Apuntes de Bioensayos.

1.- INTRODUCCIN Y PRINCIPIOS GENERALES. Caractersticas generales del curso 1.1.1. Propsito y entrega de temario y calendario de prcticas de laboratorio. 1.2. Conceptos Bsicos. Que es un Bioensayo?? Un bioensayo es el uso de un organismos VIVO como un agente de prueba para la presencia o concentracin de un compuesto qumico o un efecto ambiental. 1.2.1. Diseo Experimental. Un experimento es una investigacin planeada para descubrir nuevos hechos o para confirmar En un o negar los resultados se de investigaciones previas. experimento manipulan

deliberadamente una o ms variables independientes (supuestas causas) para analizar las consecuencias que la manipulacin tiene sobre una o ms variables dependientes (supuestos efecto), dentro de condiciones controladas por el investigador. El diseo experimental, es el proceso de planeamiento de un experimento, tal que se tomen datos apropiados con la mayor realidad posible, los cuales deben ser analizados mediante mtodos estadsticos que deriven conclusiones vlidas y objetivas. Podemos decir que la filosofa del diseo experimental es la obtencin de informacin con una alta fidelidad sobre el mensaje de la naturaleza a un costo mnimo. Los diseos experimentales deben tener algunas caractersticas como:

1. Simplicidad. La seleccin de los tratamientos y la disposicin experimental deber hacerse de la forma ms simple posible. 2. Grado de precisin. El experimento deber tener la capacidad de medir diferencias entre tratamientos con los grados de precisin que desee el investigador. Para cumplir con este propsito se deber partir de un diseo y un nmero de repeticiones adecuados. 3. Ausencia de error sistemtico. Se debe planear un experimento con el que de propsito reciban aquellas de un que asegurar reciben que otro las no unidades difieran experimentales sistemticamente tratamiento

tratamiento,

procurando de esta manera obtener una estimacin insesgada del efecto de tratamientos. 4. Rango de validez de las conclusiones. Este deber ser tan amplio como sea posible. Los experimentos que contribuyen a aumentar el rango de validez del experimento son los experimentos replicados y los experimentos con estructuras factoriales. 5. Clculo del grado de incertidumbre. En todo experimento existe algn grado de incertidumbre en cuanto a la validacin de las conclusiones. El experimento deber ser concebido de modo que sea posible calcular la probabilidad de obtener los resultados observados debido nicamente al azar.

1.2.2. Organismo de Prueba. La eleccin de un organismo de prueba adecuado para un Bioensayo depende del efecto que se desea evaluar y de las caractersticas del organismo, por ejemplo, un canario es un organismo adecuado de un bioensayo para detectar gases txicos o falta de oxgeno en una mina, porque se tiene el antecedente de su uso para estos fines, los mineros entraban con un canario y si el

canario mora, por ser mas sensible, ellos tenan la oportunidad de salir y no correr la misma suerte. Otros ejemplos de organismos de prueba son, el uso de cerdos para detectar y colectar trufas, perros para detectar explosivos y drogas, gametos de erizo de mar para detectar eco toxicidad en agua de mar, Euglena gracilis para detectar niveles de vitamina B12. Lo anterior es til para asegurarse que la respuesta de una poblacin expuesta a cierto agente txico se deba al efecto de ste y no a variaciones tanto de la sensibilidad de los organismos como de fallas operacionales en la aplicacin del mtodo. Los Organismos de prueba pueden ser: Organismos criados en Laboratorio Organismos colectados en campo.

En general, es preferible utilizar organismos criados en el laboratorio en vez de los recolectados en el campo porque los exmenes estandarizados requieren de un abastecimiento siempre disponible de organismos en buena salud provenientes de cultivos de condiciones conocidas y constantes. Los bioensayos hechos en el laboratorio usando organismos recolectados en el campo han sido menos satisfactorios, con muy pocas excepciones. Los organismos recolectados en el campo son ms satisfactorios cuando el laboratorio est cerca al lugar de recoleccin y el abastecimiento de agua desde all est siempre disponible, como es el caso de nuestro curso que cuenta con un laboratorio que provee esas condiciones.

1.2.3. Material de Prueba. Cualquier objeto orgnico o inorgnico donde se van a aplicar los diseos experimentales con el fin de observar una respuesta, Compuestos qumicos, extractos, fuente de compuestos o materia que pueden generar una respuesta biolgica en los organismos de un ecosistema. Puede ser material de prueba, el sedimento marino, pesticidas, materia orgnica 1.2.3. Aplicacin del anlisis Estadstico. En esta etapa se selecciona la(s) variable(s) respuesta(s) o variable (s) dependiente(s). El experimentador debe estar seguro que la respuesta que se va a medir realmente provee informacin til acerca de la investigacin. Cada respuesta medible, est representada matemticamente en un modelo lineal. La idea general de un modelo es expresar las observaciones generalmente denotadas por , en trminos de

efectos'' que contribuyen a de Error.

. Esos efectos se pueden clasificar en

tres categoras: Efectos de Tratamiento, Efectos de Diseo y Efectos

Los efectos de tratamientos, son un reflejo del efecto de diseo como tambin de los tratamientos simples o combinaciones de factores. Los efectos de diseo, son determinados por el diseo de control de error, en particular, efectos debidos a las varias clases de bloqueo. Los efectos de error, representan diferentes clases de variacin aleatoria. Estos son: (1) el error experimental y (2) el error observacional.

Error

Experimental.

Una

caracterstica

de

todo

material

experimental es la variacin. Asociada con la unidad experimental est el error experimental, este error es el reflejo de que las UE no son iguales. Tambin podemos decir que es una medida de la variacin existente entre las respuestas de las UE tratadas en forma similar. Contribuyendo al error experimental estn: a) El error de tratamiento, el cual resulta de cualquier falta de uniformidad en la realizacin fsica del experimento o en la replicacin de un tratamiento. Por ejemplo, si se van a administrar 20 ppm de cierta sustancia, administramos 19 21 ppm. b) El error de estado.o variabilidad inherente al material al cual se aplican los tratamientos, el cual es debido a los cambios aleatorios en el estado fsico de una UE. Por ejemplo, en un experimento de nutricin con camarones como material experimental, los individuos tendrn constitucin gentica diferente, sta es una variabilidad inherente al material experimental o error de estado. Las camarones se colocarn en jaulas sujetas a diferencias de calor, luz y otros factores; esto constituye una falta de uniformidad en la realizacin fsica del experimento o error de tratamiento. Al hacer inferencia estadstica, ya sea por intervalos de confianza o pruebas de hiptesis, la magnitud del intervalo de confianza y el poder de la prueba estadstica dependen en definitiva del estimador de la varianza del error experimental, llamado cuadrado medio del error, . As que para obtener intervalos cortos o alto poder la prueba se debe hacer todo esfuerzo posible para reducir el error experimental. Para lograr lo anterior debemos:

Manejar el material experimental de tal manera que se logre reducir los efectos debido a la variabilidad inherente. Refinar la tcnica experimental. Es responsabilidad del experimentador que se haga todo lo posible para asegurar una tcnica cuidadosa porque ningn tipo de anlisis estadstico puede mejorar los datos obtenidos de experimentos mal efectuados. La tcnica defectuosa puede aumentar el error experimental de dos maneras: i) Puede introducir fluctuaciones adicionales de una naturaleza ms o menos aleatoria y, posiblemente, sujetas a las leyes del azar. Tales fluctuaciones, si son grandes, debern revelarse por s mismas en la estimacin del error experimental, posiblemente mediante la observacin del coeficiente de variacin. Este es una medida de variacin relativa y es utilizado para comparar la precisin de dos experimentos o de dos medidas. ii) Mediante errores no aleatorios. stos no estn sujetos a las leyes del azar y no siempre pueden detectarse mediante la observacin de las medidas individuales. Se dispone de pruebas estadsticas para detectarlo. La tcnica defectuosa tambin puede producir medidas

consistentemente sesgadas, lo que no afecta el error experimental en las diferencias entre las medias de tratamientos, pero s a los valores de las medias de tratamientos. En general la variacin proveniente de una tcnica deficiente no es aleatoria y no est sujeta a las leyes del azar, en la cuales se basa la inferencia estadstica. Esta variacin puede denominarse inexacitud, en contraste con la falta de precisin. Desafortunadamente, la exactitud en la tcnica no siempre produce alta precisin ya que sta tambin tiene que ver con la variabilidad aleatoria entre las unidades experimentales, la cual puede ser bastante grande.

El error experimental no puede detectar sesgos; estima la precisin o la repetibilidad de las medidas, pero no estima la exactitud. Error Observacional. Se considera como parte del error observacional el error de medida, es decir, el error debido a la imprecisin de la medida o procedimiento de deteccin (aparatos) y el error de muestreo debido a la seleccin de las UE para la investigacin. 1.3. Panormica de la Aplicacin del Bioensayo en problemas relacionados con la bioprospeccin en el medio marino. La evaluacin de sustancias bioactivas o de condiciones

ecotxicas requiere de la medicin de una multiplicidad de parmetros que se deben de tomar de manera y en cantidad suficiente para que permitan extraer conclusiones a travs de un anlisis estadstico correcto. A pesar de que en el mar viven unas 500,000 especies lo que representa casi el 75% del total de especies del planeta, el nmero de sustancias bioactivas, conocidas, de origen terrestres superan considerablemente a las de origen marino. Esta diferencia se puede deber a que el medio marino es mucho mas homogneo que el ambiente terrestre, principalmente en factores como la disposicin de luz, nutrientes y temperatura, sus variaciones no son tan drsticas y probable la necesidad de generar sustancias para afrontar adversidades y competencia es menor en el medio marino. Tambin es probable que el potencial de sustancias bioactivas del medio marino se encuentre subevaluado debido principalmente a la dificultad de acceso al medio marino, lo que se ha ido solucionando con los avances en tcnicas de buceo y de inmersin submarina. La gran variedad de organismos que habitan en mares y ocanos y las posibles propiedades farmacolgicas y mdicas de sus extractos, hacen del medio marino una fuente potencial de frmacos y un campo abierto a la investigacin en farmacognoscia marina (DE LARA-ISASSI

et al., 1989). A pesar de que en cantidad la lista de sustancias de origen marino es menor a las de origen terrestre, en calidad hay muchos ejemplos de sustancias; la saliva que el pulpo emplea para inmovilizar cangrejos contiene un poderoso estimulante cardiaco llamado 5-HT, Las microalgas generan toxinas muy potentes, el fluido corporal del cangrejo cacerola inhiben el crecimiento de bacterias coliformes, experimentacin exploratoria en este mismo curso de Bioensayos ha demostrado que la tinta del Invertebrado conocido como Vaquita Aplysia californica inhibe significativamente el crecimiento de bacterias coliformes, las esponjas producen Ectionina que es un antibitico de amplio espectro, la holoturina de los pepinos de mar es un bloqueador nervioso. Adems de los organismos marinos, en general el agua de mar es un suero biolgico que adems de contener sales disueltas contiene una gran cantidad y variedad de materia orgnica entre esta materia se encuentran disueltas hormonas, enzimas, toxinas y esteroides principalmente, lo que hace del agua de mar un medio que inhibe y promueve reacciones bioqumicas. 2. BIOTICA Segn la Encyclopedia of Bioethics (Nueva York 1978, vol. I, p. XIX) la biotica es el "estudio sistemtico de las ciencias de la vida y del cuidado de la salud, examinada a la luz de los valores y de los principios morales". "...una primera aproximacin -que podramos llamar perifrica- a la biotica, como conjunto de temas atravesado por el cuestionamiento a la idea del avance tecnocientfico como progreso lineal de la humanidad. Esta forma de hacer biotica es ms bien terica y se inscribe en la visin crtica de la ciencia y la tcnica.". Principalmente la biotica trata por medio de la aplicacin de la ciencia y la tecnologa buscar una mejor vida en sociedad y de mejorar

la calidad de vida humana. Esta disciplina esta conformada por la interaccin de varias ciencias por lo que se fundamenta en la experimentacin con seres vivos. Se puede decir que en si, esta ciencia trata de justificar la investigacin en animales. Existen distintas agrupaciones humanas que rechazan la idea de experimentar en animales, ya que estos ltimos tienen el mismo derecho a la vida que un ser humano; pero tambin hay algunos movimientos humanos que la apoyan y mantienen de esta manera a los laboratorios. 2.1. Utilidad del uso de los bioensayos en la investigacin biomdica y ambiental pros y contras. PROS La utilidad de los bioensayos recae primordialmente en ser un mtodo de deteccin relativamente simple y que se puede emplear para el monitoreo de causas y sus efectos de tipo ambiental y en farmacologa. En un organismo, especial, la respuesta biolgica (efecto) se puede generar a concentraciones menores a los lmites de deteccin de los principales mtodos analticos y aunque, un mtodo analtico sea lo suficientemente fino para evaluar un nivel o concentracin de compuesto o causa de dao, sus datos no nos indican el efecto biolgico al ecosistema o al organismo de prueba los cuales se pueden observar en los organismos aun cuando la exposicin a los compuestos o causas ha finalizado. La deteccin de efectos en organismos se puede emplear para monitoreo lo que es muy til para Inspeccin o vigilancia antes y despus de un evento o dosificacin de algn compuesto. Vigilar la efectividad de un proceso de remediacin o biorremediacin.

