Extraco e Electroforese de DNA - Relatrio

Aulas prticas de Biologia Celular e Molecular I FMDUP

Resumo: Introduo
A eletroforese foi inicialmente proposta por Arne Teselius (1937) como a tcnica utilizada para a visualizao de protenas de acordo com as diferenas de comprimento dos fragmentos de aminocidos e cargas elctricas. A simplicidade e rapidez da tcnica impulsionaram o seu aprimoramento e uso, actualmente, para separar identificar e purificar fragmentos de DNA. A visualizao do DNA por eletroforese baseia-se na carga negativa que os fosfatos conferem ao DNA. Um gel preparado com pequenos poos, utiliza-se um pente antes do gel secar (para a deposio do material. O gel ento submetido a uma diferena de potencial elctrico. A presena da carga negativa deve ser combinada com a adio de soluo salina para maior eficincia na conduo elctrica. Posteriormente, h um deslocamento dos cidos desoxirribonuclicos de acordo com o tamanho das molculas, as de menor massa apresentam maior velocidade de migrao enquanto as de maior massa so mais lentas. Os gis usados podem ser quer de agarose como de poliacrilamida. O gel de agarose, utilizado nesta prtica, apresenta maior extenso de separao quando comparado ao de poliacrilamida, tornando possvel a visualizao de longos fragmentos de DNA. A electroforese mostra-se mais eficiente para determinar fragmentos de Dna do que outros processos como a centrifugao atravs de gradiente de concentrao utilizada em testes de paternidade, identificao de criminosos e ainda, quando combinada com outras tcnicas (por exemplo enzimas de restrio) possibilita indstria farmacutica produo de vacinas, remdios e pecuria produo de transgnicos. A actividade prtica efectuada combinou a extraco do DNA (obtido raspando o interior das bochechas com uma esptula estril) com a tcnica da electroforese a fim de visualizar o DNA em luz ultravioleta.

Andreia Arajo, Catarina Espinha e Joo Santana T3

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1.1. Protocolo 1.1.1.

relativo extraco de ADN: Material:

Microcentrfuga; Banho; Vortex; Micropipetas; Tubos de centrifugaoo colheita 2 ml; Tubos eppendorf; Colunas.

1.1.2. 1.1.3.

Reagentes:
100% etanol; Tampo de lise ( da clula); Tampo de ligao (do ADN); Tampo de lavagem (do ADN); Tampo de eluio (do ADN); Proteinase K; RNase A; Celulas epiteliais da mucosa oral

Procedimento:
1. Raspar o interior da bochecha com uma esptula estril e introduzir o contedo (150-300L) no interior de um tubo eppendorf, repetir opcionalmente num 2 tubo; 2. Adicionar 900L de Tris-Cl 20mM (pH 7,6) em cada tubo, fechar e inverter vrias vezes at misturar completamente o contedo; 3. Centrifugar os tubos a 5.000x g durante 5-10min a T ambiente; 4. Remover o sobrenadante ( a excepo de uns 20L se o pellet ficar solto) e descartar;
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Aulas prticas de Biologia Celular e Molecular I FMDUP 5. Ressuspender o pellet em 400L de soluo tampo de lise (repartir 200+200Lse so dois tubos e logo juntar num s tubo); 6. Adicionar 20L de proteinase K e 15L de RNase A. Homogeneizar a soluo no vortex 15 seg.; 7. Incubar 15-30 min no banho a 50C com agitao (se no tiver agitao, misturar 3 a 4 vezes com o vortex durante a incubao); 8. Adicionar 200L de tampo de ligao por cada 400L de tampo de lise adicionados e misturar completamente com a micropipeta. Caso aparea um precipitado, este nao afectar o ADN; 9. Colocar uma coluna num tubo de recolha de 2mL e carregar para 750L de preparao, incluindo precipitados, na coluna; 10. Centrifugar a coluna com o tubo de colheita durante 1 min a 10.000x g. Descartar o lquido recolhido. (Repetir os passos 9 e 10 at carregar a amostr toda); 11. 1 lavagem. Adicionar 650L de tampo de lavegem (tampo + 1,5 vol de etanol absoluto, que se encontra preparado) na coluna. Centrifugar 1 min a 10.000x g. Descartar o lquido recolhido. 12. 2 lavagem. Repetir o passo 11. 13. Secagem (importante no reduzir o tempo de centrifugao). Colocar a coluna no tubo de recolha e secar completamente a coluna com uma centrifugao de 2 min 10.000xg; 14. Eluio. Colocar a coluna num tubo eppendorf de 1,5 mL e introduzir 100L de tampo de eluio directamente na membrana. Incubar 3 min a T ambiente. Nota: o tampo de eluio pr-aquecido a 70C ou a incubao da coluna a 70C podem aumentar a eficincia na obteno de ADN obteno de ADN; 15. Centrifugar 1 min a 6000x g. O lquido obtido conter o ADN em soluo. Se for necessrio, repetir passo 14 com mais 100L (consultar o professor); 16. Identificar o tubo com a soluo de ADN e armazenar no congelador. 1.2.

