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Laboratoire de Chimie Analytique Pharmaceutique- Genve Pharmaceutique-

La chromatographie en phase liquide LC / HPLC

LC-MS: processus analytique


Lanalyse de composs dans des matrices complexes ncessite une prparation de lchantillon, une sparation, une dtection et un traitement des donnes.
Prparation dchantillon Analyse des donnes

Sparation

Dtection

Slectivit
-Simplification et acclration de la prparation de lchantillon -Rduction du temps danalyse -Automatisation plus facile

Chromatographies
Liquide classique et micro-LC HPLC / CPL Partage Paires d'ions Papier Couche mince Autres... Exclusion Echanges de ligandes Adsorption Echanges d'ions Chirale Supercritique SFC / CPS Polaires Apolaires

Diagramme des phases P = f (T)


Etat supercritique Etat liquide

Chirale

Electrophorse capillaire CE / EC CZE MEKC Chirale

P
Etat solide

Gazeuse GC / CG Gaz - Liquide Gaz - Solide

Etat gazeux

Chirale

Choix du systme chromatographique


Analyte

Phase stationnaire

Phase mobile

Proprits physico-chimiques
Chromatographie: partition phase stationnaire phase mobile En fonction des proprits PHYSICO-CHIMIQUES des molcules et surtout, en LC - Volatilit / Polarit - Solubilit - Hydrophobe / Hydrophile - Acide / Base

Choix du type de LC
Echantillon

Chrom. dexclusion

MODE

Chrom. adsorption/partage

Hydrophiles
(protines, sucres)

Lipophiles
(polymres)

Chrom. dchange dions

Lipophiles
(sucres, phnols, ac. carboxyliques) ac.

polymre Support rigide poreux

phase normale X+ X(nombreuses substances pharmaceutiques)

Chrom. chirale
Isomres Enantiomres phase chirale

(acides amins)

Hydrophiles
(80% des sparations chromatographiques) chromatographiques)

colonne cationique

colonne anionique phase inverse

Chromatographie liquide haute performance


La chromatographie liquide haute performance (HPLC) est base sur le partage de lanalyte entre une phase liquide mobile et une phase stationnaire solide trs finement divise. Pour obtenir une dbit satisfaisant, il faut appliquer de trs fortes pressions (> 100 bars). Suivant la nature des analytes sparer, diverses phases stationnaires solides peuvent tre utilises: 1- chromatographie par change dions 2- chromatographie dexclusion 3- chromatographie de partage 4- chromatographie daffinit

Chromatographie liquide haute performance


1- Chromatographie par change dions: la phase stationnaire est ionique, lanalyte ionique (ionisable) interagit avec les groupes de charges opposes de la phase stationnaire. La phase mobile est une solution aqueuse de force ionique donne.

2- Chromatographie dexclusion: la phase stationnaire est un tamis molculaire, les analytes sont spars en fonction de leur taille (masse molculaire > 10000 g.mol-1).

Chromatographie liquide haute performance


3- Chromatographie de partage: a. la phase stationnaire est polaire (mode normal) et la phase mobile est un solvant non polaire. b. la phase stationnaire est apolaire (mode invers) et la phase mobile est un solvant polaire.

4- Chromatographie daffinit: la phase stationnaire contient un groupement pour lequel lanalyte a une affinit trs prononce. La phase mobile est une solution aqueuse.

Appareillage
Injecteur

Pompes Colonne Colonne

Phase Stationnaire

Rservoir de phase mobile

Phase Mobile

Four

Particules de silice

Dtecteur

Intgrateur Informatique

En dtail
INJECTEUR Volumes injects entre 10 et 100 l POMPE Pompes haute pression (de 50 350 bars) COLONNE Longueur et diamtre de la colonne PHASE STATIONNAIRE Phase normale ou phase inverse PHASE MOBILE Nature, polarit force luante DETECTEUR UV, RI, fluorimtrie, lectrochimie, rfractomtrie, spectromtrie de masse (MS), CHROMMATOGRAPHIE Procd: exclusion strique, adsorption, partage, change dions Mode isocratique ou mode gradient

Injecteur

Vanne de commutation 6 voies

Pompes
- Matriaux de fabrication chimiquement rsistants aux phases mobiles employes - Capacit de travailler haute pression - Pas / peu de pulsations (amortisseur de pulsations) - Dbit de 0 3 ml / min ( 10 ml / min : CLHP-prparative) - Reproductibilit << 1% - Faible volume mort (jusqu la colonne) - Possibilit de faire des gradients, du recyclage de solvants - Petit dbit de l'ordre du l de plus en plus utilis (HPLC capillaire)

Colonnes et connections
Standard

Connexion rapide

Colonne courte

Surface de la silice: les silanols


gminaux H isols OH OH OH O H vicinaux O

Si
Modification en surface

Si OH

Si

Si

Modification interne

Phase geffe: raction de silanisation


R X Si R
MONO-FONCTIONEL X = chloro ou alkoxy

R R X Si X
BI-FONCTIONEL R: groupement alkyl, aryl, etc.