Vigilancia para asegurar el cumplimiento de parmetros estatales y federales de calidad ambiental.

Estas acciones se pueden aplicar en: Toma de decisiones de corporativos industriales y/o compaas biomdicas en el desarrollo, manufactura y comercializacin de nuevos productos. Cumplir requisitos de regulacin para registrar nuevos productos o procesos. Obtener permisos de descarga. Evaluacin de riesgo ambiental. Elementos de cargo o descargo en litigios. Fuente de datos de calidad del medio ambiente para proteger organismos de futuras afectaciones. CONTRAS. La principal desventaja de un bioensayo es que sus resultados, difcilmente, generan informacin especfica de un compuesto, causa o condicin ambiental. Durante el desarrollo de los bioensayos los organismos de prueba son sometidos a diferentes condiciones experimentales en las cuales se incluye la muerte del organismo como un efecto normal y el problema es que las causas de este efecto pueden ser muchas y difciles de detectar por medio de un Bioensayo como para decir que en este proceso, organismo. En evaluacin ambiental, la presencia o sobre vivencia de una especie u organismo en un medio ambiente nos indica que este ecosistema le provee lo necesario para solventar sus necesidades, PERO la ausencia de un organismo en un ecosistema NO vali la pena el sacrificio del

necesariamente significa lo contrario o sea que el ecosistema no le provea lo necesario. 2.2. 2.3. El Derecho de los animales a no ser usados en la investigacin Biomdica. Y El Derecho del hombre a utilizar organismos para experimentacin. La Asociacin Mdica Mundial afirma que el uso de animales en la investigacin biomdica es esencial para el progreso mdico, y a pesar que se dice que en la experimentacin con animales deben de cumplirse las normas que rigen el trato compasivo de los animales, esto no se cumple o de la misma manera sigue afectando al organismo. Ya que al estar experimentando con animales y producir alguna lesin es un proceso traumtico aunque se utilicen anestsicos ya que al terminar el efecto les producen dolor y se ven afectados en la disminucin de peso. As mismo, el impacto de estrs sobre los mecanismos fisiolgicos se ha estado analizando al igual que el miedo, que tan solo con sentir el acercamiento del hombre les causa miedo, una posible solucin sera tener un mayor acercamiento a los organismos para que mitiguen el miedo ante la presencia humana. Se conoce que la biotica tiene por objeto material los actos humanos que suponen una intervencin sobre la vida (no slo humana sino tambin animal y vegetal) para considerarlos bajo el punto de vista formal de la tica, a saber, conocer si son buenos o malos para guiar su obrar. Puesto que el nmero de animales que padece sufrimiento por su empleo en la investigacin representa un bajo porcentaje de las muertes animales por actividades humanas causadas por pesticidas, deforestacin, construccin civil, maltrato, entre otras, el sacrificio animal dirigido a la investigacin cientfica es solo una pequea parte de las perdidas comparadas a las actividades humanas. Lo cual pudiese fundamentar el derecho de los humanos a usar animalitos u otros seres vivos.

2.4. Otras alternativas al uso de animales en experimentacin biomdica y en la enseanza en la carrera de oceanologa. La creciente sensibilidad respecto a la experimentacin en animales en investigacin biomdica y la enseanza de las ciencias naturales, y la bsqueda de enfoques nuevos en los aspectos prcticos de la misma son parte de un debate actual y, probablemente, necesario. La utilizacin de animales de experimentacin en investigacin Biomdica y en la enseanza de las prcticas de diferentes y en especial en nuestra asignaturas de las Ciencias naturales

Facultad en las prcticas de Fisiologa, Bioqumica, Zoologa, Qumica Orgnica, Aprovechamiento de Productos Marinos, Acuacultura y por supuesto en BIOENSAYOS ha venido siendo la metodologa ms empleada por todos los profesores de estas disciplinas. Gracias a la utilizacin de estos animales, los estudiantes han podido ver de cerca los diferentes fenmenos que se les haban explicado anteriormente en la clase de teora. En la mayora de los casos, excepto en BIOENSAYOS, son prcticas cruentas donde varios animales son

sacrificados y adems en la mayora el fin didctico no se cumple y el estudiante se convierte. en un simple espectador. Es obvio que ste era el nico mtodo del que disponan los profesores hace unos aos para ensear. Pero en los ltimos aos las cosas han cambiado y el avance de la informtica y de las tecnologas de la imagen ha permitido el desarrollo de numerosas alternativas que no requieren el uso de estos animales para lograr los objetivos docentes que nos planteamos con las prcticas. El nmero de animales utilizados con fines educativos es relativamente pequeo comparado con el nmero total de animales utilizados en investigacin y se ha venido reduciendo en los ltimos aos, pero a pesar de ello todava se puede reducir ms. En el artculo

25 de la Convencin Europea para la Proteccin de los Animales Vertebrados utilizados en Experimentacin y otros Fines Cientficos se especifica: "aquellos procedimientos llevados a cabo con fines educativos o de entrenamiento se deben restringir a los absolutamente necesarios para los fines relativos a la enseanza y el entrenamiento y se permitirn nicamente si sus objetivos no pueden ser conseguidos por mtodos audiovisuales u otros que sean suficientemente efectivos". En las legislaciones relacionadas con la proteccin de los animales de todos los pases se considera fundamental aplicar el principio de las 3Rs, promulgado por Russell y Burch en 1959 (1). Este principio nos indica la necesidad de Reemplazar los animales de experimentacin por otros mtodos, siempre que sea posible y que el nuevo mtodo nos aporte el mismo grado de informacin. En el caso de la docencia e investigacin se plantea el reemplazo de los animales de experimentacin por otros mtodos. Entre los mtodos propuestos se pueden citar: a) modelos, maniques y simuladores mecnicos; b) pelculas y vdeos; c) simulaciones de computadora y sistemas de realidad virtual; d) autoexperimentacin en el propio individuo; e) experimentos con plantas; f) uso de material procedente de mataderos; g) estudios in vitro con lneas celulares y h) aprovechamiento de animales muertos de forma natural o utilizados despus de un procedimiento cientfico. 3. RESPUESTA BIOLGICA A LAS SUSTANCIAS BIOACTIVAS 3.1. Composicin membranas. La membrana celular est constituida de lpidos y protenas. La parte lipdica de la membrana est formada por una pelcula y propiedades fisicoqumicas de las

bimolecular que le da estructura y constituye una barrera que impide el paso de substancias hidrosolubles.

Las protenas de la membrana estn suspendidas en forma individual o en grupos dentro de la estructura lipdica, formando los canales por los cuales entran a las clulas, en forma selectiva, ciertas substancias. La selectividad de los canales de protenas le permite a la clula controlar la salida y entrada de substancias as como los transportes entre compartimentos celulares. Las protenas de la membrana no solo hacen que el transporte a travs de ella sea selectivo, sino que tambin son capaces de llevar a cabo transporte activo (transferencia en contra del gradiente de concentracin). Las dems funciones de la membrana, como son el

reconocimiento y unin de determinadas substancias en la superficies celular estn determinadas tambin por la parte proteica de la membrana. A estas protenas se les llaman receptores celulares. Los receptores estn conectados a sistemas internos que solo actan cuando la substancia se une a la superficie de la membrana. Mediante este mecanismo actan muchos de los controles de las clulas, algunos caminos metablicos no entran en accin a menos que la

molcula "seal", por ejemplo, una hormona, haya llegado a la superficie celular. En la membrana se localizan unas glicoprotenas que identifican a otras clulas como integrantes de un individuo o como extraas (inmunoreaccin). Las interacciones entre las clulas que conforman un tejido estn basadas en las protenas de las membranas. Resumiendo, la estructura de las membranas depende de los lpidos y las funciones dependen de las protenas. 3.2. Procesos de entrada de sustancias a travs de membranas Absorcin La absorcin de un Xenobitico se define como el proceso por medio del cual ste atraviesa membranas y capas de clulas hasta llegar al torrente sanguneo. El mecanismo de ingreso del xenobitico al organismo usa los mismos mecanismos de transporte diseados para movilizar compuestos de estructura similar. Los principales mecanismos de transporte son los siguientes:

Difusin simple (Pasivo). Depende de la existencia de un gradiente positivo de concentracin. La difusibilidad de una substancia a travs de las membranas biolgicas depende de sus propiedades fsicoqumicas, las substancias polares de bajo peso molecular (hasta 600 daltons) pasan a travs de los poros acuosos de las membranas, mientras que, las molculas hidrfobas se difunden a travs de las zonas lipdicas. En general, los lpidos penetran ms fcilmente las membranas que las molculas ionizadas. A travs de los poros

acuosos o canales de pequeo tamao pueden pasar de modo pasivo los compuestos hidrfilos, iones y electrlitos (PM menor 100) La difusin simple es el mecanismo de difusin pasiva se basa en la ley de Fick
dX DmAKmw (Cf Ci ) = dt d

transporte ms

importante en la absorcin de los Xenobiticos. La velocidad de

Donde: Dm: Coeficiente de difusin del Xenobitico en la membrana (cm2/min) A: Superficie de la membrana (cm2) Kmw: Coeficiente de particin del Xenobitico en la interfase aguamembrana. Cf: Concentracin del xenobitico fuera de la membrana Ci: Concentracin del xenobitico en el interior de la membrana d: Grosor de la membrana en cm.

http://www.d.umn.edu/~sdowning/Membranes/diffusion.html

Transporte activo.- El transporte activo, la endocitosis o la difusin mediada por un transportador son los mecanismos por los cuales se difunden los compuestos de peso molecular grande (sean polares o liposolubles) y los que se transportan en contra del gradiente de concentracin. Requieren de un transportador y se consume energia (ATP). Cintica Extracelular Memb Intracelular

v X + P X P 3 X '+ P
V1 V2

El Xenobitico fuera de la membrana se absorbe y enlaza al portador Pa una velocidad V1 para formar el complejo XP, la velocidad V2 es la velocidad de desorcin a la cual el xenobitico se separa de P y permanece fuera de la clula.

V 1 [ X][ P ] V1 = K1[ X][ P ] V 2 En el equilibrio V 1 = V 2 K1[ X ][ P ] = K 2[ XP ] 1

[ XP ]

V2 = K 2[ XP ]

[ X][ P ] = K 2 = Kt [ XP ] K1

Constante de Transport e

[ X ' ][ X ] V 3 =K 3[ X P P

La concentracin intracelular del Xenobitico es directamente proporcional a la concentracin del complejo Xenobitico-Portador.

