Fajardo-Ochoa y Col

2011 Volumen 3, No.
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Revista Cientfica de la Universidad Autnoma de Coahuila
INMOVILIZACIN DE CLULAS Y ENZIMAS

Ral Fajardo-Ochoa , Juan Alberto Osuna-Castro , Carlos VillaVelzquez-Mendoza , Pilar Escalante-Minakata2 y Vrani Ibarra-Junquera3* Universidad de Colima, Facultad de Ciencias Biolgicas y Agropecuarias, km 40 autopista ColimaManzanillo, Tecomn, Colima, MEXICO. 2 Universidad de Colima Facultad de Ingeniera Civil, km 9 carretera Colima-Coquimatln, Coquimatln, Colima, MEXICO, CP 28400. 3 Universidad de Colima, Facultad de Ciencias Qumicas, km 9 carretera Colima-Coquimatln, Coquimatln, Colima, MEXICO, CP 28400. *Correo electrnico: vij@ucol.mx, ibarrajunquera.vrani@gmail.com INTRODUCCIN El trmino inmovilizacin de clulas y enzimas se refiere a clulas y enzimas fsicamente confinadas o localizadas en una cierta regin definida en el espacio reteniendo sus propiedades y actividades catalticas. Asimismo, dependiendo del tipo de inmovilizacin tanto las clulas como las enzimas pueden ser inmovilizadas de forma permanente o temporal para ser utilizadas repetida y continuamente en diversos proceso qumicos. Por razones tcnicas y econmicas la mayora de los procesos qumicos catalizados por enzimas o llevados a cabo por clulas requieren su reutilizacin o el continuo uso de biocatalizadores durante largos periodos de tiempo. Bajo esta perspectiva, la inmovilizacin debera ser definida como una tcnica capaz de reutilizar o dar uso continuo de biocatalizadores y clulas. Por lo tanto, la sencillez y el bajo costo de los mtodos de inmovilizacin juegan un papel fundamental en la seleccin de protocolos de inmovilizacin. Es por ello que por medio de la inmovilizacin es posible no solo controlar la ubicacin de las clulas o las enzimas sino tambin modificar sus propiedades selectivamente. En este artculo se presenta una breve revisin del estado del arte de la inmovilizacin de clulas y enzimas, haciendo nfasis en los distintos mtodos de inmovilizacin y cmo inciden en las propiedades de las enzimas y clulas inmovilizadas. De igual forma, se discuten aspectos relacionados con la seleccin de soportes o matrices durante el proceso de inmovilizacin. 1. INMOVILIZACIN DE CLULAS
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La investigacin sobre inmovilizacin de organismos unicelulares ha generado gran inters en la comunidad cientfica, debido a sus grandes ventajas tcnicas y econmicas respecto a la fermentacin tradicional. Entre las principales ventajas que presentan los sistemas biotecnolgicos que utilizan clulas inmovilizadas se encuentra su facilidad para el manejo de una mayor densidad celular comparado con los procesos tradicionales, un mejor control en sistemas continuos y la posible recuperacin de la biomasa para su posterior reutilizacin. En general, los materiales para inmovilizar clulas deben cumplir importantes requisitos como: ser grado alimenticio (segn sea el caso), bajo costo, disponibilidad, no degradables y aptos para condiciones de pH y temperatura bajas (Bakoyianis et al., 1992 y 1996; Bardi y Koutinas, 1994; Fumi et al., 1987; Shimobayashi y Tominaga, 1986). Los mtodos de inmovilizacin de clulas ms usados son la autofloculacin (Verstrepen y Klis, 2006; Stewart y Russel, 1986), la adsorcin sobre soportes (Bardi et al., 1996) y la incorporacin de levaduras en matrices slidas. La floculacin es un proceso que muchas cepas sufren de manera natural (Stewart y Russel, 1986). La adsorcin consiste en la adhesin de las levaduras a la superficie externa de un soporte como es el caso del gluten (Stewart y Russel, 1986) o de la DEAE-Celulosa (Lommi y Ahvenaimen, 1990). La incorporacin de clulas a matrices slidas se realiza por el atrapamiento de las mismas en el seno de un material polimrico. Las matrices ms adecuadas son polmeros naturales como el alginato, el carragenato y el agar ya que polimerizan en condiciones muy suaves aunque tambin se pueden usar matrices sintticas como poliacrilamida y poliuretano (Groboillot et al., 1994). El atrapamiento de levaduras en matrices slidas puede realizarse por difusin de las clulas en matrices slidas sintetizadas previamente (Baron y Willaert, 2004) o por formacin de las matrices alrededor de las clulas (Ramakrishna y Pakasham, 1999). Este mtodo de inmovilizacin permite conseguir grandes concentraciones de biomasa (Stewart y Russel, 1986) con el uso de reactores fluidizados (Verbelen et al., 2006). Adems se pueden inmovilizar en matrices independientes clulas que no podran coexistir en contacto directo debido al efecto killer
