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Capteurs et biocapteurs lectrochimiques

Daniel Thvenot, Rgis Moilleron & Gilles Varrault, Cereve


Universit Paris 12, ENPC, ENGREF (UMR-MA 102)
http://www.enpc.fr/cereve/HomePages/thevenot/thevenot.html

IUPAC commission I.7 de Chimie biophysique


24/11/2004 D. Thvenot: Capteurs-Electrochim-C-2004.ppt 1

Sommaire
1. Capteurs / lectrodes mtalliques (EM) 2. Capteurs / lectrodes spcifiques ioniques (ESI) 3. Capteurs / lectrodes spcifiques gaz (ESG) 4. Biocapteurs / lectrodes enzymes ou anticorps immobilis(e)s 5. Conclusions et perspectives
24/11/2004 D. Thvenot: Capteurs-Electrochim-C-2004.ppt 2

4. Biocapteurs lectrochimiques
Sommaire 4.1. Dfinition des biocapteurs 4.2. Classements des biocapteurs 4.3. Constituants des biocapteurs : slectivit et sensibilit, tape sensibilit cintiquement limitante 4.4. Originalit des biocapteurs 4.5. Utilisation de biocapteurs en milieux aquatiques : possibilits & limites 4.6. Conclusion et perspectives
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4. Biocapteur : 4.1. Dfinition (IUPAC)


D.R. Thvenot, K. Toth, R.A. Durst & G.S. Wilson (1999) Electrochemical biosensors: recommended definitions and classification. Pure and Applied Chemistry, 71 (12), 2333-2348

Self-contained, integrated device Nomenclature


Biological recognition element = receptor Physico-chemical transducer = transducer

Ability to be repeatibly calibrated


Either continuous operation Or rapidly and reproducibly regenerated
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4. Biocapteur : 4.1. Dfinitions


Principe de fonctionnement & nomenclature

D. Thvenot: Capteurs-Electrochim-C-2004.ppt 24/11/2004 au sommaire biocapteur Retour

4. Biocapteurs : 4.2. Classement


4.2.1. Type de reconnaissance molculaire (rcepteur)
Catalyse enzymatique, mtabolisme cellulaire ou tissulaire
Fonctionnement continu possible vritable capteur! Enzyme purifi ou prsent dans des cellules ou tissus Oxydases, dshydrognasses, hydrolases...

Formation de bio-complexe: raction complexe immunologique, rcepteur membranaire


Ncessit damplification (enzyme, fluorescence...) et de rgnration (pour fonctionnement squentiel)
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4. Biocapteurs : 4.2. Classement


4.2.1. Type de reconnaissance molculaire (suite)
Mode de fonctionnement des membranes
Catalytiques : fonctionnement continu Chlatantes : ncessit de rgnration

Caractre commun entre les 2 types de membranes reconnaissance biologique


Consommation (locale) de lespce mesure : mesure stationnaire (si agitation) ou transitoire
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4. Biocapteurs : 4.2. Classement


4.2.2. Type de transducteur associ
Electrochimique
Ampromtrique, potentiomtrique, conductimtrique, FET

Optique
Optrode, rsonance de plasmon de surface (SPR)

Enthalpimtrique
Micro-calorimtrie

Massique
Quartz pizo-lectriques, ondes acoustiques de surface
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4. Biocapteurs : 4.2. Classement


4.2.3. Classement par espce(s) dtecte(s) espce
Substrats de ractions biologiques
Sucres, acides amins, alcools, phnols...

Nutriments
Micro-DBO (micro dans sa dure et non sa taille !)

