Extraccin de bromelina a partir de residuos de pia Linda I. S.

Gallardo Castillo1, Alfredo Snchez Solano1,2, Claudia Montalvo Paquini1 y Alejandro I. A. Alonso Caldern 1,2 Universidad Politcnica de Puebla, Programa Acadmico en Ingeniera en Biotecnologa, Tercer carril del ejido serrano S/N, San Mateo Cuanal, Juan C.Bonilla, C.P. 72640 Puebla, Mxico. augusto96mx@hotmail.com Alejandro Isaas Augusto Alonso Caldern es Qumico Farmacobilogo, con especialidad en Ingeniera Ambiental y maestra en Ciencias Ambientales, actualmente es candidato a Doctor en Ciencias Ambientales en el rea de Tecnologa Ambiental por la Benemrita Universidad Autnoma de Puebla, sus trabajos de investigacin enfocados principalmente a la purificacin de protenas de productos biticos y su aplicacin ambiental han tenido premios en diferentes eventos cientficos por ejemplo en las Convenciones Nacionales de Investigacin Aplicada y Desarrollo Tecnolgico 2005, 2006, 2008, en el Movimiento Internacional para el Recreo Cientfico y Tcnico MILSET 2007 y 2008, adems de la presentacin en Congresos Nacionales e Internacionales y publicacin en diversas revistas. RESUMEN La pia es una fruta tropical de la familia de las bromeliaceae la cual tiene actividad proteoltica debida a la bromelina, recientemente se demostr la posible actividad antitumoral de cistenoproteasas como esta enzima contenida en la pia, En este trabajo de investigacin se reporta la concentracin de protenas, actividad enzimtica y proteoltica de la bromelina extrada por precipitacin alcohlica a -10 C de diferentes partes de esta fruto, nuestros resultados muestran que a los 7 das se tuvo una concentracin de protenas en cscara de 857.35 mg/mL mayor a las encontradas en pulpa y corazn (625.09 mg/mL y 591.04 mg/mL respectivamente). La actividad especfica en corazn fue de 19.88 nmol/min/mg, similar al de pulpa (18.73 nmol/min/mg) y mayor al presente en cscara (9.05 nmol/min/mg), sin embargo esta ltima al ser un residuo
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agroindustrial puede ser potencialmente utilizado en la extraccin y purificacin de esta enzima a un menor costo.

Palabras clave: pia, bromelina, actividad

Bromelain extraction of pineapple waste ABSTRACT The pineapple is a tropical fruit belongs to bromeliaceae family. It has proteolytic activity of bromelain and recently was tested its antitumoral activity of cistein-proteases. In the present work the determination of protein concentration and enzymatic activity of bromelain were tested in each one of the parts of pineapple: crown, shell, heart and pulp. The bromelain was obtained by precipitation with ethanolic extraction at -10 C. The results shown that the best protein concentration was obtained in shell at 7 days (857.35 mg/mL) being higher than pulp and heart with values of 625.09 mg/mL and 591.04 mg/mL respectively. The specific activity was 19.88 nmol/min/mg in heart, it was very similar to pulp ( 18.73 nmol/min/mg) and both were bigger than the activity in shell (9.05 nmol/min/mg). However the crown, the shell and the heart are considered like agroindustrial waste and these could be used in extraction and purification to get bromelain with low cost. Keywords: pineapple, bromelain, activity

INTRODUCCIN Las proteasas son enzimas que catalizan la hidrlisis de enlaces peptdicos en las protenas, se agrupan segn los residuos de aminocidos, del centro activo y los mecanismos de accin, dentro de las cisteno peptidasas (EC 3.4.22) se encuentra a la papaina y bromelina (1).

La pia es una fruta tropical de la familia de las bromeliaceae, es rica en vitaminas A, B, C y tiene actividad proteoltica debida a la bromelina que se activa por la cistena, tiosulfato y glutatin. Es inhibida o inactivada por iones metlicos oxidantes y por agentes que reaccionan con los tioles (cido ascrbico). La bromelina de los frutos es una proteasa cida, su intensa actividad proteoltica no se modifica en zonas de pH entre 3 y 8. Es una protena constituida por aminocidos que se encuentran enrollados en dos partes separadas por un puente que tiene un lugar activo con un grupo tiol (SH) libre.

Esta biomolcula se utiliza como ablandadora de carnes (1), complemento alimenticio y se ha descrito que muestran varias acciones farmacolgicas por ejemplo aumentan la absorcin de medicamentos (2) se han utilizado en tratamientos de desrdenes digestivos, en enfermedades virales y en la formulacin de vacunas. Tienen potencialidades como antiedematosas, antiinflamatorias, antitrombticas y fibrinolticas. Recientemente, se demostr la posible actividad antitumoral de cisteno-proteasas como la bromelina contenida en la pia en 5 tumores transplantables de ratn: Leucemia p-388, carcinoma pulmonar de Lewis, adenocarcinoma-755, sarcoma-37 y tumor ascitico de Ehrlinch (3), as como la inhibicin en la proliferacin de tumores cerebrales (4). El objetivo del presente trabajo fue evaluar la obtencin de bromelina a partir de cscara, corazn y pulpa de la pia as como determinar la actividad enzimtica y especfica. MATERIALES Y MTODOS Se parti de una pia previamente lavada y fraccionada en pulpa cscara y corazn. Estas fracciones fueron molidas por separado en un extractor de jugos, el volumen resultante se multiplic por 1,5 y esa fue la cantidad aadida de etanol. Las mezclas extracto-etanol fueron