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(Prez e et al., 2001). No obstante, al igual que los otros mtodos de inmovilizacin presenta desventajas. Las ms importantes son los posibles problemas de difusin de nutrientes y productos a travs de la matriz porosa y la pobre resistencia mecnica de los soportes slidos (Verbelen et al., 2006). La inmovilizacin de levaduras en perlas de alginato y poliacrilamida se ha utilizado con xito en la fermentacin de vino blanco y en la produccin de etanol (Cachon y Divies, 2001). Debido a cambios en la composicin de las clulas por interaccin con el soporte de alginato, estos catalizadores se vuelven ms activos y se observa que la fermentacin ocurre a mayor velocidad respecto a los casos en los que se emplean levaduras libres (Galazzo y Bailey, 1990). Otra ventaja importante de estos sistemas inmovilizados es que el soporte protege la levadura de la accin de inhibidores, metales pesados, fenoles y temperaturas extremas. Adems, a diferencia de los flculos de biomasa, estos slidos al ser ms sencillos de manejar, permiten un mejor control de la actividad cataltica en reactores de tipo lote y continuos. La implementacin de sistemas con levaduras inmovilizadas ha sido de especial inters para el rea de los vinos espumosos. La forma tradicional de preparacin de estos vinos implica el uso de levaduras libres y la posterior eliminacin de stas por medio del dgorgement, esto es mediante congelacin (-25C) del cuello de la botella donde las levaduras se acumulan por sedimentacin durante el remuage. Este proceso lento y costoso puede ser sustituido mediante el uso de levaduras inmovilizadas en perlas de alginato sin que la cintica del proceso se vea afectada consiguindose las mismas propiedades organolpticas que los vinos producidos de manera tradicional (Yokotsuka et al., 1997). En el ao 2001 el Institute Oenologique des Vins de Champange (IOC) report la fabricacin de tres millones de botellas mediante el uso de este tipo de tecnologa (Divies y Chacon, 2005). Tambin se han reportado estudios en los que se usan estos dispositivos para la produccin de sidra espumosa y vinos de pia (Divies y Deschamps, 1986). Cabe destacar que combinando esta tecnologa con el uso de reactores de alta presin y reactores de flujo continuo ha sido posible la produccin a gran escala de vinos espumosos con composiciones y propiedades sensoriales similares a los fabricados tradicionalmente en botellas con levaduras libres (Iconomopoulou et al., 2002) En el campo de los vinos espumosos tambin se ha implementado el uso de membranas acopladas al tapn de la botella que permiten el contacto entre el vino y las levaduras durante la fermentacin final (Lemonnier, 1992). Esta tcnica alarga los tiempos de fermentacin, pero ofrece la posibilidad de realizar el dgorgement de manera ms sencilla sin necesidad de enfriar la botella. Otro proceso de inters en el que la inmovilizacin de clulas exhibe gran potencial es en la fermentacin malolctica. Este proceso es esencial en la preparacin de muchos vinos, ya que la transformacin de cido malolctico en cido lctico y anhdrido carbnico reduce la acidez y mejora la calidad de los mostos. Esta fermentacin es difcil de controlar mediante las tcnicas de fabricacin tradicionales, ya que las bacterias que catalizan dicha fermentacin, principalmente Oenococcus oeni, son especialmente sensibles a la temperatura, pH y concentracin de SO2. En 1991, se report que el O. oeni inmovilizado en perlas de alginato se puede adaptar fcilmente a procesos en continuo sin que se observe prdida de actividad en procesos de fermentacin malolctica (Fleet et al., 1991). Sin embargo, tambin se han reportado resultados en los que s se observa una prdida importante de actividad en sistemas parecidos (Naouri et al., 1991). Con base en lo presentado anteriormente es posible afirmar que la produccin de vinos espumosos se ha beneficiado con el uso de tecnologas que involucran la inmovilizacin de clulas. No obstante, es de esperar que con un mejor entendimiento de los procesos de fermentacin y la fisiologa de los microorganismos inmovilizados, sea posible implementar esta tecnologa a otros procesos de produccin. 1.1 Problemas con la inmovilizacin de clulas Si bien, el uso de clulas inmovilizadas en matrices slidas ha permitido la implementacin de procesos de fermentacin en sistemas de flujo continuo. Existen numerosos problemas que se presentan a nivel industrial, los cuales se describen a continuacin. Los sistemas floculados presentan un difcil manejo debido a que la floculacin depende de factores como el pH, la concentracin de Ca2+, temperatura y la agitacin (Verstrepen et al., 2003; Sampermans et al., 2005). Adems, cada cepa de levadura presenta un comportamiento diferente (Jin y Speers, 1999).