Inhibiteurs, toxiques Inhibiteurs


Pesticides (organo-phosphors), mtaux, fluorures...
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4. Biocapteurs : 4.2. Classement


Que retenir dans le classement ?
1. Type de reconnaissance molculaire
Catalytique: enzyme(s) Chlatante: complexe antigne-anticorps Dans les 2 cas: consommation de substrat

2. Type de transducteur
Ampromtrique Potentiomtrique

3. Type despce dtecte


Substrat Nutriment Toxique
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4. Biocapteurs : 4.3. Constituants


4.3.1. Mode dimmobilisation du rcepteur dans/sur la membrane
Emprisonnement ou inclusion : facile, stable
Gel ou membrane prpare en prsence d enzyme(s)

Adsorption du membrane : facile & peu stable Liaison covalente, rticulation sur membrane : complexe mais stable
Activation de la membrane, activation de l enzyme et raction spontane Contact d enzyme avec une membrane active

Stabilit de l activit de la membrane


3 lments: membrane + liaison physique ou chimique (immobilisation) + activit enzyme
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4. Biocapteurs : 4.3. Constituants


4.3.1. Mode dimmobilisation du rcepteur dans/sur la membrane
Inclusion dans gel ou co-polymrisation

Adsorption Adsorption & rticulation Liaison covalente


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4. Biocapteurs : 4.3. Constituants


4.3.2. Rle des cintiques enzymatiques Ssolution htrognes
Transducteur (lectrode)

Transport Pmemb. -Enz Raction -Enz


Membrane)

Transport -Enz -Enz

Psolution

S: substrat(s) P: produit(s) de la raction catalyse par l enzyme

Composition de la solution analyse modifie, par la raction, sur une paisseur ( fonction de l agitation de la solution)
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4. Biocapteurs : 4.3. Constituants


4.3.2. Rle des cintiques enzymatiques htrognes
Transport du/des substrat(s) S vers le site ractionnel (surface ou intrieur membrane) V = (DS / ) (Ssolution - Smembrane)

avec si agitation avec DS diffusion substrat S et paisseur couche modifie

Raction du/des substrat(s) S catalyse par l enzyme (Michaelis-Menten) V = Vmax . Smembrane / (Smembrane + KM,S)

avec Vmax activit enzymatique et KM,S (Michaelis) transport de partie du/des produits P vers le transducteur (rponse) et vers l chantillon (inutile)
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4. Biocapteurs : 4.3. Constituants


4.3.2. Rle des cintiques enzymatiques htrognes
Quelle tape la plus lente : cintiquement limitante? Transport ou raction ? Rgime diffusionnel si transport = tape la + lente

Vmax / KM,S >> DS / forte activit immobilise Vmax et/ou barrire diffusionelle externe (DS faible) rponse indpendante de l activit immobilise TB!

Rgime chimique si raction = tape la + lente

Vmax / KM,S << DS / faible activit immobilise et/ou forte agitation ( ) rponse dpendante de l activit immobilise => peu souhaitable pour instrumentation analytique !
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4. Biocapteurs : 4.3. Constituants


4.3.3. Transducteur lectrochimique associ
Electrode mtallique : H2O2, Fe(CN) 6 3/4 - Electrode spcifique ionique : H30+, NH4+ Electrode spcifique gaz : O2, CO2, NH3..
1. Transducteur ampromtrique ou pH mtrique 2. Membrane enzymatique Membrane permable aux gaz
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4. Biocapteurs : 4.3. Constituants


Que retenir sur limmobilisation ?
1. Immobilisation du rcepteur (enzyme)
Inclusion ou rtention Adsorption: peu stable Liaison covalente: stable mais plus complexe

2. Cintiques htrognes
Rgime chimique: cintique enzymatique limitante Rgime diffusionnel: transport du substrat limitant (permet une plus grande stabilit du capteur)

3. Transducteur lectrochimique
EM (H2O2), ESI (pH) ou ESG (Clark, CO2, NH3) Retour au sommaire biocapteur
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4. Biocapteurs : 4.4. Originalit


4.4.1. Slectivit: dtecteur & transducteur
Catalyse enzymatique: trs / peu slective
Glucose oxydase, alcools oxydase, amino-acides oxydase Enzyme(s) purifi ou cellule / tissus biologique

Anticorps mono- ou multi-clonal: trs/peu slective Transducteur associ: trs / peu slectif

4.4.2. Amlioration de la slectivit


Membrane slective supplmentaire
Actate de cellulose (anionique): arrt de lascorbate

Transducteur lectrochimique: Eappl. + faible Montage diffrentiel 2 capteurs ( colorimtrie)


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Utilisation de catalyseurs supplmentaires