Si

[ Pt ] = [ P ] + [ XP ] [ P ] = [ Pt ] [ XP ]
de 1

entoces

[ X ][[ Pt ] [ XP ]] = Kt [ XP ]

XPt-XPX MP

= Kt

XPt-XPX = KtXP XPt = KtXP + XPX XPt = XP ( Kt + X ) X XP = 3 Kt + X Pt de 2 V 3 = K 3[ XP ] El trasnporte mximo se d cuando todos los portadores cuando [MP] = Pt entonces estan enlazados con el xenobitic o V3 la Vmax = K 3[ Pt ] si se divide Vmax [ XP ] sustituim os en (3) V3 K 3[ XP ] V3 = = Vmax K 3[ Pt ] Vmax [ Pt ] V3 = V max X Kt + X Esta ecuacin nos revela la cintica de trasnporte activo sigu e la ecuacin de Michaelis - Menten El Portador es de naturaleza enzimtica

X XP = Kt + X Pt

V3 X = Vmax Kt + X

La Endocitosis Existen dos formas la Fagocitosis proceso y activo la por Pinocitosis, se trata de un ejemplo la asimilacin de vitaminas a, d, y c

Difusin Facilitada

Se realiza a favor de un gradiente de concentracin

Necesita un portador No consume energia

3.3 Factores inherentes a los principios activos que influyen en el efecto farmacolgico. Las propiedades fisicoqumicas de los Xenobioticos Pequeo radio atmico o molecular Grado de ionizacin Coeficiente de particin Pka Tamao Lipofilicidad Solubilidad En general pasan mas fcilmente molculas de bajo peso molecular, neutras y lipoflicas. La absortividad de cidos y bases dbiles depende de su estado de ionizacin y por lo tanto del pH y Pka. Se transportan ms fcilmente las formas no disociadas. La cantidad absorbida depende de

la velocidad de absorcin y del tiempo de residencia del agente en la superficie de transporte. 3.4. Factores inherentes a los organismos que influyen en el efecto farmacolgico. Cuando el txico se ingiere, entra al Tracto Gastro Intestinal (TGI), la mayor cantidad se absorbe en el estmago y en los intestinos aunque tambin puede haber absorcin en cualquier lugar del TGI, incluyendo las absorciones sublingual y rectal. El sitio de absorcin depende en parte del estado de ionizacin del compuesto. Los cidos dbiles es ms probable que se absorban en el estmago, donde hay un pH bajo, mientras que las bases dbiles, que estn menos ionizadas a pH alto, se absorben mejor en el intestino donde existen estas condiciones. La gran rea de absorcin del intestino y los largos tiempos de residencia, dependiendo de la movilidad intestinal, permiten que se tengan absorciones considerables aunque el flux, cantidad transportada por unidad de rea y de tiempo, sea pequeo. La absorcin de los xenobiticos usa los mismos mecanismos que tiene el TGI para absorber los nutrimentos. Por ejemplo, el plomo se absorbe en el intestino usando el sistema de transporte del calcio. Para que un compuesto ingerido pueda alcanzar la circulacin general, accesar el resto del organismo y tener la posibilidad de causar un dao, debe primero ser capaz de resistir:

la accin de las enzimas digestivas, el pH del estmago, la biodegradacin por la flora intestinal. la biotransformacin por las enzimas hepticas.

La absortividad del txico ingerido depende de sus propiedades fsicoqumicas. Como se mencion antes, los compuestos liposolubles de bajo peso molecular y los compuestos no ionizados se absorben mejor. Los xenobiticos se pueden ligar reversiblemente a las protenas plasmticas, por medio de distintos tipos de uniones: interacciones hidrfobas, puentes de hidrgeno y fuerzas de van der Waals. La molcula de protena tiene un nmero limitado de sitios donde se pueden ligar, tanto los xenobiticos, como los compuestos endgenos. As que, un agente determinado tiene que competir con los dems compuestos (xenobiticos y/o endgenos) por los sitios de unin disponibles. La unin reversible del compuesto a las protenas impide la difusin simple pero no limita su transporte activo. 3.5. Modelos organismos. 3.5.1. ADBE. Adsorbcin. Distribucin Biotransformacin Eliminacin. 3.5.2. ADME Adsorcin Distribucin Metabolismo Eliminacin que explican y la absorcin, de distribucin, por los

biotransformacin

excrecion

sustancias

Los

modelos de

ADBE

ADME en

representan un organismo

la y

cintica su

de

transferencia

xenobiticos

efecto

farmacolgico, a traves del estudio de estos modelos se generan las terapias correspondientes para eliminar su efecto. La interaccin dinmica de todos los procesos que constituyen el ADME, determina el tiempo que permanecer un agente dentro del organismo despus de que ste ha sido expuesto a una dosis determinada. Al estudio de la velocidad de cambio de la concentracin de las especies txicas dentro del organismo se le conoce como toxicocintica. Las tasas de cambio que se presentan en cada fase del ADME se pueden modelar matemticamente e integrarlas en un modelo que represente la dinmica global del txico dentro del organismo. Cada proceso, sea este de cambio de lugar y/o de identidad qumica, se puede representar por una ecuacin diferencial en la que la derivada de la concentracin con respecto al tiempo en un sitio determinado, se expresa como una funcin de la concentracin en ese lugar. La constante de proporcionalidad se denomina velocidad especfica y normalmente se representa por la letra "k". (http://superfund.pharmacy.arizona.edu/toxamb/c2-3-5.html) Podemos representar al cuerpo por un modelo de un solo compartimiento que sigue una cintica de primer orden si se supone que se llega rpidamente al equilibrio en la interface sangre-tejido. En este caso, el cambio de concentracin en plasma refleja el cambio de concentracin en los tejidos. Este modelo establece que la velocidad de eliminacin de un compuesto, en un momento dado, slo es proporcional a su concentracin. La variable eliminacin incluye la expulsin del compuesto por todas las rutas de excrecin y la desaparicin por biotransformacin. La cintica de primer orden se representa matemticamente de la siguiente manera:

dC/dt = - kelC donde C primer = concentracin orden plasmtica kel = constante de velocidad de eliminacin de t = tiempo al que se muestre la sangre. Este modelo indica que la velocidad global a la que procede el ADME de un compuesto es directamente proporcional a la concentracin y que la velocidad no vara linealmente con la dosis, sino que su variacin es exponencial. La velocidad de eliminacin es alta cuando la dosis es alta, pero disminuye fuertemente a medida que la concentracin del txico disminuye. Vida media es el tiempo que tarda el organismo en reducir a la mitad la concentracin del txico. Si un compuesto tiene una vida media de 24 horas y su concentracin en un momento dado es 40 mg/L, en un da se bajar la concentracin a 20 mg/L, pero bajar esta concentracin otros 20 mg/L (bueno, casi 20 mg/L, digamos 19.8 mg/L) requerir de ms de 6 das. La constante kel se puede evaluar graficando la concentracin plasmtica contra el tiempo en escala semilogartmica. Se obtiene una lnea recta con pendiente - kel. La mayora de los compuestos siguen una cintica de primer orden, pero no todos, el alcohol etlico sigue una cintica de orden cero, en la cual la velocidad de eliminacin es independiente de la concentracin y slo es funcin del tiempo. La cintica de orden cero se presenta cuando se saturan las enzimas de un camino metablico. Si la concentracin de un agente es muy alta, se saturarn las enzimas

y su eliminacin mostrar una cintica de orden cero aparente, aunque a concentraciones no saturantes presente una cintica de primer orden. Por el contrario, los compuestos que normalmente se eliminan siguiendo una cintica de orden cero, cuando las concentraciones son muy bajas, su eliminacin sigue una cintica de primer orden aparente. El modelo que representa la cintica de orden cero es:

dC/dt = Ko Donde: ko es la constante de velocidad de orden cero, C y t tienen el mismo significado que en la ecuacin anterior Cuando se tienen dosis repetidas el nivel del txico se aproxima a la concentracin de estado estacionario porque las velocidades de eliminacin y de absorcin son iguales. Se necesitan aproximadamente 5 vidas medias para alcanzar el estado estacionario, as que los compuestos que se eliminan muy lentamente tardan mucho en alcanzarlo. El clculo de la concentracin en estado estacionario se hace con la siguiente ecuacin: C* = FD/tTs Donde: C* es la concentracin en el estado estacionario; D es la dosis; F la biodisponibilidad o fraccin de la dosis absorbida;

Ts es el tiempo de residencia en el organismo y t es el intervalo entre dosis.

3.6. Biotransformacin. Biotransformacin Fase I (http://superfund.pharmacy.arizona.edu/toxamb/c2-3-4-1.html) La Fase I es un conjunto de reacciones de oxidacin que preparan a los txicos para que puedan transformarse por las reacciones de la Fase II. Esto lo logran transformando los grupos funcionales del xenobitico en sitios que pueden llevar a cabo reacciones de la Fase II, o bien introducen grupos nuevos que le dan esta caracterstica. Para hacer este trabajo las clulas cuentan con dos sistemas de enzimas, que tienen la funcin de introducir en el substrato un tomo de oxgeno proveniente del oxgeno molecular (oxigenasas de funcin mixta). Estos dos sistemas son las aminooxigenasas y los Citocromos P-450. Ambos sistemas se encuentran localizados en el retculo endoplsmico. Las amino-monoxigenasas oxidan aminas y compuestos sulfurados. Los diferentes, Citocromos una tiene P-450 estn formados por dos protenas una

funcin

de reductasa y

la otra es

hemoprotena con actividad de oxigenasa. La oxigenasa es una protena, que en estado reducido y monoxicarbonada, presenta un pico de absorcin a 450 nm. Que es lo que le da el nombre a esta familia de enzimas). El mecanismo de la reaccin de la oxidacin del xenobitico catalizada por citocromo P-450, en trminos generales es como sigue: (A) el xenobitico entra a su sitio activo que se encuentra en la oxigenasa, (B) la reductasa transfiere un electrn al hierro hemtico

reducidolo del nivel (III) a (II), de frrico a ferroso, (C) la reduccin abre el sitio activo del O2, (D) el O2 entra a su sitio activo y oxida al xenobitico que est en la superficie de la enzima transfirindole uno de los tomos de oxgeno. Existen varios Citocromos P-450 que se diferencian en su especificidad, por ejemplo, el P-450 IIE oxida al etanol y el P-450 IA oxida al alfa-benzo-pireno. Si la concentracin de oxgeno en la clula es muy baja, entonces la reaccin catalizada por el Citocromo P-450 es una reduccin en la que el NADPH acta como donador de iones hidruro. Las reacciones de reduccin ms comunes son la transformacin de nitroderivados aromticos a aminas, la azoreduccin de aminas primarias y la deshalogenacin reductiva. La reduccin puede dar lugar a la formacin de un radical libre ms txico que el xenobitico original, capaz de producir daos en el ADN. Esta biotransformacin es entonces una bioactivacin. Por ejemplo; el tetracloruro de carbono sufre la deshalogenacin reductiva produciendo el radical libre triclorometilo.

Reacciones Comunes de Oxidacin en la Fase I.

Reacciones de Reduccin Catalizada por Citocromo P-450.