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Otro caso, es el uso de membranas microporosas como filtros para retener las levaduras en el reactor, lo cual resulta muy costoso cuando se emplean reactores continuos. El mayor problema que presenta esta tcnica es el bloqueo que eventualmente sufren los poros de la membrana debido a partculas o a las mismas levaduras (Lebeau et al., 1998). Por otro lado, la inmovilizacin de clulas por adsorcin sobre la superficie de materiales es fcil de conseguir, pero al ser la adsorcin un fenmeno fundamentalmente electrosttico, durante los procesos en continuo, especialmente por efecto de la agitacin, las clulas se liberan del soporte. Adems, por este mtodo es difcil inmovilizar grandes cantidades de biomasa (Verbelen et al., 2006). 1.2 Otros mtodos de inmovilizacin de clulas para procesos de fermentacin Si bien, existe una problemtica alrededor del uso de clulas inmovilizadas, hoy en da se han enfocado esfuerzos en el desarrollo de rutas novedosas que permitan el desarrollo de sistemas inmovilizados mediante el uso de materiales porosos diferentes a los polmeros de origen natural que se han usado hasta ahora. Muchos de estos slidos porosos podran encontrar un lugar importante en los procesos de produccin de vinos y fermentaciones alcohlicas en general. Las zeolitas y los diferentes zeotipos son materiales microporosos muy usados en diversos procesos catalticos, prueba de ello es su extensa aplicacin (Corma, 1995). Debido a su tamao de poro pequeo, no sera posible inmovilizar levaduras dentro de sus cavidades. Sin embargo, el uso de membranas zeolticas s podra ser de gran utilidad en procesos de fermentacin en los que se requiere eliminar el etanol del reactor de forma selectiva (Bowen et al., 2003). Para tal aplicacin se podran emplear materiales zeolticos hidrofbicos convencionales como la zeolita beta (Camblor et al., 1996) o materiales hbridos orgnicos-inorgnicos como los metilaluminofosfatos-alfa y metilaluminofosfatosbeta (Maeda et al., 1997). Cabe mencionar que la produccin de membranas zeolticas compactas y con propiedades mecnicas adecuadas no es sencilla y hoy en da sigue siendo un reto para muchos grupos de investigacin. Los materiales mesoporosos templados mediante aglomeraciones micelares (Taguchi y Schuth, 2005), aunque siguen sin presentar el tamao de poro adecuado para la inmovilizacin de levaduras, s permiten la inmovilizacin de enzimas (Yiu y Wright, 2005). Esto hace que estos slidos tengan un inters especial en la industria vincola ya que mediante el uso de enzimas podran modificarse la naturaleza de algunas sustancias responsables de aromas y sabores caractersticos del vino consiguindose productos con propiedades organolpticas diferentes. Los materiales mesoporosos ms adecuados para la inmovilizacin de enzimas seran los slidos del tipo SBA-15 debido a su gran tamao de poro (Zhao et al., 1998). La inmovilizacin de las enzimas se conseguira por difusin de las mismas en los poros del slido previamente funcionalizado con molculas que anclaran la enzima a la pared del material (Hartmann, 2005). Slidos como los que se proponen aqu podran usarse en procesos en continuo o en sistemas fluidizados. La inmovilizacin de levaduras requiere de materiales macroporosos con radios del orden de algunas micras. Estos materiales pueden sintetizarse mediante dos tcnicas: La primera hace uso de esferas sintetizadas por polimerizacin en microemulsin, que posteriormente son usadas como moldes que se recubren con precursores de xidos, metales u otros materiales (Grochowicz et al., 2008; Marrero-Lpez et al., 2008). Por medio del proceso de calcinacin de las esferas es posible sintetizar materiales macroporosos de cavidades esfricas regulares conectados por ventanas de menor tamao. Mediante esta tcnica sera posible sintetizar bioslidos de gran resistencia mecnica en los que no habra grandes problemas de difusin de reactivos o productos. El paso ms complejo de sntesis sera la inoculacin de las clulas en el interior del slido, ya que aunque los poros pueden ser muy grandes, las levaduras deben difundir por las ventanas que comunican los poros. La estructura 3D de canales que estos materiales exhiben podra resultar de inters para la fabricacin de membranas para la retencin de levaduras en reactores en continuo. El segundo mtodo que posee gran potencial es el uso de materiales porosos sintetizados por congelacin unidireccional y posterior liofilizacin (Choi et al., 2009). Esta tcnica de preparacin de slidos macroporosos, al ser reciente, es la menos explorada en el campo de la catlisis. Este mtodo implica la congelacin de una solucin de partculas que pueden ser polimricas, silceas, metlicas etc. a temperatura de nitrgeno lquido de manera unidireccional y a velocidad controlada. El proceso que parece complejo, es en realidad un mtodo sencillo de fabricacin de materiales macroporosos que, adems, permite la incorporacin de especies biolgicas in-situ en la matriz durante la sntesis del material debido a que no se requiere calcinacin de ningn molde orgnico. Para
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inmovilizar bacterias dentro de una matriz polimrica Gutirrez et al. (2007), partieron de una suspensin acuosa concentrada de bacterias E. coli protegidas con alginato de calcio y glucosa. Las cuales incorporaron a la suspensin alcohol polivinlico y la mezcla se transfiri a una jeringa de insulina. Esta se introdujo en un bao con nitrgeno lquido a velocidad controlada (5.9 mm/min) y posteriormente se liofiliz. Durante el proceso de congelacin unidireccional se producen frentes de congelacin perpendiculares a la direccin de inmersin en los que los cristales de hielo apartan las impurezas, que en este caso seran las bacterias y el alcohol polivinlico. Una vez eliminado el hielo por liofilizacin se obtiene una matriz porosa de alcohol polivinlico en la que quedan retenidas las bacterias. En este caso las bacterias se recubrieron con alginato-glucosa para protegerlas durante el proceso de congelacin criognica. Mtodos similares de proteccin deben usarse si se pretende inmovilizar sistemas biolgicos sensibles al proceso de congelacin. Otra ventaja de este mtodo es que se obtienen monolitos con la forma y geometra del recipiente que contiene la suspensin que se congela, en lugar de los clsicos polvos que dan como resultado los otros mtodos de inmovilizacin. Tambin es posible modular el tamao de poro al jugar con la relacin masa suspendida/agua de la suspensin a congelar y con la velocidad de inmersin. De ah que estos mtodos