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Efecto de nuevas molculas inhibidores de la 17-Hidroxilasa

esteroidales

como

Jos Eduardo Hernndez Torresa, Marisa Cabeza Salinasa

a

Laboratorio de Hormonas, Universidad Autnoma Metropolitana, Unidad Xochimilco, Calzada del Hueso 1100, Colonia Villa Quietud, Mxico, D.F., C.P. 04960, Mxico

Resumen Introduccin. El cncer de prstata y la hiperplasia prosttica benigna estn asociados a un mal funcionamiento de los andrgenos tales como la T y DHT. Por lo que el objetivo de estudio consisti en probar el efecto in vitro de dos nuevas molculas esteroidales, S-CL y T-S3, sobre la biosntesis de T y de DHT a partir de [H3] 4-diona, la cual fue utilizada como precursor. Material y mtodos. Se determin la actividad de la 17- HSD utilizando prstata humana como fuente; en presencia de los esteroides S-CL y T-S3, a partir de 4-diona [H3], se extrajo y purific los esteroides formados y se construy una curva del log de la concentracin utilizada de los nuevos esteroides contra la actividad de la 17-HSD. Resultados. Mostraron que los esteroides S-CL y TS3 de acuerdo a la curva IC50 de 1.18x10 -11 M 0.0076 y 2.6 x10-11 M 0.0038 respectivamente. Conclusin. Los esteroides S-CL y T-S3 poseen actividad inhibitoria de la enzima 17-HSD, para la produccin de T y DHT. Palabras clave. Ruta sinttica de la androstendiona y T, prstata, 17-HSD, DHT, 5-diona.

Introduccin
Los andrgenos juegan un rol crucial en el desarrollo, crecimiento y mantenimiento de la prstata. Estos estn involucrados frecuentemente en enfermedades, especialmente hiperplasia prosttica benigna y el cncer de prstata. Uno de los objetivos para el tratamiento de estas enfermedades es la reduccin de niveles de andrgenos en las clulas prostticas. Ahora bien, el cncer de prstata es el cncer ms frecuentemente diagnosticado y es la segunda causa de muerte en 1 norteamerica. La testosterona (T) juega un rol importante en testculos y msculos; por otro lado la dihidrotestosterona (DHT) es crucial para el desarrollo, funcin y patologa de la prstata (hiperplasia y cncer). Este tejido prosttico produce DHT a partir de la reduccin de la T circulante, tal conversin es llevada a cabo por la enzima 5-reductasa presente en la prstata. La T o DHT activan al receptor andrognico (AR) el cual interacta con elementos que responden al andrgeno en el ADN para regular el gen que lleva a cabo la transcripcin.2 La T se convierte tambin en androstendiona (4-diona), una reaccin que es catalizada por la enzima 17hidroxilasa presente en los tejidos andrgeno dependientes y en la corteza suprarrenal3. Se ha informado de la existencia de 15 isoenzimas de 17hidroxilasa (17- HSD)3. Es evidente, que muchas de estas enzimas estn asociadas con funciones en la produccin de esteroides sexuales. La 17- HSD subtipo 15 es una enzima que

2 est involucrada en la formacin de andrgenos activos en la prstata.3 La androstendiona (4-diona) se convierte a 5-androtandiona (5-diona) por la enzima 5-reductasa presente en la prstata y posteriormente transformada a DHT por la 17- HSD4. Despus de la castracin qumica que es uno de los tratamientos ms utilizados contra el cncer de prstata, el esteroide 4-diona ha sido implicado como una fuente de DHT en el tejido de la prstata. La presencia de otras enzimas esteroidognicas en la prstata lleva a la 4-diona, la cual fue utilizada como precursor. Los estudios se llevaron a cabo utilizando prstata humana como fuente de la enzima 17-HSD.

Material y mtodos
Material Se utiliz 4-diona [H3] con actividad especfica de 90 Ci/mmol suministrados por Perkin Elmer Life. Los esteroides, TS3 y S-CL fueron sintetizados por el grupo del Dr. Eugene Bratoeff de la Facultad de Qumica de la Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Por otro

Figura 1. Ruta metablica y biosinttica de DHT que no requiere la sntesis de T. dihidrotestosterona.