distribuidas en tubos falcn de 50 mL y colocados a -10 C durante 7 das, a continuacin las muestras fueron centrifugadas a 8 500 rev/min durante 10 min. El sobrenadante fue eliminado y las pastillas de cada muestra fueron recolectadas en un volumen final de 1 mL de solucin tampn Tris-HCl 50 mM pH 8. Para la cuantificacin de protenas se utilizo el mtodo de Lowry cuya sensibilidad es de 1 a 2 g, el cual se realiz de la siguiente manera: a 300 L de muestra o estndar se le adicionaron 300 L de solucin de hidrxido de sodio 2N y se coloc a 100 C durante 10 min. Despus se dej enfriar la mezcla a temperatura ambiente y se le agregaron 3000 L del reactivo para formar el complejo. Se dej la reaccin 10 min a temperatura ambiente, enseguida se agregaron 300 L de reactivo de Folin 1N mezclando por inversin y se dej a temperatura ambiente por 40 min., se determinaron los valores de absorbancia a 750 nm utilizando un espectrofotmetro UV-visible Agilent 8453, se prepararon estndares con albmina bovina a distantes concentraciones para elaborar una curva de calibracin. La actividad proteoltica fue determinada de acuerdo al procedimiento de Arnon con ligeras modificaciones (5). Este procedimiento consisti en una mezcla de reaccin que contena: 200 L de cistena 50 mM-20 mM EDTA pH 8, 700 L de solucim tampn Tris-HCl 50 mM pH 8, 20 mg de concentrado de protenas precipitadas. Esta mezcla fu colocada a 37 C por 5 min. Posteriormente se agreg 1000 L de casena 1 % (m/v) como sustrato y la reaccin fue puesta nuevamente a 37 C durante 10 min. Para detener la reaccin se adicionaron 3000 L de cido tricloroactico (TCA) 5 % (m/v) y se dej a 37 C durante 30 min. Finalmente las muestras de reaccin fueron centrifugadas a 8 000 rev/min durante 10 min y el sobrenadante fue medido a 275 nm. La lectura fue corregida por un blanco en el cual el concentrado fue adicionada despus de agregar el TCA, la actividad fue determinada por medicin de la velocidad de liberacin de tirosina a partir de casena como sustrato; expresada en unidades enzimticas, una unidad (U) es

la cantidad de enzima que cataliza la formacin de 1 nmol de tirosina por minuto a 37 C. La actividad especifica se calcul como el cociente de la actividad enzimtica entre la concentracin de protenas. RESULTADOS Y DISCUSIN El fraccionamiento del fruto permiti obtener muestras representativas, las cuales fueron cscara, pulpa y corazn.. En la figura 1 se aprecia que el mayor valor de protena se registr para la cscara (857,35 mg/mL) con diferencia significativa respecto a las dems muestras; pulpa (625,09 mg/mL) y corazn (591,04 mg/mL).

Concentracin de protenas (mg/mL)

1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 Cscara Pulpa Corazn

Figura 1. Concentracin de protenas (mg/mL)

La Fig. 2A muestra la actividad enzimtica (nmol/min) de los extractos obtenidos a partir de las diferentes secciones de la pia., en la cual observamos que para corazn fue de 397,6642

nmol/min, muy similar a pulpa (374,7928 nmol/min) y por arriba de cscara cuyo valor fue de 181,1357 nmol/min. De manera similar la actividad especfica (nmol/min/mg) fue mayor en

corazn y pulpa teniendo valores de 19,8832 nmol/min/mg y 18,7396 nmol/min/mg respectivamente seguida por la cscara en la cual se obtuvo un valor de 9,0567 nmol/min/mg (Fig. 2B).

Actividad enzimatica (nmol/min)

450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 Cscara Pulpa Corazn

Fig. 2A. Actividad enzimtica de los diferentes extractos de la pia.

Actividad especfica (nmol/min/mg)

25

20

15

10

0 Cscara Pulpa Corazn

Fig. 2 B Actividad especfica de los diferentes extractos de la pia Los resultados muestran que en pulpa y corazn se encuentra una mayor cantidad de enzimas proteolticas a diferencia de las presentes en cscara, sin embargo, esta ltima al ser un residuo agroindustrial puede ser potencialmente utilizado a un menor costo en la extraccin y purificacin, mediante tcnicas bioqumicas como dilisis y cromatografa de intercambio catinico y poder aplicarla en diversos procesos. CONCLUSIONES. 1.- Se logr establecer que las mejores condiciones para la extraccin de la bromelina fueron con el solvente etanol, temperatura de -10 C y durante un tiempo de 7 das. 2.- La mayor cantidad de protenas se encuentran en la cscara, sin embargo esta tiene la menor actividad enzimtica y especfica. 3.- La bromelina extraida de cscara de pia tiene un menor costo con respecto a la de las dems partes del fruto ya que es un residuo agroindustrial. 4.- Los resultados obtenidos son prometedores para que con un mayor grado de purificacin sea factible aplicar esta enzima en tratamientos biomdicos.

REFERENCIAS 1. Kleef, R., Delohery, T. y Boubjerg, D. Pathobiol. 64:339-46, 1996. 2. Leipner, J. y Saller, R. Drugs. 59:769-80, 2000. 3. Hernndez, M., Chvez, M., Bez, R., Carvajal, C., Mrquez, M., Morris, H., Santos, R., Gonzlez, J., Quesada V., Rodrguez C. Biotec Aplicada 20:180-182, 2003 . 4. Berit, B, Tysnes., H, Rainer, Maurer., Torsten, Porwol., Beatrice, Probst., Rolf, Bjerkuing. and Frank, Hoover. Neoplasia 3(6): 469-479, 2002. 5. Nitsawang, S., Hatti-Kaul, R. y Kanasawud, P. Enzyme and Microbial Technology 39: 11031107, 2006.