novedosos de inmovilizacin de clulas abran un abanico de posibilidades empleando matrices slidas de diversa naturaleza, y as de esta forma lograr disear sistemas de fermentacin que trabajen en reactores continuos. Asimismo, existen otros mtodos modernos que no requieren del uso de dispositivos inmovilizadores complejos. Uno de estos mtodos es el uso de catalizadores artificiales inertes, como los nanotubos de carbono, que inducen la floculacin de los micro-organismos. Utilizando nanotubos de carbono, clulas de Saccharomyces cerevisiae han sido inmovilizadas exitosamente por el mtodo de floculacin (T.A. Mamvura, 2010). Aunque esta tcnica aporta buenos resultados con respecto a la inmovilizacin, la sntesis selectiva de nanotubos de carbono sigue siendo costosa. Es comn que la inmovilizacin de levaduras y enzimas con los mtodos mencionados anteriormente enfrenten problemas tcnicos y cientficos. No obstante, es importante plasmar una visin sobre las expectativas y potencialidades que tienen estos materiales en el proceso de fermentacin alcohlica. Por lo tanto, surge la motivacin para realizar investigacin profunda y novedosa fundamentada en el hecho de que los recientes avances en la sntesis de micro y nano materiales porosos an no se han permeado al campo de la catlisis con levaduras. Por lo cual, se abren nuevos horizontes en el rea de investigacin y aplicacin de estos mtodos de inmovilizacin de clulas. 2. INMOVILIZACIN DE ENZIMAS
En la actualidad, la industria requiere gran cantidad de enzimas con el fin de obtener productos con mejores caractersticas y menor costo. Por ello, la implementacin de procedimientos que aumenten la estabilidad de las enzimas y permitan su reutilizacin ha sido por muchos aos el objetivo de diversos laboratorios alrededor del mundo. La preparacin y estabilizacin de enzimas ha sido un tema de estudio desde hace casi 50 aos (PiugMuset, 1964) y es de inters tanto cientfico como econmico. La inmovilizacin combina la actividad elevada y especfica de las biomolculas activas, como las enzimas o anticuerpos, con la estabilidad qumica y mecnica del soporte. Consiste en mantener la biomolcula unida o atrapada en un soporte fsico, conservando su actividad cataltica y permitiendo el flujo de sustratos y productos. Las enzimas pueden ser inmovilizadas en sustratos naturales y/o sintticos por medios qumicos (unindolas al sustrato mediante enlaces covalentes) o fsicos (fuerzas electrostticas o membranas), y pueden adems ser encapsuladas mecnicamente la adicin de agentes que formen una pelcula protectora alrededor de la enzima inmovilizada, permitiendo el paso de reactivos y productos de pequeo tamao, pero no de protenas (Heering et al., 2004; Wang y Caruso, 2005). Las enzimas inmovilizadas presentan varias ventajas sobre su contraparte en solucin. Permiten un uso continuo, reutilizacin y control de las concentraciones de protena empleada. Asimismo, es viable mejorar la estabilidad y actividad de la enzima en funcin del pH y la temperatura, adems, al ser inmovilizadas quedan protegidas ante enzimas proteolticas, aumentando as la eficiencia del sistema. Sin embargo, la inmovilizacin tambin puede presentar ciertas desventajas, por ejemplo, la actividad de la enzima puede verse afectada por el proceso de inmovilizacin, adems, la velocidad de reaccin puede estar limitada por la velocidad de difusin de sustratos y productos hacia dentro y fuera del sistema.
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2.1 Clasificacin de mtodos de inmovilizacin Los mtodos de inmovilizacin de enzimas se clasifican en dos rubros: mtodos reversibles y mtodos irreversibles (Gupta y Mattiasson, 1992). 2.1.1 Mtodos de Inmovilizacin Irreversibles El concepto de inmovilizacin irreversible implica el enlace del biocatalizador a un soporte de manera permanente, por lo cual el biocatalizador no puede ser liberado sin destruir o modificar su actividad biolgica o el soporte. Los procedimientos ms comunes de inmovilizacin irreversible son el enlace covalente, enlace cruzado, atrapamiento y micro encapsulado. a) Formacin de enlaces covalentes
La inmovilizacin de protenas por mtodos basados en la formacin de enlaces covalentes estn entre los ms usados. La ventaja de estos mtodos estriba en la naturaleza estable de los enlaces formados entre las enzimas y el soporte. De igual manera, las enzimas en este mtodo no son liberadas en la solucin en uso. Sin embargo, para lograr altos niveles de enlace, los residuos de aminocidos esenciales para la actividad cataltica no deben involucrar un enlace covalente con el soporte aunque esto puede resultar difcil de lograr en algunos casos. Los mtodos covalentes de inmovilizacin son empleados cuando existe un requerimiento estricto de ausencia de enzimas en el producto. Los mtodos de acoplamiento en general pueden dividirse en 2 clases: 1) activacin de la matriz o soporte por adicin de una funcin reactiva en un polmero y 2) modificacin del polmero para producir un grupo activado. Los procesos de activacin son comnmente diseados para generar grupos electroflicos en el soporte, el cual durante el acoplamiento reaccionan con los fuertes nuclefilos en las protenas. Los principios bsicos que controlan el acoplamiento covalente con matrices son anlogos con las usadas en la modificacin qumica de protenas. Las reacciones ms usadas involucran las siguientes cadenas de amino cidos: lisina (grupo amino), cistena (grupo tiol), y cidos asprtico y glutmico (grupo carboxilo). En este mtodo se enlaza covalentemente la enzima con un soporte insoluble natural o sinttico. El enlace se da entre algn grupo funcional reactivo de la enzima (amino, Cis-tiol, Tir-hidroxil o His-imidazol) y el soporte previamente activado, generalmente recubierto con grupos funcionales orgnicos en la superficie (Monocapas tiol autoensambladas, oro, CNBr-Sepharosa, etc.) (Figura 1). El seguimiento de la inmovilizacin se realiza cuantificando la concentracin de protena libre (generalmente por el mtodo de Bradford), y de la protena unida covalentemente al soporte (ej. cido bicinconnico). Las desventajas de este mtodo radican en el sitio del enlace, ya que puede modificarse el sitio activo o pueden ocurrir impedimentos estricos que reduzcan la actividad. Sin embargo, esto es poco probable y puede verse reducido al dirigir el enlace a sitios especficos y/o con una orientacin molecular definida (Wood et al., 1997; Heering et al., 2004). Adems, la unin por enlace covalente confiere a la enzima una inmovilizacin ms estable a cambios de pH y temperatura en el medio (Queiroz-Claret et al., 1997).