X R X Si X
TRI-FONCTIONEL

R Si OH

R R HX Si O Si R R

Si R

Phases stationnaires

Phases stationnaires
EXCLUSION STERIQUE Gels organiques (polymres) ou supports rigides poreux (pores de taille comparable la taille des espces sparer). ADSORPTION Silice avec silanols la surface: interactions diple-diple ou liaisons hydognes Ordre daffinit pour les supports adsorbants: hydrocarbures saturs < hydrocarbures aromatiques < thers < ctones < alcools < amides < acides carboxyliques ECHANGE DIONS Rsine ou silice greffes avec groupements fonctionnels chargs (cations sulfonates SO3- ou anions ammonium quaternaires NR3+) Le mcanisme principal est un change dions par des liaisons lectrostatiques. PHASE NORMALE Silice greffe avec groupements polaires: silica, amino, nitro, nitrile, diol, cyano. Lchange est bas sur des interactions type diple-diple, liaisons hydrogne, PHASE INVERSE ( 80% des sparations chromatographiques ) Silice greffe avec des chanes alkyle (RP-8, RP-18) ou phnyle: caractre apolaire et hydrophobe PHASE CHIRALE Rsine optiquement active ou silice greffe avec des cyclodextrines

Adsorption, partage, change

Les interactions peuvent suivre des mcanismes dadsorption, dchange ou de partage. Le premier est un phnomne dinterface alors que les deux autres sont rgls par un phnomne dchange.

Phase mobile: proprits des solvants


Lquilibre en adsorption est un phnomne de comptition. Les molcules de la phase mobile entrent en comptition avec les molcules de soluts pour les sites polaires dadsorption (sparation liquide-solide). Plus linteraction entre la phase mobile et la phase stationnaire est forte, moins ladsorption du produit en solution sera importante et vice-versa. Les solvants sont donc classs selon leur force qui va dans le mme sens que leur polarit.

Phase mobile: proprits des solvants


Proprits de quelques solvants utiles en chromatographie phase liquide Solvant Isooctane Hexane Tolune Mthyl-t-butylther Dichloromthane Propanol-1 Ttrahydrofurane Chloroforme Ethanol Actate dthyle 1,4-Dioxane Actone Mthanol Actonitrile Acide actique Eau UV cutoff (nM) 215 195 284 210 233 210 212 245 210 256 215 330 205 190 190 Viscosit (cP) 0.50 0.31 0.59 0.27 0.44 2.30 0.55 0.57 1.08 0.45 1.37 0.36 0.55 0.38 1.10 1.00 Eb 99 69 111 55 40 97 66 61 78 77 101 56 65 82 118 100 Indice de Polarit (C) miscibilit (M) (P) 29 29 23 20 17 19 19 17 15 11 0.1 0.1 2.4 2.5 3.1 4.0 4.0 4.1 4.3 4.4 4.8 5.1 5.1 5.8 6.0 10.20

Phase mobile: force luante


PHASE INVERSE Eau Methanol Isopropanol Acetonitrile Actone Actate dthyle Ether Ttrahydrofuran Chlorure de mthylene Chloroforme Tolune Iso-octane Hexane

FAIBLE

PHASE NORMALE Hexane Iso-octane Tolune Chloroforme Chlorure de mthylene Ttrahydrofuran Ether Acetate dthyle Acetone Acetonitrile Isopropanol Methanol

FORTE

Dtecteur: attention au choix du solvant

Gradient dlution
Il existe deux modes dlution: - isocratique o lluant est de composition fixe - par gradient o lluant est de composition variable. Cet luant peut provenir dun mlange de 2 4 solvants dont les proportions peuvent changer pendant la sparation. Le changement dans le proportions des solvants peut tre linaire, concave ou convexe et mme comporter des rgions isocratiques. En phase normale, ils sont utiles pour La sparation de soluts de polarit trs diffrente. En phase inverse, ils servent la sparation de substances de masse molaire diffrentes dune srie homologue.