Reacciones de Exposicin de Grupos Funcionales Los Citocromos P-450 exponen grupos funcionales catalizando reacciones de desalquilacin, desaminacin y deshalogenacin . Las peroxidasas catalizan reacciones entre los xenobiticos y los perxidos

endgenos, permitiendo, al mismo tiempo, que la clula oxide al xenobitico y se deshaga de estos compuestos endgenos altamente txicos. El producto de esta reaccin es un alcohol que puede ser destoxificado por una alcohol deshidrogenasa. Biotransformacin Fase II La Biotransformacin Fase II, tal como se mencion

anteriormente, consiste en reacciones de conjugacin, catalizadas por un conjunto de enzimas, la mayora de ellas localizadas en el citosol. Las reacciones consisten en agregar un grupo polar de tamao relativamente grande a los productos de las reacciones de la Fase I o a los xenobiticos originales que contienen los grupos funcionales apropiados para ser substratos de las reacciones de conjugacin. Los donadores de los grupos polares tienen que ser compuestos de alta energa, ya que las reacciones de conjugacin no son termodinmicamente favorables. El resultado que se logra con estas reacciones es un gran incremento de la solubilidad en agua del xenobitico. Glucuronidacin.- La reaccin consiste en agregar un grupo glucuronil en un grupo hidroxilo, amino o sulfhidrilo del txico. La enzima que cataliza la reaccin es la UDP glucuronil transferasa y el donador del grupo polar es el cido UDP glucurnico. La enzima se encuentra localizada en el retculo endoplsmico, a diferencia de las otras enzimas de la Fase II que se localizan en el citosol. Los compuestos glucuronidados son muy solubles en agua y aparecen en la orina y en la bilis. Existe un nmero muy grande de xenobiticos que son substrato de esta enzima. Sulfatacin.- La reaccin consiste en la transferencia de un grupo sulfato de PAPS (3-fosfoadenosil-5-fosfosulfato) a un grupo hidroxilo o amino en el xenobitico. La reaccin es catalizada por

sulfotransferasas, enzimas solubles localizadas en el citosol. El producto de la reaccin es un sulfato orgnico ionizado, muy soluble en agua que se excreta en la orina. Aminoacidacin.- La reaccin consiste en la formacin de una unin peptdica entre el grupo amino de un aminocido, normalmente glicina, y un carboxilo en el xenobitico. Obviamente para que esta reaccin se pueda dar es indispensable que el xenobitico tenga un grupo carboxilo. Estos conjugados son eliminados en la orina debido a que el sistema de transporte del rin reconoce al aminocido. Glutationizacin.- La glutationizacin consiste en la adicin de glutatin (GSH), a travs de su grupo sulfhidrilo (nucleoflico), con un carbn electroflico del xenobitico. La reaccin es catalizada por la glutatin-S-transferasa y el glutatin mismo es el cofactor de alta energa. El glutatin es un tripptido, Glu-Gli-Cis. El compuesto que se forma se rompe en el rin produciendo el Cis-derivado, que se acetila para producir un conjugado del cido mercaptrico, el cual se excreta en la orina. Esta reaccin es importante en la destoxificacin de epxidos y perxidos. La glutatin-S-transferasa se encuentra en clulas de muy diversos tejidos. Si esta reaccin disminuye significativamente el nivel celular de glutatin, el organismo puede sufrir daos considerables debido a la peroxidacin de lpidos o por otros tipos de agresin qumica. Metilacin.La metilacin juega un papel menor en la

biotransformacin de xenobiticos, excepto en la destoxificacin de arsnico. Los compuestos inorgnicos de arsnico se transforman en metabolitos monometilados y dimetilados que son menos txicos. La reaccin consiste en la transferencia de un grupo metilo a un hidroxilo, amino o sulfhidrilo, es catalizada por las metiltransferasas y el compuesto donador de grupos metilo es la SAM (S-adenosilmetionina). La metilacin es importante en la transformacin de

compuestos endgenos y forma parte en la biosntesis de varios aminocidos y esteroides, as como en la metilacin del ADN. Las reacciones de la Fase I activan grupos funcionales, la metilacin los enmascara impidiendo que participen en reacciones de la fase II, por lo tanto, si se metilan los xenobiticos se disminuye la tasa de eliminacin del compuesto. Como se puede ver, varias de las reacciones de la Fase II requieren de los mismos grupos funcionales, as que los compuestos que pueden ser modificados por ms de una enzima entran en reacciones que son mutuamente competitivas. Qu tanto tiene lugar una reaccin determinada depende, de la capacidad del tejido para llevar a cabo la reaccin y de la afinidad de la enzima por el substrato. La capacidad est definida por la cantidad de cofactor presente en el tejido cuando ste es expuesto al xenobitico. Capacidades y Afinidades de las Reacciones de Conjugacin REACCIN Glucuronidacin Aminoacidacin Sulfatacin Glutationizacin Acetilacin CAPACIDAD Alta Media Baja Baja Variable AFINIDAD Baja Media Alta Alta Variable

Por ejemplo, el fenol contiene un grupo hidroxilo y puede ser transformado por una glucuroniltransferasa o una sulfotransferasa. La capacidad de estas reacciones depender de la concentracin celular de UDP glucuronato y PAPS. Cuando se administran cantidades pequeas de fenol, aparece el sulfoester en la orina, si se administran cantidades crecientes de fenol,

se incrementar la concentracin del sulfoester y posteriormente aparecer el derivado glucuronidado. Esto significa que el fenol tiene mayor afinidad por la sulfotransferasa, esta reaccin proceder hasta que se agote la disponibilidad de PAPS. Cuando se agota el PAPS se empieza a utilizar el UDPglucuronato. En el caso de la N-acetilacin, las afinidades y capacidades pueden cambiar debido al polimorfismo de esta enzima (acetiladores lentos contra los acetiladores rpidos).

Reacciones de Conjugacin de Fase II. Los hidrocarburos aromticos policclicos (PAHs) tienden a bioacumularse en peces y moluscos, mientras que los peces tienen un conjunto de enzimas de la fase I y II que asimila, distribuye, metaboliza y elimina (ADME) estos compuestos y en cuestin de das despus de la exposicin de estos txicos solo se encuentran niveles detectables de PAHs en la bilis en forma de compuestos hidrosoluble, producto de la fase II.

En los moluscos esta biotransformacin es muy lenta y los PAHs tienden a acumularse en estos organismos. Bioactivacin La bioactivacin es el conjunto de reacciones metablicas que incrementan la toxicidad de los xenobiticos, o sea que los metabolitos resultantes de la biotransformacin de la sustancia absorbida son ms txicos que el compuesto original. Por ejemplo las toxinas de las mareas rojas incrementan su toxicidad cuando son metabolizadas en el hgado de los peces. La mayora de las bioactivaciones son producidas por las enzimas de la Fase I, aunque algunas de las enzimas de la Fase II tambin pueden bioactivar algunos xenobiticos. Este efecto lateral indeseable de la biotransformacin ocurre cuando se producen especies qumicas muy reactivas, normalmente compuestos electroflicos con gran afinidad por los nuclefilos. El ADN, las protenas y los lpidos son nuclefilos. La mayora de las reacciones en los que se generan productos de aduccin de ADN y protenas se deben a la interaccin de estas macromolculas con los productos de las reacciones de bioactivacin. El acetoaminofn se N-hidroxila en el hgado, va un Citocromo P-450. El producto de la hidroxilacin reacciona con protenas del hgado, produciendo hepatotoxicidad. La aduccin del ADN es un tema de estudio de gran importancia, ya que da por resultado la transformacin de las clulas normales en cancerosas. El benzo-alfa-pireno es un cancergeno que es bioactivado en el hgado, formando un epoxidiol altamente electroflico que se liga al ADN. Existen varios mecanismos por medio de los cuales una substancia puede incrementar la toxicidad de otra:

Induccin de Enzimas. Un xenobitico puede inducir una enzima que bioactiva a otro xenobitico. Por ejemplo el etanol induce la sntesis del Citocromo P-450 que bioactiva al tetracloruro de carbono. Esta interaccin hace que el tetracloruro de carbono sea ms txico cuando se administra junto con alcohol Inhibicin de enzimas. La inhibicin tambin puede incrementar la bioactivacin. Por ejemplo, una substancia que bloquee la sntesis de los Citocromos P-450 har que el organismo se vuelva ms susceptible a los txicos que son destoxificados por los P-450. Las substancias que inhiben la sntesis de Citocromo P-450 tambin pudieran servir de antdoto si la especie txica es producto de la bioactivacin del xenobitico por el Citocromo P450 Las rutas de Bioactivacin son las siguientes:

1. El

tejido

blanco

contiene

las

enzimas

para

bioactivar

el

xenobitico y es el sitio activo para la especie txica. El ejemplo clsico de esta ruta es la bioactivacin del tetracloruro de carbono va la deshalogenacin por el P-450 del hgado, produciendo el radical libre triclorometilo, el cual reacciona con protenas y lpidos del hgado. 2. Un tejido no blanco bioactiva al xenobitico, el cual experimenta otra bioactivacin en el tejido blanco. Ejemplo, el benceno es oxidado a fenol por los P-450 del hgado y este compuesto se transporta hasta la mdula sea donde se transforma en hidroquinol,
un diol que causa dao en la mdula sea.

3. Un tejido no-blanco bioactiva el xenobitico, el cual tiene sus efectos en el tejido blanco. Ejemplo: el hexano se transforma en 2,5-hexanodiona por la accin del P-450 y la alcohol deshidrogenasa del hgado. Este metabolito produce ligaduras

cruzadas en los neurofilamentos causando dao en nervios perifricos.

Ejemplos de Reacciones de Bioactivacin En resumen:

La

biotranformacin

Fase

son

reacciones

de

oxidacin

catalizadas por un sistema complejo de enzimas que convierten los xenobiticos no polares en compuestos solubles en agua. La mayora de los xenobiticos no seran substrato de las enzimas de la Fase II sin las transformaciones introducidas por las reacciones de la Fase I

A bajas concentraciones de oxgeno, los Citocromos P-450 pueden catalizar reducciones de los xenobiticos Las reacciones de la Fase I pueden dar lugar a bioactivaciones Las reacciones de la Fase II son adiciones de residuos polares en los grupos funcionales del xenobitico, normalmente producidos

en la Fase I, que dan productos mucho ms solubles en agua que los compuestos absorbidos y los productos de la Fase I

Algunas reacciones de la Fase II producen compuestos menos solubles en agua La capacidad de los tejidos para hacer transformaciones Fase II depende de la cantidad disponible de cofactores en las condiciones fisiolgicas en las que se encuentra el organismo

Normalmente el organismo tiene las defensas adecuadas para manejar la agresin qumica para lo cual cuenta con lo siguiente:

las enzimas de las dos fases de la biotransformacin la presencia de antioxidantes que eliminan radicales libres y reducen especies txicas las protenas plasmticas que ligan los txicos en el plasma sanguneo impidiendo su difusin hacia los tejidos La toxicidad ocurre cuando todas las defensas han sido vencidas.

Por ejemplo el fenol, como vimos anteriormente, se destoxifica primero por sulfatacin y despus por glucuronidacin. Cuando se agotan los dos cofactores para estas reacciones, el fenol se empieza a acumular y se produce su distribucin hacia su sitio activo, la mdula sea, donde produce su respuesta txica.

Oxiradicales y Estrs Oxidativo Rand 1995. Cap 17 Fund. Aquatic Toxicology. El Oxgeno vital para la vida, oxida la materia orgnica mientras se reduce a agua. Cada molcula de O2 requiere 4e- para reducirse a agua, la secuencia de la reaccin es:

O 2 +e 2 O
2H O 2 +e H 2O 2 H H 2O 2 +e OH + H 2O . . H OH +e H 2O
+ + +

Reaccin Neta En esta

H O 2 + 4e 4 H 2O

secuencia

se

producen

radicales

como

el

O2-

(superxido), H2O2 (perxido de Hidrgeno) y OH-, que son muy reactivos y perjudiciales a los sistemas biolgicos. El O2-, y el OH- son radicales libres del oxgeno. El agua oxigenada; H2O2, aunque no es un radical libre es tambin muy reactiva y junto con el O 2- es un precursor del OH-:
O 2 + H 2O 2 .OH + OH + O 2

Esta reaccin es muy lenta sin embargo metales como el Fe y Cu catalizan la reaccin y facilitan la produccin de .OH.:
O 2 + Fe +3 Quelato O 2 + Fe +2 Quelato Fe +2 Quelato + H 2O 2 .OH + OH +Fe +3 Quelato

Reaccin Neta: O 2 + H 2O 2 .OH + OH + O 2

Compuestos que generan radicales libres: Quinonas, Bleumicina. Mecanismos de defensa AntioxidantesLos mecanismos de defensa de antioxidantes es el costo Bioqumico que se paga por la eficiencia del oxgeno para producir energa. Los radicales libres se generan por el oxgeno disuelto, la luz UV y por reactivos oxidantes. Los antioxidantes, que reducen su efecto nocivo, pueden ser de naturaleza hidrosoluble y liposoluble: Hidrosoluble Glutationa Liposoluble Vitamina E ( -Tocoferol) Herbicidas, Nitro-Aromticos, Hidroxi-Aminas

Aromticas, Compuestos Azo, Quelatos de Metales; Fe-EDTA , Cu-

Vitamina C

Vitamina A ( -caroteno) Xantofilas SuperOxidasaDismutasa (SOD) Catalasa

S D O 2O 2 +2 H + H 2O 2 +O 2 CT A 2 H 2O 2 2 H 2O +O 2

La clula no est indefensa contra estas especies reactivas, tiene dos lneas principales de defensa para protegerse.