Soporte con grupos funcionales en la superficie
Enzima inmovilizada y orientada mediante enlace covalente
Sitio de enlace
Figura 1. Enzimas inmovilizadas en un soporte fsico por enlace covalente, las enzimas se encuentran orientadas espacialmente en el soporte
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b) Formacin de enlaces cruzados Con esta tcnica los soportes no son necesarios, ya que la inmovilizacin se da por un enlace directo entre enzimas, que puede ser mediado o no por un agente de unin. Generalmente se aade el agente de bajo peso molecular (ej. glutaraldehdo) a la enzima en solucin, uniendo covalentemente los grupos funcionales de las enzimas para formar agregados (Figura 2). Este mtodo tiene como ventaja su sencillez, sin embargo, es susceptible a cambios pequeos de pH y temperatura en las condiciones de operacin (Gdia-Casablancas, 2005).
Protena inmovilizada
Agente de unin
Figura 2. Enzimas inmovilizadas por enlaces cruzados (lneas negras). c) Atrapamiento
El mtodo de atrapamiento est basado en la oclusin de las enzimas dentro de una red polimrica que permite al sustrato y a los productos pasar a travs de ellos y retener las enzimas (ODriscoll, 1976). Este mtodo difiere de los mtodos de acoplamiento covalente descritos anteriormente, ya que las enzimas no estn enlazadas a la matriz o soporte. Existen diversos mtodos de atrapamiento de enzimas como el de gel (Bernfeld y Wan, 1963) o atrapamiento por fibras (Dinelli et al, 1976), microencapsulado (Wadiack y Carbonell, 1975) y por inclusin. El uso prctico de estos mtodos es limitado debido a la baja transferencia de masa a travs de las membranas o geles. Atrapamiento por inclusin. Con este mtodo la enzima queda atrapada dentro de una matriz de gel que permite una fcil difusin de productos. La matriz puede ser de origen natural o sinttico y de diversos materiales (Slica gel, poliacrilamida, agarosa, carregnatos, entre otros), y pueden clasificarse como geles hmedos, geles secos (xerogeles) o geles en aerosol (aerogeles) (Figura 3). En este mtodo las enzimas son colocadas en una solucin que posteriormente es gelificada (por temperatura o adicin de polimerizantes), quedando atrapadas dentro de la matriz (Figura 3A). En algunos casos el gel es sometido a un proceso de secado y molido, obteniendo as mayor rea de contacto entre la enzima y la solucin que contiene el sustrato (Figura 3B), dando como resultado esferas de 2 m con un tamao de poro de 35 7 (Mureseanu et al., 2005). Tambin es posible incrementar la capacidad de inmovilizacin de los geles al utilizar agentes estabilizadores (sorbitol, polietilenglicol, diferentes mono- o disacridos) y surfactantes (lecitina, lactosa, 3-sn-fosfatidilclorina, bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB)) (Mureseanu et al., 2005), o al aadir agentes policatinicos o polianinicos con carga contraria a la enzima o a regiones de la superficie de la misma como el poli(1-vinilimidazol) (PVI) y la poli(etilamina) (PEI) antes de la polimerizacin (Chen et al., 1998). La inclusin tiene la ventaja de prevenir el acceso de proteasas y mantener intacta la estructura de la protena, por lo que su actividad no se ve afectada. Sin embargo, el tamao de los poros no puede ser controlado, es difcil de escalar y reutilizar ya que el gel puede disolverse bajo ciertas condiciones o tras poco tiempo de uso, y un aumento en la cantidad de enzima cargada ms all de cierto punto no implica necesariamente un aumento de la actividad, debido a las limitantes de difusin que se podran presentar.
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Matriz de gel Protena inmovilizada incluida en la matriz
Matriz de gel reducida a pequeas esferas Protena incluida en las esferas
Figura 3. Enzimas inmovilizadas por inclusin dentro de una matriz de gel. A) gel hmedo. B) esferas del gel seco y triturado. Atrapamiento por micro-encapsulacin. El mtodo puede ser de dos tipos: por microencapsulacin en soportes porosos (con un dimetro de 2-50 nm), que posteriormente pueden ser recubiertos con un revestimiento nanocompuesto, atrapan la enzima en su interior y permiten el paso de sustratos y productos (Figura 4A); por microemulsin o liposomas, combinando la enzima con agentes emulsificantes y agitando para formar micelas que la protegen de medios cidos/alcalinos, proteasas y durante los periodos de almacenamiento (Chen et al., 1999; Kuiper et al., 2008) (Figura 4B). En la microencapsulacin las partculas porosas (esferas de slice con nanoporos, micropartculas de CaCO3, etc.) son puestas en suspensin con la enzima por un tiempo dado (aprox. 40 min), y la cantidad de enzima inmovilizada es monitoreada por espectroscopa. La desventaja radica en la inclusin de la enzima en el interior de la matriz, ya que generalmente queda atrapada en la superficie exterior y puede desprenderse paulatinamente debido al tipo de interacciones presentes o tras varios ciclos de uso (Volodkin et al., 2004). Sin embargo, esto se ve solucionado al controlar el tamao de poros de las esferas y al dar un tratamiento con un agente que encapsule la protena (ej. policloruro de dialilamonio, nanopartculas de slice, polihidrocloruro de alilamina o poliestirensulfonato) evitando su fuga y protegindola de proteasas, adems, este mtodo por su naturaleza de interaccin suave, permite una alta actividad y resistencia a cambios de pH y temperatura (Wang y Caruso, 2004; 2005). La microemulsin tiene la ventaja de ser muy sencilla, suficientemente porosa para permitir que la enzima funcione en un sistema en solucin, pero al mismo tiempo protegida del ambiente degradante. Tambin puede llevarse a cabo repetidas veces (emulsin mltiple), agregando agentes emulsificantes secundarios y espesantes (ej. goma arbiga, Tween 80, polestireno40-b-poili(isocianoalanina(2-thiophen-3-il-etil)amida)50, entre otros), para proporcionar una mayor proteccin. Adems, por la naturaleza de los reactivos utilizados, puede tener uso farmacolgico en la administracin oral de inmunoglobulinas. La desventaja de este mtodo radica en la prdida de actividad ante la inmovilidad de la protena al quedar atrapada en la interface agua/aceite, o al ser desnaturalizada por el esfuerzo de corte generado durante la preparacin de las micelas (Chen et al., 1999; Kuiper et al., 2008). El dimetro de las micelas puede variar de 100 a 250 nm, dependiendo de los emulsificantes utilizados, de la fluidez del copolmero y de la habilidad de la enzima para ser adsorbida en la membrana.