T, testosterona; DHT,

posibilidad de tener disponibles varios precursores de esteroides tales como la 4-diona, lo que sugiere la existencia de rutas adicionales que estn involucradas en la biosntesis de metabolitos de DHT.5 (Figura 1). En este estudio, se determin el efecto in vitro de dos nuevas molculas esteroidales, S-CL y T-S3, sobre la biosntesis de T y de DHT a partir de [H3]

lado, se obtuvo prstata humana de un individuo que muri por litiasis renal y que fue donada por el Depto. de Patologa del Hospital General de Mxico. La fraccin membranal se obtuvo despus de homogeneizar y centrifugar este tejido. El trabajo se realiz en el Laboratorio de Hormonas de la Universidad Autnoma Metropolitana Unidad Xochimilco. Esta fraccin membranal se almacen a -70C y fue

3 suspendida en un buffer (20 mM de fosfato de sodio, pH 6.5, con 0.32 M de sucrosa y 0.1 mM dititreitol (DTT) SigmaAldrich). Mtodos Determinacin de la actividad de la 17- HSD Para la determinacin de la actividad de la 17- HSD se prepararon dos series de tubos conteniendo: 4X10-8 M de 4-diona [H3] sin o con una cantidad creciente de cada uno de los esteroides a probar en concentraciones crecientes (1X10-111X10-7) M disueltos en 50 L de dimetl sulfxido (DMSO). A esta mezcla se le agreg un volumen de buffer de fosfatos 40 mM a pH 6.5 con 2 mM de NADPH, 1 mM DTT, suficiente para completar 1 mL. A c/u de los tubos excepto al blanco se le agregaron 40 L de la suspensin de prstata humana, obtenida como se dijo anteriormente. La reaccin se llev a cabo en un bao de incubacin (Julabo SW22, Equipar) con agitacin constante mantenido a una temperatura de 37 C, por duplicado. Extraccin y purificacin de esteroides formados de 4-diona los Asimismo se construy una curva del log de la concentracin utilizada de los nuevos esteroides contra la actividad de la 17-HSD, con la finalidad de determinar la concentracin de stos que fuese capaz de inhibir la actividad de la 17-HSD en un 50 % (IC50). La construccin de esta curva se llevo a cabo a travs del programa computacional sigmaplot 2001 7.0. una lmpara de UV (254 nm), y se visualizaron los estndares T y 4-diona; el estndar 5-diona se revel por la reaccin de Zimmermann la cual se realiza al aplicar una mezcla de solucin de 2% de m-dinitrobenceno en etanol absoluto y una solucin 2.5 N de hidrxido de potasio.6 Para el revelado de la DHT se utiliz una solucin de cido fosfomolibdico al 8%. Uno de los blancos sin tejido se utiliz para determinar la eficiencia de extraccin con acetato de etilo; para ello el solvente se introdujo en un vial de conteo y se evapor. Ms tarde se le agregaron 10 mL de lquido de centelleo y se contaron en un Liquid Scintillation Analyzer Tri-carb 2100 TR Packard. La radioactividad de las placas se monitore utilizando un contador de placas cromatogrficas (BIOSCAN AR 2000). La actividad 17- HSD fue calculada a partir de la formacin de T, de DHT y de 5-diona formados, tomando en consideracin la recuperacin y la actividad especfica de [H3] 4-diona.

La mezcla de reaccin se extrajo con 1 mL de acetato de etilo 5X. El acetato de etilo fue evaporado ms tarde bajo una corriente de nitrgeno y el residuo fue colocado en 50 L de metanol (grado reactivo). El extracto se aplic en una placa cromatogrfica (20x20); en la cual a los lados se colocaron como estndares: T, DHT, 4-Diona y 5-diona. La placa cromatogrfica se desarroll en una mezcla cloroformo-acetona= 9:1 por 3 veces y posteriormente secada al medio ambiente. La placa se expuso a

Resultados
De acuerdo al monitoreo de las placas cromatogrficas se obtuvieron los siguientes cromatogramas del blanco, control y las muestras ms significativas de los dos diferentes esteroides respectivamente:

Cromatograma 3. Cromatograma de la actividad del esteroide S-CL en una concentracin 10 pM. Donde se observa en 160 mm 5-diona y la T y DHT estn prcticamente ausentes.

Cromatograma 1. Cromatograma del blanco obtenido, donde en la posicin 160 mm se observa el percusor 4-diona.

Cromatograma 4. Cromatograma de la actividad del esteroide T-S3 en una concentracin 1 nM. Donde se observa en 110 mm T, en 120mm DHT y en 160 mm 5-diona.

Cromatograma 2. Cromatograma control donde se observa en 90 mm T, en 110mm DHT y en 160 mm 5-diona.

Como resultado de la curva del log de la concentracin utilizada de los nuevos esteroides contra la actividad de la 17HSD se obtuvo la grfica 1 y a partir de esta se calcul el IC50 a travs de la interpolacin de los datos en la curva al 50% de inhibicin de cada esteroide (Tabla 1).