4. Biocapteurs : 4.4. Originalit


4.4.2. Amlioration de la slectivit
Montage diffrentiel : soustraction des rponses
Suppression rponse aux interfrents lectrochimiques Capteur Biocapteur enzyme

sans enzyme

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4. Biocapteurs : 4.4. Originalit


4.4.3. Sensibilit plus leve que si raction homogne (dosage par kit enzymatique)
Intgration de la reconnaissance molculaire et de la transduction du/des produits de la raction
Pas de dilution dans lchantillon

Amplification de la raction principale laide de raction supplmentaire


Utilisation de seconde raction enzymatique
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4. Biocapteurs : 4.4. Originalit


4.4.4. Stabilit: mthodes d valuation Stabilit
Stabilit opratoire (fonctionnelle)
Mme biocapteur, calibration squentielle, rpte

Stabilit au stockage
Diffrent biocapteurs issus d un mme lot (homogne) de production: diverses dures stockage

Dpend de: membrane, enzyme, immobilisation Dure de vie: modes d expression vie
Dure (quelques heures quelques mois)
50 % de dcroissance de la sensibilit : t1/2 soit en fonctionnement soit au stockage

Vitesse de dcroissance de la sensibilit : %/mois


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4. Biocapteurs : 4.4. Originalit


Que retenir de leur originalit ?
1. Spcificit ou slectivit du capteur
Spcificit ou slectivit enzymatique
Molcule: glucose oxydase, urase Famille: alcool oxydase

Spcificit ou slectivit du transducteur

2. Amlioration de la slectivit
Montage diffrentiel Membrane permslective

3. Sensibilit leve
Intgration spatiale du dtecteur et transducteur
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4. Biocapteurs : 4.4. Originalit


Que retenir de leur originalit ?
4. Stabilit
Modes dvaluation bien dfinir
Au stockage ou en fonctionnement

Dpend de tous les constituants du capteur et du rgime cintique utilis


Rgime diffusionnel ou chimique ?

Dure dutilisation comprise entre


1 semaine: dispositifs de recherche Plusieurs annes: dispositifs commercialiss

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4. Biocapteurs : 4.5. Applications


4.5. Application des biocapteurs lectro-chimiques
4.5.1. Mesure de substrats :
Substrats simples de ractions enzymatiques Applications mdicales, environnementales ou agro-alimentaires 4.5.2. Exemple de biocapteur ure Sucres, acides amins, phnols, mtabolites

Mesure de matire oxydable Mesure dinhibiteurs enzymatiques


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4. Biocapteurs : 4.5.2. Ure


4.5.2. Urase immobilis & dtecteur NH3
Rponse stationnaire E = pente . log [ure] O=C(NH2)2 + H2O => 2 NH4+ + HCO3 NH4+ dtect via NH3 pH optimal dfini: dfini pH = 7 pour urase pH > 9,2 dtection NH3 Agitation ncessaire pour rponse stationnaire Remplissage du biocapteur
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4. Biocapteurs : 4.5. Applications


4.5. Application des biocapteurs lectro-chimiques
4.5.1. Mesure de substrats :
4.5.2 Exemple de biocapteur ure 4.5.3. Exemple de biocapteur glucose Acides amins, phnols, mtabolites

Mesure de matire oxydable Mesure dinhibiteurs enzymatiques


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4. Biocapteurs : 4.5 3. Glucose


4.5.3.1. Raction enzymatique
D Glucose oxydase (GOD ou GOx) immobilise D Glucose + O2 => Gluconate + H3O+ + H2O2 K = 9,3 .1023 pH 5,7 => raction totale (si GOx prsent et actif )

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4. Biocapteurs : 4.5 3. Glucose


4.5.3.2. Transducteurs associs : 3 possibilits
Capteur de pH : non spcifique au gluconate Capteur oxygne : trs spcifique, mais rponse dcrot si glucose Capteur mtallique (Pt) oxydation H2O2 : peu spcifique H2O2 mais rponse avec glucose Conditions de fonctionnement du capteur
Milieu pH neutre (sang pH 7,2) Prsence doxygne dissous
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4. Biocapteurs : 4.5.3. Glucose


