en la figura 2. En donde se representa claramente los tiempos de retencin 0.780 min y 1.016 min para PG y TBHQ respectivamente, este tomado a una concentracin de 0.016 mg/ml; asimismo se deja en claro que la eleccin de PG como estndar interno cumple con los requisitos para tal asignacin, como un tiempo de retencin cercano al analito de inters, su nula interaccin, as como su parecido en su naturaleza con el analito. El Cromatograma tambin muestra una buena resolucin por parte del sistema de HPLC utilizado, por lo cual no deja ver interferencia alguna por parte del equipo.
1..

A!CT!H"/A!CP&

1.1 ,.0 ,./ ,.. ,., , ,.2 1 1.2 -.2

CT!H"/CP&

DISCUSIN Y RESULTADOS

Linealidad Para el estudio de la linealidad del sistema se prepar la curva de calibracin por triplicado, en un intervalo de concentracin de 4.0 hasta 24.0 g/mL de TBHQ y 12g/mL del estndar interno. La curva de calibracin para TBHQ fue construida usando la relacin de reas bajo la curva del pico cromatrogrfico. ABCTBHQ/ABCPG = f(CTBHQ/CPG). Se realiz el anlisis de regresin lineal considerando el

Grfica 1. Curva de calibracin para TBHQ, utilizando PG como estndar interno. Datos utilizados para evaluar linealidad del sistema.

1./ 1.. 1.A!C TH!"/P& 1 ,.0 ,./ ,.. ,., , ,.2 1 1.2 -.2 C T!H"/P& 6 7 ,.2033+ 8 ,.,4R9 7 ,.555/

Figura 2. Cromatograma de la separacin de TBHQ y PG utilizado como estndar interno. Las condiciones cromatogrficas se mencionan en el texto.

Grfica 2. Curva de calibracin para TBHQ, utilizando PG como estndar interno. Datos utilizados para evaluar reproducibilidad en 3 das diferentes.

Repetibilidad Se repiti tres veces la curva de calibracin, en el mismo intervalo de concentraciones, por el mismo analista, con el mismo equipo en tres das diferentes. El criterio de aceptacin fue una comparacin de medias. En la grafica 2 se aprecia una comparacin de las curvas de cada uno de los tres das, mostrando tambin sus barras de error tpico, el cual es ms grande en los ltimos dos puntos. Este procedimiento compara los datos en los 3 das en donde la prueba-F en la tabla ANOVA determino si hay diferencias significativas entre las medias, mostrando que la tabla ANOVA (tabla 1) descompone la varianza de los datos en dos componentes: un componente entre-grupos y un componente dentro-de-grupos. La razn-F, que en este caso es igual a 0.03, es el cociente entre el estimado entre-grupos y el estimado dentro-de-grupos. Puesto que el valor-P de la razn-F es mayor o igual que 0.05, no existe una diferencia estadsticamente significativa entre las medias de las 3 variables con un nivel del 95.0% de confianza por lo cual el sistema es reproducible.

Fuente Entre grupos Intra grupos Total (Corr.)

Suma de Cuadrados 0.00631434 6.08 6.08632

Gl 2 51 53

Cuadrado Medio 0.00315717 0.119216

Razn-F 0.03

ValorP 0.973 9

Tabla 1. Resultados del ANOVA para determinar si existe diferencias significativas en la repetibilidad.

Precisin Para la prueba de precisin se analizaron por sextuplicado dos concentraciones de TBHQ 0.009 y 0.022 mg/mL. Se considera como criterio de aceptacin un coeficiente de variacin (CV) de la relacin de ABC menor al 3%. Los CV obtenidos se muestran en la tabla 4, su valor e inferior al 3%, por lo que se establece que existe precisin.
CT!H"/ CP& ,.32 1.04 A!CT!H"/ A!CP&# Media ,..32 1.,53 De'(iacin e't)ndar ,.,11 ,.,1/ CV

-..,0 1.244

Tabla 2. Resultados del estudio de precisin.