La primera es la presencia de antioxidantes los cuales donan o aceptan un electrn para formar intermediarios estables. Ejemplos de ellos son el alfa-tocoferol, ascorbato y GSH.

Probablemente de mayor importancia, particularmente en la destoxificacin de radicales oxigenados y del perxido de hidrgeno, son los sistemas de enzimas protectoras. stas incluyen la perxido dismutasa, la cual convierte el superxido en perxido de hidrgeno, la GHS peroxidasa y la catalasa convierten al perxido de hidrgeno en agua. Si el radical libre no es inactivado causar daos a la clula y

puede hacerlo va la unin a un blanco o capturando un hidrgeno del blanco. Los radicales libres neutros, como el HO* y el Cl3C*, se pueden unir covalentemente a biomolculas y alterar su funcin, o en el caso que se unan a ADN el resultado sea una mutacin. Los radicales libres pueden capturar un hidrgeno de otras molculas, convirtindolos en radicales libres. La abstraccin de hidrgeno del ADN produce rompimiento o ligaduras cruzadas de las cadenas, la abstraccin por lpidos inicia la peroxidacin de estos compuestos.

El dao por radicales libres est implicado en las lesiones causadas por agentes qumicos, por radiacin, inflamacin, envejecimiento y reperfusin/isquemia. Metabolismo de Metales y Toxicidad. Se pueden clasificar en dos tipos Metales esenciales : Cu, Mn, Zn Metales no esenciales: Cd, Pb, Hg La exposicin a concentraciones elevadas de ambos tipos de metales es txica, los metales generan enlaces no especficos a biomolculas. El metabolismo y biotransformacin de un metal y su enlaces dentro de las clulas, generan quelatos que bien pueden ser almacenados en compartimientos intracelulares o pueden eliminarse. Los mecanismos de biotransformacin en macro y microalgas pueden implicar diferentes procesos como la unin con Metalotioeninas, sntesis de fitoquelatos o la formacin de complejos con polifenoles o Taninos. Las Metalotieneinas son protenas de bajo peso molcular ricas en cysteina que compleja iones metlicos en anillos Tiol. La funcin de estas protenas es la de quelar las trazas de metales y reducir la concentracin de iones libres, citotxicos. Las microalgas se pueden emplear en la purificacin de agua contaminada con metales pesados. (W. Gekeler, E. Grill, E. Winnacker, and M.H. Zenk, Arch Microbiol, 1988, 150, 197.) En las algas pardas y en menor proporcin las algas rojas, contienen diferentes tipos de polifenoles sulfatados que tienen la capacidad de quelar o secuestrar irreversiblemente una gran cantidad de metales pesados. de Los polifenoles de algales estan compuestos principalmente unidades 1,3,5-trihydroxybenzoid

(floroglucinol-). Los

Tambien los Bromochlorofenoles como la sal

dibsica del potasio de 2,3,-dibromo-5-hydroxyl-1,4-disulfato son muy efectivos en secuestrar iones metlicos. Estos mecanismos de biotransformacin actuan como

reguladores de metales esenciales y no esenciales y modulan su biodisponibilidad para las macromolculas. Se conoce que algas pardas como el Fucus vesiculosus tienen la capacidad de asimilar grandes cantidades de metales sin sufrir dao en su metabolismo.

CRITERIOS PARA LA SELECCIN DE ORGANISMOS DE PRUEBA. Principios de Weil. Semejanza Metablica Para generar la dosis de referencia (DRf) de un medicamento

para su aplicacin en Humanos se debe de considerar que existe un factor de incertidumbre (Uf) que se presenta cuando se usan animales de prueba como modelos de toxicidad para humanos. La magnitud de esta incertidumbre de puede determinar por evaluacin de las variaciones Inter-qumicas que existen entre las proporciones de dosis asociadas con efectos toxicolgicos similares en animales de laboratorio y humanos: Uf= NOAEL crnico en Animales/ NOAEL crnico en Humanos NOAEL (Non Observed Adverse Effects Level) es el nivel de exposicin experimental que representa el mximo nivel probado al cual no se observan efectos txicos. Para el propsito de evaluacin de riesgos ste es el dato clave que se obtiene de los estudios de DosisRespuesta. Si las exposiciones experimentales fueron intermitentes, se corrige el valor del NOAEL para que representen exposiciones continuas. De esta evaluacin se observa que: La evidencia de toxicidad se incrementa con el peso corporal, sin embargo los humanos no son siempre mas sensibles a una dosis que los animales. Los valores de las proporciones de Uf son menores a 10 en la mayoria de los casos pero no para todas las drogas.

Mientras mas informacin se tenga sobre una droga en diferentes especies, abulones, camarones, almejas y monos, la dosis de referencia, DRf, que se obtiene permite reducir el factor de incertidumbre, Uf.

Los datos de comparacin entre especies sugieren que las proporciones pueden variar segn la dosis empleada en el ensayo.

Adems de las consideraciones anteriores para la evaluacin del Uf, se debe de tener en cuenta la variabilidad interhumana, porque cuando se tienen datos suficientes sobre el efecto de una droga en Humanos, su dosis se puede estimar sin la necesidad de aplicar el factor de incertidumbre Uf. Pero, cuando no existen datos suficientes sobre seres humanos sensibles, al Uf se agrega otro factor de incertidumbre que expresa la variabilidad en respuestas entre individuos y se trata con un factor de 10 veces. Este factor de incertidumbre asume que existe variabilidad de respuesta entre humanos y que esta variabilidad no se puede obtener categricamente debido al tamao de la muestra que se puede usar es muy reducido. Este factor tambin implica que existen sub-poblaciones de humanos que son mas sensibles a la toxicidad de un producto qumico que el promedio de la poblacin mundial. La variabilidad de respuesta a dosis de drogas es mayor en humanos que en entre animales humanos de en laboratorio, su existen de diferencias metabolizar considerables poblacin. Para calcular La dosis de referencia DRf se dividen los niveles NOAEL sobre el producto de todos los factores de incertidumbre Uf, observados. capacidad

Xenobioticos y el factor de 10 veces incluye entre el 80 y 95% de la

DRf= NOAEL/ Ufn 4.1.2. Vias de entrada. Consideraciones sobre la va de exposicin. La filosofa detrs del clculo de la DRf es la misma, independientemente de cual sea la va de exposicin, sin embargo, la forma de calcularla es diferente. Si en los estudios experimentales la exposicin fue intermitente, la DRf se calcula ajustando los valores observados de tal manera que reflejen exposiciones continuas. El procedimiento de clculo de las dosis de referencia orales es el descrito anteriormente. Los valores tabulados de las DRf estn expresados en mg de substancia por Kg de masa corporal por da. Cuando la va de exposicin es el aparato respiratorio, la extrapolacin de datos obtenidos con animales debe de considerar

Las diferencias anatmicas entre el animal de estudio y el hombre. Estas diferencias pueden afectar el patrn de deposicin, salida y redistribucin de los contaminantes. Consecuentemente, las diferentes especies, no recibirn la misma dosis de contaminante en los mismos lugares del aparato respiratorio, aunque hayan estado expuestos a las mismas concentraciones de partculas o gases. Las dosis calculadas en animales se convierten a dosis equivalentes en humanos sobre las bases de consideraciones de fisiologa comparada, v.g., parmetros de ventilacin y superficie de las diferentes regiones pulmonares.

Las diferencias en las caractersticas fsicoqumicas de los contaminantes, tales como tamao y forma de las partculas, o si el contaminante es un aerosol o un gas, tambin influyen en los patrones de deposicin, salida y redistribucin.

Los valores de DRf tabulados se expresan en funcin de la concentracin del txico en el aire en mg por metro cbico para una exposicin continua de 24 horas por da. Otros ndices. Adems de las DRf se han calculado y publicado otros ndices de toxicidad que se denominan HA1 y HA10 para exposiciones de corta duracin. Son concentraciones de contaminantes en agua potable, a las cuales no se presentan efectos adversos si la exposicin es de una duracin especificada, un da o 10 das respectivamente. Estos ndices de toxicidad no-cancergena se obtienen dividiendo el NOAEL por los Uf y UFM adecuados. Se basan en que un nio de 10 Kg. ingiere 1 litro de agua por da y se incluye un margen de seguridad para proteger a los miembros ms sensibles de la poblacin. Los HAs no incluyen ningn riesgo cancergeno an si la substancia es un cancergeno potencial. 4.2. Criterios para la seleccin de organismos de prueba. Se entiende por bioensayo un ensayo en que un tejido, organismo o grupo de organismos vivos se usan como reactivo para determinar la potencia de cualquier sustancia fisiolgicamente activa cuya actividad se desconoce (FAO, 1981). Los bioensayos, o pruebas de toxicidad son experimentos que miden el efecto de uno o ms contaminantes en una o ms especies (Reish y Oshida, 1987), permiten evaluar el grado de toxicidad de una sustancia qumica, un efluente, un cuerpo de agua, etc., empleando organismos vivos (Esclaps, 1999). Puede determinarse la influencia relativa de cada factor sobre los parmetros biolgicos estudiados. Los rangos de variacin de los factores considerados pueden ser mayores que los existentes en el ambiente natural, lo que muchas veces facilita el estudio de su modo de accin. Tambin pueden estudiarse combinaciones de dos o ms factores, lo que permite revelar la existencia de antagonismos o sinergismos entre ellos. La posibilidad de

controlar muchas de las variables hace posible la eliminacin de las fluctuaciones propias de las condiciones naturales, que generalmente oscurecen o interfieren con la finalidad principal del estudio llevado a cabo (Rodrguez et al., 1995). Seleccin de Especies Para obtener la mxima informacin de los bioensayos es necesario escoger los organismos ms apropiados. Se debe tener en cuenta que requieren diferentes perodos de aclimatacin en el laboratorio, segn las especies, y es sumamente importante que los organismos de ensayo se manipulen con cuidado, no sufran daos, se encuentren sanos y sean de edad o tamao uniformes (FAO, 1981); Segn Henry (1988) la seleccin de organismos para bioensayos debe basarse en:

Los objetivos del programa toxicolgico La informacin disponible sobre los posibles organismos Las caractersticas de las especies Las instalaciones y equipos de laboratorio El nivel de capacitacin de los tcnicos Criterios generales de seleccin: Existe suficiente informacin sobre la historia de vida del

organismo? Sobre las tcnicas de cultivo? Sobre los procedimientos de bioensayos? (Henry, 1988). Los organismos acuticos frecuentemente tienen ciclos de vida y requerimientos de cultivo y de manejo complejos. El desarrollo de esta informacin es una tarea larga que frecuentemente requiere aos de investigacin. Es recomendable que se consideren solo aquellos organismos de los que se tiene suficiente. Adaptabilidad de los organismos como especies para

bioensayos. Adaptabilidad del organismo Organismos para bioensayos Cultivo de laboratorio Recoleccin de campo Comnmente utilizado como un organismos para bioensayos 1. Algas Excelente Disponoble Muy difcil de 2. Protozoos Excelente recolectar cultivo puro 3. Invertebrados a. Planctnicos Muy difcil de 1. Rotferos Bueno recolectar cultivo puro Alta tasa de mortandad 2. Cladceros Excelente despus de la recoleccin de campo Alta tasa de mortandad 3. Coppodos Mediano despus de la recoleccin de campo 4. Camarones Bueno Bueno Si Limitado Si Limitado Muy limitado Si

b. Bnticos 1. Anlidos 2. Insectos 3. Moluscos 4. Crustceos 4. Peces Mediano Bajo Bueno Bajo Excelente Mediano Mediano Mediano Mediano Alta tasa de mortandad despus de la recoleccin de campo (Henry, 1988) Es apropiado el ciclo de vida de los organismos a los objetivos y diseos? (Henry, 1988). El diseo de los bioensayos tiene que ser cuidadosamente considerado en el contexto del ciclo de vida del organismo. La mayora de los protocolos de bioensayos agudos y crnicos requieren organismos jvenes o recin nacidos. Sin embargo, algunos protocolos tales como la prueba de crecimiento de ostras, se aplican a organismos adultos. Asimismo, para pruebas crnicas que involucran reproduccin, el tiempo requerido para la reproduccin del organismo es un factor clave (Henry, 1988). El bioensayo es para toxicidad en agua o en sedimentos? Para sedimentos, es el objetivo determinar las sustancias txicas que se filtrarn hacia el agua superficial o las sustancias txicas que pueden acumularse en los organismos bnticos? (Henry, 1988). Si Limitado Si Si

Los sedimentos pueden servir como fuentes de sustancias txicas para el agua superficial o para los organismos bnticos que viven en los sedimentos. Las sustancias txicas que se mueven desde los sedimentos hacia el agua superficial pueden ser determinados preparando lixiviados del sedimento para bioensayos. Tambin pueden ser de preocupacin las sustancias txicas que estn estrechamente ligadas a los sedimentos y que pueden ser bioconcentradas en organismos bentnicos, particularmente cuando stos son un componente importante de una cadena alimenticia que resulta en la exposicin humana (Henry, 1988). Los bioensayos para determinar toxicidad en agua o de sedimentos en contacto con agua se realizan en mejor forma con organismos planctnicos o de libre natacin. An cuando el sedimento puede ser el material de prueba, la toxicidad puede ser evaluada exponiendo los organismos planctnicos a un lixiviado o a un extracto del sedimento usando el agua superficial (Henry, 1988). Si se sospecha la presencia de sustancias txicas firmemente ligadas a los sedimentos, entonces deben usarse los organismos bentnicos en contacto directo con los sedimentos. Estas pruebas revelarn cualquier toxicidad de los sedimentos y tambin el potencial de bioacumulacin de las sustancias txicas y su transferencia a travs de la cadena alimenticia (Henry, 1988). Caractersticas de un organismo ptimo para bioensayos: Representativo del ambiente, de amplia distribucin en el pas o de importancia comercial (Esclaps, 1999). Disponibilidad, ser fciles de encontrar, en nmero suficiente y colectarse sin dificultad. Se debe tomar en cuenta problemas con el transporte (FAO, 1981). Con un tamao suficientemente pequeo para poseer los necesarios por experiencia y que sean representativos para los estudios estadsticos (FAO, 1981).

De fcil cultivo, lo que garantiza un adecuado suministro de organismos en los ensayos y el establecimiento con exactitud de la edad o estado de desarrollo. La edad es de suma importancia en los bioensayos, ya que la sensibilidad puede variar significativamente durante su desarrollo (Esclaps, 1999).

Especies

con

gran

susceptibilidad

exposiciones

con

sustancias xenobiticas. Garantizando cubrir el peor de los escenarios, y proporcionando resultados que ofrecen una alta proteccin al resto de la cadena trfica (Esclaps, 1999). El uso de ms de una especie permitir una determinacin ms cuidadosa de toxicidad porque los organismos acuticos varan en su respuesta a las sustancias txicas. Por ejemplo, los peces pueden ser ms sensibles que los invertebrados a una sustancia qumica, mientras que puede suceder lo contrario con otra sustancia qumica (Henry, 1988). Organismos criados en el laboratorio para bioensayos. Ventajas: Disponibilidad en forma inmediata de organismos aclimatados, saludables, que han sido criados bajo las mismas condiciones (Henry, 1988). Los organismos cultivados minimizan la variabilidad gentica que supondra traer individuos capturados en diferentes localidades geogrficas (Esclaps, 1999). La respuesta de los organismos para bioensayos a la sustancia txica est influenciada por factores tales como su edad (los animales jvenes son usualmente ms sensibles), dieta (los animales bien alimentados brindan respuestas ms consistentes), estrs (los organismos alterados son ms sensibles) y condiciones fsicas como temperatura, luz y el nivel de oxgeno disuelto en el agua (Henry, 1988). Los organismos para bioensayos cultivados en laboratorio representan una fuente predecible de organismos de prueba de una edad conocida. El uso de condiciones estndares de

laboratorio y de alimentacin asegurar que todos los organismos de prueba respondern a las sustancias txicas en forma similar con el paso del tiempo. Es una caracterstica importante cuando se comparan los resultados de diferentes laboratorios (Henry, 1988). Desventajas: Muchos organismos con ciclo complejo de vida o informacin insuficiente sobre su cultivo no pueden ser cultivados en el laboratorio. Por lo tanto, la variedad de organismos est limitada cuando se usan los que han sido cultivados en el laboratorio. Los requerimientos de cultivo para organismos acuticos varan sustancialmente, an entre especies estrechamente relacionadas. Es necesario conocer el alimento ptimo, la temperatura, el ciclo de luz y el agua a fin de mantener cultivos continuos en el laboratorio. Aunque muchas algas, invertebrados y especies de peces se han usado como organismos para bioensayos, slo existe informacin disponible sobre algunas especies, que permiten un cultivo satisfactorio de laboratorio (Henry, 1988). Falta de representatividad a las condiciones y organismos en la comunidad a ser probada. El aspecto negativo de los organismos estndares criados en el laboratorio es que ellos no son necesariamente representativos de la comunidad acutica o de las condiciones de salud de los organismos de cada lugar. Por lo tanto, si el objetivo es estudiar un efluente especfico o la descarga a un ro o lago, entonces deben considerarse los organismos recolectados en el campo como una alternativa (Henry, 1988). Organismos recolectados en el campo para bioensayos

Segn Henry (1988), existen circunstancias en las que los organismos recolectados en el campo son apropiados. Las siguientes son algunas preguntas que necesitan hacerse antes de decidir usar los organismos recolectados directamente del medio.

Puede recolectarse el organismo directamente del campo? Esto ocurre en poblaciones grandes, monoespecficas?

Estn los organismos disponibles durante todo el ao o slo durante ciertas estaciones?

Es el organismo sensible al manejo durante su recoleccin y transporte al laboratorio?

Se adaptar el organismo al agua del laboratorio o se necesita un abastecimiento de agua fresca diariamente desde el campo?

Ventajas: Representativo de la comunidad impactada por el efluente. Se puede seleccionar una especie importante en una comunidad especfica (Henry, 1988). Las pruebas de microcosmos conteniendo muchas especies pueden prepararse fcilmente. Se pueden desarrollar exmenes con varias especies en la misma cmara de prueba. Los organismos que son compatibles, tales como caracoles, almeja, peces y plantas acuticas pueden incluirse en la misma cmara de prueba, permitiendo un estudio simultneo de efectos mltiples (Henry, 1988). Los bioensayos hechos en el laboratorio utilizando organismos recolectados en el campo han sido menos satisfactorios, con muy pocas excepciones. Los organismos recolectados en el campo son ms satisfactorios cuando el laboratorio est cerca al lugar de recoleccin y el abastecimiento de agua desde all est siempre disponible (Henry, 1988). Desventajas: El estrs y la mortalidad frecuentemente estn asociadas con los procedimientos de recoleccin y transferencia. Muchos organismos pueden morir antes o durante la prueba y otros pueden ser inusualmente sensibles a sustancias txicas como resultado de la presin asociada con los procedimientos de recoleccin y transferencia. Las muertes en los controles pueden invalidar la prueba (Henry, 1988). La disponibilidad de los organismos puede estar limitada. Muchas especies no abundan

durante todo el ao o tienen varios cambios en su ciclo de vida (Henry, 1988). La edad, salud y condiciones de cultivo de los organismos son desconocidas. No existe manera de obtener organismos "estandarizados" del campo y frecuentemente hasta la edad es desconocida (Henry, 1988). Los invertebrados son un grupo mucho ms diverso que las algas o los peces, con diferencias dramticas en su forma fsica, sus caractersticas histricas de vida y sus requisitos de cultivo (Henry, 1988). Es conveniente el uso del plancton en los bioensayos debido a su pequeo tamao y porque con ellos es posible realizar muchos ensayos en espacios reducidos. Su ciclo vital es muy corto y se conocen sus necesidades nutricionales. Son buenos para los estudios de bioacumulacin, puesto que se ubican en el nivel ms bajo de la pirmide trfica (FAO, 1981).

ESTRATEGIAS

PARA

LA

VALORACIN

DE

SUSTANCIAS

BIOACTIVAS. 5.1. Bioprospeccin. La bioprospeccin es la bsqueda de elementos tiles de la naturaleza, generalmente para fines comerciales o medicinales. El potencial biomdico de los organismos marinos representa una fuente muy grande de compuestos con actividad biolgica de importancia medicinal pero aun mas importante que esto representan una fuente de modelos moleculares para la sntesis de medicamentos mas eficientes. 5.1.1. PLANEACIN Y BSQUEDA DE ANTECEDENTES Como la meta de la bioprospeccin es la identificacin de nuevos agentes farmacolgicos, una pregunta muy importante es que actividades se han observado y que conclusiones se han generado de

ellas?? Con respecto a la relacin de actividad de acuerdo al phyla, ambiente marino, temperatura, profundidad, localidad geogrfica. Con respecto al phyla se ha observado que la actividad es una propiedad general, pero hay actividades especficas que se concentran en cientos phylas, por ejemplo la actividad antifungal se observa principalmente en los Holothuridos (Echinodermata). Durante la campaa AHCE 1978 (Alpha Helix Caribbean Expedition) se evaluaron unas 650 especies en actividades antibacteriales, antifungales y antivirales, adems de citotxicas. Actividades, antimicrobianas, antivirales y citotxicas en

diferentes pilas. Bioprospeccin Alpha Helix Caribbean. 1978. % de Especies activas Phylum Porifera Cnidaria Ectoprocta Mollusca Annelida Arthropoda Echinodermata Chordata Cyanophyta Chlorophyta Phaeophyta Rhodophyta Tracheophyta Especies E.c evaluadas 187 70 1 20 3 6 36 27 5 42 19 43 3 14 4 100 5 33 0 0 15 20 7 0 10 0 B.s. 41 26 100 15 0 0 3 37 60 55 37 35 0 S.c. 19 7 0 0 0 0 50 15 20 10 0 7 0 P.a. 11(138) 2 (66) 0 0 (17) 0 0 26(27) 14(22) 0 (4) 5 (41) 0 (18) 0 0 HSV-1 14 17 0 0 0 0 16 23 100 7 25 17 33 CV-1 62 56 0 33 0 0 72 70 80 36 50 43 0