4.5.3.3. Calibration
lectrode de Pt: oxydation de H2O2 Rponses des

I (nA) T (min) 3 mM

3 mM

3 mM 3 mM

additions de glucose 3 mM I (nA)


Temps (min) dans une solution tampon (pH 7,4) Mesures des rponses stationnaires

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4. Biocapteurs : 4.5.3. Glucose


25 20 15 10 5 0 0 3 6 9 12 [Glucose total] 15 18 I - I0 (nA)

4.5.3.3. Calibration des rponses stationnaires du biocapteur : I-I0 = f(glucose)total


Soustraction du signal de fond I0 Quel domaine de linarit ?
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D. Thvenot: Capteurs-Electrochim-C-2004.ppt

4. Biocapteurs : 4.5.3. Glucose


4.5.3.3. Calibration
I / C (nA/mM) 1,5 1 0,5 0 0
Sensibilit stationnaire S (rponse relative) = I/C Domaine de linarit de la rponse lorsque

domaine de linarit

S = I/C = constante ltape cintiquement limitante

[glucose]max. indicateur de

9 12 15 18 [glucose total]

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Ici diffusion du glucose vers le site ractionnel (membrane GOx) Car [glucose]max > KM,glu
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D. Thvenot: Capteurs-Electrochim-C-2004.ppt

4. Biocapteurs : 4.5.3. Glucose


4.5.3.3. Calibration

Rponse stationnaire : Istat. = s [glu]


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Rponse transitoire: (dI/dt)max. = s [glu]


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4. Biocapteurs : 4.5.3. Glucose


4.5.3.4. Biocapteur implantable (KU, Paris 12,
INSERM)
Polyurethane membrane Ag / AgCl

Brevet US 5,165,407 (24/11/1992)


450 m o.d. Teflon Pt-Ir anode 170 m o.d.

Teflon Sensing cavity : Cellulose acetate GOx + B SA + GA 250 m o.d.


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Ag - cathode 100 m o.d.

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4. Biocapteurs : 4.5.3. Glucose


4.5.3.4.Biocapteur implantable (Universit de
Manchester)

capteur extrmit (anode de Pt 125 m) et lectrode auxiliaire / rfrence en acier inox

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D. Thvenot: Capteurs-Electrochim-C-2004.ppt

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4. Biocapteurs : 4.5.3. Glucose


Suivi de la glycmie sur un volontaire non diabtique
mesure continue sous-cutane (ligne) et ponctuelle plasmatique ( ) ligne

Absorption 100 g Glu

Injection 12 g Glu

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D. Thvenot: Capteurs-Electrochim-C-2004.ppt Sensor Research Center, Greifswald, Allemagne

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4. Biocapteurs : 4.5.3. Glucose


4.5.3.4. Biocapteur jetable (MediSense)
Languette usage unique avec zone dinsertionaspiration de la goutte de sang

24/11/2004

D. Thvenot: Capteurs-Electrochim-C-2004.ppt

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4. Biocapteurs : 4.5.1. Substrats


Que retenir sur les biocapteurs substrats?
Les plus tudis, publis, brevets, commercialiss March agro-alimentaire mais surtout mdical
Diabte = maladie touchant une part importante de la population et entranant des problmes importants: reins, vision Ncessite la mesure multi quotidienne de la glycmie sanguine (pour injection dinsuline) 2 approches complmentaires
Capteur usage unique Capteur implant in vivo
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4. Biocapteurs : 4.5.1. Substrats


Que retenir sur les biocapteurs substrats?
Multiplicit de transducteurs lectrochimiques possibles
Eau oxygne produite Oxygne consomm

Bonne stabilit (conservation et fonctionnement) de la glucose oxydase


Possibilit de commercialisation de capteurs usage unique (sans talonnage par usager)

Dveloppements industriels et scientifiques


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4. Biocapteurs : 4.5. Applications


4.5. Application des biocapteurs lectro-chimiques
4.5.1. Mesure de substrats
4.5.2. Exemple de biocapteur ure 4.5.3. Exemple de biocapteur glucose 4.5.4. Exemple de mesure dacide

amin et

mtabolites
Mesure de matire oxydable Mesure dinhibiteurs enzymatiques
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4. Biocapteurs : 4.5.4. Mtabolites


