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Marilena Meira
Macromolcula
Massa molecular elevada Unidades de repetio polmero Sintticos: Policarbonato, Poliuretano, Policloreto de vinila (PVC), Poliestireno, Polipropileno, Polietileno tereftalato (PET), etc. Naturais: Polissacardeos, Protenas, cidos nuclicos, Borracha natural, etc.
Polissacardeos
So polmeros de unidades de monossacardeos. A celulose formada por unidades de betaglicose:
Peptdeo
Pepitdeo: condensao de 2 a 100 aminocidos atravs de ligaes peptdicas.
AMINOCIDOS
Protenas
Protena: condensao de um grande nmero de alfa-aminocidos atravs de ligaes peptdicas. Peso molecular: 5.000 a 1.000.000 Da.
A: Primria: seqncia linear de aminocidos. B: Secundria: arranjo espacial, aminocidos prximos. C: Terciria: arranjo espacial, aminocidos distantes. D: Quaternria: 2 ou mais cadeias de polipeptdeos.
Hlice alfa
Folha-beta
Estrutura terciria
HISTRICO
1946: F. Bloch e E. Purcell (Prmio Nobel de Fsica de 1952). Dcada de 50. RMN ambiente qumico. 1H. Baixa sensibilidade.
HISTRICO
1966: Ernst e Andrew: Tcnica de pulsos e transformada de Fourier (TF). Aumento da sensibilidade da tcnica. Espectros acumulados.
HISTRICO
1991: R. Ernst Prmio Nobel de Qumica: Desenvolvimento da RMN multidimensional. 1998: Kurt Wthrich - TROSY 2002: Kurt Wthrich Prmio Nobel de Qumica: Estruturas tridimensionais de macromolculas biolgicas em soluo por RMN.
TEORIA RMN
Espectroscopia de absoro. Campo magntico. Radiao eletromagntica: Radiofreqncia. Caractersticas estruturais da amostra. Determinados ncleos.
B0
O nmero de spin pode assumir os valores: 0, 1/2, 1, 3/2, 2, 5/2, 3, 7/2, 4, 9/2, 5, 11/2, 6.
Para spin = :
+1/2 -1/2
B0
orientados
aleatoriamente.
orientados paralelo
ou anti-paralelo
Movimento de precesso
L
B0
Induo de Transio
Transio Aplicao de RF adequada Ou seja se 1 =L Ressonncia
RF
B0
Condio de Ressonncia
Para um ncleo isolado de spin 1= L = . B0 2 E = h. E = .h.B0 2 h. = .h.B0 2 = .B0 2
Aplicao de RF
Aplicao de RF: B1 perpendicular ao campo B0. Pulso de RF de 90 M na direo do plano xy. Magnetizao transversal.
Relaxao
Quando o pulso de RF cessa: Magnetizao eixo z com Mz=M0. Razo da populao estado de equilbrio. Spin-spin spin-rede
Relaxao transversal Relaxao longitudinal Energia do sistema no muda Troca energia com a rede
T1 e T2
T1 magnetizao longitudinal recupera 63% da sua magnitude inicial paralela a B0. T2 magnetizao transversal atinge 37% da sua magnitude aps a excitao inicial.
T2 e largura do pico
T2 curto Pico largo
C - H.
C=O
Aumenta massa molecular problemas Muitos picos, sobreposio de sinais, sinais largos. Protenas de alto peso molecular: perda de sinal.
menor mobilidade
menor T2
sinal
Marcao isotpica
Protenas sintetizadas a partir de aminocidos marcados. Protenas biosintetizadas por bactrias crescidas em meio marcado. Exemplo: nica fonte de C:glicose-13C nica fonte de N: on amnio-15N
HSQC desacoplado
TROSY-HSQC
15N
N
13C 1H
RMN multidimensional
Maior dimensionalidade requerida quando: Maior nmero de picos Sobreposio de sinais. RMN Multidimensional: Resolve sobreposio de sinais. Automatizao de parmetros como o efeito Overhauser nuclear (NOE), o acoplamento spin-spin.
Visualizaes do espectro 3D
Visualizaes do espectro 3D
Representao 3D Projeo no plano H-C inferior
15N
15N
1H
13C
Clculo estrutural
Deslocamento qumico: Ambiente qumico NOE: Distncias internucleares Constante de acoplamento: ngulos de toro.
COSY COSY: identifica multipletos acoplados NH com HA; HA com HB. TOCSY: identifica sistemas de spins de aminocidos. NOESY: H espacialmente prximos. Conecta seqncia de sistemas de spins.
COSY de protena
COSY: Identifica multipletos acoplados
TOCSY de peptdeo
Constante de acoplamento
Constantes de acoplamento
A B
15N-NOESY-HSQC
(3D)
NOESY
15N
H
15N
15N-NOESY-HSQC
(3D) :
1H-15N1H-15N-HSQC
HSQC
1H-15N-
HSQC
HMBC
HMBC: correlaciona hidrognios com carbonos atravs de J3 e J2.
15N
13C 1H
Plano H - CO
N CA H
55
13C A
60
65
8,0
7,5
N H CA
60
13C
65
10,5 10,0
9,5
9,0
1H
8,5
8,0
7,5
15N
13C 1H
Para cada NH 2 CA e 2 CB
40
Em alguns casos os 4 picos no aparecem
174 176
CO
1H-15N
HSQC-TOCSY
15N-NOESY-HSQC
(3D)
15N
H
15N
Plano HN - NOESY
13C-NOESY-HSQC
Cada strip contm NOEs de um grupo CH para todos os outros H espacialmente prximos 2,0
(3D)
4,0 6,0
8,0 10,0
NOESY
1H 13C
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
ESPECTRMETRO BRUKER
XWIN-NMR verso 2.5 o programa de pulsos e parmetros dos espectrmetros Bruker. Bio Tool um pacote adicional: Contm vrios experimentos 3D com a seqncia de pulsos e parmetros comumente usados em anlise de protenas, DNA e RNA. A biblioteca de experimentos atualizada freqentemente pela BRUKER.
ESPECTRMETRO VARIAN
VNMRJ o software da Varian que controla o espectrmetro de RMN adequado para anlises multidimensionais. Biopack um pacote adicional ao VNMRJ tendo um conjunto de seqncias de pulsos, macros de calibraes e parmetros para anlise de protenas, DNA e RNA. atualizado com freqncia pela Varian.
Experimentos Biopack
Experimentos Biopack