Dtecteurs en LC
1- Deux types de dtection bass: a. sur les proprits gnrales (solvant + solut). Ex: indice de rfraction, conductivit, constante dilectrique, b. sur les proprits des soluts. Ex: UV, polarographie, radioactivit, 2- Principaux paramtres a. bruit: qui se dfinit comme la variation du signal de sortie dun dtecteur non attribuable au passage du solut dans la cellule. b. sensibilit absolue: mesure par un dplacement sur toute lchelle de lenregistreur lorsque la sensibilit du dtecteur est maximale sans interfrence du bruit de fond relative: concentration minimale de solut dtectable pour un signal au moins gal trois fois la hauteur du bruit de fond.

Dtecteurs en LC
La sensibilit peut changer avec la nature du bruit de fond (type de dtecteur), peut varier avec le dbit (polarographie) ou avec la temprature ambiante La quantit minimale dtectable dune substance peut tre augmente en rduisant le volume mort, en limitant llargissement des pics dans la cellule et en optimisant les raccords. c. linarit: rgion o le signal de sortie du dtecteur est directement proportionnel la concentration du solut
Signal / Abondance / Aire du pic Saturation

Domaine de linarit

Quantit injecte (l) Concentration (g/ml, ng/ml)

Dtecteurs
DETECTEUR
UV Rfractomtrie diffrentielle Fluorimtrie Electrochimie

REMARQUES
le plus couramment utilis. Quantitatif mesure universelle. Peu sensible et peu pratique slectif et sensible. Quantitatif dtection des substances oxydables et rductibles. Trs sensible. Quantitatif Dtecteur universel. Trs sensible et spcifique

MS Conductimtre Infra-rouge Diffraction de la lumire Radioactivit RMN Ionisation de flamme etc

Dtection UV
UV visible
Cest le dtecteur le plus utilis en HPLC. Il est quip dune micro-cuve de circulation de quelques l dont le trajet optique est gnralement de 1 cm. Les cuvettes doivent tre construites de faon empcher la production de faisceaux parasites et dviter la formation de bulles dair. La rponse est directement proportionnelle la concentration du solut lu selon la loi de Lambert-Beer: A=lc Mesure labsorbance absolue dun solvant + solut ou la diffrence dabsorbance entre le solvant et le solvant + solut (en prsence dune cellule de rfrence). La sensibilit de ce dtecteur est de lordre de 10-8 M. Trois modles existent sur le march: longueur donde fixe longueur donde variable laide de prisme ou rseaux ( = 190 800 nm). Ils sont alors appels spectrophotomtres. spectrophotomtres barettes de diodes pouvant travailler entre 190 et 800 nm et dans le mme temps mesurer labsorbance donne.

Dtection UV

Abs

A B
t

Abs

B A
detection 2 t

detection 1

Fluorimtrie
Mesure lnergie de fluorescence dun solut excit par une radiation ultraviolette. Lmission de lumire est mesure langle droit du faisceau dexcitation. Ce mode de dtection est plus slectif et plus sensible que labsorbance UV visible (env. 10-10 M). Lintensit de fluorescence mesure est directement proportionnelle la concentration de lanalyte en solution Peu de composs sont fluorescents par eux-mmes, il est donc souvent ncessaire de les driver.

Rfractomtrie
Mesure de manire continue la diffrence dindice de rfraction entre la phase mobile contenant le solut et la phase mobile pure correspondant la rfrence Ce dtecteur permet une mesure universelle mais peu sensible (env. 10-5 M). De plus, il est peu pratique car il est trs sensible aux fluctuations extrieures (temprature) et intrieures (densit de la phase mobile). Ainsi, il est impossible de travailler en mode gradient de solvants.

Electrochimie
Permet la dtection de substances oxydables ou rductibles (ions mtalliques, anions inorganiques, composs nitrs, acides amins et alcalodes) par la mesure le changement de courant entre deux lectrodes (lectrode goutte de mercure ou lectrode fil de platine). Gnralement, on effectue la mesure par ampromtrie, cest dire que lon mesure la variation de courant un potentiel donn. La sensibilit de la mthode est trs importante (env. 10-10 M). Il est possible de travailler en mode rducteur (E < 0V) ou oxydant (E > 0V). En mode rducteur, loxygne dissous dans la phase mobile perturbe la dtection. Il est alors ncessaire de dgazer la solution lors de la mesure. Le systme est compos de trois lectrodes plonges dans une micro-cellule de volume aussi faible que possible. Lchantillon est modifi au cours de la mesure.