4.5.4. Capteur L aminoacides (spcifique
d 1 famille) a.a oxydase capteur O2 courbes de calibration diffrent aminoacides
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4. Biocapteurs : 4.5.4. Mtabolite

Dispositif de mesure ponctuelle


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Dispositif danalyse circulation


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SensLab GmbH, Leipzig (alcool, glucose, lactate, glutamate)


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4. Biocapteurs : 4.5. Applications


4.5. Application des biocapteurs lectro-chimiques :
4.5.1. Mesure de substrats 4.5.5. Mesure de matire oxydable (levure immobilise) :

Micro-DBO: capteur demande


biologique en oxygne (rponse en h) Mesure dinhibiteurs enzymatiques
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4. Biocapteurs : 4.5.5. Micro-DBO


4.5.5. Capteur Demande Biologique en Oxygne (DBO)
Capteur O2 avec membrane en tflon

Levures immobilises dans une membrane Echantillon ar : circulation


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4. Biocapteurs : 4.5.5. Micro-DBO


Biosensores SL, Moncofar, Espagne
Suivi du fonctionnement de stations d puration

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D. Thvenot: Capteurs-Electrochim-C-2004.ppt

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4. Biocapteurs : 4.5.5. Micro-DBO


Biosensores SL, Moncofar, Espagne
Suivi continu de la DBO en entre et sortie de la station dpuration de Valence (Alboraya)

24/11/2004

D. Thvenot: Capteurs-Electrochim-C-2004.ppt

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4. Biocapteurs : 4.5. Applications


4.5. Application des biocapteurs lectrochimiques
4.5.1. Mesure de substrats 4.5.5. Mesure de matire oxydable 4.5.6. Mesure dinhibiteurs enzymatiques
Pesticides, mtaux lourds, fluorures Intrt environnemental: soutien Europen Exemple de biocapteur pesticides

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4. Biocapteurs : 4.5.6. Pesticides


4.5.6.1. Importance de la mesure des pesticides
Contrle de la qualit des eaux (rglementation Europennes)

4.5.6.2. Toxicit des pesticides en relation avec leur inhibition de l AChE 4.5.6.3. Dveloppement de biocapteur miniaturis AChE pour leur mesure dans chantillons aqueux ou organiques (G. Turdean, Univ. Cluj, Roumanie)
24/11/2004 D. Thvenot: Capteurs-Electrochim-C-2004.ppt 47

4. Biocapteurs : 4.5.6. Pesticides


4.5.6.4 Dtection
Type 1. Mlange Pesticide + ASCh :
Addition 0,2 ou 1 mM ASCh => I0 Addition de pesticide => I = I0 - I I / I0 vs log [pesticide] => courbe calibration

Type 2. Incubation avec le pesticide seul


Courbe de calibration ASCh, i.e. I vs [ASCh] Incubation 30 min avec pesticide (sans ASCh) Courbe de calibration ASCh (sans pesticide) => inhibition : diminution de la sensibilit
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4. Biocapteurs : 4.5.6. Pesticides


Dtection de type I
100 80

Paraoxon :
O C H5 O 2 P - O - C H -NO 6 5 2 C H5 O 2 Type 1: Inhibition AChE par [pesticide] = 0.1-10 M avec [ASCh] = 200 M Moyenne de 4 capteurs 10% inhib. = 0,4 M
49

[AChE] = 480 mU/mm2 tampon phosphate pH 8 30C E=+410 mV vs Ag/AgCl

I/I (%) o

60 40 20 0

0,1

1 log [paraoxon] (M)

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D. Thvenot: Capteurs-Electrochim-C-2004.ppt

4. Biocapteurs : 4.5.6. Pesticides


Limite dtection insecticide organophosphor [AChE] (10% inhibition)
Trichlorfon (Dipterex) 5 - 55 M 5-150 mU/mm2 Paraoxon 0,4 M 480 mU/mm2

Rgnration (30 min, 1 mM 2-PAM)


85-90 % => rversibilit de linhibition insecticide

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4. Biocapteurs : 4.5. Applications