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Protena inmovilizada dentro de los poros
Soporte esfrico poroso
Protena inmovilizada dentro de la micela
Figura 4. Enzimas inmovilizadas por encapsulacin. A) microencapsulacin dentro de esferas porosas. B) Microemulsin en micelas.
2.1.2 Mtodos de Inmovilizacin Reversible En el mtodo de inmovilizacin reversible, las enzimas inmovilizadas pueden ser desprendidas del soporte bajo condiciones no extremas. El uso de mtodos reversibles para la inmovilizacin de enzimas es altamente atractivo, principalmente por razones econmicas debido a que el soporte puede regenerarse y recargarse con enzimas nuevas cuando la actividad enzimtica decae. Existen distintos mtodo de inmovilizacin reversible, que a continuacin se describen: Por adsorcin El mtodo de adsorcin emplea soportes orgnicos o inorgnicos que presentan un adsorbente activo (monocapastiol auto ensambladas, oro, entre otros) en los cuales, las enzimas son atradas y retenidas por medio de interacciones inicas o fuerzas dbiles (puentes de hidrgeno, fuerzas de Van der Waals, interacciones hidrofbicas) (Figura 5) (Wood et al., 1997). Este mtodo consiste en poner en contacto la enzima en solucin acuosa con un soporte adsorbente por un lapso de tiempo dado (2-48 h), para despus lavar el soporte y eliminar la enzima que no fue inmovilizada. Presenta la ventaja de mantener intacta la actividad de la enzima, ya que la unin es dbil y no afecta su conformacin, sin embargo, esta caracterstica hace que al mismo tiempo la unin sea reversible y sensible a cambios de pH y temperatura.
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Soporte con adsorbente activo cargado negativamente Protena inmovilizada con una regin cargada positivamente
Figura 5. Enzimas inmovilizadas en un soporte fsico. A) Por adsorcin, la regin positiva de la protena interacta con el soporte negativo. Adsorcin no especfica. El mtodo de inmovilizacin reversible ms simple es la adsorcin no especfica, el cual se basa en la adsorcin fsica o enlace inico (Messing, 1976; Woodward, 1985). En la adsorcin fsica las enzimas son unidas a la matriz a travs de puentes de hidrgeno, fuerzas de van der Waals, o interacciones hidrofbicas; mientras que enlaces inicos de enzimas son producidos a travs de uniones con sales. La naturaleza de las fuerzas involucradas en la inmovilizacin no covalente resulta en un proceso que puede ser reversible cambiando las condiciones que influyen en la resistencia de la interaccin (ej. pH, resistencia inica, temperatura y polaridad del solvente). La inmovilizacin por adsorcin es fcil de realizar y usualmente preserva la actividad cataltica de la enzima. Dichos mtodos son, por lo tanto, atractivamente econmicos, pero pueden presentar problemas como la liberacin de enzimas cuando las interacciones son relativamente dbiles. De igual forma es difcil encontrar condiciones bajo la cuales las enzimas permanecen enlazadas fuertemente y activas. Adsorcin hidrofbica. Otro mtodo es el uso de interacciones hidrofbicas, donde la adsorcin hidrofbica ha sido utilizada como un principio cromatogrfico por ms de 3 dcadas. Consiste en variables experimentales conocidas como el pH, concentracin de sales, y la temperatura (Porath, 1987). La resistencia de las interacciones radica en la hidrofobicidad del adsorbedor y de la protena. La hidrofobicidad del adsorbedor puede ser regulada por el grado de sustitucin del soporte y por el tamao de la molcula ligante hidrofbica. El xito de la inmovilizacin reversible de la -amilasa y amiloglucosidasa en soportes de hexilagarosa ha sido reportada (Caldwell et al 1976; Caldwell et al, 1982). Muchos otros ejemplos de enlace reversible con adsorbedores hidrofbicos ha sido tambin mostrado en la literatura. (Cashion, 1982; Yon, 1974; Dixon, 1979) Quelacin o enlace metlico. Sales de metales de transicin o hidrxidos depositados en la superficie de soportes orgnicos han podido ser enlazados gracias a la coordinacin de los grupos nucleoflicos en la matriz. Se utilizan principalmente sales de titanio y circonio, siendo este mtodo conocido como inmovilizacin por enlace metlico (Cabral, 1991; Cabral, 1986; Kennedy, 1985). La sal metlica o el hidrxido es precipitado en el soporte (ej. celulosa, quitina, acido algnico y bases de slice) por calentamiento o