E.c. Escherichia coli, B.s. Bacillus subtilis, S.c. Saccharomyces cereviseae, P.a. Penicillym atrovenetum., HSV inhibicin del virus del Herpes simples, CV,citotoxicidad a las clulas del higado de chimpanc a ; 200 g/disco Los datos de la expedicin R/V Seward Jonson Sea Pharm en el caribe occidental en 1985 y en Islas Galapagos en 1986, comparan las

actividades respecto a la profundidad e indican que a pesar de ser localidades diferentes, las actividades son similares en las dos localidadas. La actividad presenta patrones parecidos en organismos bentnicos de profundidades de 600 a 762m. La principal limitante en la colecta de organismos a profundidades superiores es por supuesto el costo. Son pocas las variaciones con la profundidad las actividades antibacteriales y antifungales se reducen generalmente en organismos colectados en aguas profundas. Este fenmeno probable esta relacionado con las temperaturas del agua, ya que la incidencia de actividades antibacteriales y antifungales en organismos colectados en la costa oeste de Espaa asi como en Maine y Nueva Escocia son muy bajas mientras que las actividades citotxicas y antivirales se presentan en intervalos normales. Las actividades con respecto a la temperatura del agua indican que los organismos de zonas trpicales exhiben mayores actividades que aquellos de aguas templadas. Esto se refleja principalmente en la presencia de Icthiotoxinas de esponjas y holoturidos. Las aguas frias de las costas Nororientales de Estados Unidos, orientales de Canada, Oeste de Espaa y Nueva Zelanda son zonas ricas de aprovisionamiento de sustancias con actividades antitumor, citotxicas y antivirales La bioprospeccin de una gran cantidad de especias marinas han producido la generacin de agentes farmacuticos en diferentes reas como antitumorales, antiinflamatorios, antivirales, antibacteriales y citotxicos. 5.1.2. Mtodos para la colecta y acopio de datos.
Recoleccin de datos

Para la recoleccin de los datos o toma de observaciones se deben tener en cuenta las siguientes recomendaciones:

i). El experimentador debe liberarse de toda simpata personal hacia determinado tratamiento que pudiera sesgar los resultados. ii). Todas las observaciones que se tomen deben ser anotadas cuidadosamente en un registro apropiado, no dejando nada a la memoria. Los datos deben anotarse en forma ordenada, de tal forma que puedan ser utilizados por otro experimentador si fuese necesario en una fecha ms o menos lejana, quien debe poder entender todas las anotaciones. iii) Se recomienda que el experimentador cules tome son las los

observaciones

(aleatoriamente)

olvidndose

tratamientos de las parcelas a fn de no dejarse influir por prejuicios sobre determinados tratamientos. iv). En algunos experimentos no es prctico tomar

observaciones en toda la unidad experimental, tal es el caso de determinaciones qumicas. En estos casos es recomendable muestrear la unidad experimental para obtener subunidades. Generalmente hay mas variabilidad entre las unidades que entre las subunidades experimentales. Es por esto que no debe haber mucho inters en muchas determinaciones qumicas en cada unidad experimental, ya que las subunidades solo sirven para estimar las UE, y el experimentar est basado en la variabilidad entre las UE y no entre subunidades experimentales. Un aspecto muy importante en el desarrollo de los bioensayos es la reproducibilidad de estas pruebas, lo que consiste en obtener resultados similares con la misma sustancia qumica. Esto requiere que las pruebas sean estandarizadas de acuerdo a protocolos muy definidos. En el caso de la especie en estudio, el nmero de resultados consecutivos contemplados se ajusta a lo recomendado por USEPA (1990), organismo que establece para una correcta intra calibracin un nmero mnimo de cinco (5) bioensayos triplicados consecutivos. Otros

organismos internacionales, como EPS (1990), indican que se debe ejecutar un nmero mnimo de veinte (20) bioensayos de toxicidad consecutivos con el txico de referencia antes que se pueda realizar una calibracin intralaboratorio. El Laboratorio de Bioensayos ha trabajado estrechamente bajo la gua de la US EPA, Los bioensayos, como toda herramienta de medicin, deben tener cierta precisin y exactitud en sus resultados. Organizaciones internacionales (ASTM, 1996; OECD 1993;ISO, 1996;EC, 1992 y USEPA, 1994) han estandarizado metodologas para la realizacin de estos bioensayos con distintos organismos, en donde adems se describen mtodos de cultivo, condiciones de los experimentos, aplicabilidades y restricciones. Una vez estandarizadas las metodologas experimentales, los laboratorios que ejecuten el bioensayo deben realizar una calibracin de su mtodo. La calibracin es un proceso relacionado con los conceptos que rigen el control de calidad, y cuyo objetivo es determinar la precisin y exactitud que puede y debe alcanzarse en los resultados generados por un determinado bioensayo. Lo anterior es til para asegurarse que la respuesta de la poblacin expuesta a cierto agente txico se deba al efecto de ste y no a variaciones tanto de la sensibilidad de los organismos como de fallas operacionales en la aplicacin del mtodo. La precisin y exactitud se determina con el concurso de un qumico llamado txico de referencia, el cual permite definir un rango de variabilidad mximo aceptable en los resultados generados por el bioensayo. Adems, los resultados de la calibracin permiten definir en forma estadstica el rango de sensibilidad de la especie frente al txico de referencia, al tiempo de exposicin y a la manifestacin biolgica empleados.

Us Epa. 1990. Methods for measuring the acute toxicity of effluents and receiving waters to freshwater and marine organism. Fourth Edition. Report 600/4-90/027F.

Pruebas de hipotesis Si queremos decidir entre dos hiptesis que afectan a un cierto parmetro de la poblacin, a partir de la informacin de la muestra usaremos el contraste de hiptesis, cuando optemos por una de estas dos hiptesis, hemos de conocer una medida del error cometido, es decir, cuantas veces de cada cien nos equivocamos. En primer lugar, veremos cmo se escribiran las hiptesis que queremos contrastar: H0 se llama hiptesis nula y es lo contrario de lo que sospechamos que va a ocurrir (suele llevar los signos igual, mayor o igual y menor o igual) H1 se llama hiptesis alternativa y es lo que sospechamos que va a ser cierto (suele llevar los signos distinto, mayor y menor)
Los contrastes de hiptesis pueden ser de dos tipos: Bilateral: En la hiptesis alternativa aparece el signo distinto.

Unilateral: En la hiptesis alternativa aparece o el signo > o el signo <.

Podemos aceptar una hiptesis cuando en realidad no es cierta, entonces cometeremos unos errores, que podrn ser de dos tipos: Error de tipo I: Consiste en aceptar la hiptesis alternativa cuando la cierta es la nula. Error de tipo II: Consiste en aceptar la hiptesis nula cuando la cierta es la alternativa. Estos errores los aceptaremos si no son muy grandes o si no nos importa que sean muy grandes.

alfa: Es la probabilidad de cometer un error de tipo I. beta: Es la probabilidad de cometer un error de tipo II.

De los dos, el ms importante es alfa que llamaremos nivel de significacin y nos informa de la probabilidad que tenemos de estar equivocados si aceptamos la hiptesis alternativa. Debido a que los dos errores anteriores a la vez son imposibles de controlar, vamos a fijarnos solamente en el nivel de significacin, este es el que nos interesa ya que la hiptesis alternativa que estamos interesados en probar y no queremos aceptarla si en realidad no es cierta, es decir, si aceptamos la hiptesis alternativa queremos equivocarnos con un margen de error muy pequeo. El nivel de significacin lo marcamos nosotros. Si es grande es ms fcil aceptar la hiptesis alternativa cuando en realidad es falsa. El valor del nivel de significacin suele ser un 5%, lo que significa que 5 de cada 100 veces aceptamos la hiptesis alternativa cuando la cierta es la nula. Solamente vamos a estudiar el contraste bilateral para la media.

CONTRASTE DE HIPTESIS BILATERAL PARA LA MEDIA

Si se cumple una de las siguientes hiptesis: El tamao de la muestra es mayor de 30 y la variable sigue un modelo normal. El tamao de la muestra es mayor de 100.

Estudiaremos el siguiente contrate de hiptesis bilateral:

Calculamos los siguientes valores: , valor experimental que se calcula a partir de la muestra.

, valor terico y es el valor que en la distribucin N(0,1) deja a su derecha un rea de alfa/2 para un nivel de significacin alfa. Es el valor z que definamos ala principio del tema.

La regla de decisin fijado el nivel de significacin, alfa, es la siguiente: Si se acepta la hiptesis alternativa, llegamos a la conclusin de que la hiptesis es cierta. Si se acepta la hiptesis nula, en realidad no podemos

afirmar que sea cierta, sino que la hiptesis alternativa no es cierta, ya que el margen de error con el que se acepta la hiptesis nula es muy grande.

Actividad 21. Un equipo de psiclogos han comprobado que en cierta poblacin infantil, el tiempo (en minutos) empleado en realizar determinada actividad manual, sigue un modelo Normal de probabilidad. Un grupo de 36 nios, seleccionados aleatoriamente en dicha poblacin, realizaron esa actividad manual en un tiempo medio de 6,5 minutos con una desviacin tpica muestral de 1,5 minutos. A partir de esta informacin, para un nivel de significacin del 1% (alfa=0,01) podamos rechazar la hiptesis de que el tiempo medio en la poblacin es de 7 minutos? Utiliza la escena siguiente.

No podemos aceptar la hiptesis alternativa, y por lo tanto no podemos rechazar la hiptesis de que el tiempo medio en la poblacin es de 7 minutos.

Actividad 22. El gerente de una empresa selecciona aleatoriamente entre sus trabajadores una muestra de 169 y anota el nmero de horas de trabajo que cada uno de ellos ha perdido por causa de accidentes laborales en el ao 2001. A partir de la informacin obtenida determina, en esos 169 trabajadores, un nmero medio de horas perdidas por accidentes laborales

en el 2001 de 36,5 horas. Sabiendo que:

donde

representa el nmero de horas perdidas por el i-simo trabajador.

a) Podramos rechazar, con un nivel de significacin del 1% la hiptesis de que el nmero medio de horas perdidas a causa de accidentes laborales en esa empresa durante el ao 2001 fue de 35 horas? b) Y para un nivel de significacin del 5%?

Adaptacin de Mara Vicenta Cabalgante Perera de la unidad:

http://descartes.cnice.mecd.es/Bach_HCS_2/inferencia_estadistica/index_inferencia.htm

en If adequate toxicity data on humans do not exist, then experimental animal data are used as the basis of the assessment, and an uncertainty factor of 10 is routinely applied to the NOAEL. The basic assumptions for this uncertainty factor are that the results seen in experimental animals are relevant to humans, that toxicokinetic and toxicodynamic differences exist among species, and that humans are more sensitive than animals at a given mg/kg/day dose or mg/m3 concentration. A number of authors have tried to quantify this area of uncertainty by investigating the ratios between animals and humans, and between different animal species for a number of parameters.

Weil, C.S. (1972). Statistics vs safety factors and scientific judgment in the evaluation of safety for man. Toxicol. Appl. Pharmacol. 21, 454-463. Weil, C.S., and McCollister, D.D. (1963). Relationship between short- and long-term feeding studies in designing an effective toxicity test. Agric. Food Chem. 11, 486-491. Factores de Incertidumbre en dosis de medicamentos entre Humanos y pruebas con animales Variabilidad De Interhuman Siempre que sea posible, los datos sobre seres humanos se utilicen para conducir el gravamen de riesgo del noncancer, de tal modo evitando los problemas inherentes con la extrapolacin de los interspecies. Si existen los suficientes datos sobre individuos sensibles, la dosis subliminal se puede estimar directamente, es decir, sin la necesidad de un factor de la incertidumbre. Si no existen los datos adecuados sobre seres humanos sensibles, se encuentra una incertidumbre que se debe tratar -ma's a menudo con un factor 10fold. Este factor de la incertidumbre asume que ocurre la variabilidad en respuesta a partir de un ser humano al siguiente y que esta variabilidad no se pudo haber detectado en el estudio, generalmente debido al tamao de muestra pequeo. Este factor puede tambin asumir que existen las subpoblaciones de seres humanos que sean ms sensibles a la toxicidad del producto qumico que la poblacin media. Dourson y Stara (1983) describen un anlisis de los datos agudos de la toxicidad en animales de experimento en 490 productos qumicos de Weil (1972), que sugiri que para el cerca de 92% de los productos qumicos un factor de diez veces rindiera una reduccin adecuada de una respuesta mediana . Concluyeron que un factor de diez veces para explicar