4.5. Application des biocapteurs lectrochimiques :
4.5.1. Mesure de substrats 4.5.5. Mesure de matire oxydable 4.5.6. Mesure dinhibiteurs enzymatiques

4.5.7. Biocapteurs ADN


Oxydation lectrochimique de la guanine Fonction de l tat d hybridation de l ADN Permet la reconnaissance d ADN
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4. Biocapteurs : 4.5.7. ADN


Biocapteur lectrochimique : hybridation ADN
Universit de Florence
Biocapteur lectrochimique pour dtection de lhybridation de l ADN Biocapteur lectrochimique pour molcules se liant ADN

24/11/2004

D. Thvenot: Capteurs-Electrochim-C-2004.ppt

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4. Biocapteurs : 4.5. Applications


4.5. Application des biocapteurs lectro-chimiques
4.5.1. Mesure de substrats 4.5.5. Mesure de matire oxydable 4.5.6. Mesure dinhibiteurs enzymatiques 4.5.7. Biocapteurs ADN

4.5.8. Micro-capteurs et microcellules de mesure


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4. Biocapteurs : 4.5.8. Miniature


Institute of Microsystem Technology (IMTEK), Universit de Freiburg, Allemagne

Micro systme bioanalytique avec un rseau de biocapteur et mlangeur de ractifs


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4. Biocapteurs : 4.5. Applications


Que retenir sur les applications ?
Trs grand foisonnement de proposition de capteurs & instruments Exploitant le principe des biocapteurs lectrochimiques Souvent de dissmination/valorisation limite
Complexit du passage de la recherche la ralisation industrielle Moyens et objectifs trs diffrents !
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4. Biocapteurs : 4.6. Conclusions


Potentialits trs importantes des biocapteurs
Diversit, slectivit, sensibilit

Complexit oprationnelle des biocapteurs


Multi-disciplinarit des comptences ncessaires

Effets de mode et perspectives des progrs en


Electrochimie, miniaturisation, optique, immunologie, ADN, production industrielle, traitement de signal

Difficults spcifiques aux mesures en eaux naturelles ou uses


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Sommaire
56

5. Capteurs lectrochim. : Conclusion


5.1. Synthse des performances des capteurs
4 types de capteurs / lectrodes spcifiques

5.2. tapes de dveloppement des capteurs et instruments associs :


Quel fonctionnement ?
Mesure unique Surveillance continue Alerte...

Quels utilisateurs ? Patient, technicien Quel degr dautomatisme ?


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5. Capteurs lectrochim.: 5.1. Synthse


Type cap- Mtal teur
Espce

Spcif. Spcif. gaz Biocapteur ionique


Gaz oxydant ou ac-base Mtabolite, inhibiteur

Electrode Pt, Electrode Pt, C Au ou capteur pH, ou capt. pH O2 ou CO2 Membrane Sans Verre, cris- Hydrophobe, Enzyme(s) ou taux, orga- permable aux Ab immobilinique gaz s(s) Rponse : E lg C Istat C Ip C Istat C calibration E lg C E lg C E lg C Rponse : TransiEquilibre Stationnaire, Stationnaire, type toire, staquilibre transitoire tionnaire, quilibre
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Rduc- Ions minteur, oxyraux dant Pt, Au, 2 lectrodes TransducHg, C de rfrence teur

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5. Capteurs lectroch. : 5.3. Perspective


5.3. Perspectives offertes par :
La miniaturisation, La production industrielle des capteurs et instruments associs Le traitement de signal
Capteurs intelligents , redondants (ex: nez artificiel)

L'utilisation de transducteurs non lectrochimiques


Optiques Massiques Enthalpiques...
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5. Capteurs lectroch. : 5.4. Perspective


5.4. Comptences ncessaires au dveloppement de capteurs et capteurs lectrochimiques :
Analytique, Physico-chimique, Biochimique et micro biologique, Electronique et traitement de signal Mathmatiques et modlisation

Fort dveloppement en cours : vous de jouer !


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4. Biocapteurs : 4.5.5. DBO


Biosensores SL, Moncofar, Espagne
Suivi de la prsence Biocapteur DBO de toxiques : inhibiteurs Moncofar, Espagne Biosensores SL,

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