Conductimtrie - Polarimtrie
Conductimtrie
Mesure la conductivit lectrique due la prsence dun solut dans la phase mobile (de faon absolue ou diffrentielle). Ce dtecteur est utilis pour les solutions ioniques et est trs sensible la temprature.

Polarimtrie
Mesure lactivit optique de substances possdant un ou des centres dasymtrie. Cette activit est gnralement associe lactivit biologique. Les nouveaux appareils quips de laser permettent de dtecter des rotations optiques de lordre du microdegr.

Spectroscopie infrarouge
Mesure labsorbance dune substance dans linfrarouge et permet lacquisition du spectre IR des produits spars par la chromatographie liquide. Permet didentifier une substance par son spectre infrarouge, den reconnatre les fonctions chimiques (slectivit). La difficult du couplage avec la chromatographie liquide rside dans lincompatibilit entre ce dtecteur et les solvants utiliss, en particulier leau. On utilise maintenant un procd analogue celui qui sert dans linterfaage de la chromatographie liquide et la spectroscopie de masse.

Spectromtrie de masse
Cette mthode est maintenant largement utilise dans tous les types de laboratoires danalyse, car elle permet dobtenir dans le mme temps, une analyse qualitative et quantitative. On peut, laide de cette mthode, dterminer la composition, la structure et la masse molculaire des composs. De plus la sensibilit de cette technique est trs grande, elle est en effet une des mthodes analytiques les plus sensibles. Cette mthode a connu un grand dveloppement ces 20 dernires annes, principalement de par la possibilit de la coupler aux chromatographies en phase gazeuse et liquide. Cette technique suit un processus en chane compos des tapes suivantes: ionisation des molcules (ventuellement fragmentation) acclration des ions chargs dans un champ lectrique et/ou magntique sparation des ions suivant leur rapport m/z dtection des ions au moyen dun analyseur appropri Interprtation du spectre de masse obtenu (bibliothques de rfrence) Diffrents appareillages sont commercialiss pour ce type danalyse et en fonction de la technique utilise, il est possible dobtenir des spectres de masse trs diffrents.

LC-UV-MS: Appareillage
Phase mobile (tampon)

Pompes binaires

Injecteur automatique Colonne thermostate Interface Dtecteur MS

Systme dexploitation / Traitement des donnes

Dtecteur UV

Couplage LC-MS

Chromatographie liquide Slectivit (sparation) Efficacit Robustesse

Spectromtrie de masse Slectivit (dtection) Sensibilit Information structurelle

Interfaces: lectrospray, thermospray

Rsolution
1/1 1/4 1/16

Rs = 0.6

Mauvaise rsolution
Rs = 0.8

1.6

N 100

Rs 0.75

Rs = 1.0

Rs = 1.25

Bonne rsolution efficacit 1.6 N 1000 Rs 4.67

Si le dtecteur a une slectivit suffisante, une rsolution importante n'est pas essentielle

Bonne rsolution slectivit 2.6 N 100 Rs 2.2

Allure du pic: cintique des changes


Diffusion turbulente

Diffusion longitudinale

Resistance au transfert de masse

% de modificateur organique
80 % 48 %

70 %

47 %

60 %

46 %

Type de modificateur organique

MeOH - H2O

THF - H2O

MeOH - THF - H2O

pH de la phase mobile
B

pH 2.5

pH 3.0
AH B N BH+

pH 3.5
AA-

pH 4.0

Sparation dun mlange complexe

Influence de la temprature
30C

35C

40C

45C

Slectivit du greffage

Choix de la colonne: type et longueur


C8

Phenyl

CN

Applications
-Trimacinolone - Prednisolone - Prednisone - Cortisol - Cortisone - Methylprednisolone - Dexamethasone - Flumethasone - Betamethasone - Triamcinolone acetonide - Flunisolide

Analyse en routine des corticostrodes par LC-MS

Applications
Analyse en routine des diurtiques par LC-MS/MS

- Acetazolamide - Dichlorphenamide - Acide Ethacrinique - Chlorothiazide - Chlorthalidone - Probenecide - Hydrochlorothiazide - Furosemide