variabilidad interhuman fue apoyado indirectamente, pero que puesto que los animales de experimento son generalmente menos heterogneos cuando estn comparados a los seres humanos, el factor de diez veces no era necesariamente conservador. Calabrese (1985) encontr diferencias considerables entre temas humanos en su capacidad de metabolizar sustancias extranjeras, y concluy que un factor de diez veces proporcion la proteccin para cerca de 80-95% de la poblacin. Esta conclusin, sin embargo, fue basada en la suposicin que el factor de diez veces era explicar la gama total de la variabilidad humana. Hattis et el al. (1987) analizaban 101 modems de los parmetros toxicokinetic individuales para 49 sustancias especficas (sobre todo drogas) en los grupos de adultos cinco o ms sanos. Estos datos sugirieron que un factor de diez veces de la incertidumbre considerara el cerca de 96% de la variacin en estos parmetros toxicokinetic. Sin embargo, estos datos tambin midi la gama total de la variabilidad humana en este experimento, y no el punto medio a la variabilidad humana sensible. Sheeman y Gaylor (1990) compararon los cocientes del LD 50 del adulto a los mamferos recin nacidos para 238 productos qumicos como medida de variabilidad de los intraspecies. El cociente mediano era 2,6 (adulto a recin nacido). Los cerca de 86% por de los valores eran menos que un cociente de diez veces, similar a las observaciones Dourson y Stara (1983). En general, el valor prefijado de 10 para la variabilidad interhuman aparece ser protector al comenzar de una respuesta mediana, o por inferencia, de un NOAEL asumido para ser de un grupo medio de seres humanos. Sin embargo, cuando NOAELs est disponible en una subpoblacin humana sensible conocida, o si el toxicokinetics o el toxicodynamics humano se sabe con una cierta certeza, este valor prefijado de 10 se debe ajustar o substituir por consiguiente. Animal to Human If adequate toxicity data on humans do not exist, then experimental animal data are used as the basis of the assessment, and an uncertainty factor of 10 is routinely applied to the NOAEL. The basic

assumptions for this uncertainty factor are that the results seen in experimental animals are relevant to humans, that toxicokinetic and toxicodynamic differences exist among species, and that humans are more sensitive than animals at a given mg/kg/day dose or mg/m3 concentration. A number of authors have tried to quantify this area of uncertainty by investigating the ratios between animals and humans, and between different animal species for a number of parameters. For example, Brown and Fabro (1983) identified the lowest effective dose to cause teratogenicity in animals and humans for eight chemicals. Ratios (animal-to-human) vary from 1.8 to 50, with a geometric mean of 7. For the chemicals examines, these authors state that humans appear to be more sensitive, although the difference is generally less than an order of magnitude. Dourson and Stara (1983) showed an interspecies adjustment factor calculated as the cubed root of the ratio between the assumed average human body weight (70 kg) and animal weight. Assuming that such an adjustment could account for all of the differences in animal to human extrapolation, then a 10-fold factor accounts for many of the experimental animal to human differences. Ford (1990) suggests that kinetic and metabolic data, when available, should be used in the assessment of the likely human health hazard of reproductive toxicants from animal toxicity data. Calabrese et al. (1992) and Hoel et al. (1975) have recommended that an uncertainty factor for animal-to-human extrapolation and a technique for dose normalization be considered separately. In this case, the adjustment based on body weight might account for toxicokinetic differences; toxicodynamic differences would be addressed by a separate factor. An example of this recommendation which might be worked into the existing subthreshold dose methods is provided in the Renwick (1993) approach discussed in the next section. Perhaps the most promising research in the area is that of physiologicallybased pharmacokinetic (PBPK) modeling. Such modeling can serve as the basis for replacing the toxicokinetic component of the traditional 10-fold uncertainty factor for interspecies extrapolation in noncancer risk

assessment. The use of PBPK models for this purpose is likely to grow (Jarabek 1995a,b). Agencies such as Health Canada, IPCS, and EPA have positions reflecting the use of reduced interspecies UF when dosimetric adjustments, toxicity data or comparative toxicokinetics are available. Less-than-Chronic Studies to Chronic The subchronic-to-chronic UF is based on the assumption that an effect seen at shorter durations will also be seen after a lifetime of exposure, but at lower doses. This factor also assumes that effects may only be seen after an experimental group is exposed chronically. In fact, several investigators have examined subchronic-to-chronic ratios of NOAELs and LOAELs, and the average differences between subchronic and chronic values are only 2 to 3, while some small percentage of chemicals have ratios that exceed 10-fold (McNamara, 1976; Dourson and Stara 1983; Woutersen et al., 1984; Aida et al. 1992; Kadry et al., 1995). Lewis (1993) showed an analysis of subchronic-to-chronic NOAEL ratios based on peerreviewed literature or information from the U.S. National Toxicology Program. Criteria for inclusion in their analysis were rigorous. Of 54 chemicals considered, only 18 chemicals were analyzed. Of these, 78% had ratios of 3.5 or less. All but one of these ratios (17/18, or 94%) had ratios of 10-fold or less. Unpublished work in EPA (Swartout, 1995) encompasses more chemicals than described above, but the criteria for inclusion are not as rigorous. Despite this lack of rigor, however, the mean of these unpublished ratios lies between 2- and 3-fold with approximately 95% of the ratios with values of 10-fold or less. The data shown here suggests that the routine use of a 10-fold default factor for this area of uncertainty should be closely examined. For example, short term (2 weeks) and subchronic (90 days) NOAELs are often available for comparison, which can give an indication of the possible differences in the subchronic NOAEL and the expected chronic NOAEL. However, when such data are not available, a 10-fold uncertainty factor may not be unreasonable, but it should be considered as a loose upper-bound estimate to the overall uncertainty.

LOAEL to NOAEL If a LOAEL exists on which to base the estimation of a subthreshold dose, the uncertainty in the NOAEL must be addressed. Analysis of several data bases suggest that a factor of 10 or lower is adequate and that use of data does support a lower factor with certain chemicals. For example, Dourson and Stara (1983) describe ratios of LOAELs to NOAELs of either subchronic or chronic exposures based on data from Weil and McCollister (1963). Ninety-six percent of these ratios had values of 5-fold or less. Kadry et al. (1995) also evaluated the uncertainty factor for LOAEL to NOAEL extrapolation for several chlorinated compounds. Ratios were 1.4 to 8.9 for methylene chloride, 2 to 5 for pentachlorophenol, 2 or 4.2 for monochlorobenzene, 3.3 or 10 for chlorpyrifos, and 1.6 or 2.2 for 1,1dichlorethane. The authors conclude that 91% of these ratios were 6-fold or less; all of them were 10-fold or less. The results of the research on LOAEL to NOAEL extrapolation are not extensive, nor unexpected. Experiments are seldom designed with doses in excess of 10-fold apart, leading to the common statement that these ratios depend more on dose spacing than inherent toxicity. The choice of dose spacing, however, often reflects the judgment on the likely steepness of the dose-response slope, with steeper slopes resulting in tighter dose spacing. The data indicate that when faced with a LOAEL and not a NOAEL, the choice of uncertainty factor should generally depend on the severity of the effect at the LOAEL. More severe effects should be judged to need a larger uncertainty factor because the expected NOAEL is further away from the LOAEL. Less severe effects would not require a large factor, because, presumably, the LOAEL is closer to the unknown NOAEL.

2.5.1 Curvas Dsis-Respuesta Si se obtiene una respuesta de una magnitud definida para cada dosis, dentro de un rango de dosis, se dice que la respuesta es "gradual". Es decir que a diferentes dosis, D1, D2,...Di, se observan los efectos, E1, E2,...Ei,

que varan en forma continua y tienen un valor nico para cada dosis (dentro de la variabilidad normal que siempre se observa cuando se hacen bioensayos). La curva dosis-efecto se construye graficando en las ordenadas los Efectos (E) causados en el organismo expuesto a una substancia qumica y en las absisas las Dosis (D) a las que fue expuesto. Si la experimentacin se hizo con el tejido blanco aislado expuesto directamente a la substancia, la respuesta observada normalmente es una funcin hiperblica de la dosis de una forma similar a la ecuacin Michaelis-Menten para expresar la velocidad inicial de una reaccin enzimtica. La curva pasa por el origen del sistema de coordenadas cartesianas y la pendiente mxima se presenta en el origen. La pendiente permanece aproximadamente constante durante un rango amplio de la dosis (cintica de primer orden), despus la pendiente disminuye con la dosis hasta que se vuelve cero (cintica de orden cero) y la respuesta adquiere su valor mximo. A este valor mximo se le denomina efecto mximo (Emax) y es una medida de la eficacia del txico. En algunas ocasiones, la relacin dosis-efecto no es tan definida y dentro de una poblacin se observa una distribucin de respuestas para cada dosis. En este caso el efecto que se mide no es la magnitud, se mide el porcentaje de la poblacin en estudio que presenta una determinada respuesta para cada dosis suministrada. Este tipo de efecto se le denomina cuantal. En estos casos se acostumbra graficar, en la ordenada, el por ciento de la poblacin que presenta un determinado valor de la respuesta y en la absisa, el logaritmo de la dosis suministrada. Esta curva tiene forma sigmoidal.

Figura 2.5.1.A.- Curva Dosis-Respuesta. 0 a 1.-Regin NOAEL; 2.-LOAEL; 3.-Regin Lineal; y 4.-Respuesta Mxima. La curva pasa por el origen (cuando la dosis es cero, la respuesta es cero) y a valores muy bajos de la dosis, la curva es horizontal con un valor del efecto igual a cero (la curva va sobre el eje de las dosis). La respuesta empieza a tener un valor mayor que cero cuando la dosis llega al nivel lmite. De all en adelante la pendiente de la curva crece con la dosis, hasta que se llega a una pendiente mxima. Esta pendiente se mantiene por un amplio rango de dosis en el que la respuesta es directamente proporcional a la dosis (lnea recta). A dosis mayores la pendiente empieza a decrecer hasta que la curva se vuelve asinttica a un valor mximo de la respuesta (Emax). A la regin de la curva donde los efectos no son medibles, se le conoce como regin NOAEL (por sus siglas en ingles No Observed Adverse Effects Level). La regin lineal de la curva abarca aproximadamente del 16 al 84% de la respuesta mxima. El valor de Emax es una medida de la eficacia del txico o la droga (Figura 2.5.1.A). Algunas substancias presentan relaciones dosis-respuesta diferentes a la descrita y la curva no tiene la forma de S. Hay compuestos peligrosos que presentan dos curvas dosis-efecto, una curva que representa efectos txicos y otra los efectos letales. Cuando se aumenta el nivel de la dosis, se pasa de una rea de la curva en la que no se observan efectos dainos a otra donde se observan efectos txicos

crecientes. Cuando se aumenta an ms la dosis se presentan los efectos letales crecientes que tambin se relacionan con la dosis en la misma forma que los efectos anteriores. Las dos curvas son paralelas (Figura 2.5.1.B).

Figura 2.5.1.B. Curva Dosis-Respuesta. Compuesto que presenta las dos curvas. 1= curva de dosis-efectos txicos; y 2= curva de dosis-efectos letales.
2.5.1.1 Potencia vs. Eficacia

Potencia se refiere al rango de dosis dentro del cual una substancia produce respuestas crecientes. La curva del txico (o droga) ms potente aparece ms cercana al origen.

Figura 2.5.1.C.- Potencia y Eficacia de 3 Compuestos.

La potencia de un droga est influenciada por factores tales como la absorcin, el metabolismo, etc. La eficacia est relacionada a una accin ms fundamental de la droga, es una medida de la capacidad intrnseca de la droga para producir un efecto. Este valor se estima midiendo la altura mxima de la curva dosis-respuesta (cuando la curva se vuelve asinttica a las absisas) y, como ya vimos anteriormente, se le denomina Emax. Dos drogas que son cualitativamente iguales en producir un efecto particular pueden diferir en su eficacia, en su potencia, o en ambas (Figura 2.5.1.C). El compuesto 1 es ms potente que el compuesto 2, y el compuesto 2 es ms potente que el compuesto 3; los compuestos 1 y 2 tienen igual eficacia, pero el compuesto 3 es menos eficaz que 1 y 2 .