5 Esteroide S-CL
O H H O H O Cl

IC50

1.18x10 -11 M 0.0076

N HC 3 N

CH3

T-S3
N N N H H O H H O CH3 O

Cromatograma 5. Cromatograma control de la repeticin del experimento. Donde en la posicin 4 160 mm se observa el percusor -diona.

CH3

2.6 x10-11 M 0.0038

Tabla 1. Estructura qumica de los esteroides con posible actividad inhibitoria y su respsctivo IC50.

Cromatograma 6. Cromatograma de la actividad del esteroide T-S3 en una concentracin 10 nM en la repeticin del experimento. Donde en 140 mm se encuentra DHT y en 170 mm 5-diona.

Grfica 1. Curva log de la concentracin utilizada de los esteroides vs la actividad de la 17- HSD. Donde los tringulos () representan el esteroide T-S3 y los cuadrados () es el esteroide S-CL.

Se realiz nuevamente el experimento, obteniendo como resultado los cromatogramas 5, 6 y 7. Al obtener estos resultados no se procedi a construir la curva de log de la concentracin utilizada de los nuevos esteroides contra la actividad de la 17-HSD, debido a que no se presento dicha actividad.

Cromatograma 7. Cromatograma de la actividad del esteroide S-CL en una concentracin 50 nM en la repeticin del experimento. Donde en 140 mm se encuentra DHT y en 160 mm 5-diona.

Discusin y conclusiones
Conforme a los resultados obtenidos a partir del cromatogramas 1, se destaca que no hay produccin de T, DHT y 5diona, solo se observa el precursor. En el cromatograma 2 correspondiente al control se aprecia la actividad de los tres compuestos anteriores, interpretando que la suspensin que contena el tejido prosttico, inclua la 17-HSD y que consecuentemente mostr su actividad, tal como lo citan en sus estudios Geissler7 y Dufort8 respecto a la ruta sinttica de tales compuestos a travs de la enzima 17-HSD. Sin embargo al adicionar los esteroides S-CL y T-S3 en las diferentes concentraciones con las que se dirigi el estudio, se observ una inhibicin en la produccin de T y consecuentemente de DHT, al no aparecer su pico en el cromatograma, as como la inexistencia del compuesto de acuerdo a su factor de retencin (Rf) en la placa cromatogrfica; por otro lado la 5-diona no mostr este fenmeno de inhibicin. Este fenmeno lo confirma la figura 1, al interpretar que a mayor concentracin de los esteroides S-CL y T-S3 mayor inhibicin exista. A travs de la figura 1 tambin se calcul la IC50 la cual nos lleva a conocer la concentracin de esteroide suficiente para inhibir la actividad de la 17-HSD al 50%. La capacidad de inhibicin de S-CL y TS3 sugerimos que es debida a la similitud estructural a la 4-diona, lo que provoca una inhibicin de tipo competitiva. Al realizarse nuevamente el experimento se observaron resultados diferentes a los arrojados anteriormente por lo que se supuso una desviacin del mtodo en algn punto, sin embargo se descartaron,

problemas de analista o de equipos. Por lo que al final se cay en la cuenta de que la enzima 17-HSD contenida en la fraccin de prstata humana era muy termolbil, puesto que al realizar por primera vez el experimento, esta se descongelo y se volvi a congelar al finalizar el experimento, por tanto, cuando se inici por segunda vez el experimento y se volvi a descongelar la suspensin prosttica la 17-HSD se piensa que se descompuso por tales cambios de temperatura; a consecuencia de este hecho, no existi actividad de la 17-HSD como lo demuestran los cromatogramas 5, 6 y 7. A pesar de que no existi actividad de la 17-HSD respecto a la produccin de T, los cromatogramas 6 y 7 mostraron el pico de la DHT y un aumento en la actividad de la 5-diona lo que sugiere actividad por medio de otra ruta sinttica5. Donde de acuerdo a la figura 1 a partir de la 4-diona se produjo 5-diona a travs de la 5-reductasa y a partir de esta se sintetizo DHT por la 17-HSD, lo que se sugiere que la 17-HSD posee dos isoformas, en la cual la 17-HSD que acta de 4-diona a T es ms termolbil que la que acta por la otra va antes mencionada. Cabe sealar que no se encontraron reportes acerca de este hecho. En conclusin se demostr en este estudio que los esteroides S-CL y T-S3 poseen actividad inhibitoria de la enzima 17-HSD, para la produccin de T y DHT lo que podra contribuir al tratamiento del cncer de prstata y la hiperplasia prosttica benigna, obviamente acompaado por otros tipos de estudios como pruebas in vivo que reafirmen esta

7 actividad de tipo inhibitoria de dichos compuestos.

Referencias
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