neutralizacin. Debido a los factores estricos es posible para la matriz ocupar todas las posiciones de coordinacin del metal, por lo tanto algunas de las posiciones permanecen libres para coordinarse con grupos de enzimas. La elusin de protenas enlazadas puede ser fcilmente lograda por competencia con ligantes solubles o disminuyendo el pH. El soporte es subsecuentemente regenerado lavndolo con un fuerte quelante como el cido etilendiaminotetraactico (EDTA). Estos soportes metlicos han sido utilizados ampliamente en cromatografa de protenas (Porath, 1992; Kagedal, 1998). Formacin de enlaces disulfuro. Estos mtodos son nicos, porque aunque se forma un enlace covalente estable entre la matriz y la enzima, es posible que se rompan los enlaces por medio de una reaccin utilizando agentes apropiados como el dithiotreitol (DTT) bajo suaves condiciones. Adems, debido a que la reactividad de los grupos
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tiol pueden ser modulados mediante la alteracin del pH, la actividad es alta para mtodos que usan enlaces disulfuro, con la condicin de que el apropiado tiol adsorbente con alta especificad sea utilizado (Carlsson, 1998). Puntos crticos. Cabe mencionar que aunque la inmovilizacin sea dirigida a un sitio y/o por un mtodo especfico, los enlaces qumicos y las interacciones entre la enzima y el soporte son complejos, y un mtodo de estabilizacin nico no asegura que las interacciones sean 100% propias del mtodo (Wood et al., 1997). La estabilidad de protenas globulares en una matriz generalmente depende de las interacciones electrostticas, interacciones estricas, cambios en el estado de hidratacin y reacomodos en la estructura de la protena (Volodkin et al., 2004), adems, dicha estabilidad es determinada por la combinacin de fuerzas electrostticas globales e interacciones locales especficas (Chen et al., 1998). Las fuerzas electrostticas globales tienen efecto directo en la adsorcin de la enzima, y el pH del medio altera el grado de influencia de estas fuerzas electrostticas, en especial la interaccin protena-sustrato (Volodkin et al., 2004). En lo que concierne a la mejora de la estabilidad de enzimas han surgido dos conceptos fundamentales, el primero indica que al restringir el movimiento de los segmentos en las cadenas de la protena se reduce la probabilidad de un cambio estructural irreversible; el segundo, un cambio similar irreversible en la estructura de la protena ocurre por el choque de los segmentos con la superficie en la que la enzima es inmovilizada o adsorbida (Chen et al., 1998). En algunos casos cuando se estabiliza una enzima por inmovilizacin, un cambio estructural irreversible puede ser prevenido restringiendo el movimiento de los segmentos al encerrar la enzima en cavidades estrechas (Chen et al., 1998). Un tamao de poro similar al tamao de la enzima es ms apropiado para obtener una buena actividad (Mureseanu et al., 2005). Un alto rendimiento en la estabilizacin puede ser logrado al aadir azcares a la enzima en solucin, ya que estos pueden contribuir a mantener la estructura tridimensional de la protena, lo que es crucial para su actividad, adems, el tipo y la cantidad de azcar utilizado en la estabilizacin es determinante para generar una alta actividad cataltica (Mureseanu et al., 2005). A continuacin se indican algunas enzimas que han sido inmovilizadas por distintos mtodos (Tabla 1). Tabla 1. Comparacin entre los distintos mtodos de inmovilizacin de enzimas
Enzima Cit C Lisozima Proteasa Catalasa HRP Gox An HRP Ar IgG de leche Gox An Lox Av GLyOx So Lipasa N Estearasa GB Lipasa MY Mtodo de inmovilizacin Caracterstica BMS BMS BMS BMS PDDA/SiNP CaCO3 poroso PS-PIAT Tween-80 Protena de soya Estearato de sacarosa Slica-Gel Slica-Gel/PVI Slica-Gel/PEI 0.5 mg/g 1 mg/g 1 mg/g Enzima inmovilizada Cantidad Porcentaje 231 mg/g 23.10% 397 mg/g 39.70% 203 mg/g 20.30% 75 mg/g 7.50% 75 mg/g 7.50% 1.5 pg/esfera % de actividad tras Tipo de proteccin la inmovilizacin Proteasas pH T Tiempo Referencias Wang y Caruso, 2005. 35% Tras 25 ciclos No Si Si 70% Tras 25 ciclos Si Si Si Volodkin et al ., 2004. 37% Si Si Si Si Si SI Si Si SI Si Si Si Si Si Kuiper et al ., 2008. Chen et al ., 1999.
Microencapsulacin
Microencapsulacin Microemulsin Microemulsin
58.70% 50% 56.10%
Inclusin
Chen et al ., 1998.