Recuperacin. Para la evaluacin del parmetro de recuperacin se realiz una curva de calibracin de 0.004 a 0.020 mg/ml del stock de TBHQ por triplicado adicionando los estndares a muestras de aceite comercial PAM, el cual no contena el antioxidante de inters. La adicin de la disolucin stock de AAs tiene el objetivo de proteger la TBHQ y el PG de la oxidacin puesto que son muy sensibles al oxgeno del aire. El valor de R para la curva de calibracin del aceite adicionado con los estndares fue de 0.9981, que demuestra

buena linealidad. As tambin, se evala el porcentaje de recuperacin de TBHQ, comparando las ABC obtenidas en la curva de calibracin con slo estndares, con las ABC obtenidas en la curva de calibracin en aceite y con extraccin. La representacin grfica de estas ABC permite evaluar el porcentaje de recuperacin de la extraccin. Un valor en la pendiente de 1.0 corresponde al 100% de recuperacin del compuesto. En este caso la relacin de reas presenta coeficiente de correlacin de 0.9993 y un valor de pendiente 0.831; por lo anterior, el porcentaje de recuperacin a travs de la extraccin lquido-lquido fue del 83.1%. En la figura 3 se muestra el cromatograma obtenido de la extraccin de una muestra de aceite adicionado con los conservadores, a una concentracin de 0.012mg/mL de TBHQ. Se puede observar los picos de PG y TBHQ, y el pico del AAS con tiempo de retencin menor a los dems (0.616 min).

acto antes de la adicin de AAs. Una diferencia entre los aceites es que el aceite sin conservador PAM tiene una presentacin era aerosol, cuyo envase lo protege del aire y de la luz; mientras que aceite 1-2-3 se vende en una botella de plstico transparente.
1.,,, ,.5,, ,.0,, ,.3,, ,./,, ,.2,, ,..,, ,.4,, ,.-,, ,.1,, ,.,,, , ,.,.. ,./

A!C T!H"/P& en aceite

6 7 ,.041.+ > ,.,110 R9 7 ,.5554

,.0

1.A!C T!H"/P&

Grfica 3. Comparacin de reas entre curvas de calibracin, con y sin aceite.

AB: TBHQ;<" mues!ras ,..30 :oncen!raci#n calculada !e#rica de acuerdo a la cur(a de calibraci#n mg;m= ,.,111/-00

Tabla *% Resul!ados de recu$eraci#n.

En el Cromatograma de la figura 4 se puede observar el comportamiento de la muestra, la cual fue similar a la del estndar mostrando el TBHQ, PG y el AAs.

Figura 3. Cromatograma obtenido de una muestra de aceite adicionado con AAs, PG y TBHQ.

Anlisis de la muestra. Se utiliz una muestra de aceite comercial 1-2-3 que contiene TBHQ y posteriormente se analiz por triplicado, aplicando el mtodo descrito para la preparacin de la muestra. Para la cuantificacin, el valor del rea (ABC) obtenido de la extraccin al aceite comercial se interpol en la curva de calibracin y se determin su concentracin, los datos obtenidos se muestran en la tabla 3. Conforme a la concentracin obtenida en la muestra, que obviamente es menor a la terica, se deduce que la reduccin de esta se debe a que quiz parte del conservador

Figura 4. Cromatograma de la muestra problema de aceite comercial, se aprecian los picos de AAs, PG y TBHQ.

Una observacin que se hizo de acuerdo con la presencia de AAs es que conforme pasaba el tiempo despus de haber preparado la disolucin a inyectar, el rea bajo la curva del AAs disminua, por lo que se constat que protega a los otros conservadores al oxidarse l preferentemente disminuyendo su concentracin.

CONCLUSION La identificacin de los compuestos se vio muy favorecida, conforme a las condiciones cromatogrficas establecidas, pues se obtuvo una separacin de los componentes adecuada, por lo que el tipo de columna, refirindose al tamao de partcula y longitud de columna, as como el tipo de elucin fue satisfactorio con base al mtodo oficial, puesto que se gasto menos disolvente y menos tiempo de anlisis (tiempo de corrida), obteniendo finalmente una buena resolucin. En la determinacin cuantitativa, el mtodo se valido satisfactoriamente apegado a los parmetros establecidos de linealidad, precisin, repetibilidad y recuperacin que se aplicaron en el estudio, aunque para el parmetro de recuperacin es necesario optimizar el proceso para la obtencin de un mejor porcentaje de dicho parmetro. Asimismo se debe tener precaucin en la eleccin de muestras de acuerdo a su presentacin puesto que puede variar de alguna forma en el anlisis, en este caso en el parmetro de recuperacin. Por lo tanto el mtodo establecido en este estudio resulta vlido para la cuantificacin de TBHQ por medio de la adicin de PG como estndar interno. A consecuencia, es igualmente necesario, la aplicacin de otros parmetros de validacin para un anlisis ms completo como la exactitud del sistema, limites de deteccin y especificidad. BIBLIOGRAFA

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