Protocolo relativo electroforese de ADN: 1.1.1. Material:

Eppendorfs; Suporte para os tubos de eppendorfs; Pontas para micropipetas;
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Aulas prticas de Biologia Celular e Molecular I FMDUP Micropipeta; Suporte para a soluo de agarose; Banho-maria, microondas ou placa elctrica; Centrifugadora; Tina de electroforese; Transiluminador de UV; culos de proteco; Luvas; Balana.

1.1.2.

Reagentes:
Agarose; Tampo de electroforese TAE 1x (40mM tris acetato, 2mM EDTA, pH 8,5),; Soluo de GelRed Amostra de ADN; Amostra de um produto PCR controlo; Amostra de marcador de pesos moleculares; Tampo de amostra ou loading buffer.

1.1.3.

Procedimento: Preparao do gel:

Preparar 200 ml de soluo de agarose 1% para fazer um gel:

1.

Pesar 2 gr de agarose e dissolver em 200mL de tampo de electroforese TAE 1X(40 mM tris acetato, 2mM EDTA, pH 8,5);

2. Aquecer

no

banho,

microondas

ou

placa

elctrica

at

dissolver

completamente a agarose e obter uma soluo homognea;

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3. Deixar arrefecer um pouco e adicionar a soluo de GelRed (concentraoo

final de aproximadamente 0,01%(v/v));

4. Colocar

a soluo de agarose num suporte, retirar bolhas de ar e colocar

pente na extremidade para gerar os pocinhos;

5. Deixar arrefecer at a solidificaoo do gel.

NOTA: o gel foi previamente preparado pelo docente.

Preparao das amostras:

Sero analisadas amostras das extraces de ADN realizadas pelos diferentes grupos na aula anterior. Tambm sero fornecidos: Uma amostra de ADN genmico controlo; Uma amostra de um produto PCR controlo; Uma amostra de marcadores de pesos moleculares.

A preparao das amostras para o seu carregamento no gel da seguinte forma:

1.

Colocar em eppendorfs individuais 10 L de amostra de ADN; 2 L tampo de amostra de ou loading buffer 6x (L.B.

2. Adicionar

1x:0,30% de azul de bromofenol e 36% de glicerol);

3. Centrifugar ligeiramente a mistura se houver muitas repartidas dentro do

tubo, para recolher todo o volume da amostra.

Electroforese
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1.

Colocar o gel na tina de electroforese;

2. Preencher o volume da tina com tampo TAE 1x at cobrir o gel; 3. Aplicar 4. Colocar
o padro de marcadores moleculares num dos poos extremos e

seguidamente as amostras de ADN; a tampa e aplicar corrente elctrica (100V) deixando correr

aproximadamente 30-60 min (ou at uma suficiente separao das amostras);

5. Desligar
analisar.

a fonte elctrica e levar o gel ao transiluminador de UV para

Precaues
Os olhos e pele devem ser protegidos com os raios UV utilizando visor, culos e luvas.

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