0.05% 20% Mureseanu et al ., 2005. Inclusin MTS 0.10% 46% 0.10% 20% Covalente 22% Wood et al ., 1997. Cit C Sc Adsorcin SAMS 78% Queiroz-Claret et al ., 1997. Fosfatasa 2A Covalente CNBr-Sepharosa 70-85% Casi 100% Neg Neg Si Enzimas: Citocromo C (Cit C), peroxidasa de rabano (HRP), glucosa oxidasa de Aspergillus niger (GOx An), peroxidasa de rbano de Amoracia rusticana (HRP Ar), inmunoglobulina G de leche (IgG), glucosa oxidasa de Aspergillus niger (GOx An) lactato oxidasa de Aerococcus viridans (LOx Av), glicolato oxidasa de Spinacia oleracea (GLyOx So), lipolasa de Thermomyces lanuginosus recombinante de Aspergillus oryzae (Lipolasa N), estearasa de Mucor miehei (Estearasa GB), lipasa MY de Candida cylindracea (Lipasa MY), citrocromo C de Saccharomyces cerevisiae (Cit C Sc) y fosfatasa 2A de Yarrowia lipolytica (Fosfatasa 2A). Abreviaciones: BMS, Silica con mesoporos bimodales; PDDA/SiNP, poli(dialilmetilamonio)/nanopartculas de slica; PS-PIAT, polestireno40-b-poili(isocianoalanina(2-thiophen-3-il-etil)amida)50; PVI, poli(1-vinilimidazol); PEI, poli(etilamina); MTS, micelas de silica templada; SAMS, monocapas tiol autoensambladas. -, no reportado; Neg, efecto negativo.
2.2 Seleccin de soportes Las caractersticas de las matrices o soportes son de gran importancia en la determinacin de la eficiencia del sistema de inmovilizacin de enzimas. Las propiedades ideales de un soporte incluyen la resistencia fsica a la compresin, hidrofilicidad, inertes entre las enzimas y sus derivados, biocompatibilidad, resistencia al ataque microbial y bajo costo (Trevan, 1980; Brodelius y Mosbach, 1987; Buchholz y Klein, 1987). Asimismo, los soportes pueden clasificarse en inorgnicos y orgnicos en funcin de su composicin qumica. En donde los soportes orgnicos pueden dividirse en polmeros naturales y sintticos (Cabral y Kennedy, 1991). Las caractersticas fsicas de los soportes (como el tamao medio de partcula, resistencia mecnica a la compresin, etc.) son de gran importancia en el comportamiento del sistema inmovilizador y determinar el tipo de
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reactor por usar bajo condiciones tcnicas. En particular, el parmetro de poro y el tamao de partcula establecern el total del rea superficial, por lo tanto la adecuada seleccin incidir en la capacidad de enlace de las enzimas. Los soportes no porosos muestran pocas limitaciones difusionales, pero presentan baja capacidad de carga. Por lo tanto, los soportes porosos son generalmente preferidos por su alta rea superficial que permite una alta carga de enzimas, as como porque las enzimas inmovilizadas quedan aisladas del medio ambiente. Se debe controlar la distribucin del tamao de poro en los soportes porosos para optimizar la capacidad y las propiedades de flujo. A pesar de las muchas ventajas de los soportes inorgnicos (ej. alta estabilidad ante degradacin fsica, qumica y microbial), la mayora de las aplicaciones industriales se realizan con soportes orgnicos. El carcter hidroflico es uno de los factores ms importantes que se utilizan para determinar el nivel de actividad de las enzimas inmovilizadas (Gemeiner, 1992). Una excelente matriz o soporte que ha sido utilizada es la agarosa. Adems de su alta porosidad que influye en su elevada captacin de protenas, tambin presenta un carcter hidroflico, fcil obtencin, ausencia de grupos con carga (el cual previene la adsorcin no especfica del sustrato y los productos) y es de bajo costo. Sin embargo, como la mayora de las enzimas son relativamente inestables, el costo del aislamiento es todava alto, y es tcnicamente difcil recuperar un enzima activa despus de una reaccin. CONCLUSIONES En conclusin, la inmovilizacin de clulas y enzimas es un proceso prometedor en la industria, con las ventajas y desventajas antes mencionadas, y bajo condiciones que pueden ser optimizadas en el laboratorio, pero sobre todo con un enorme campo de aplicacin. Este proceso puede ayudar a mejorar la produccin de alimentos, frmacos, qumicos y bioproductos de inters cientfico y econmico. REFERENCIAS Bakoyianis, V, Kanellaki, M., Kaliafas, A. y Koutinas, 1992. A. A. Low temperature wine making by immobilized cells on mineral Kissiris. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 40(7): 12931296. Bakoyianis, V. y Koutinas, A. A. 1996. A catalytic multistage fixed-bed tower bioreactor in an industrial-scale pilot plant for alcohol production. Biotechnology and Bioengineering. 49: 197203. Bardi, E. y Koutinas, A. A. 1994. Immobilization of yeast on delignified cellulosic material for room temperature and low temperature wine-making. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 42: 221226. Bardi, E. P., Bakoyianis, A., Kounitas, A y Kanellaki, M. 1996. Room temperature and low temperature wine making using yeasts immobilized on glutem pellets. Process Biochemistry. 31: 425-430. Baron, G.V. y Willaert, R. G. 2004. Cell Immobilization in preformed porous matrices. En: Nedovic V, Willaert R. (eds) Fundamentals of cell immobilization biotechnology. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands. pp 67-95. Bernfeld, P. y Wan, J. 1963. Antigens and enzymes made insoluble by entrapping them into lattices of polymers. Science 142: 678-679. synthetic
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Enzima inmovilizada y orientada mediante enlace covalente

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Figura 2. Enzimas inmovilizadas por enlaces cruzados (lneas negras). c) Atrapamiento

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Matriz de gel Protena inmovilizada incluida en la matriz

Matriz de gel reducida a pequeas esferas Protena incluida en las esferas

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Protena inmovilizada dentro de los poros

Soporte esfrico poroso

Protena inmovilizada dentro de la micela

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Microencapsulacin Microemulsin Microemulsin

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